20/1/2015 GuaAmericanThyroidAsociacinparaInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodeloscelulares
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/ 1/133
Ira:
Ira:
Tiroides.01deenero201424(1):88168.doi:10.1089/thy.2013.0109
PMCID:PMC3887458
InformedelGrupodeTrabajodelaAsociacinAmericanadeTiroidesEnfoquesyEstrategiasparaInvestigarlahormonatiroideaEconomayAccin
AntonioC.Bianco, , deGrantAnderson, DouglasForrest, ValerieAnneGalton, BalzsGereben, BrianW.Kim,PeterA.Kopp, XiaoHuiLiao, MaraJessObregn, RobinP.Peeters, SamuelRefetoff, DavidS.Sharlin, S.WarnerSimnides, RoyE.Weiss, yGrahamR.Williams
DivisindeEndocrinologa,DiabetesyMetabolismodelaUniversidaddelaEscuelaMillerdeMedicinadeMiami,Miami,Florida.DepartamentodePrcticadeFarmaciayCienciasFarmacuticasdelaFacultaddeFarmaciadelaUniversidaddeMinnesotaDuluth,Duluth,Minnesota.LaboratoriodeEndocrinologayBiologadelreceptor,elInstitutoNacionaldeDiabetesyEnfermedadesDigestivasydelRin,InstitutosNacionalesdeSalud,Bethesda,Maryland.DepartamentodeFisiologayNeurobiologadelaEscueladeMedicinadeDartmouth,Lebanon,NewHampshire.DepartamentodeEndocrinologadeNeurobiologadelInstitutodeMedicinaExperimentaldelaAcademiaHngaradeCiencias,Budapest,Hungra.DivisindeEndocrinologa,MetabolismoyMedicinaMolecular,yelCentrodeMedicinaGenticadelaFacultaddeMedicinaFeinbergdelaUniversidadNorthwestern,deChicago,Illinois.SeccindeAdultosyPeditricaEndocrinologa,DiabetesyMetabolismodelaUniversidaddeChicago,Chicago,Illinois.InstitutodeInvestigacionesBiomdicas(IIB),espaolConsejoSuperiordeInvestigacionesCientficas(CSIC)ylaUniversidadAutnomadeMadrid,Madrid,Espaa.DivisindeEndocrinologa,DepartamentodeMedicinaInterna,CentroMdicoErasmus,Rotterdam,PasesBajos.DepartamentodeCienciasBiolgicas,UniversidaddelEstadodeMinnesota,Mankato,Minnesota.LaboratoriodeFisiologa,InstitutodeInvestigacionesCardiovasculares,VUUniversityMedicalCenter,Amsterdam,PasesBajos.DepartamentodeMedicinadelImperialCollegedeLondres,HammersmithCampus,Londres,ReinoUnido.Autorcorrespondiente.
Correspondenciadedireccionespara:,AntonioC.Bianco,MD,PhD,delaDivisindeEndocrinologa,DiabetesyMetabolismo,UniversidaddelaEscuelaMillerdeMedicinadeMiami,suite816DominionTowers,1400NW10thAve.,Miami,FL33136,Email:Email:[email protected]
DerechosdeAutor2014,AmericanThyroidAssociation
EsteartculohasidocitadoporotrosartculosenPMC.
Abstracto
Antecedentes:Unconocimientoprofundodelosprincipiosfundamentalesqueregulanlahomeostasisdelahormonatiroideaescrticaparaeldesarrollodenuevosenfoquesdediagnsticoytratamientoparalospacientesconenfermedaddelatiroides.
Resumen:prcticasclnicasimportantesenusohoyendaparaeltratamientodelospacientesconhipotiroidismo,hipertiroidismo,ocncerdetiroidessonelresultadodelosdescubrimientosdelaboratoriorealizadosporloscientficosqueinvestiganlosaspectosmsbsicosdelaestructuradelatiroidesylabiologamolecular.Enestedocumento,unpaneldeexpertosconvocadoporlaAsociacinAmericanadelaTiroideshaceunaseriederecomendacionesrelacionadasconelestudiodelaeconomadelahormonatiroideaylaaccin.Estasrecomendacionesestndestinadasapromoverlanormalizacindeldiseodelestudio,quedebeasuvezaumentarlacomparabilidadylareproducibilidaddelosresultadosexperimentales.
Conclusiones:Seesperaquelaadhesinaestasrecomendacionesdelosinvestigadoresenelcampofacilitarelavancehaciaunamejorcomprensindelaglndulatiroidesylahormonatiroideaprocesosdependientes.
INTRODUCCIN
GuaAmericanThyroidAsociacinparaInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodeloscelulares
* 1, 2 3 4 5 16 7 8 9 7 10
11 7 12
123
456
78
9101112
TIROIDES
Textooriginal
American Thyroid Association Guide to Investigating ThyroidHormoneEconomyandActioninRodentandCellModels
Sugiereunatraduccinmejor
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Refetoff%20S%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gereben%20B%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Simonides%20WS%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bianco%20AC%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liao%20XH%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gereben%20B%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/citedby/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20BW%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peeters%20RP%5Bauth%5Dhttp://www.liebertonline.com/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Galton%20VA%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20BW%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Forrest%20D%5Bauth%5Dhttp://www.liebertonline.com/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Anderson%20G%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Williams%20GR%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kopp%20PA%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peeters%20RP%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Anderson%20G%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kopp%20PA%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liao%20XH%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Williams%20GR%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weiss%20RE%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Forrest%20D%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sharlin%20DS%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Galton%20VA%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Obregon%20MJ%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Simonides%20WS%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Obregon%20MJ%5Bauth%5Dmailto:dev@nullhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weiss%20RE%5Bauth%5Dhttp://www.liebertonline.com/search/advancedhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sharlin%20DS%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Refetoff%20S%5Bauth%5Dhttp://www.liebertonline.com/action/showPreferences?menuTab=Alertshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/about/copyright.htmlhttp://www.liebertonline.com/http://dx.doi.org/10.1089%2Fthy.2013.010920/1/2015 GuaAmericanThyroidAsociacinparaInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodeloscelulares
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OVERLOSLTIMOS150AOS,losinvestigadoresutilizanmodelosexperimentalesdeclulasanimalesylaculturabasadosenhaberlogradodescubrimientosemblemticosquehandadoformaanuestracomprensindelafisiologadelatiroidesylaenfermedad.Apartirdelaidentificacindelestimuladortiroideodeaccinprolongadaparaeldescubrimientodefrmacosantitiroideos,losestudiosdeinvestigacinbsicahanproporcionadolosfundamentossobrelosquesebasannuestrasherramientasdediagnsticoyteraputicosclnicos.DecenasdemilesdepublicacionesindexadasenPubMed(www.pubmed.gov)clulasdecaractersticasoanimalespequeoshicieronhipotiroidismootirotxica.Lasgrandessimilitudesenmltiplesaspectosdelafisiologatiroideaentrehumanosyroedorespequeoshanfacilitadolarpidatraduccindeloshallazgosexperimentalesalmbitoclnico.Almismotiempo,existendiferenciasentreespeciesfundamentalesydebensercuidadosamenteencuentasilosresultadosexperimentalessontenerrelevanciaclnica.
Mientrasqueciertastcnicasexperimentaleshansidoampliamenteaceptadoyadaptadodespusdesuusoenlosdocumentosgeneradosporloslaboratoriosinfluyentes,faltadeestandarizacin,sinduda,hapromovidolaheterogeneidaddelosresultados.Debidoaqueciertasvariablesexperimentalespuedentenernivelesumbralesbiolgicosdesconocidos,faltadenormalizacinpuedeconduciratenerresultadosmuydiscordantesendiferentesestudiosqueexaminanelmismotema.
Parahacerfrenteaestafaltadeestandarizacin,laAsociacinAmericanadelaTiroides(ATA)convocaunpaneldeespecialistasenelcampodelainvestigacinbsicadelatiroidesparadefinirestrategiasdeconsensoyenfoquesparalosestudiosdelatiroidesenroedoresyenmodeloscelulares.Estegrupodetrabajoseencargaderevisarlaliteraturaprimeroparadeterminarquprcticasexperimentalespodranbeneficiarsedelanormalizacinylasegundaparaidentificarlasvariablesexperimentalescrticosqueexigenconsideracincuandolosestudiosdelatiroidesseestndiseando.Lasconclusionesdelgrupodetrabajosepresentanenestedocumentocomo"GuadelaAsociacinAmericanadeTiroidesdeInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodeloscelulares."Las70recomendacionesysuscomentariosqueacompaanaexaminartemasquevandesde"hacerquelasclulashipotiroidismo"a"cmoparaestudiarelhuesotirotxica."Mientrasquelejosdeserexhaustiva,estasrecomendacionessetocanenciertosaspectosfundamentalesdelainvestigacindelatiroidespertinentesparatodoslosinvestigadoresenelcampo.
Cadarecomendacinenestaguapromueveunenfoqueexperimentalenparticularsobrelabasedecriteriosqueincluyenlaprevalenciadelenfoque,contcnicasampliamenteusadasserdadoprioridad,yenparticularsielenfoquesehademostradoqueconducenaresultadosreproduciblesenlosestudiosrealizadosporinvestigadoresindependientes.Debidoaquelascomparacionescientficasdecabezaacabezadelosmtodosexperimentalesenestecamposonprcticamenteinexistentes,estasrecomendacionesnopuedenserclasificadosenfuncindelafuerzadelaevidenciaenlamodadelasguasclnicasdehecho,todosecalificaroncomo"laopinindeexpertos."Almismotiempo,adiferenciadelasguasclnicas,elobjetivoprincipaldeestasrecomendacionesysucomentariosacompaanoesidentificarlamejorprcticanicaHQVtPLVPD,sinoparaanimaralosinvestigadoresaelegirestndarenfoquesporejemplo,evitandolasdosisomtodosdeadministracindelahormonatiroideadetratamientoalazar,quesloserviranparalimitarlacomparacinconestudiosanteriores.
Lanaturalezaprcticadelasrecomendacionesdebeserfcilmenteevidentesparaellector.Estedocumentopretendeservirdereferenciaparalosinvestigadores,ayudndolesatomardecisionesdediseoqueevitenpeligrosconocidosaltiempoqueaumentalanormalizacinenelcampo.Comopartedeesteenfoqueprctico,elcrditodereferenciasedaamenudoalosmanuscritosenlosquelosdetallestcnicossonmsclaramenteoexhaustivamenteexplicado,enlugardelaprimerapublicacindeutilizarunatcnica.Adems,sehizohincapienlosenfoquescontemporneos,enlugardelasestrategiashistricos,detalmaneraqueeldocumentoilustraloqueestactualmentedisponibleparaelestudiocontemporneodelahomeostasisdelahormonatiroidea,elmetabolismo,ylaaccin.EslaposicindelaATAquesedebenrealizarestudiosconanimalesdeacuerdocontodaslasnormasticasaplicablesylosprotocolosdeinvestigacinaprobadosporcomitsdeanimalesinstitucionaleslocales.
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Ira:MTODOSDEDESARROLLODELASRECOMENDACIONES
Administracin
ElConsejoEjecutivoATAseleccionaaunpresidenteparadirigirelequipodetrabajo,yesteindividuo(ACB)identificalosotros14miembrosdelgrupoespecialenconsultaconlajuntadirectivadeATA.Lamembresaenelpanelsebasenlaexperienciaylasaportacionesanterioresalcampodelatiroides.Losmiembrosdelpaneldeclaradositenancualquierposibleconflictodeinteresesenelcursodelasdeliberaciones.LafinanciacindelaguasederivadelaATAyporlotantoelgrupodetrabajofuncionsinapoyocomercial.
Elaborarundocumentotil,elgrupodetrabajodesarrolladoporprimeravezunalistadelostemasqueseranmstilesylaspreguntasmsimportantesqueloscientficosquetrabajanenelcampodelatiroidespuedenplantearenlaplanificacindeunexperimentoointerpretacindelosdatosexperimentales.Cadaunodelos10temassedistribuyaunescritorprimariaqueutilizasuconocimientodelamateria,ascomounabsquedasistemticaenPubMedyGoogleAcadmicoparalasreferenciasprimarias,opinionesyotrosmaterialesadisposicindelpblicoantesdediciembrede2012,paradesarrollarunconjuntoderecomendaciones.Todoslosproyectosfueronrevisadosyeditadosporlasilladecoherenciaydevueltosalosautoresprincipalesdelarevisinenalgunoscasosmltiplesiteracionessellevaronacabohastaquesefinalizlarecomendacin.Unanteproyectodecadarecomendacinfuerevisadoporloscolaboradoressecundarioyterciariodentrodelgrupoquepreparentonceslascrticasadicionales.Estosfueronabordadasporelescritorprimariayenviadosdevueltaalasilla.TodoslosproyectossefusionaronysepublicarnenladireccinwebprotegidodisponiblesloparalosmiembrosdelgrupodetrabajoyoficinaATA.Estedocumentoqueddisponibleparasurevisinperidicaporpartedelgrupodetrabajoengeneral,concrticasysugerenciasenviadasdenuevoalasillaqueactualizaeldocumento.Enunospocoscasos,elpresidentepidiaexpertosexternospararevisarcrticamentelasrecomendacionesespecficasdadassusconocimientosenunreaenfocada.Suscomentariosysugerenciasfueronluegotrabajaroneneldocumentomaestro,ylosaportessonreconocidosalfinaldeesteartculo.
