ClonaciClonacióón n Se refiere al proceso de aislar una secuencia de ADN de
interés, insertarlo en un plásmido o vector de clonación y
obtener múltiples copias de ella en un organismo
(generalmente procariota) por acción de la DNA
polimerasa.
Vector de clonaciVector de clonacióónn
Molécula pequeña de ADN que puede replicarse de manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras).
Los vectores se utilizan para clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales de ADN sean incorporadas en su material genético.
3 Caracter3 Caracteríísticas importantessticas importantes
La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones entonces…
ConstrucciConstruccióón de pln de pláásmidos smidos artificiales o VECTORES DE artificiales o VECTORES DE
CLONACICLONACIÓÓNN
1.Combinar en una misma molécula diversos rasgos útiles de los plásmidos naturales como:
La presencia en el plásmido del gen de resistencia permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos
II. Promotores fuertesII. Promotores fuertes
Muchos genes se expresan sólo bajo ciertas circunstancias metabólicas y/o en tejidos específicos
Sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresión
Pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento
pETpET--24 cumple con las caracter24 cumple con las caracteríísticas de un sticas de un vector de clonacivector de clonacióónn
EXISTEN DIFERENTES EXISTEN DIFERENTES VECTORES VECTORES DEPENDIENDO DE LA DEPENDIENDO DE LA LONGITUD DEL GEN DE LONGITUD DEL GEN DE INTERINTERÉÉS POR CLONARS POR CLONAR
EjemplosEjemplos
-Plásmidos-Fago lambda -Cósmidos-Fásmidos (fagémidos)-Cromosomas Artificiales:
Bacterias (BAC)Levaduras (YAC)
PlPláásmidossmidos
Moléculas de ADN circular (generalmente bacteriano) separadas del cromosoma principal y con capacidad de replicación independiente de la bacteria. Tamaño de inserto: 20 kb
Fago LambdaFago Lambda
Es un virus bacteriófago, cuya región central del genoma es prescindible y se puede sustituir por un inserto de ADN.
Tamaño de inserto 10-15 kb.
Se forma un multímero que luego se utiliza para rellenar cápsides del fago mediante empaquetamiento in vitro.
CCóósmidossmidosSon vectores híbridos entre el fago H y un plásmido. Se pueden replicar en una bacteria o empaquetarse como un fago.
Tamaño de inserto hasta 45 kb.
Se remueve casi todo el ADN del H y se deja sólo las secuencias que actúan como señales de empaquetamiento (cos). Casi todo se rellena con el inserto que queremos clonar.
Replicación a modo de plásmido
Otros vectoresOtros vectoresFásmidos: Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso y un plásmido y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido.Cromosomas artificiales: Se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos.
Vector recombinanteVector recombinante
Resulta de la inserción del gen de interés (transgen) en el vector de clonación.
Como insertar el gen de interComo insertar el gen de interéés en s en el vector de clonaciel vector de clonacióónn
Fragmentación del DNA vector DNA de interés (producto de PCR o de
enzimas de restricción) Ligación
Vector en la prVector en la práácticactica Vector recombinante que contiene gen de la β-
lactamasa (transgene)
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