IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS DE P.
FALCIPARUM EN LA VÍA ALTERNA DE SECRECIÓN
MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
[2003]
DR. CÉSAR NÁQUIRA VELARDEBLG. GISELY HIJAR GUERRRABLG.. CARLOS PADILLA ROJAS
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº88
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS DE P. FALCIPARUM EN LA VÍA ALTERNA DE SECRECIÓN
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INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
I. IDENTIFICACIÓN
Código del Proyecto de investigación: 2-01-05-03-074
Centro de referencia: Centro Nacional de Salud Publica
Título Identificación y caracterización de proteínas secretadas de P. falciparum en la vía alterna de secreción
Autores:
a. Blg. Gisely Hijar GuerrraLaboratorio de Biotecnología y Biología MolecularINSTITUTO NACIONAL DE SALUD
b. Dr. César Náquira Velarde.División de parasitologíaINSTITUTO NACIONAL DE SALUD
c. Blg.. Carlos Padilla RojasLaboratorio de Biotecnología y Biología MolecularINSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Categoría científica:
II. RESUMEN
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS DE P. FALCIPARUM EN LA VÍA ALTERNA DE SECRECIÓN
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La malaria ocasiona una considerable morbilidad en las Américas,
principalmente en la región de la Cuenca Amazónica, donde el P. falciparum es el
principal responsable. En el Perú, sólo hasta la semana 37 del año 2003, se han
notificado 11636 casos confirmados de malaria por P. falciparum. Durante el
mismo periodo del año 2002, se notificaron 15088 casos (Oficina General de
Epidemiología. Boletin Epidemiológico Semanal 2003, Vol XII, N° 37). Por lo tanto
es una prioridad en nuestro país la investigación en métodos de diagnóstico que
sean rápidos, sensibles, sencillos y económicos.
La importancia del presente estudio era el conocer las características de los
antígenos secretados por P.falciparum por vía alterna de secreción, los cuales
podrían ser utilizados en un futuro para la elaboración de una prueba rápida
basadas en detección de estos antígenos.
Los datos generados por el presente estudio indican que antígenos de
P.falciparum son mayoritariamente secretados por la vía clásica de secreción y
algunos antígenos menos representados en la vía alterna.
INTRODUCCIÓN
La Malaria es la enfermedad parasitaria más importante que afecta al
hombre (Wensdorfer WH y McGregor I, 1988). Aproximadamente 41 % de la
población mundial se encuentra en riesgo de adquirirla y cada año se reportan
entre 300 a 500 millones de casos de malaria, siendo más del 90% de estos
reportados en el África. Aproximadamente 2 millones de muertes por año son
atribuidas a esta enfermedad, la mitad de ellas, en niños menores de 5 años de
edad (UNDP/World Bank/WHO 1996).
Durante la etapa eritrocitaria, Plasmodium falciparum sintetiza diversas
proteínas algunas de las cuales son exportadas dentro del citoplasma del eritrocito.
Estas proteínas son solubles y se las detecta circulando en la sangre de los
pacientes infectado, ejemplo de estas proteínas son la proteína que unen
glicoforina (GBP), la proteína rica en histidina (HPRII), y la lactato deshidrogenasa
(pLDH) de Plasmodium falciparum. En la actualidad estas proteínas son utilizadas
para el desarrollo de pruebas rápidas para le diagnóstico de esta enfermedad.
Estos antígenos son secretados por la vía clásica de secreción de proteínas de
P.falciparum. Sin embargo, últimos estudios demuestran varias proteínas de
Plasmodium falciparum no son secretadas por esta vía sino por una vía
independiente denominada vía alterna de secreción. Esta vía de alterna de
secreción y las proteínas que son secretadas por medio de ésta no han sido
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caracterizadas, dada la importancia de estos antígenos secretados es necesario su
estudio detallado.
Investigaciones realizadas en la vía clásica de secreción de proteínas de P.
falciparum, así como el secuenciamiento del genoma total de este parásito, han
permitido postular una vía alternativa de secreción de proteínas, denominada vía
alterna. El conocer más sobre esta vía de secreción podría ayudar a elucidar
algunos mecanismos patogénicos de este parásito, así como permitiría encontrar
nuevos antígenos que podrían ser utilizados en pruebas ó métodos diagnósticos.
Plasmodium falciparum, es un parásito protozoo que infecta eritrocitos
humanos causando algunas veces malaria severa durante la etapa intraeritrocitica,
durante esta etapa el parásito sintetiza y secreta proteínas, las cuales son
exportadas a las células del huésped. Algunas de estas proteínas son importantes
en la detección del parásito debido a que se encuentra circulando en sangre
durante la infección.