Elpanelestuvodeacuerdoenquelasrecomendacionessebasanenelconsensodelpanel.Deliberacionesdelequipodetrabajosellevaronacaboprincipalmenteatravsdelacomunicacinelectrnica.Tambinhubounaseriedereunionesdelosautoresylasllamadasdeconferenciatelefnica.
Presentacin,AprobacinyRatificacindelasRecomendaciones
LaestructuradenuestrasrecomendacionessepresentaenlaTabla1.Lasrecomendacionesespecficassepresentanenelcuerpoprincipaldeltextoy,enmuchoscasos,desglosadosensubtemasidentificadosporletras.Losnmerosdepginaylatecladelalocalidadsepuedenutilizarparanavegarrpidamentealostemasyrecomendacionesespecficas.
TABLA1.ORGANIZACINDELASRECOMENDACIONESDELGRUPODETRABAJO
Antesdelapresentacininicialdeestasdirectrices,quefueronaprobadasporlajuntadirectivaycomitejecutivodelaATAyposteriormenteenviadasalosmiembrosdelaATAaprincipiosde2013paracomentariosysugerencias.Estaretroalimentacinfueconsideradoenlaelaboracinulteriordeldocumentoquefuepresentadoparasupublicacin.ConposterioridadaldocumentoqueestsiendoaceptadoparasupublicacinenODWLURLGHV,quefueaprobadoporlajuntadirectivaycomitejecutivodelaATA.
EldocumentofinalfueaprobadooficialmenteporlaAcademiaAmericanadeOtorrinolaringologaCirugadeCabezayCuello(AAOHNS),laAsociacinAmericanadeCirujanosEndocrinos(AAES),elColegioAmericanodeMedicinaNuclear(ACNM),AsiayOceanaAsociacintiroides(AOTA),SociedadBritnicadeMedicinaNuclear(BNMS),ThyroidAssociationBritnica(BTA),EuropeanThyroidAssociation(ETA),laAsociacin
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Visindeconjunto
Fondo
Comentario
>$@relacionesestructurafuncin
Ira:
InternacionaldeCirujanosEndocrinos(IAES),ItalianoSociedaddeEndocrinologa(SIE),JapntiroidesAssociation(JTA),SociedadCoreanadecabezayNeckSurgery(KSHNS),AmricaSociedadAmericanadelaTiroides(LATS),SociedadCoreanadeMedicinaNuclear(KSNM)ylaSociedaddeEndocrinologa(TES).
RESULTADOS
>$@Laevaluacindelaglndulatiroides
Estudiosdelafuncindeestructuraderelacindelaglndulatiroides,ascomolosestudiosdelacinticadeyodurodetiroidesydeformacindeimgenesseempleantradicionalmenteparaevaluarlaglndulatiroides.Caracterizacinestructuralesimportanteparaevaluarloscambiosfuncionalestalescomohipoehipertiroidismoyparaevaluarlatransformacindeclulasdetiroidesenunfenotipomaligno(13).Almismotiempo,elestudiodelaformacindeimgenestiroideaeconomayyodurodetiroidessonrelevantesnosloparalosestudiosdelasntesisdelahormonatiroidea,sinotambinparalacomprensindelosefectosdelastoxinasambientales,talescomoelpercloratootiocianatoenlaeconomadelatiroides(47).
Mientrasquelatiroideshumanaconsisteenunaizquierdayunlbuloderechoqueestnconectadosporunistmo,roedorestienendoslbulostiroideosindependientes.Laglndulatiroidesestdivididaportabiquesdetejidoconectivoenlbulos,cadaunodeellosquecontienede20a40folculos,launidadfuncionalbsicadelaglndulatiroides.Elfolculoesunarondaoestructurahuecoalargadorevestidoporunasolacapadeclulasfolicularescbicasoaplanadaspolarizadasquesellenaconcoloidequecontienetiroglobulina.Estrodeadoporunamembranabasalyunaredcapilarricaconaltoflujodesangre(8).Losfolculosnormalmentevarandetamaoconsiderable,ylamorfologadeclulasfolicularesesgeneralmentemontono.Laalturadelasclulasvaradeacuerdoconelestadofuncionaldelaglndula.
Todalaglndulasiempredebeserdiseccionadomientrasqueestunidoalatrqueaeinmediatamentesefijaronconformalinaal10%tamponadaneutraparaanlisishistolgicoeinmunohistoqumico.Hematoxilinayeosina(H&E)tincinesampliamenteutilizadoparaevaluarlostirocitos,mientrasquelatincincidoperidicodeSchifftietiroglobulinaconavidezyseadaptabienaresaltarelcontenidodeprotenafolicularylaestructurafolicular(Fig.1)(8).Lasmodificacionesestructuralesreflejanloscambiosenlaactividadsecretoraqueresultandeladeficienciadeyodo(9),exposicinalfrocrnica(10),otratamientoconfrmacosantitiroideos(11).Algunosparmetrosdelasclulasfolicularescomolaalturasepuedenmedirconmicroscopadeluzusandounacuadrculademicrmetroocular(porejemplo,enunaratade1mesdeedad,laalturadelasclulasepitelialessetratade10 micras)(12).Unepitelioplanoeshipoactivo,mientrasqueunepiteliomayorseobservaenlasglndulasenelqueseestimulalatirotropina(TSH)ylava(10).Elusodeanlisisdeimagensemiautomticacomputarizadoesmsobjetivoyampliamenteutilizado(13).Dichoanlisismorfomtricosdebecentrarseenunadelasseccionescentralesdelatiroides(13)queesrepresentativadetodoellbulo(14).Losdatosobtenidossereducenenmodelosmatemticospredefinidosqueasumenlosfolculostiroideostienenunaformaesfricaylasclulasfolicularessonoctgonosconunabasecuadrada.Estareduccindedatosseobtienenlossiguientesparmetros:mediacircunferenciadelfolculosuperficieyvolumenvolumentotaldeepitelioydecoloidenmerodencleosdeclulasepitelialesvisiblesencadafolculoylaaltura,reasuperficial,yelvolumendelasclulasepitelialesdetiroides,quepuedeserutilizadoparaestimarelestadofuncionaldelaglndulatiroides.As,elndicedeactivacin,expresadaporlarelacindevolumendevolumen/coloideepitelial,aumentaamedidaquelatiroidessevuelvemsactivo,loquereflejaunaumentoenelvolumenepitelialyunadisminucinenelvolumendecoloide(13).MedicindelvolumentotaldeclulasencultivosdetirocitosprimariasolneascelularescultivadasLQYLWURsepuederealizarutilizandomicroscopaconfocaldeescaneolserdespusdelasclulassecarganconoctadecilrodaminaB(15,16
RECOMENDACIN1a
0RUIRPHWUtDGHORVIROtFXORVWLURLGHRVVHSXHGHXWLOL]DUFRPRXQtQGLFHGHODDFWLYLGDGWLURLGHD
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Comentario
).
),* Estructuramicroscpicadelaglndulatiroidesderatn.$conhematoxilinayeosina(H&E)tincin.%cidoperidicodeSchiff(PAS)detincin.Losratonesfueronsacrificados,ylatiroidesdiseccionaron,fijaronenformalinatamponada,yembebidosenparafina.Seccionesdelatiroides
Clulasfolicularestiroideasconcentranyodurodeacuerdoconsuactividad.Aunquelaactividaddelosmilesdeclulasfolicularesdebesersimilardentrodeunaglndulatiroidesdado,hayunagranvariacinentrelasclulasdentrodelamismafolculoyentrefolculos.Asautorradiografaofreceunavisinnicadelaactividaddelasclulasfolicularestiroideasindividuales.
Iseinyectaporvaintravenosa,tpicamentede48a72horasantesdematarelanimal.Glndulastiroidessedisecaronyseprocesaronparalaautorradiografautilizandotcnicasestndar(17,18).Organificacindeyoduropuedeserbloqueadaporeltratamientodelosanimalesconmetimazol(MMI).Experimentosconautorradiografahumano,roedor,yeltejidobociofelinotambinsehanrealizadodespusdexenotrasplantesdetejidotiroideoenratonesdesnudos.Fragmentosimplantadosubcutneamentesemantienenenratonesreceptoresdurantevariassemanasantesdesuposterioranlisis(19).
SIMSesunatcnicautilizadaparaanalizarlacomposicindelaspelculasdelgadasporpulverizacincatdicalasuperficiedelamuestraconunhazdeionesprimariocentradoyrecogeryanalizarexpulsadoionessecundarios(Fig.2).Lasrelacionesdemasa/cargadeestosionessecundariossemidenconunespectrmetrodemasasparadeterminarlacomposicinelemental,isotpicoomoleculardelasuperficieaunaprofundidadde12 nm.SIMSeslatcnicadeanlisisdesuperficiemssensible,conlmitesdedeteccinelementalesquevandesdepartespormillndepartespormilmillones.Esespecialmenteadecuadoparaelestudiodeladistribucindeionestrazaanivelultraestructural(20).
),* MicroscopaelectrnicadetransmisindetiroidesMouse.Lbulostiroideossefijaronenglutaraldehdoal2,5%en0,1 Mtampncacodilatodurante1,5horas,despusdelafijadaen1%detetrxidodeosmiodurante1hora,yseembebieronenresinaLX112(LaddInvestigacinIndustries,Burlington,
Imgenesinicosmuestranqueladistribucinanticipadadeyodoesheterogneadeunfolculoaotro,deuntirocitoaotrodentrodelamismafolculo,yqueestadistribucinvaracomounafuncindetiempo(21).Entiroidesnormaleslonatural Iistoposeencuentrapredominantementeenlaaberturafolicular.Laidentificacindeluminadesprovistade Iy/olademostracindecantidadessignificativasde Ienelcitoplasmadelasclulas
RECOMENDACIN1b
/DDXWRUUDGLRJUDItDVHSXHGHXWLOL]DUSDUDFXDQWLILFDUODDFWLYLGDGJOREDOGHORVIROtFXORVWLURLGHRV\SDUDGHWHUPLQDUODXELFDFLyQGH\RGXURGHQWURGHORVIROtFXORV
125
1cRECOMENDACIN
/DGLVWULEXFLyQXOWUDHVWUXFWXUDOGH\RGXURGHQWURGHORVIROtFXORVGHODWLURLGHVVHSXHGHGHILQLUFRQODHVSHFWURPHWUtDGHPDVDVGHLRQHVVHFXQGDULRV6,06
127
127 127
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/figure/f2/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/figure/f1/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/figure/f1/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/figure/f2/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/figure/f2/20/1/2015 GuaAmericanThyroidAsociacinparaInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodeloscelulares
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Fondo>$@cinticadeyodurodetiroides
epitelialesoenlamembranaapicalindicaundeteriorodelavadeyodacin.ParadefinirladistribucinultraestructuraldeyodurousandoSIMS,lbulostiroideosseprocesanenformasimilaracomoparamicroscopaelectrnica,incluyendolafijacinconglutaraldehdoypreparacindedelgadassecciones(20).
Losanticuerpossondisponiblescontralamayoradelasprotenasclaveenlabiologatirocito(22,23).Porlotanto,lastcnicasdeIHCestndarseutilizancomnmenteenestudiosdetiroides(Figs.3y4)(24,25).Lavisualizacinpuedeserrealizadoconmicroscopadeluzconvencional,microscopadeinmunofluorescencia,omicroscopaconfocalparaunamayorresolucinyreconstruccindelaimagenen2Do3D(26).Protenasyprocesosdelasuperficiecelularseinvestiganmejormediantemicroscopaelectrnicadebarrido(10).
),* Ladeteccindetiroglobulinaytiroglobulinayodadaenlatiroidesratnporinmunohistoqumica.$Latiroglobulinasedetectenseccionesdeparafinautilizandoanticuerpopoliclonaldeconejoantitiroglobulina(Dako)diluido1/1500yseincubarondurantelanoche.
),* Deteccindeladobleoxidasa(DUOX)ytiroperoxidasaenlatiroidesratnporinmunohistoqumica.$DUOXsedetectenlasseccionescongeladasconanticuerpopoliclonaldeconejodiluido1/3000yseincubarondurantelanoche.Lapositividadseobservenelpoloapical
Laactividadperoxidasaendgenaesmuyaltaenlasclulastiroideasysedetectamediantelareaccindeseccionesdetejidofijadasconsustrato3,3'diaminobencidinapretratamientoconperxidodehidrgenoantesdelaincubacinconelanticuerpoprimarioeliminalaactividaddelaperoxidasaendgenaquepuedainterferirenlosestudiosdeIHC.Elusodeprotenasfluorescentesetiquetadodebeserevitadosilaautofluorescenciaesunproblema(talcomoseevalumediantelavisualizacindeseccionesdetejidoconunmicroscopiodefluorescenciaantesdecualquierincubacindelanticuerpo).EstudiosdedistribucinsubcelularBellassepuedenhacerconIHCymicroscopaconfocalmicroscopaelectrnicadetincininmunopermiteladeteccindeantgenosamuyaltaresolucinenlosestudiosdedistribucinsubcelular(Fig.5)(20,27).
),* Ladeteccindetiroglobulinaenlatiroidesratnpormicroscopaelectrnicainmunooro.Despusdellavadoconalbminatamponadaconfosfatosolucinsalinadesuerobovino(PBSBSA1%),ultrafinasecciones(0,1 micras)seincubarondurantelanocheconunconejo
Lasntesisdelahormonatiroidea,sutetrayodadoformatiroxina(T ),y3,3',5triyodotironina(T )requiereunaglndulatiroidesnormalmentedesarrollado,unaingestaadecuadadeyodo,yunaseriedepasosbioqumicosreguladosenclulasfolicularestiroideas,queformanlosfolculostiroideosesfricas,launidadfuncional
1dRECOMENDACIN
/DPLFURVFRStDFRQIRFDOHQFRQMXQFLyQFRQWpFQLFDVGHLQPXQRKLVWRTXtPLFD,+&SXHGHXWLOL]DUVHSDUDGRVRWUHVGLPHQVLRQHV R GHUHFRQVWUXFFLyQGHLPDJHQSDUDHVWXGLDUODH[SUHVLyQGHSURWHtQDVHQORVIROtFXORVWLURLGHRVODUHGFDSLODUTXHURGHD\HOHVWURPD
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delaglndulatiroides(28).Enlasclulasepitelialesdetiroides,elcotransportadoryodurodesodio(NIS)mediaenlacaptacindeyoduroenlasclulasfolicularestiroideas(29),ysuexpresinestpolarizado(esdecir,quesloseexpresaenlamembranabasolateral).Enlamembranabasolateraldelostirocitos,Na /K ATPasageneraungradientedesodioquepermiteNISparamediarinhibirseperclorato,Na dependientedelacaptacindeyodo(30).Elyodurosetranslocaalamembranaapicalyalcanzaellumenfoliculartravsdelamembranaapical.Sibiensehasupuestoqueelyodurosemueveatravsdelamembranaapicalprincipalmentedebidoalagradienteelectroqumico,losestudiosenlaseccindecongeladosdemostraronqueseacumulaprimeroenelcitoplasmayslomstardeenellumen,yyodurodeeflujoapicalseacelerarpidamenteenlasclulaspolarizadasdespusexposicinaTSH(31).Losestudioselectrofisiolgicosusandoinvertidasvesculasdemembranadeplasmasugirieronlaexistenciadedoscanalesapicalesdeyoduro,perosuidentidadmolecularnosehadeterminado(32).Elaninmultifuncionalintercambiadordependrin(SLC26A4/PDS),quetieneafinidadporanionestalescomoyoduro,cloruro,bicarbonatoysecreequerepresentanunadeestasentidades(33,34).TantoNISyexpresinylaactividadSLC26A4seincrementanporlaTSH(30,33).MientrasquelacaptacindeyodotrminopuedeserutilizadoampliamenteparaLQYLWUReLQYLYRenfoques,interpretacindedatosdebetenerencuentalasdiferenciascrticasentrelosdosajustes,conelanteriorreflejalacaptacindeyodocelularyelltimoprincipalmentelaconcentracindeyodoorganifiedenelcoloide.
Medicindelaabsorcindeyoduroydeflujodesalidaenlasclulasnopolarizadosesrelativamentesencillo.Elestablecimientodesistemasdeclulaspolarizadasrequiereelaislamientodeclulasprimariasotransfeccinotransduccindeclulasheterlogaspolarizadasyladocumentacindelaformacindemonocapaintacta,quesontediosoyconsumemuchotiempo(31).Paralosensayosdecaptacindeyoduro,lasclulasseincubaronenunasolucindeabsorcinquecontienetpicamente10 MNa Iporunperododetiempodeseado.OrganificacinpuedeserbloqueadaporeltratamientodelasclulasconMMI.Elcontenidodeyodurointracelularsedeterminamediantelamedicindeyoduroderadiomarcadoenloslisadoscelularesusandouncontadorgammadespusdelalisiscelular.Losresultadosseexpresancomocuentasporminutoporpocilloo,idealmente,pormicrogramodeADN.Lacantidadgravimtricadeyodurointracelularmenteacumulada(ADNpmol/mg)tambinsepuedecalcularsobrelabasedelaactividadespecficadeltrazador.Losmtodosalternativosquesehanutilizadoincluyenelusodeinactivadoresdehaluro.Unproblemaconesteenfoqueesqueestosinactivadoresnosonespecficosparayoduro,perotambinreaccionanconotroshaluros.Ladisponibilidaddeunaumentodeprotenafluorescenteamarilla(EYFP)modificadoH148Q/I152Lconaltaafinidadporelyodurohapermitidoelseguimientodeafluenciayyodurodeeflujoconrelativamentebuenaprecisinyunaltogradodecorrelacinconlasmedicionesdirectasdeyoduroderadiomarcado(3537).Alternativamente,laespectrometrademasassehautilizadoparaestudiarlaabsorcindepercloratoenFRTL5clulas,quetambinestmediadaporNIS(38).
UnnmerodemodeloscelularesyconfiguracionesestndisponiblesparaestudiareltransporteNISmediadaporyodurode(46,31,33,3941),incluyendomltipleslneascelularesheterlogasqueexpresantransitoriamenteNIS(29,42).TalesestudiossontilesparalacaracterizacindelafuncindeNISylasactividadesdeorigennaturaloprotenasmutantesartificiales(29,42).Porejemplo,sontilesparamedirelestadodeequilibrioylavelocidadinicialyodurodeabsorcin,ascomolosparmetroscinticosdetransportedeyoduromediadaporNIS.LacaptacindeyodurotambinhasidoestudiadoenlneascelularesdecncertransfectadasotransducidasconconstruccionesenlasqueelADNcdeNISestbajoelcontroldepromotoresespecficosdetejidoconelobjetivodepromoverlacaptacinde Iyparainducirlamuertecelularatravsdesuemisinbeta(43,44).ParalosestudiosqueevaluaronelefectodelaTSH,elmediousadoparacultivarclulastiroideassecambiaalosmediosde
+ +
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RECOMENDACIN2a
%DVRODWHUDODEVRUFLyQGH\RGXURGHHIOXMRFHOXODU\DSLFDOGH\RGXURSXHGHQVHUHVWXGLDGRVHQPRQRFDSDVGHFpOXODVSRODUL]DGDVFXOWLYDGDVHQPHPEUDQDVSHUPHDEOHVVHPLTXHIRUPDQXQVLVWHPDGHGRVFiPDUDVRHQPRGHORVGHFpOXODVQRSRODUL]DGRVWDOHVFRPRODVOtQHDVGHFpOXODVGHWLURLGHV)57/RGHUDWD3&&/
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TSHprivadoparavariosdasyluegopresentadoalasdiferentescondicionesexperimentales.
ParaestudiaryodurodeeflujoLQYLWUR,lasclulassecargancon Idurante12horasyposteriormentetratadosconpercloratoelfindebloquearlacaptacindeyodurodeporNIS.Elflujodesalidapuedeentoncesserestudiadoporlarecogidadelossobrenadantesenunoomltiplespuntosdetiempo(5).Elcontenidointracelulardeyodurotambindebedeterminarseenunoomltiplespuntosdetiempo.Otraestrategiaesutilizarunsistemadedoscmaras,enlaqueelflujodesalidadeyoduroenlamembranaapicalsepuedemedirporrecogiendoelsobrenadanteenunoomltiplespuntosdetiempo(31,40).Medicindeyodurodirectamenteconelectrodosselectivosdeionesenlossobrenadantesdelisadoscelularesoesproblemticodebidoaqueestassondasnosonespecficosparayoduroytambinreconocenotroshaluros,talescomocloruro.
FlujodesalidadeyoduroradiactivoporelSLC26A4canaldeaniones(pendrin)ocualquierotrocanaldeanionestambinpuedeserestudiadoenmltipleslneascelularesheterlogasqueexpresantransitoriamenteNISquepermitelacaptacindeyodoinicial(3,40).EstopuedeserdocumentadoporlamedicindelcontenidodeyodurointracelularenlasclulascoexpresindeNISyelcanaldeinteresesconlacomparacindirectadelasclulasquesloexpresanNIS.UnsistemamodeloqueesadecuadoparatalesexperimentoseslalneacelularderincaninoMadinDarbypolarizado(40).Latransfeccindeestasclulasesmuyineficienteyestopuederequerirelestablecimientodelneascelularesqueexpresandeformaestableotransduccinviralconvectoresapropiados.Porotraparte,eleflujosepuedeseguirusandoEYFPH148Q/I152Lcomounindicadordelaconcentracindeyodurointracelular(3537).
Tiroidescaptacindeyoduroradioactivo(RAIU)yotrosaspectosdelacinticadeyodopuedenserestudiadosenroedoresutilizandodiferentesistoposdeyodo,mscomnmente I,queseinyectaporvaintraperitoneal(210 Ci I).Laglndulatiroidesestestudiposteriormenteendiferentespuntosdetiempo,yaseaconunasondagamma(utilizado,porejemplo,paralaidentificacindetejidoparatiroideoencirugamnimamenteinvasiva)bajoanestesia(45,46)opostmortemdiseccionadoconlatrqueaHQEORTXHbajounmicroscopioyseprocesaronpararadiometradurante1minutoenuncontadorgamma.Losresultadossepuedenexpresarcomounafuncinde Ienelsuero(47)ocomoporcentajedeladosisinyectadatotal(46).TiroidesRAIUalcanzaunmximoaaproximadamente4horasdespusdelaadministracinde Iymesetasenalrededorde12horas(48).Estossonlospuntosdetiempoaproximadosquepuedenvariarsegnlaespecieylacepadelroedorbajoinvestigacin.Momentodela deinyeccinquepuedesercoordinadoconlainyeccindeTSHbovina(bTSH10 mU)paraevaluartiroideaRAIUlainducidaporTSH.EnalgunoscontextosestilparasuprimirlaTSHendgenaporelpretratamientodelosanimalesconT durante4dasantesdelaadministracinderadioistopos(48).EstominimizarlaposibilidaddequeTSHendgeno,quepuedeserdiferenteentredosgruposdeanimales,estinterfiriendoconlarespuestaabTSH.Enparticular,unestudiocomparativoenratasyratonesutilizandotirotropinahumanarecombinante(rhTSH)indicaqueesmuchomsimportanteparatratarpreviamenteconT ysuprimirlaTSHendgenaenratasqueenlosratones(49).
2bRECOMENDACIN
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Fondo>$@imgenestiroides
Lapruebadepercloratopermitelacuantificacindelacantidaddeyodurodequenormalmenteseunealatiroglobulina(50).LapruebasebasaenelhechodequeelyodurosetransportaalasclulastiroideasporNIS,luegoseliberaenellumenfoliculardondeserpidamenteunidocovalentementearesiduosdetirosilodelatiroglobulina(organificacin).LosanionestalescomopercloratoinhibenNIS,ycualquieryodurodeintratiroideoquenohasidoincorporadoalatiroglobulinaseliberarpidamenteeneltorrentesanguneoenlamembranabasolateralynopuedensertransportadosdenuevoentirocitos.Enlapruebadepercloratoestndar,losrecuentostiroideassemidenaintervalosfrecuentesdespusdelaadministracindeyodoradiactivoconelfindedeterminarlaabsorcinenlaglndulatiroides.Despusdedocumentarlaabsorcin,percloratoseadministraporvaintravenosaointraperitoneal,ylacantidaddeyodoradiactivointratiroideosemideaintervalosfrecuentes.Encondicionesnormalesdeorganificacinyoduro,nohayunadisminucinsignificativaenelrecuentodeintratiroideos.Encontraste,unaprdidade10%indicaundefectoorganificacin,quepuedeserparcial(10%90%)ocompleta(>90%).
Enratones,percloratodesodio(NaClO )seinyectaporvaintraperitoneal1horadespusdelainyeccinde Iporvaintraperitoneal,ylosanimalessematan1horamstarde(47).Laradiactividadquequedaenlaglndulatiroidesdelosanimalestratadosconpercloratosecomparaconel Icaptacinmedidoenlasglndulasdelosratonesdecontrolquenofueronexpuestosalapersecucinyoduroinducidaperclorato.Unidaaprotenas I(esdecir,eltotaldelashormonastiroideasradiactivounidosaprotenasdetransportedesuero)sedeterminaentodaslasmuestrasdesangredespusdecidotricloroactico(TCA)precipitacin(47).Otroshansidocapacesderastrearlacaptacindeyodoyladescargaenratonesutilizandodirectamentesondasgamma(45).Elpercloratodepotasio(KClO )sehautilizadoenratas618horasdespusdelainyeccinde Iysemuestraparareducirel Itiroides/ratiodesangrecuandoseinhibelaperoxidasatiroidea(51,52). tomografaportomografadeemisindepositronesI/computarizado(PET/CT)sehautilizadoparaevaluarlaabsorcinraravezyladescargadeyoduroentiroidesderoedoresLQYLYR(53).