P.falciparum, al igual que las células eucariotas secreta proteínas a su entorno
mediante una vía de secreción denominada clásica, toda proteína secretada que
es sintetizada directamente al lumen del Reticulo Endolplasmatico Rugoso, donde
sufre una serie de modificaciones como glicosilación, posteriormente mediante un
sistema de vesículas estas proteínas son transportadas al Aparato de Golgi y luego
son exportadas por medio de vesículas al exterior (Lodish, H et al; 1999)
Sin embargo, P.falciparum presenta algunas perculiaridades en su vía de
secreción clásica que los diferencia de los demás eucariontes superiores como por
ejemplo en su Reticulo Endolplasmatico (RE) el cual ha perdido algunos sistemas
de vesículas (Langreth, S.G. y colab 1978) y su Aparato de Golgi es un
compartimiento pequeño con estructuras parecidas a vesículas (Meis, J.F.G.M y
colaboradores 1983; Slomianny, C. y Prensier, G.1990). Además en Plasmodium
el RE y el aparato de Golgi parecen estar más desarrollados en los estadios
tardíos del ciclo replicativo.
Así es importante mencionar que algunos componentes proteicos de la vía
secretoria intracelular clásica han sido identificadas en Plasmodium esto incluye a
la ATPasa de calcio del RE, la proteína Sec 61alfa, un componente de la
translocación del poro en el RE denominado BiP, una chaperona en el lumen del
RE, denominada reticulobalbina, y una proteína que une calcio del RE denominada
ERD2 (Elmendorf, H.G. and Haldar, K,1993).
Entre las proteínas que secreta Plasmodium falciparum por la vía clásica de
secreción destaca la proteína rica en histidina (HRPII), la cual es hidrosoluble, y la
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proteína lactato deshidrogenasa de P.falciparum (pLDH) ambas empleadas en el
diagnóstico rápido de la malaria.
Actualmente con el conocimiento del genoma, nuevos marcadores y nuevas
tecnologías se ha podido especular de la existencia de una vía alterna de
secreción. Benting J, y colaboradores han estudiado esta vía utilizado como
marcador a la proteína de Plasmodium falciparum que une glicoforina (GBP), esta
proteína es normalmente secretada al citoplasma del eritrocito por vía clásica de
secreción. (Helms y Rothman 1992). Estos investigadores encontraron que en
presencia de Brefeldina A (BFA), inhibe las proteínas de secreción en organismos
eucariontes superiores por ruptura de la integridad del aparato de Golgi, la GBP no
fue transportada dentro del eritrocito, pero permanece dentro de la célula del
parásito. Los efectos causados por BFA fueron reversibles, y la proteína puedo ser
expulsada al citoplasma del eritrocito.
El efecto de la Brefeldina A en la secreción de proteínas de P.falciparum y la
identificación de genes que codifican proteína auxiliares indican una vía secretoria
dentro del parásito involucra el trafico de vesículas. Sin embargo, las proteínas de
secreción de P.falciparum tienen un número de peculiaridades: (i) Muchas
proteínas del parásito que están transportados a través de la membrana vacuolar
dentro del eritrocito del hospedero no contiene la secuencia de señal clásica N-
terminal (Foley and Tilley, 1998); (ii) Varias proteínas han sido reportadas ser
secretadas en presencia de BFA (Elmendorf et al., 1992; Mattei et al., 1999ª).(iii) El
tratamiento con BFA causa la formación de compartimientos parecidos a RE
(Wiser et al., 1997; 1999). Así mismo, Cortes et al 2003, ha reportado que
proteinas son localizadas a un único compartimento subcelular usando anticuerpos
monoclonales. Estos anticuerpos monoclonales reconocen proteínas de 68, 45 y
22 kDa que son conservadas en especies de Plasmodium de roedores. Estudios
de colocalización indican que estas proteínas son localizadas en compartimientos
inducidos por Brefeldina A en la etapa temprana de exportación de proteínas al
eritrocito infectado. Estas proteínas se co-localizan parcialmente con las proteínas
tipo COPII, Sar1p y Sec31p y la proteína chaperona BiP (Elmendorf et al., 1992;
Wiser et al., 1999) (Cortes et al, 2003).