EstaestrategiaseutilizaparaevaluarLQYLWURlasecrecintiroideainducidaporTSH,loqueminimizalainterferenciadeotrosHQYLYRfactores(20).Losratonesrecibenunainyeccinintraperitonealdeaproximadamente30 Cide Iy24horasdespusdelatrqueaylaglndulatiroidesseeliminanHQEORTXHyseincubdurante3horasenunmediodebicarbonatodeKrebsRingerquecontienen0,5 gdealbminadesuerobovino/L(BSA),8mMglucosay10 MNaClO paraevitarlarecirculacindeyoduro.RadiomarcadohormonatiroideasecretadaLQYLWURseextraeconbutanol(54).Lasecrecinseexpresacomounporcentajedelaradiactividadtotaleneltejidoaliniciodelaincubacin.Hayunainduccindeaproximadamente10vecesenlasecrecintiroideaconlaadicinde5mU/mldeTSH(20).
Imgenesdelatiroidesenroedorespequeoshaseguidolastcnicasdesarrolladasparalossereshumanos,comolaexploracinconistoposdeyodo,microPET,CT,yultrasonidodealtafrecuencia(HFUs).Sinembargo,eltamaodelaglndulaminutossigueplanteandounretoimportanteparalaobtencindeimgenesdealtaresolucindealtacalidad,quehasidoparcialmentesuperadoporlanuevatecnologareciente.
7LURLGHV\RGXURRUJDQLILFDFLyQVHSXHGHFXDQWLILFDUDWUDYpVGHODSUXHEDGHGHVFDUJDGHSHUFORUDWR
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3cRECOMENDACIN
&LQpWLFDGHODVHFUHFLyQWLURLGHDSXHGHQVHUHVWXGLDGRVLQYLWURXWLOL]DQGRODUHVHFFLyQHQEORTXHGHODWUiTXHD\ODWLURLGHV
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RECOMENDACIN4a
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Iy Isepuedeutilizarjuntoconunacmaragammadeimgenesplanas,ascomolatomografaporemisindefotones(SPECT)estudios. Itieneunavidamedialarga(8das),perosualtaenergaproduceimgenesdemalacalidad.Encontraste,labajaenergaemisor Iesideal,produciendogammagrafastilesconunadosisbajaabsorbidalasprincipaleslimitacionessonelresultadodesucortavidamedia(13horas).Lagammagrafadetiroidesenratasanestesiadastambinsepuederealizar124horasdespusdeunainyeccinintraperitonealde10 Ci IusandoSPECT(46).Imagingsemejorasustancialmentemediantelacolocacindelosanimalesenunadietabajaenyodo(LID)duranteaproximadamente3semanasantesdelosestudios(46).EstomejoralaRAIUtiroides4horasdesdealrededorde3,5%a27%yhacequelagammagrafadetiroides,entodoslostiemposdeadquisicin,msbrillanteymsdetallada(46).SPECTenratonesutilizando Tco Tambinhesidoinformado(55,56).
EstudiosdePETdelatiroidesusando meproducenbuenacalidaddeimagen,conunavidamediarazonable(4das).LasensibilidaddelaPETesmayorqueladeunacmaradecentelleo,ascomoelcontrasteylaresolucinespacial(53).Paraimgenesdetiroidesprecisaenratas,lacombinacindemicroPETymicrotomografaaxialcomputarizadacon esnecesarioI(Fig.6)(57).Ratasadultasanestesiadasoratonesseinyectanatravsdelavenadelacolacon20a540 CideNa IyescaneadosenelmicroPETdurante40minutosa24,48,y72horasdespusdelainyeccinbajoanestesia.Losdatosdeimagenresultantessenormalizaronalaactividadadministradaentrminosdelporcentajedeladosisinyectadaporgramodetejidos(Fig.6B).Regiones2Dextradasmanualmentedeintersovolmenes3Ddeinterssepuedenutilizarparadeterminarelreayelvolumentiroideo.Porejemplo,elvolumendelatiroidesdeunadulto400500 gratavaraentre35y70 l(57).Ademsdelaglndulatiroidesens,esteenfoquetambinsehautilizadoparametstasisdeimagendecncerdetiroidesenratones(58).
),* Imgenesdelatiroidesusando IyoduroLQYLYR.$biodistribucinde
Iyoduroenlatiroidesderatonesmodificadosgenticamenteenlosquelacaptacindeyododelatiroidessesuprimeporinduccindeuntransgn1semanadespusdesupresinsealiviaylacaptacindeyodosenormaliza.
HFUs(20100MHz)esunametodologadeformacindeimgenesqueseextiendelaLQYLYRlavisualizacindelaresolucinmicroscpica(delordende100 micrasFig.7)(59,60).LaglndulatiroidesdeunratnpuedeserexaminadausandounsistemadeMicroImagingquetieneunasolasondaelementodelafrecuenciacentralyunrangodinmicode52 dB.HFUsserealizabajoanestesiageneral(porejemplo,1,5%2%deisofluranovaporizadoenoxgeno)enunescenariocalentado.Furseretiradelazonadeinters(cuelloylaaltatrax)paraobteneruncontactodirectodelgeldeultrasonidoalapieldelanimal,reduciendoalmnimolaatenuacindeultrasonido.Formacindeimgenesentiemporealsepuederealizarconunavelocidadde20 Hz(correspondienteaunaresolucintemporalde50milisegundos)elcentrodelatiroidesderatnsecolocaalrededorde6 mmdelazonafocaldeltransductor.Elestudio,queincluyemedicionesyadquisicindeimgenesprecisas,repetiblesydealtacalidad,sepuedecompletarenunos30minutosenlasmanosdeunoperadorbienentrenadoycapacitado(61).
),* Ecografadealtafrecuencia(HFU)delatiroidesratn.$imagenrepresentativadelatiroidesderatnusandoHFUsysucorrelacinanatmica
DGTXLVLFLyQGHLPiJHQHVHQXQDFiPDUDJDPPDRDWUDYpVGHPLFUR3(7&7
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99m 123
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RECOMENDACIN4b
0LFUR,PDJLQJPRUIROyJLFDGHODJOiQGXODWLURLGHVVHSXHGHUHDOL]DUSRU+)8
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Visindeconjunto
>%@Suero
con%imgenestransversaleshistolgicasdelasregionessubhyoidytraqueales.Estructurasvisiblesincluyen:1,
Elvolumendecadalbulosepuedecalcularutilizandolafrmulaovoide(anchuraxprofundidadxlongitudx/6)(61).ElvolumendelatiroidesdeunadultoratnC57BL/6oscilaentre2,1y4,9 l.En6npropil2tiouracilo(PTU)tratadaconratonesnobociodifusoconvolmenesqueoscilanentre4,1y8,8 l.Losndulostiroideospuedenserdetectadosatravsdeestametodologa,as,conelndulodetectablemspequeoquepresentaundimetrode0,46 mm.Caractersticassugestivosdemalignidadtambinpuedenidentificarsecomohipoecogenicidadrelacinconeltejidonormaladyacente,losmrgenesmaldefinidos,microcalcificacionesinterna,formasirregulares,ylaextensinextraglandular(61).Estodeberasertilenlacaracterizacinfenotpicademodelosderatndecncerdetiroides.
>%@Laevaluacindecirculacinydeltejidonivelesdehormonasdelatiroides
"Estadodelatiroides"deunorganismoeslasumadetodosloseventosdesealizacindelahormonatiroideaydependetantodelosnivelescirculantesdelahormonatiroideaydefactoreslocalesqueinfluyenenlaconcentracinnucleardehormonatiroideaentejidosespecficos.Latirotoxicosiseselsndromeclnicoasociadoconelexcesodehormonatiroidea,mientrasqueelhipotiroidismodedeficienciadelahormonatiroidea.Almismotiempo,lostejidosindividualespodrandicequetieneelestadodeltiroidesespecfica,esdecir,hipotiroidismootirotxica,relativamenteindependientedelosnivelessricosdehormonatiroideaestoesdebidoalasactividadesdesyodasasespecficosdetejidoy/omecanismosdetransporte(Fig.8).Porejemplo,laisquemiaylahipoxiahacenqueelcerebroyelcoraznparaponersemuyhipotiroidismoenunanimaldeotramaneraeutiroideodebidoalainduccindetipoIIIdeiodinasa(D3)expresin(6265).Almismotiempo,eltejidoadiposo(BAT)presentamarrnlocalizadosaumentodelahormonatiroideadesealizacinpocodespusderoedoressemuevenalfrodebidoalainduccinagudadetipoIIdeiodinasa(D2)expresin(66).
),* SuministroyelmetabolismodelashormonastiroideasafectannegativamenteypositivamenteT genesregulatedenelcerebro.Paraconstruirestafigura,losautoresutilizaronlapolimerasadetranscriptasainversacuantitativareaccinindividualcadenadedatos(RTqPCR)deT regulated
Unaformacomndeevaluarelestadodeltiroidesdeunorganismo,elestadodeltiroidesakasistmica,esmediantelamedicindelosnivelessricosdelahormonatiroidea(T yT )yTSH,asrevertirT tambinsepuedemedir,peroporlogeneralsereservaparasituacionesespecialesparaconfirmaranormalidadesenelmetabolismodelahormonatiroidea.Estadodelatiroidesespecficadetejidosepuedecaracterizarmediantelamedicindirectadelosnivelesdehormonastiroideastejido.Porlogeneral,lamedicindelaexpresindeT responsivegenes(vaseODVHFFLyQ,)y/oT responsiveparmetrosbiolgicos(vaseOD6HFFLyQ-)estambinpartedeltrabajoparadefinirelestadodeltiroides.
Aligualqueconlosensayosclnicosdesarrolladosparalospacientes,unnmerodeinmunoensayosparalaT ,TyTSHhansidodesarrolladosespecficamenteparalosroedores,quetienenencuentalasdiferenciasdetiposycapacidaddeyodotironinasueroprotenasyespecificidaddeespeciedelamolculadeTSHvinculante.Engeneral,estosensayosfuncionanbienypresentanlasuficienteprecisinparaevaluarlafuncindelatiroidesyelestadodeltiroidessistmicaenroedores.Encircunstanciasexperimentalesodefectosgenticosespecficos,losnivelessricosyodotironinanosiempresonrepresentativasdelahormonatiroideadesealizacineneltejidooelnivelcelular.Enestoscasos,elestadodeltiroidespuededeterminarsemediantelamedicindeT concentracioneseneltejidooclulasespecficasmediantelaadaptacindelosinmunoensayosdesarrolladosparalasmedicionesdesuero.
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Losnivelesdehormonastiroideasensueropuedenvariarsustancialmenteenfuncindelsexo,laedad,ylacepadelroedorydebensercontabilizadoseneldiseodelestudio.Losniveleselevados(comosedefineentrelosrangosnormalesajustados)suelenindicarhipertiroidismo,mientrasquedisminuyeronlosnivelessricossonindicativosdehipotiroidismo.Ladeficienciadeyodo,alteracionesenelmetabolismodelahormonatiroidea,ascomolasensibilidaddelhipotlamoylahipfisisalahormonatiroideapuedealterarlarelacinrecprocacuantitativaentresuerodeT ,T ,yTSHcomoesamenudoelcasoenlosmodelosderesistenciaalaTSHuhormonatiroidea.
LosinmunoensayosfuerondesarrolladoshacedcadasyhanservidocomopiedraangularparamediryodotironinassueroyTSH.Sinembargo,estosensayosoriginaleshansidosustituidosengranmedidaporlosinmunoensayosmsrecientes(porejemplo,enzimadeensayodeinmunoabsorcinligado[ELISA],ensayoradiomtricoinmune[IRMA])estndisponiblescomercialmente,todosloscuales.Elusodekitsdisponiblesenelmercadoparamediryodotironinassueroenroedoresnoessencilladebidoaquemuchosdeestoskitssedesarrollanparaelsuerohumanoyhacenusodeunamatrizartificialparaimitarprotenasdeuninhumanosconmayorafinidadycapacidadquelosdelosratonesoratas.Estoskitsutilizan"agentesdedesplazamiento"paradesplazarelyodotironinasdelaglobulinafijadoradetiroxinahumana(TBG,porejemplo,8anilinonaftalencidosulfnico,difenilhidantona,cidosaliclico)queseutilizaconfrecuenciaenexceso(paraelratn).Aesterespecto,interfierenmsconT aT ,yenparticularcuandoelsueroT valoressonbajos.Estoslosepuedecorregirapropiadamenteparamedianteelusodesueroderatniodothyroninedeficientecomoenblancoylaconstruccindeunacurvaestndarquecalibrarelensayoporejemplo,suerodeemparejadogencuadro8(3D[)knockout(KO)losratonesnotratadosconT oT durantealmenos2meses(67).LaslimitacionestcnicastambinrequierenlautilizacindesueroderatnTSHenblancoydeficienteparalapreparacindeunacurvaestndarconTSHdesueroderatn,noTSHhipofisaria,comoestndar(68).Lquidoespectrometrademasas/cromatografatndemtambinseestconvirtiendoendisponible,aunquesuaplicabilidadparalosroedoreseslimitadaporquelosvolmenesdesuerorequeridossontodavademasiadogrande.
Curvasestndartpicassepreparanenelrangode2,5a240 ng/mLparaT y0,16 ng/mLparaT .Estosensayossepuedendesarrollarenlacasamediantelamodificacindekitsparausohumanoobtenidoapartirdemltiplesfuentescomerciales.RIAshechasencasatienenunamayorsensibilidadconlasmedicionesenelrangode0,053 ng/mL(67).Ensayosclnicosdesarrolladosparalospacientespuedenserutilizadossiempreycuandolacurvaestndarderoedoresesparalelaalacurvaestndarproporcionadoenelkityunfactordecorreccinadecuadoaplicadolacurvaestndarderoedoressedebeutilizarparacalcularlosresultados(67).ComercialmentedisponibleskitsdiseadosparalamedicindesueroderatnT yT en10 muestrasmulsehandesarrolladoyutilizadoconresultadosaceptables(69).
Muestrasdesangrefrecuentespuedenserobtenidosduranteelcursodeunexperimentosiselimitaaaproximadamente10%delvolumentotaldecada24semanasy1%cada24horas.Serumsepuedealmacenara20Cduranteperodosdetiempolargos.Elusodelaanestesiapuedetenerefectosvariablesenlosnivelesdehormonatiroidea,ycadainvestigadordebeevaluarlosefectospotencialesensusistemaconlaanestesiaqueestnutilizando.
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6pULFDWRWDO7 \7 FRQFHQWUDFLRQHVSXHGHQVHUPHGLGRVSRUUDGLRLQPXQRHQVD\R5,$RXQDVHULHGHRWURVLQPXQRHQVD\RVWDOHVFRPR(/,6$R,50$VLHPSUHTXHODVFXUYDVGHFDOLEUDFLyQVHSUHSDUDQFRQVXHURGHURHGRUHVGHVSRMDGRGHODKRUPRQDWLURLGHD
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5bRECOMENDACIN
/RVHQVD\RVSDUDPHGLU7FLUFXODQWHV \7 VHUHDOL]DQPHMRUXWLOL]DQGRVXHURHQYH]GHSODVPD\DTXHODIRUPDFLyQGHILEULQDDIHFWDSLSHWHR\DGLWLYRVWDOHVFRPRODKHSDULQDSXHGHLQWHUIHULUGLUHFWDPHQWHFRQODGHWHUPLQDFLyQGHKRUPRQDV
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SueroT yT exhibenmnimasvariacionescircadianasalolargodelosciclosdedaynocheestospodransertomadosencuentaenfuncindelmomentodelarecogidademuestras.Lasmuestrasdesueroconaspectolechosodelactantespresasodesuscraspuedendarresultadoserrneosdebidoasualtocontenidodelpidos.Enestoscasoslaextraccindelsueroylaeliminacindeloslpidosusandocloroformoesrecomendable(67).
LaexistenciadeprotenasenelsueroqueseunendeformareversiblelahormonatiroideaestablecedospiscinascirculantesdeT yT (esdecir,unidoaprotenaylibre).Laprotenasdeuninprincipalcirculantedealtaafinidaddelahormonatiroideadifierenenroedoresysereshumanos,contranstiretinasiendolaprincipalprotenaenlaratayTBGenlossereshumanos.Eslahormonatiroidealibreenelplasmaqueestenequilibrioconlostejidosyafectaalasealizacindelahormonatiroidea.Lamedicindelahormonalibreporprocedimientosdistintosdedilisisdeequilibriopuededarresultadoserrneos,aunquemicrofiltracindelasmuestrassehautilizadoconresultadosconfiables(70,71).EquilibriodedilisisdesuerocontrazadormarcadoyodotironinaenbolsasdedilisissehautilizadoparamedirlaTlibre yT enlarata.Elmtodonoseutilizaparalosratones,debidoalrequisitodemsde1 mldesueroparalamedicinportriplicadoporqueamenudoseproducenfugas.Elusodesuerodiluidoyaplicarlacorreccinnoesaconsejable.Slo100 ldesueroserequierecuandoseutilizalamicrofiltracindelasmuestras(70).
Alternativamente,unaestimacindelaFT IoFT Isepuedenobtenerusandounvolumenrelativamentepequeodesueromedianteelusodelaresinaocarbnmtodos(72).Elsuerosediluyeensolucinsalinatamponadaconfosfato(PBS,pH7,4)quecontena[ I]T o[ I]T .Lasmuestrassedejaronequilibrarymezclanposteriormenteconunasolucindecarbnvegetalactivado0,0125%.Seobtienengrnulosdecarbnydespussecontaronenuncounter.Lascondicionesdebenseroptimizadosdetalmaneraqueaproximadamenteel20%30%deltrazadorseuneacarbnenlossuerosdelosanimalesdecontroleutiroideo.UnaestimacindelaTlibre oT(FT IoFT I)sepuedecalcularmultiplicandoeltotaldeT oT concentracinsricadelaT oT captacindecarbn.
Losinmunoensayosparalamedicindelahormonatiroideapuedensufrirdemalaespecificidad.Comoalternativa,lamedicinsimultneadeT yT sepuedelograrmedianteelusodeistoposdedilucinespectrometrademasastndemdentrodeunasolacarrera(67,73).Elmtodorequiere100 ldesueroyimplicalaadicindepatrninterno,precipitacindeprotenasconmetanolylainyeccinenunacolumnaC18.T yT seeluyenposteriormenteusandoungradientedemetanol.Estemtodoespreciso,especficoypreciso(coeficientedevariacinde3,5%9,0%).Unapreocupacineselvolumendemuestranecesarioparaladeterminacindelahormonalibre,quetodavaesrelativamentegrandeparaaplicacionesqueimplicanratones,exceptoenelsangradoterminal.Metodologasimilaraplicandocromatografalquidaespectrometrademasasentndemsehadesarrolladoparalamedicindeiodothyronamines,unayodotironinadescarboxiladopresenteenunacantidaddefluidosbiolgicos(74).
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5cRECOMENDACIN
/DVGHWHUPLQDFLRQHVGHORVtQGLFHV\RGRWLURQLQDJUDWXLWDV)7 ,\)7 ,HQHOVXHURVHSXHGHQORJUDUPHGLDQWHODPHGLFLyQGHODFRQFHQWUDFLyQGHKRUPRQDWRWDOHQVXHUR\ODFDSDFLGDGGHXQLyQ\RGRWLURQLQDVXHURXWLOL]DQGRXQRGHORVPpWRGRVGHUHVLQDRFDUEyQ
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5dRECOMENDACIN
LOXFLyQGHLVyWRSRVGHHVSHFWURPHWUtDGHPDVDVHQWiQGHPVHSXHGHXWLOL]DUSDUDPHGLU7 \7 HQPXHVWUDVELROyJLFDV
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RECOMENDACIN6a
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Engeneral,losacuerdosdeintegracinregionaldeTSHsonmssensiblesqueAMIR.Ensayoscomercialesnoproporcionanespeciesreferenciacruzadaespecficay,porlotanto,lascurvasdecalibracinsonraramenteparalelosalosvaloresobtenidoscondilucindelamuestrareal.Sinembargo,reactivoscomercialessepuedenadaptarparamedicionesespecficasyprecisasdeTSHcomosedescribeacontinuacin.
CurvasestndardeTSHdebenconstruirseutilizandoespeciesespecficasdecirculacin(suero,nopituitaria)estndardeTSH,diluidoensueroTSHdeficienteobtenidoapartirdelamismaespecie.EstndardeTSHsricaseobtienedeanimalesprestadoshipotiroidismo(vaseOD6HFFLyQ( ).ElcontenidodeTSHestcalibradocontraunestndarbTSHenunbioensayo.SueroTSHdeficientesepreparahaciendoroedorestirotxicos(tratamientocon20mgdelevotiroxina[LT ]/100 gdepesocorporal[BW]/dadurante1semana).NonparallelismmuestraconlascurvasdecalibracinsedebealasdiferenciasentreespeciesydereactividadcruzadaconsubunidadesdeTSHlibresyotrasglicoprotenaspituitariasenextractosdepituitaria.ElusodelalactoperoxidasaparaetiquetarTSHcon ImejoralaestabilidaddelaTSHmarcadaylasensibilidaddelensayodeTSHhastatirotxicarangos(68).MedicindelaconcentracindeTSHenlosextractosdelaglndulapituitariasepuedehacer,sinembargo,utilizandoelmismoensayoaunadilucinde1:500a1:2000entampndeensayo.Lacurvaestndartambinsepuedeconstruirusandotampn,enlugardesueroderoedoresTSHdeficiente,comodiluyente.EjecucindelosRIAsendesequilibrio(adicindeltrazadorisotpicoduranteuntiempomscortodespusdelaincubacindelanticuerpoTSHconlasmuestras)mejoralasensibilidaddelensayo.SinohaymedicinfiableTSHdesueroderata/ratnestdisponible,losnivelesdemRNATSHenlaglndulapituitariapuedenserutilizadoscomounaindicacindelaproduccindeTSH(75).
ActividadbiolgicadeTSHesmoduladaporunnmerodefactoresincluyendosuestructura,glicosilacinoramificacindehidratosdecarbono,ascomoporelreceptordeTSH.LaactividadbiolgicadelamolculadeTSHpuedeserdeterminadoporunLQYLWURbioensayousandoclulasdeovariodehmsterchinoqueexpresanestablementeelreceptordeTSH(68,76).Elsubclncl213deJP2626esparticularmentesensibleabajosnivelesdeTSH.Acercade50000clulassesembraronentubosdeensayoindividualesyseincubaroncon20 ldesuero,seguidodeextraccinconcAMP0,1 MHClylamedicinporRIA(77).LosespaciosenblancoseprocesancomoyasehadescritoconsueroTSHagotadoobtenidoapartirdeT tratadaconratones.laproduccindecAMPesunafuncindelacantidaddeTSHendgenafuecontenidaenlamuestradeplasma(68).DividiendoelcAMPgeneradoLQYLWURporlosvaloresdeTSHenlamuestradeplasmaproporcionaunndicedelaactividadbiolgicadeTSH.Porsupuesto,estopuedevariardeacuerdoconlasmutacionesenlamolculadeTSHogradoytipodeglicosilacinoramificacindehidratosdecarbono.Sinembargo,estoscambiosnosiemprepuedenmostrardiferenciasbiolgicasutilizandoLQYLWURpruebas.Laalteracinenlaglicosilacindeprotenasolaestructuraterciaria(hidratosdecarbonoderamificacin)delresiduodeazcar,alteralavidamediadeTSHLQYLYRyafectaasubioactividad.Sinembargo,estopuedenosersiempredemuestraLQYLWURbioensayo.Enalgunoscasossepuededemostrarmedianteisoelectroenfoque,siunacantidadsuficientedeTSHpuedeserconcentradoydesarrolladoportransferenciaWesternoporConcanavalinaAcromatografa(78).OtromtodoconsisteenpurificarporafinidadlaTSHestprobando,inyectarporvaintravenosaenratonesoratasconsupresindeTSH(tratadoscondosisaltadeT ),yseguirsuvidamediaporRIA,oseguirlaactividadbiolgicadeTSHmediantelamedicindeT secrecinenelsuero.DisminucindelabioactividadTSHtambinpuedesercausadapordefectosenelreceptordeTSHoel
5DWD\UDWyQ76+HQVXHURVHSXHGHQPHGLUXVDQGRNLWVGHHQVD\R76+GHUDWDFRPHUFLDOPHQWHGLVSRQLEOHV$OWHUQDWLYDPHQWH5,$VHVSHFLHVHVSHFtILFDVVHSXHGHQUHDOL]DUXWLOL]DQGRORVUHDFWLYRVGHO3URJUDPD1DFLRQDOGH3pSWLGRV\KRUPRQDOHO,QVWLWXWR1DFLRQDOGH LDEHWHV\(QIHUPHGDGHV LJHVWLYDV\5HQDOHV%HWKHVGD0
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6bRECOMENDACIN
$FWLYLGDGELROyJLFDGH76+SXHGHVHUHVWXGLDGRSRUHVWDQGDUL]DGRLQYLWURHQVD\RVDVtFRPRLQYLYRHQVD\RV
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>%@Tissue
nmerodereceptoresdeTSHexpresadosenlasuperficiedelaclulafolicular(porejemplo,TTF1heterocigotosratonesKO)reduce.EstopuedeserconfirmadoporlarespuestaquemuestraintactaenunLQYLWURbioensayojuntoconalteracinenlarespuestadelanimalainyectarTSHautntica(79).
ElejeTRHTSHpuedenserinterrogadosyaseaenlapituitariaonivelglandulartiroideamediantepruebasdinmicasespecficas.LapruebadeestimulacinconTRHserealizaconunainyeccinintravenosaointraperitonealdeTRH(5,0 g/kgBW).Serecogesangre30minutosdespusparalamedicindeTSHensueroy2horasmstardeparalamedicindesuerodeT ,queindicalacapacidadderespuestaalaTSHtiroideainducidaporTRH.ElaumentoprevistodelaTSHsricaesdetriple,mientrasqueunaelevacindeaproximadamenteel50%enelsueroT seespera(80).