MATERIAL Y MÉTODO
Diseño de estudio :
Estudio Descriptivo
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Material Biológico :
Cultivo de P. falciparum
La cepa referencial que se empleará en este trabajo corresponde a Plasmodium
falciparum FCR3 obtenido de un aislamiento africano (Gambia), asi mismo las
cepas 3D7, 7G8, D10, D6,Dd2 y W2. Estas cepas referenciales seran mantenidas
en cultivo in vitro mediante el método de Trager (1976). Las cepas han sido
clasificadas por Taxonomy Browser del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) como: Eucariota; Alveolata; Apicomplexa; Haemosporida;
Plasmodium; Plasmodium falciparum.
Con la finalidad de comparar los resultados obtenidos de las cepas referenciales
sé incluiran dos aislamientos peruanos (cepas masntenidas en cultivo in vitro) uno
proveniente de la Costa Norte y el otro de la Selva Peruana.
Para la inhibición de la vía clásica de secreción se utilizará BFA a una
concentración de 0.5 mg/ml.
a.- Purificación de proteínas secretadas al citoplasma del eritrocito
Las fracciones citosólicas de eritrocitos infectados por P. falciparum cepa FCR3
serán obtenidas en presencia de inhibidores de proteasas (Bottius E y colab.,
1998). La fracción citosólica será extraída según lo reportado (Clavijo CA y colab.,
1998). Las membranas seràn colectadas usando Percoll, lavadas con PBS
conteniendo inhibidores de proteasas. El pellet será resuspendido en PBS
conteniendo inhibidores de proteasas y 0.05% de saponina seguido de
centrifugación a 10000 g por 10 minutos, seguidamente el pellet será resuspendido
en 1% de Triton X-100 a 4°C y centrifugado nuevamente a 10000 g. La cantidad
de proteínas será cuantificada por el método de Lowry (Lowry O, et al , 1951).
RESULTADOS
a.- Establecimiento del Cultivo de P.falciparum
La cepa referencial que se empleó en este trabajo corresponde a Plasmodium
falciparum PSS1 (Brasil), FCR3 obtenido de un aislamiento africano (Gambia), así
mismo las cepas D6,7G8 y W2. Estas cepas referenciales seran mantenidas en
cultivo in vitro mediante el método de Trager (1976). Las cepas han sido
clasificadas por Taxonomy Browser del National Center for Biotechnology
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Information (NCBI) como: Eucariota; Alveolata; Apicomplexa; Haemosporida;
Plasmodium; Plasmodium falciparum.
Las cepas 7G8 , D6, W2,PSSI, HB3 y FCR3, fueron cultivadas in vitro con medio
RPMI 1640 suplementado con Glutamina, plasma humano y eritrocitos grupo O
positivo.
Mezcla de gases de 5% O 2, 10% CO2 y Nitrógeno 85%. Los cultivos fueron
incubados a 37°C y el medio de cultivo fue renovado diariamente.
Ver Figura N°1 a—d Mantenimiento y obtención de antígenos a gran escala.
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b. Proteínas secretadas al citoplasma del eritrocito
Las fracciones citosólicas de eritrocitos infectados por P. falciparum cepa FCR3
fueron obtenidas mediante cetrifugación y mediante lavados con el Buffer PSS 1X.
La cantidad de proteínas fue cuantificada por el método de Lowry (Lowry O, et al,
1951).
c. Inmunogenisidad de las proteínas citosolicas de P.falciparum
Las proteínas secretadas al medio han sido obtenidas y analizadas por
electroforesis en geles de poliacrilamida, a demás fueron transferidos a membrana
de nitrocelulosa, para evaluar su reactividad.
Proteínas totales a partir de cultivo PSSI fueron utilizadas para el ensayo de
inmunoblot , empleando un pool de sueros de pacientes positivos a P.falciparum.
Las proteínas fueron de bajo peso molecular de 5, 20 y 30 KDa. Ver Figura.
N°2.
d. Detección de HRPII (proteína secretada por la vía clásica de P. falciparum.)
Las proteínas citosólicas fueron evaluadas mediante ELISA para ver determinar
si estas proteínas eran secretadas. Así mismo se probó con diferentes fracciones
de las muestras sanguíneas de pacientes infectados con malaria falciparum.
Ver Tabla N° 1.
e. Extracción de ADN y Polimorfismo Genético.
Se extrajo ADN de las cepas utilizando columnas de purificación y se realizó el
análisis de polimorfismo. Ver Figura N° 3.
f. Genotipificación de la resistencia
El patrón molecular de resistencia para Cloroquina fue ADN fue analizado
resistencia a CQ empleando el marcador molecular de P.falciparum (pfCRT). Ver
Tabla N° 2.
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CONCLUSIONES
El cultivo continuo de cepas de P.falciparum Referenciales fue implementado mediante el método de Trager and Jensen.