LapruebadeestimulacinconTSHserealizaconunainyeccinintravenosaointraperitonealdebTSH(2250 mU/100 gBW).Doshorasmstarde,serecogesangreparalamedicindesuerodeT ,conunaelevacinesperadadeaproximadamente40%encomparacinconlosnivelesdereferencia(7981).Unenfoquealternativoesparapretratarratonesdurante4dasconT (1 g/d)conelfindesuprimirlaTSHendgenayluegoadministrarbTSH(2,10,o30 mU)enlamaanadelquintoda.Enestecaso,larespuestatiroideaseevalaenfuncindelaelevacininducidaporTSHensuerodeT 3horasmstarde,queesaproximadamente1 g/dl(81)otresvecesenlalneadebase(82).Unenfoquesimilarsepuedeutilizarenratas,yelTinducidaporTSH respuestavarabastantesustancialmentedeacuerdoconlacepaderata.Todavaenratas,inducidaporlaTSHT mesetasrespuestaaunadosisbTSHdeaproximadamente100 mU,conunaumentodealrededorde2 g/dlporencimadelalneadebase(79).EsdedestacarqueunaevaluacincomparativadelacapacidadderespuestadelatiroidesarhTSHenratasyratonesindicapobreonularespuestaenratasquenofueronpreviamenteconT (49).
MientraselplasmaconstituyelamayorpiscinaextratiroideadeT ,aproximadamentedosterciosdetodoslosT seencuentraenelespaciointracelulareinicialaaccindelahormonatiroideamediantelauninareceptoresnuclearesdehormonastiroideas(TR).LaintensidaddelasealizacindependedelnmerodeTRsocupadosencualquierdadoT responsivetejido.Debidoaqueloscompartimientosextracelulareseintracelularesestnencomunicacinylahormonatiroideamolculasdetrnsitodentroyfueradelasclulasatravsdelosdiferentestransportadoresdemembrana,enlamayoradelostejidosdemedicindelaconcentracinsricadelahormonatiroideaproporcionaunaestimacindelaintracelularT concentracin.Sinembargo,unainterrupcindelsistemadetransportepodraimpedirellibreaccesodeT alcompartimientointracelular.Adems,elmetabolismointracelulardelahormonatiroidea,tantolaactivacincomolainactivacin,podraafectaralasealizacindelahormonatiroideadeunamaneraquenosepuedepredecirapartirdetomademuestrasdelcompartimentodeplasma.Porlotanto,losnivelessricosdeT noreflejannecesariamentelacantidaddeT entodoslostejidosolaintensidaddelasealizacindelahormonatiroidea.LamedicindirectadeltejidoT contenidoproporcionaestainformacinadicional.
Extraccindesangreapartirdetejidosporperfusinesimportanteparticularmenteparatejidosmuy
RECOMENDACIN7
+RUPRQDOLEHUDGRUDGHWLURWURSLQD75+76+LQGXFLGDSRUODVHFUHFLyQGHODVSUXHEDVVHSXHGHXWLOL]DUSDUDHYDOXDUODFDSDFLGDGGHODJOiQGXODSLWXLWDULDSDUDVHFUHWDU76+7K\URLGDOSUXHEDVVHFUHFLyQLQGXFLGDSRU76+VHSXHGHXWLOL]DUSDUDHYDOXDUODFDSDFLGDGGHODJOiQGXODWLURLGHVSDUDSURGXFLU\VHFUHWDUODKRUPRQDWLURLGHD
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RECOMENDACIN8
&RQWHQLGRGHWHMLGRGH7 \7 SXHGHPHGLUVHSRULQPXQRHQVD\RVGHVSXpVGHODH[WUDFFLyQGHWHMLGR
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>%@FuentesdetejidoT ylasaturacinTR
vascularizados.Despusdeobtenerlamuestradesangre,losratonessesometieronaperfusinconheparinaquecontienePBSatravsdeunaagujaquesecolocaenelventrculoizquierdo(VI)delcoraznseguidoporuncorteabiertalavenacava.Lostejidosserecogenacontinuacin,secongelaroninmediatamenteenhielosecoysealmacenarona80C.Yodotironinasseextraendetejidosutilizandometanolcloroformo(1:2).Lacantidaddetejidoqueseextraedependedelestadodelahormonatiroideadelanimalylaabundanciadelahormonaenuntejidoespecfico.Amododeejemplo,50 mgdecerebroy15 mgdehgadodeunratneutiroideogeneralmentedarnresultadossatisfactorios,perolacantidaddebeseraumentadoenmuestrasderatonesoratasconhipotiroidismo.Tradiactivo oT ,debeaadirseacadamuestraparadeterminarlaeficienciadelaextraccinunamezclade[ I]T y[ I]T sepuedeutilizarcuandoambashormonassonobjetodeestudio.Dependiendodelprocedimientodeextraccin,cloroformodebeeliminarse,yaquecontienelpidosyotrassustanciasqueinterfierenenlosacuerdosdeintegracinregional.Estoimplicaretroextraccinenclorurodecalcio,laconcentracindelosextractos,ylaevaporacin(83).Unavezquesehacompletadolaextraccin,sedisuelveelextractoseco,preferiblementeentampnosueroderoedoresconcarbnvegetal,yT contenidomedidoporelinmunoensayoespecfico,siguiendolasrecomendacionesdadas.ARIAaltamentesensibleesdecisivaparaobtenerresultadosfiablesenmuestraspequeasoenmuestrasdeanimaleshipotiroideos.ParaladeterminacindetejidoT contenido,ensayoscomercialesnosonlosuficientementesensiblesyaltamentesensibleT RIAentampndebenutilizarse(83).Todoslosensayosdebenincluirtubosenblanco/decontrolapropiadas,quecontienetodoslosreactivosexceptoparalamuestradetejido,paraserutilizadoparacomprobarelfondodelensayo.Validacindelensayotambinincluyelademostracindeparalelismoentreunacurvadetejido(conmltiplespuntosprogresivamentemayorescantidadesdeextractodetejido)ylacurvaestndarporencimadelrangodeinters.
T presenteenlostejidosextratiroideapuedederivarsededosfuentesdistintas:plasmaT yT generadolocalmenteapartirdeT (84,85).ElltimomecanismoseencuentratpicamenteenlostejidosqueexpresanD2talescomoelcerebro,pituitaria,yBAT.LasestimacionessugierenquealmenoslamitaddelaT presentesenlostejidosD2expresanesproducidolocalmentedesdedesyodacindeT (8689).MsrecientementeexpresinD2sehaencontradoenungrannmerodetejidosyclulas(9098),loqueilustralaimportanciadedefinirsucontribucinalasealizacindelahormonatiroideaespecficosdetejido.LadeterminacindelasfuentesdeintracelularT esfactibleporqueplasmaT seequilibrarpidamenteconlamayoradelostejidos(peronotodos).Enelpuntodetiempodeequilibrio(7P)sepuedeutilizarelplasmaT laconcentracinylaproporcinnuclear/plasmadetrazadorT paraestimarlacantidaddeTnuclear quesederivadeplasma.UnaestrategiasimilarpuedeaplicarseentoncesparaT ,devolviendoelTnuclear quesederivadelaconversinlocaldelaT aT .
Losestudioshansidoestandarizadosenratas,peropodranenteoraseraplicadoenratones,as,acondicindequelaslimitacionesdebidoaeltamaodelcuerpoylaanestesiasonsuperados.LostejidospuedenserestudiadoscomountodoofraccionarparaaislarlafraccinnuclearquecontieneTR(66,8689).Despusdelaadministracinde[ I]T ,7Psedefinecomoeltiempoenelquelacantidaddetrazador[ I]T queentraeneltejidoocompartimentonuclearesigualalacantidadde[ I]T quesaledelmismocompartimiento.7Psealcanzaenhorasdelainyeccinintravenosaopocosdasdelarranquedelabomba.Enla7P,el[ I]Tproporcindetejidodeplasma/ylaconcentracinplasmticadeT seutilizanparacalculareltejidoTconcentracin.Clculossimilaresseutilizanentrazadoresradiomarcadoscasosseinfundenatravsdebombas(99,100).Estosmtodossehannormalizadocon IT deseparacinporcromatografaenpapeldescendente.Haybuenacuerdodequelacromatografalquidadealtorendimiento(HPLC)ycromatografalquidadeunrendimiento
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RECOMENDACIN9a
/DFRQWULEXFLyQGHSODVPD7 DOWHMLGR7 VHSXHGHFXDQWLILFDUPHGLDQWHWpFQLFDVGHWHMLGRGHHWLTXHWDGRTXHHQWUDxHQLQ\HFFLRQHVLQWUDYHQRVDV~QLFDVRERPEDLPSXOVDGDSRUODLQIXVLyQFUyQLFDGHWUD]DGRUUDGLRPDUFDGR7
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Visindeconjunto
ultra(UPLC)sonexcelentesmtodosparasepararyodotironinasetiquetadosyenteorapodraserutilizadotambin.
Laadministracincombinadadetrazador[ I]T concantidadescrecientesdeTfro saturaprogresivamentelaaltaafinidadT sitiosdeunin(TR)(8689,101).Enestecaso,losncleosseaslanyseprocesaronpara[ I]T contenido.ElplasmaT ylarelacindeconcentracindeplasma/nuclearenla7PseobtienenentoncesparacadadosisdeTfra quefueinyectada.LosresultadosseexpresanpormiligramodeADN,yelanlisisdeScatcharddelosdatospermiteelclculodelamximacapacidaddeTRylaafinidaddeuninrelativaencualquiertejidodado.ElplasmaT Tfrentenuclear curvahacequeseaposiblecalcularlasaturacindeTRencualquierniveldadodeT ,incluyendolosnivelesplasmticosfisiolgicos.
Laadministracinde[ I]T ylaposteriormedicindeplasmaytejido[ I]T permitelacuantificacindelaproduccinlocaldeT enlostejidosensuconjuntooTRquecontienelafraccinnuclear(8689).Aunquerelativamentegrandesactividadesde[ I]T seutilizan,lascantidadesde[ I]T producidosenel7Psonmnimosenlosanimaleseutiroideos.As,tantoelplasmayeltejido(nuclear)[ I]T deberaconcentrarseusandounanticuerpoantiT columnadeafinidadantesdelaseparacinporcromatografa.Al7P,larelacindeplasma/tejidode[ I]T /[ I]T yelsueroT concentracinseutilizanparacalcularlaproduccinlocaldeT .Losvaloresde[ I]T semultiplicanpor2debidoaqueslohayun Ienelanillofenlico(exterior)de[ I]T ydesyodacinocurrealazarentrelasposiciones3'y5'.Lascorreccionespertinentessedebenusarcuandoeltrazadorcontieneyodoradiactivoentantofenlico(exteriores)ytyrosilanillos(interior).Paratenerencuenta(ycondescuento)porlacontribucindeplasma[ I]T (quesaledelostejidos)alostejidos[ I]T ,laadministracinde[ I]T escoordinadaconlaadministracinde[ I]T .Debidoaquela7P(T )y7P(T )sondiferentes,laadministracindelosdostrazadoresdeberprogramarseparaquetanto7Pcoincidensentiempolosanimalesmueren.
>&@EvaluacindetiroidesHormonadeTransporteenclulas
Basndoseenlaestructuralipoflicadelashormonastiroideas,sepensdurantemuchotiempoquelahormonatiroideaentraenlaclulaatravsdedifusinpasiva.Sinembargo,haquedadoclaroquelashormonastiroideassontransportadosatravsdelamembranaplasmticaatravsdeltransportemediadoporportador,proporcionandolaclulaconunaherramientaimportantepararegularladisponibilidadintracelulardelahormonatiroidea.Eltransportemediadoporportadordelashormonastiroideassevefacilitadaporinteraccionesespecficassustratodeltransportadoryconducidopredominantementeporgradientesdeconcentraciny,paraalgunostransportadores,atravsdelacotransportedeotrasmolculas.Portadoresdesolutosconocidosparaeltransportedehormonastiroideasincluyentransportadoresmonocarboxilato(MCT),Na /taurocolatopolipptidocotransporte,lostransportadoresdeanionesorgnicos(OAT),transportadoresdeaminocidos(porejemplo,detipoLtransportadoresdeaminocidos)yanionestransportarpolipptidosorgnicos(OATPs)(102106).LaimportanciadelostransportadoresdelahormonatiroideaseilustraporelhechodequelasmutacionesenretrasopsicomotorcausaMCT8humanaynivelesalteradosdeyodotironina(107,108).ConlaexcepcindeOATP1C1(T y3,3',
9bRECOMENDACIN
75Pi[LPDFDSDFLGDGGHXQLyQHQXQWHMLGRVHSXHGHHVWLPDUDWUDYpVGHDQiOLVLVGHVDWXUDFLyQFRQ7 \ODUHGXFFLyQGHGDWRVPHGLDQWHHOPpWRGRGH6FDWFKDUG
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9cRECOMENDACIN
7pFQLFDVGHHWLTXHWDGR XDOFRQ> ,@7 \> ,@7 VHSXHGHXWLOL]DUSDUDGHWHUPLQDUODVFRQWULEXFLRQHVUHODWLYDVGHSODVPD7 IUHQWHSURGXFLGRVORFDOPHQWH7 DWUDYpVGH7 GHV\RGDFLyQDOWHMLGR7FRQFHQWUDFLyQ
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>&@transportehormonatiroideaLQYLWUR
5'triyodotironina[rT ]sloeltransporte),lamayoradelostransportadoresdelahormonatiroideatransportartantoT yT .EsimportantedarsecuentadequelosmiembrosdelafamiliaMCT,talescomoMCT8yMCT10,facilitannoslolacaptacincelular,sinotambinelflujodesalidadeyodotironinas(109).Elpapelfisiolgicodelostransportadoresesnoslodependedesusafinidadesrelativasparalashormonastiroideas,perotambindependedelospatronesdeexpresinentejidosyespecficosdelaclula.Unfactordeconfusinenlasburlasacaboelpapelfuncionaldetransportadoresespecficoseslaposibleexpresindediferentestransportadoresenlasuperficiedeuntipodeclulaindividual(porejemplo,hepatocitosyneuronas).Enestoscasoslaabundanciarelativadeunmiembrodelafamiliaespecficaprobablementedeterminarlajerarquadelasfuncionesdetransporteparauntipoespecficodeclula.Finalmente,lostransportadoresdelahormonadelatiroidesvariosnotransportanlashormonastiroideasexclusivamente.Porejemplo,losOATPstransportarunaampliavariedaddeambosendobiticosyxenobiticosyposeenmltiplessitiosdeuninasustrato(110,111).Estacomplejidadenlaexpresinyfuncinrevelaalgunosdelosretosasociadosconelestudiodetransportedelahormonatiroidea,tantoLQYLYReLQYLWURquedebeserconsideradoporelexperimentador.
(QLQYLWURestudiossongeneralmenteconsideradosparalacaracterizacinbioqumicadelostransportadoresindividuales,elestudiodelosefectosdelasmutacionesespecficassobrelafuncindeltransportador,ylaelucidacindelafuncindelostransportadoresespecficosexpresaentiposdeclulasindividuales.Unaconsideracinprincipaleslagarantadequeelexperimentoestdiseadoycontroladoparaprobarlafuncindelostransportadoresespecficosfrentealaaccincolectivademltiplestransportadoresexpresadasenlamismaclulacorrectamente.Losestudioscinticosrequierenlaconsideracindeposiblesfactoresdeconfusincomolagarantadelalocalizacindelamembranaplasmticadelostransportistasexpresado,transportesustratobidireccional,laeleccindeltipodeclulaexperimental,ytpicofrentecinticaatpicos.
Laevaluacindelafuncionalidaddeclonadodetiposalvajeotransportadoresdelahormonatiroideamutantesseconsiguefcilmentemediantelarealizacindeexperimentosdeabsorcin(110,112).Loscontrolesapropiadosincluyencomparacinconlasclulastransfectadasconelvectorvacoylainhibicindelaabsorcindelahormonatiroideamarcadoporlacoincubacinconunexcesodehormonafro.Elltimocontrolescrticaparaasegurarquelaclulaasociadacaptacindehormonatiroideaobservadoesunprocesosaturableynoestsimplementeasociadaconuninnoespecficadehormonamarcadaalaclula.Paralosensayosdetransporteengeneral,lacaptacinseiniciaconlaadicindesustratomarcadoalasclulasyterminaenpuntosespecficosdetiempoconlavadosrpidoscontampndetransportefro.Estasetapasdelavadosonesenciales,yaqueyodotironinastiendenaadherirsealasparedescelulares.Sedebeprestaratencinalaseleccindememoriaintermediadetransporte(porejemplo,tampnKrebsHenseleit,mediano/F12deEaglemodificadoporDulbecco,oPBSregularcon/osinBSA).Esimportantedarsecuentadequediferentestamponesdetransportepuedencontenergrandescantidadesdeaminocidos,quetambinpuedensertransportadosporciertostransportadoresyporlotantoinfluyenenlosresultadosdelosexperimentosdeabsorcin.BSAsepuedeaadiralmedioparamanteneryodotironinasensolucinyevitarlaadsorcinalosplsticos.Sinembargo,disminuyendolaconcentracinyodotironinalibretambinpuedelimitarladisponibilidaddesustrato.
Memoriasintermediasdetransportecontienenpreferiblementenosueroenabsoluto,yaqueelsueroinclusoresinadespojadodeintercambioinicotodavapuedecontenerbajosnivelesdehormonastiroideasqueinterfierenconelensayodecaptacin.Comoconsecuencia,lasmedicionescinticas(porejemplo,lasconstantesdetransporte,lasvelocidadesmxima)nosepuededeterminar.Lacaptacinsecalculaapartirdelaproporcinderadiactividadasociadaconellisadocelularencomparacinconlaradiactividadtotalasociadaconeltampndetransporte
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RECOMENDACIN10bis
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isotpico.Laradiactividaddefondoenlasclulastransfectadasconelvectorvacoserestadetodaslasmuestras.Lacaptacinsecalculaapartirdelaproporcinderadiactividadasociadaconellisadocelularencomparacinconlaradiactividadtotalasociadaconeltampndetransporteisotpicayexpresadoenunidadesdepicomolesporminuto(113,114).
Diferentesresultadossepuedenobtenerendiferentestiposdeclulas,dependiendodelosnivelesdeexpresinendgenosdelostransportadoresdelahormonatiroideay/uotrosfactoresnecesariosparaeltransportedelahormonatiroidea.Alestudiarlafuncindelostransportadoresdemutantes,puedesertilcompararlosresultadosenclulasconnivelesdeexpresinendgenosdealtaversusbaja.
Transportadoresdehormonatiroideaexhibentransportebidireccional.ParaalgunostransportadorestalescomoelOATPs,secreequeunsustratoantiportadoasernecesariaparaeltransportedelahormonatiroideaatravsdelamembranaplasmticaysedebeconsideraralelegirunamemoriaintermediadetransporte.Laacumulacindehormonastiroideastransportaenlaclulaesnecesariaparaevaluarlaactividaddetransporteypuedepresentarunproblemaparaalgunostransportadoresbidireccionalesporqueelsustratodeeflujopuederpidamentelashormonastiroideasdelaclula.Cotransfeccinconlahormonatiroideaintracelularprotenasdeunintalescomomucrystallinproporcionaunmtodoparaasegurarlaacumulacindelahormonatransportado(109,115,116).Unaadvertencia,sinembargo,esqueelusodetalesmtodosseoponeaestudioscinticosposterioresdebidoaqueeltransportedelahormonaprobablementenuncaalcanzarelestadodeequilibrio.
Paraestudiarlasconsecuenciasdelasobreexpresindeuntransportadorespecficodelahormonatiroideadeladisponibilidadintracelulardelahormonadelatiroides,lasclulaspuedensercotransfectadasconundeiodinasayodotironinayposteriormenteanalizadosparaelmetabolismo(114).Alternativamente,; HQRSXVovocitospuedenserutilizadosparaestudiosdetransporte(118).
Laespecificidaddesustratodelostransportadores(putativo)delahormonatiroideapuedeserinvestigadaporincubacindelasclulascondiferentesligandosradiactivosputativo,incluyendolasdiferentesyodotironinasT,T ,Rt ,y3,3'diyodotironina(T ),ascomoanlogosdelahormonatiroideacidotalcomo3,5,3'triyodotiroactico(tiratricol,tambinconocidocomoTRIAC)y/ovariosaminocidos,talescomoLeu,Phe,Tyr,yTrp.EspecificidaddetransporteTHsepuedemedirmedianteladeterminacindelacaptacindeyodotironinasradiomarcadosenlapresenciadecompetidoresputativo,incluyendolosderivadosdeyodotironinamarcadoscomoDyLyodotironinas,tiratricol,cidotetraiodotiroactico(tetrac),yaminocidos.
Caracterizacindelosparmetroscinticosdeclonadodetiposalvajeymutantestransportadoresdelahormonatiroidearequieredeterminarprimeroelcursodeltiempodeafluenciadesustratoenlasclulastransfectadas.Apartirdeestosdatosdeunpuntodetiemposeidentificacuandolacaptacindesustratoestcercademximos,peroeltransporteannohaalcanzadoelestadodeequilibrio.Todoslosestudioscinticosadicionalessellevaronacaboacontinuacin,mediantelamedicindelaacumulacindesustratoenlasclulastransfectadasydecontrolenestepuntodetiempoidentificado.
Paraelanlisisdemutantestransportadorseradeesperarquelosmutantespuedenposeeractividadescinticasalteradas.Porlotanto,paraeltiempodeestudioelinvestigadordebeevaluarlaabsorcinenmltiplespuntosdetiempoeneltranscursode120minutos.LosmutantessepuedensometeraanlisisdelacinticadeMichaelisMentenparacuantificarloscambiospotencialesenlacinticadetransportedelahormonatiroidea.
Paralosestudioscinticosposteriores,unpuntodetiempodebeserelegidoantesdeestadoestacionariocuandose
10bRECOMENDACIN
/DGHWHUPLQDFLyQGHODHVSHFLILFLGDGSRUHOVXVWUDWR\ODVFDUDFWHUtVWLFDVFLQpWLFDVSDUDORVWUDQVSRUWDGRUHVGHODKRUPRQDWLURLGHDUHTXLHUHXQFRPSURPLVRGHSUREDUYDULRVVXVWUDWRVHQXQDDPSOLDJDPDGHFRQFHQWUDFLRQHV
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observandiferenciasmximasentretransportadorexpresadofrentealacaptacinvectorvaco.Enestepuntodetiempo,sepuedemedirlaabsorcinutilizandomltiplesdiferentesconcentracionesdesustratoqueabarcanelrangodinmicodedeteccinparacadasustrato.Dadoqueestosgrandesexperimentossondifcilesderealizar,muchosinvestigadoresoptanporlimitarelnmerodepuntosdedatosrecogidos,laaceptacindeunaestimacinmenosprecisadelacinticadetransporte.Notablemente,saturabilityyvaloresdeKmaparentespuedenestarinfluenciadasporlaunindeyodotironinasaprotenastalescomoBSAenelmedio.
EvaluacindelafuncinOATPesanmsdifcil,yaqueestostransportadoresposeenmltiplessitiosdeunindesustratoyporlotantopresentanunacinticadetransporteatpicas(110,119).ParaevaluaradecuadamentecinticadetransporteOATPrenendatoscinticoscomolosdescritosanteriormenteyutilizarotrosmtodosparaanalizarlosdatos(110,120122).Estoscinticadetransportenopuedenserdeterminadosparalostransportistasconaltacapacidaddeflujodesalida,talescomoMCT8yMCT10,quepuedenrequerircotransfeccinconprotenasdeuninintracelulares(vaseladiscusinanterior).
Unaprecaucincuandosetrabajaconclulasprimariasesposibleunarpidabajaregulacindelaexpresindeltransportador(123).Seguimientodelaexpresindeltransportadormediantetransferenciaoinmunocitoqumicaoccidentalatravsdeltiempoenlaculturatanto,esfundamental.Adems,lapresenciadeunapoblacindeclulasmixtasexigelaidentificacindetiposdeclulasqueexpresantransportadoresespecficos(124).Sinembargo,lafaltadeespecificidaddelosanticuerpospuedeplantearproblemassignificativosparaelseguimientodelaexpresindedeterminadosmiembrosdelasgrandesfamiliasdeltransportadorconmltiplesmiembrosestrechamenterelacionados.
AsegurarquelostransportadoresevaluadosestnlocalizadosenlamembranaplasmticaesdeimportanciaclaveparalaLQYLWURestudios.CuandolosanticuerposadecuadosestndisponiblesanlisisdeWesternprimerosedeberealizarparaasegurarlaexpresindeprotenaseguidoporinmunocitoqumicafluorescenteparaevaluarlalocalizacinsubcelulardeprotenas.Alestudiarlasclulastransfectadas,esimportanteparaestudiarlasclulasconbajosnivelesdeexpresinendgenadeltransportadordeinters.Porejemplo,lasclulasJEG3sonunexcelentemodeloparaestudiarlamembranaplasmticalocalizacindeMCT8mutadooMCT10debidoasusbajosnivelesdeexpresinendgenadeMCT8y/oMCT10.Paraelanlisisbioqumico,transportadoresclonadoseptopodeetiquetadoproporcionanunadianaantignicapreparadatantoparaWesternblotyanlisisinmunocitoqumico.Localizacinsubcelularsedeterminapreferiblementepormicroscopaconfocalporquemicroscopafluorescentetpicadecampoamplionodistinguirfcilmenteentrelasuperficiecelularyetiquetadointracelular.Apropiadamenteprotenaexpresadoselocalizaprincipalmenteenlamembranaplasmticaconlatincinintracelularlimitado.EsteanlisisescrucialparaunaevaluacinadecuadademutantesgenticoscomolafaltadetransporteobservadoenLQYLWURensayospodraserdebidoaunafaltadefuncindetransporteounaincapacidadparaeltrficocorrectamentelaprotenaalamembranaplasmtica.Enambossupuestos,elensayodetransportedemostraraunaprdidadelafuncindeltransportador,aunquelaexplicacinbioqumicaparaesteresultadoseramuydiferente.Tengaencuentaqueestosestudiospuedenserdifcilesderealizarenlasclulastransfectadastransitoriamente,debidoaunaeficaciarelativamentebajadelatransfeccin.Paratalesestudios,elusodeclulastransfectadasdeformaestablepuedesermstil.