La tasa mayor tasa de crecimiento de las cepas de P.falciparum PSS1 y FCR3 (cepas no clonadas) a diferencia de las cepas clonadas
Las proteínas secretadas al medio presentan un peso molecular bajo.
Las cepas presentan bandas únicas para marcadores polimorfismos MSA, GLURP, las cuales confirman que las cepas son puras y no presentan mezclas entre ellas.
Las cepas presentan las mutaciones asociadas a resistencia a antimaláricos pfCRT.
Lamentablemente por la falta compra de insumos no se pudo cumplir con los otros objetivos específicos del proyecto original.
Estrategias de divulgación
Estos resultados serán publicados en la revista de la Institución
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Figura 1 a. Manteniendo de cultivo de P.falciparum a gran escala para la obtención de proteínas citosólicas
Figura 1 b. Coloración de láminas para determinar el estadio de los parasitos
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Figura 1 c. Coloración de láminas de frotis
Figura 1 d. Coloración de Laminas
AAnniillllooss
EE
EE
EE
EE
EE
EE
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Figura N°2 . Electroforesis de proteínas de P.falciparum.1; Estándar de peso molecular; 2: cepa 7G8; 3. cepa D6 ; 4: cepa D6 ( medio completo con eritrocitos).
RESULTADOS DE ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9A 1.468 2.018 0.859 1.411 1.766 0.052 0.627 0.038 0.040B 1.491 1.933 0.785 1.239 1.75 0.051 0.595 0.040 0.040C 0.143 0.728 0.978 0.143 0.057 0.600 2.673 0.037 0.040D 0.14 0.657 0.986 0.122 0.050 0.660 2.597 0.04 0.041E 1.632 1.985 0.782 1.235 1.674 0.610 0.578 0.046 0.042F 1.645 1.641 0.837 1.279 1.504 0.055 0.523 0.051 0.031G 0.198 0.54 1.073 0.129 0.050 0.064 2.583 0.039 0.037H 0.18 0.485 1.036 0.121 0.057 0.074 2.601 0.051 0.043
g Monoclonal contra HRP II500 ng Monoclonal contra HRP IIDilución de los antígenos 1/25
Tabla N° 1. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas.
1155 KKDDaa
2255 KKDDaa
3355 KKDDaa
5500 KKDDaa
7755 KKDDaa
110000 KKDDaa
11 22 33 44
~~ 55 KKDDaa
~~ 2200 KKDDaa
~~ 3300 KKDDaa
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15
Cepa PSSI
1 2 3 4 5 6 7
sobrenadante cultivomedio de cultivo sin infectar
Sangre Perifierica
infectar
Eritrocitos s/infectar
Suero de Paciente
sangre total de Paciente
0.859 0.978 0.057 0.060 0.052 0.627 2.6731ug
0.785 0.986 0.050 0.066 0.051 0.595 2.5970.822 0.982 0.0535 0.063 0.0515 0.611 2.635
Tabla N° 1a. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 1ug)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Deteccion de HRPII por ELISA1ug de Monoclonal
Sobrenadante de Cultivo
Cultivo
medio de cultivo solo
Sabgre periferica
Eritrocitos sin infectar
Suero de Paciente
Sangre de Paciente
Grafico N° 1. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 1ug) empleando el Anticuerpo Monoclonal HRPII.
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16
1 2 3 4 5 6 7
sobrenadante cultivomedio de cultivo sin infectar
Sangre Perifierica
infectar
Eritrocitos s/infectar
Suero de Paciente
sangre total de Paciente
0.782 1.073 0.050 0.064 0.061 0.578 2.583500 ng
0.837 1.036 0.057 0.074 0.055 0.523 2.6010.8095 1.0545 0.054 0.069 0.058 0.551 2.592
Tabla N° 1b. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 500 ng)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Deteccion de HRPII por ELISA500ug de Monoclonal
Sobrenadante de Cultivo
Cultivo
medio de cultivo solo
Sabgre periferica
Eritrocitos sin infectar
Suero de Paciente
Sangre total de Paciente
Grafico N° 2. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 1ug) empleando el Anticuerpo Monoclonal HRPII
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Figura N°3. Electroforesis de productos de PCR . PM, 100 pb ladder; 2: cepa D6 (GLURP); 3. cepa D6 (MSA2); 4: cepa PSSI (MSP2); 5: cepa PSSI (GLURP).
Tabla N° 2.Perfil de Resistencia a la droga antimalarica: Cloroquina
PSSIFCR3
W2
D6
CQ-SHB3
Honduras
CQ R Brasil
CQ R Africa
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