10cRECOMENDACIN
(YDOXDUHOWUDQVSRUWHGHODKRUPRQDWLURLGHDHQFXOWLYRVGHFpOXODVGLVRFLDGDVSULPDULDLQYLWURVyORHVGHYDORUOLPLWDGRVLVHXWLOL]DQFXOWLYRVGHFpOXODVPL[WDV
RECOMENDACIN11
/DFRQILUPDFLyQGHODFRUUHFWDORFDOL]DFLyQGHODPHPEUDQDGHSODVPDHVQHFHVDULRSDUDHVWXGLRVTXHXWLOL]DQODVFpOXODVTXHH[SUHVDQWUDQVLWRULDPHQWHORVWUDQVSRUWDGRUHVGHODKRUPRQDWLURLGHD
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>&@transportedehormonatiroideaHQYLYR
Visindeconjunto
,QYLYRestudiodeltransportedelahormonatiroideaseconsideraparadilucidarlosrolesfisiolgicosyfisiopatolgicosdetransportadoresespecficosyparadeterminarlacinticadelaafluenciadetejidoyflujodesalidadelashormonastiroideas.Losestudioscinticosrequierenunaconsideracindeposiblesfactoresdeconfusintalescomometabolismodeprimerpasodelahormonadeltrazadorinyectado,lapresenciademltiplesmiembrosdelafamiliatransportadordelahormonatiroideaenunnicotejidooinclusotipodeclula,ycambioseneldesarrolloenlospatronesdelaexpresindeltransportador.Consecuenciasdetransportedelahormonatiroideadefectuosoenlasealizacindelahormonatiroideasepuedenanalizarusandoanlisisdelgenomadeancho(SeccinI.3)enelmaterialdelpacientetalescomolosfibroblastos(125),mientrasqueconsecuenciasparadiferentesparmetrosbiolgicossistmicospuedenseranalizadosusandodiferentesmodelosderatnknockout[ver6HFFLRQHV,y-verHeueryVisser(126)paraunarevisin].
(QYLYRmedidasdetransportedelahormonatiroideaestnconfundidosporlaexpresindemltiplestransportadoresdehormonatiroideaenlamayoradelostejidos.Unaconsideracinclaveesdeterminarlosperfilesdeexpresindeltransportadorynivelesendeterminadostiposdeclulasentejidosespecficos.DesdelaafinidaddeT yT essimilarenlamayoradelostransportistas,lacontribucindeuntransportadorindividuogeneralmentesiguesusnivelesdeexpresin.Diseoexperimentaldeberatenerlaposibilidaddetantoinflujohormonalyflujodesalidaenconsideracin[verHeueryVisser(126)paraunarevisin].Consecuenciasdeltransportedelahormonatiroideadefectuosoparalasealizacindelahormonatiroideapuedenseranalizadosutilizandoelanlisisdelgenomadeancho(verVHFFLyQ,)dematerialdelospacientestalescomolosfibroblastos(125)odiferentestejidosdelosratonesknockout(127).
LashormonastiroideassonsometidosametabolismoLQYLYRincluyendodesyodacinyelmetabolismoconjugativo.Esimportantedestacarquetalesimpactosmetabolismodeldestinodeltransportedelashormonasycuandolashormonastiroideassemetabolizansonsustratostrazadoresradiomarcados,interpretacindelosresultadosobtenidosesdifcil.Elcontrolsobreelmetabolismosepuedeejercersilasestrategiasindividualesdepasoseutilizancomolacanalizacindirectadelosbuquesquellevaalostejidosdiana,seguidodeinfusincontinuadetampndetransportedefinidoysustrato.Talesestrategiaslimitanelmetabolismodelsustratoylaprdidaalostejidosperifricosypermitenlamedicindirectadetransportedelahormonatiroideaeneltejidoevaluado.Comounejemplo,selogramejormedidadeltransportedelahormonatiroideaatravsdelabarrerasangrecerebrousandoelLQVLWXmtododeperfusincerebral(128).Estametodologapermitemedicionescinticasexactastalescomolastasasdetransporteyafinidadesdetransporteysepuederealizarenneonatalalosanimalesadultos.ComparacindelacinticadetransportedetiposalvajeytransportadorespecficoanimalesnulospermitiraladeterminacindelascontribucionesespecficasdelostransportistasindividualesHQYLYR.
> @Laevaluacindelahormonatiroideadesyodacin
ElyodotironinacirculanteesT .Sinembargo,T puedeserconvertidoenlostejidosaT ,laprincipalhormonadetiroidesqueseunealosreceptoresnucleareseiniciaunaaccindelahormonatiroidea(129).
RECOMENDACIN12a
3RULQYLYRHVWXGLRVHOWUDQVSRUWHGHODKRUPRQDWLURLGHDQHWRWtSLFDPHQWHUHSUHVHQWDODVXPDGHXQDVHULHGHGLIHUHQWHVDFWLYLGDGHVWUDQVSRUWDGRUDV(YDOXDFLyQGHODFRQWULEXFLyQGHXQWUDQVSRUWDGRUGDGRDOWUDQVSRUWHQHWRUHTXLHUHHOH[DPHQGHWRGRVORVWUDQVSRUWDGRUHVH[SUHVDGRVHQHOWHMLGR
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12bRECOMENDACIN
(OPHWDEROLVPRGHODVKRUPRQDVWLURLGHDVHYDOXDGRVGHEHVHUFRQVLGHUDGDFXDQGRVHPLGHHOWUDQVSRUWHLQYLYR
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EnsayoparalaactividadD1.
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> @deidentificacin,expresinycuantificacindedeiodinasas
Enlostejidosextratiroidea,laconcentracindeT enloscompartimentosintracelularesynuclearessedeterminaenparteporlastasasdeT aT conversinyT yT degradacinenlaclula(84,130132).
LaformacinyladegradacindeT enlostejidosdependenprincipalmentedelasactividadesdetresselenoenzimasintegraldelamembranaquecontienetiorredoxinaplegablesdeaproximadamente60 kDa(dmero)quecatalizanlaeliminacinselectivadeyododeyodotironinas(132135).EldesyodasadetipoI(D1)ylasenzimasD2estnactivandoenzimasquecatalizanelanilloexterioro5'desyodacin(5'd)deT aT .D3esunaenzimaquecatalizalainactivacinanillointerioro5desyodacin(5D)deambosT yT ensusderivadosrelativamenteinactivos,rTyT ,respectivamente.ElD1tambinpuedeinactivarlashormonastiroideas,catalizandoladesyodacinanillointeriordeconjugadosyodotironinasulfatados(130132).NivelesdeactividaddeD1,D2,yD3puedenserestudiadosenpreparacionesdeclulascultivadas(136,137),rodajasdetejido(138,139),yhomogeneizadosdetejido(140,141).
Lapresenciadelosdeiodinasaspuedeseridentificadoenuntejidodadoysusnivelesdeactividadcuantificusandoensayosbienestablecidosparalaactividadenzimticaypropiedadescinticas.EnloscasosdeD1yD3,contenidodetejidodelaprotenadeiodinasasepuedeevaluarmediantetcnicasinmunohistoqumicasutilizandoantisueros/anticuerposdisponibles(142).LosnivelesdeexpresindelostresgenesdesyodasaspuedendeterminarseusandomuestrasdeARNpreparadasapartirdetejidodeintersmediantereaccinencadenadelapolimerasadetranscriptasainversacuantitativaestndar(RTqPCR)tcnicas(127).
Ensayodelosnivelesdeactividaddeiodinasay/olacinticadereaccindelaenzimaenlaspreparacionesdeclulas/tejidosrotosrequierelapresenciadecompuestosquecontienengrupossulfhidrilolibrestalescomoditiotreitol(DTT).EnsayodelosnivelesdeactividadD1,D2,D3ysellevanacabogeneralmenteutilizandoyodotironinasradiactivoscomosustratosseguidodecuantificacindelosproductosradiactivosgeneradosporunidaddetiempo.Alternativamente,enelcasodelaD1yD2,losnivelesdeactividadsepuedendeterminarusandonoradiactivoT ylacuantificacindelaT generadaporRIA.
Existenvariosprotocolosparaensayosdesyodasas,ytodosellossonaceptablessiemprequesesiganciertosrequisitos.Engeneral,laliberacindeyodurodetrazadorradiactivoogeneracindeunproductoespecficodeiodinasasonloscriteriosdevaloracinexperimentalesmedidos.Siempreesmejorutilizaryodotironinasradiomarcadosconlamsaltaactividadespecficadisponible.Inclusocuandosealmacenanenlaoscuridada4C,haydesyodacinyodotironinaespontnea.Porlotanto,afindeminimizarlosnivelesdefondo,trazadoresdebenserpurificadosenSephadexLH50almenos24horasantesdelensayo.Todoslosensayosdebencontenercontrolesdefondoenlosquenohaydesyodacinsustratodeiodinasamediada.Idealmente,duplicadosdelasmuestrasseejecutanenparaleloentubosquecontenanungranexcesodesustratoqueoutcompeteslayodotironinaradiomarcado.
ElsustratopreferidoparaD1esrT tomandolarelacinVmax/Kmcomounamedidadelaeficiencia,rT realizatantocomo700vecesmejorqueT comounsustratoparaD1.Adems,adiferenciadeT ,rT esunsustratorelativamentepobreparaD3yporlotantoeselmejorsustratoconelcualensayarD1enlostejidosquetambincontienenactividadD3.Almismotiempo,laactividadD1tambinsepuededeterminarusandoTcomosustrato.Eltampndereaccinvaraunpocoentreloslaboratorios,perolamayorasellevanacaboenunPBSo2amino21,3propanodiolhidroximetilhidrocloruro(TrisHCl)tampnquecontenacidoetilendiaminotetraactico(EDTA12 mM),sacarosa(0,250,3 M),yDTT(1050 mM).Laconcentracindesustratoes0,12 mM.Lacantidaddetejidopresentedebeajustarseparaasegurarunporcentajedesyodacin
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4 3 3 4
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13aRECOMENDACIN
HLRGLQDVDDFWLYLGDGHV\VXVSHUILOHVFLQpWLFRV\ODVSURSLHGDGHVLQWUtQVHFDVSRUHMHPSOR9PD[. PODDFWLYLGDGPHGLDGHYLGDODVHQVLELOLGDGDFRIDFWRUHV\RLQKLELGRUHVVHSXHGHQGHWHUPLQDUHQSUHSDUDFLRQHVGHFpOXODVRWHMLGRV
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EnsayoparalaactividadD2.
EnsayoparalaactividadD3.
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relativamentebaja(
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Fondo> @desyodacinenclulasintactas
deiodinasa(D2)enpresenciadedesyodasadetipoI(D1porejemplo,enlatiroideshumana):(i)utilizar1 mM6npropil2tiouracilo
NohayinhibidoresespecficossonconocidosporD2oD3.Sinembargo,tantoD2yD3actividadespuedensereliminadosmediantelaadicindeunexcesorelativodesusustratopreferido(esdecir,T oT ,respectivamente),lasaturacindelaenzimayoutcompetingeltrazadorradioactivo.Porejemplo,lamedicindelaactividadD2enpresenciadeD3esposiblemedianteelusorT oT comosustratoylaadicinde1001000 nMT enlamezcladereaccin.AdicindelaT saturaelexcesodesitiosdeunindeD3peronointerfiereconlaactividadD2.Sinembargo,seprefiereunreactivodealtapureza,yaque,aaltasconcentraciones,inclusopequeascantidadesdeuncontaminanteyodotironinainterfieraconelensayo.
MientrasD1yD3seexpresanennivelesquepuedensermedidosporWesternBlotoimmunocyto/histoqumicautilizandoantisueroscomercialmentedisponible(65,157,158),labajaexpresincombinadadeD2conlafaltadedisponibilidaddeafinidadsuficientementealtaantisuerosD2hadeterioradocuantificacindeprotenaD2(159).Dehecho,noexisteunconsensoencuantoalavalidezdeantisueroantiD2/anticuerposparalamedicindelaprotenaendgenaLosresultadosdebenserevaluadossobreunabasedecasoporcaso.Sinembargo,unaestimacindelosnivelesdeprotenaD2puedeobtenersedeformafiablemediantelamedicindeD2Vmax,quereflejalacantidadmximadeenzimaactivaenunaclulaotejido.D1yD3puedenserevaluadosyaseaatravsVmaxoWesternblot.Losnivelesdeprotenadelostresdeiodinasaspuedencuantificarsedespusdelmarcajedelasclulasqueexpresancondesyodasas Se,inmunoprecipitacin,ylaresolucinmedianteelectroforesisengeldesodiododecilsulfatopoliacrilamida,peroestollevavariassemanasporensayodeD2(93).NotaquelaalteracinbiolgicadeKm(porejemplo,lasmutacionesdeaminocidos)podraalterarlarelacinentreVmaxylosnivelesdeprotena.
MedirlosnivelesD1mRNAessencillo,ydadasuexquisitacapacidadderespuestaaT ,constituyeunmarcadorsensibledelestadotiroideoperifricaenroedores(72).D2esungendependientedecAMPysusnivelesdemRNApuedeserreguladohastavariasvecesdurantelaestimulacinsimpticadeBAT(161).Almismotiempo,D2exhibeunafuerteregulacinpostraduccionalatravsdelaubiquitinacinyladegradacinproteasomalpordiferentescomponentesdelretculoendoplsmico(162165).Porlotanto,losnivelesdemRNAnoreflejannecesariamentelaexpresindeprotenaoactividaddelaenzima(162,166,167).El LRgenesintrones,yloscontrolesad
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