INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ESCUELA NACIONAL DE DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
S
SE
“ INDUCCIÓN DE MIELOMA EN
RATONES BALB/c “
TESIS
QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA
OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
PRESENTA:
QBP. BERENICE SÁNCHEZ GONZÁLEZ
DIRECTOR DE TESIS:
DR. LUIS ANTONIO JIMENÉZ ZAMUDIO
México, D.F. Diciembre, 2010
El presente trabajo se realizo en el Laboratorio de Inmunología Clínica del Departamento de
Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas bajo la dirección del Dr. Luis
Antonio Jiménez Zamudio.
Se contó con el apoyo de becas: Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) clave
227288 y de Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del Instituto
Politécnico Nacional con clave de proyecto 20100406
DEDICATORIA
Porque: Toda carne es como hierba, y toda la gloria del hombre como flor de la hierba.
La hierba se seca, y la flor se cae; Mas la palabra del Señor permanece para siempre.
1ª Pedro 1:24-25
Dedicada a mis padres, hermanos y amigos.
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a mi Director de Tesis, el Dr. Luis Jiménez quien constituye la base de este
proyecto. Gracias a la Dra. Elba Reyes por todo el apoyo que me brindo. Gracias a los
Químicos Elena y Gustavo del hospital 20 de Noviembre, a la Dra. Lilia Domínguez y al Dr.
Víctor Hernández, por el apoyo en el proceso experimental. Gracias a la Dra. Ethel quien es
coordinadora del programa de Maestría y a la Dra. Laura Montiel por haber sido parte de mi
comité tutorial.
Gracias a mis niños de licenciatura, Ivon, Alejandro y Pedro, quienes me han ayudado mucho,
a Jessica, quien también forma parte de este proyecto. Gracias al Sr. Luis del Bioterio, por su
gran ayuda en el mantenimiento de los ratones. Gracias a Yolanda, por su apoyo en el
laboratorio de Inmunología molecular. Gracias a Araceli, por todo el apoyo administrativo que
siempre nos brinda a todos.
Gracias Maricela, por el tiempo y ayuda que me brindaste. Gracias amiga Erika, porque sin ti
no sé como lo hubiera logrado. Gracias amigo Emilio, por apoyarme en este trabajo. Gracias
amigas Alma y Dany, por su apoyo en el equipo, Gracias amiga y compañera de viaje Bere, por
apoyarme con las muestras. Amiga Alicia R, gracias por tu gran amistad. Gracias amigo
Mauricio por tu gran amistad y todos los ánimos. Gracias Marcelo, Margarita, Ángeles, Wendy,
Cesar, Ricardo, Minerva, Alicia, Adriana por su amistad.
Gracias a todos ustedes, por ser mis amigos y formar parte de esta etapa en mi vida.
Gracias amiga Erika y Juan por el apoyo incondicional que me brindaron desde el momento en
que los conocí. Gracias Química Silvia, por su apoyo en el laboratorio de Inmunología del
hospital 20 de noviembre.
Gracias a mis Padres y hermanos por su gran amor, dirección y apoyo, porque sin todo esto,
mis locuras no serian posibles.
Gracias Dios mío por ser el dueño de mi vida, porque tú eres mi fuerza y razón de existencia.
Gracias porque soy feliz al sentir que estás conmigo en donde quiera que voy. Gracias por
permitirme concluir esta etapa en mi vida, sin ti simplemente no hubiera sido posible.
i
ÍNDICE GENERAL Paginas
ÍNDICE GENERAL ............................................................................................................................... i
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................ iii
ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................................... iii
ABREVIATURAS ............................................................................................................................... iv
RESUMEN ........................................................................................................................................... vi
ABSTRACT ........................................................................................................................................ vii
I INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1
1.0 Generalidades del Mieloma Múltiple ........................................................................................... 1
1.1. Antecedentes del Mieloma Múltiple .................................................................................... 1
1.2. Epidemiología, etiología y patogénesis ................................................................................ 2
1.3. Microambiente de la médula ósea ........................................................................................ 3
1.4. Oncogenes y genes supresores ............................................................................................. 4
1.5. Características del Mieloma Múltiple .................................................................................. 5
1.6. Evaluación diagnostica del Mieloma ................................................................................... 6
1.6.1. Electroforesis de Proteínas ....................................................................................... 6
1.6.2. El ensayo de cadena ligera libre de inmunoglobulina sérica (FCL) ......................... 6
1.6.3. Estudios en Médula ósea .......................................................................................... 7
1.7. Tratamiento para el control del Mieloma ............................................................................. 7
2.0. Respuesta inmunológica ............................................................................................................. 8
2.1. Linfocitos Th1 y Th2 ............................................................................................................ 8
2.2. Linfocitos Th17 ................................................................................................................... 8
2.3. Linfocitos T reguladores .................................................................................................... 10
3.0. El Modelo de Plasmocitoma en ratón BALB/c ........................................................................ 12
3.1. Importancia del modelo de plasmocitoma .......................................................................... 12
3.2. Estandarización del modelo del Plasmocitoma Murino ..................................................... 13
3.3. Plasmacitogénesis ............................................................................................................... 13
3.4. Características de diagnóstico ............................................................................................ 17
3.5. Agente inhibidor del MPC ................................................................................................. 17
ii
4.0. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 18
5.0. HIPOTESIS .............................................................................................................................. 19
6.0. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................... 20
6.1. OBJETIVOS PARTICULARES ........................................................................................ 20
II MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................................................... 21
III RESULTADOS ............................................................................................................................. 28
IV DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 42
V CONCLUSIÓN ............................................................................................................................. 46
VI EXPECTATIVAS PARA TRABAJOS FUTUROS ................................................................... 47
VII BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 48
iii
ÍNDICE DE FIGURAS Paginas
Figura 1. Esquema de Inducción de mieloma en ratones de las cepas BALB y C57BL ................... 22
Figura 2. Imagen del glomérulo renal de ratones BALB/c ............................................................... 28
Figura 3. Imagen de la zona perivascular en riñón de ratón BALB/c ............................................... 29
Figura 4. Imagen del corte histológico de bazo de ratones BALB/c ................................................. 29
Figura 5. Cortes histológicos de intestino delgado de ratón BALB/c ............................................... 30
Figura 6. Análisis densitométrico del suero humano como control .................................................. 33
Figura 7. Análisis densitométrico del suero de ratón BALB/c ................................................... 33
Figura 8. Análisis densitométrico del suero de ratón C57BL .................................................... 34
Figura 9. Niveles de la fracción Gamma globulinas ................................................................... 35
Figura 10. Niveles de la fracción Beta globulinas ....................................................................... 36
Figura 11. Niveles de la fracción Alfa-2 globulinas ..................................................................... 37
Figura 12. Niveles detectables y no detectables de IL-6 en líquido peritoneal de ratones
BALB/c y C57BL .............................................................................................................................. 39
Figura 13. Niveles detectables y no detectables de IL-10 en líquido peritoneal ratones
BALB/c y C57BL .............................................................................................................................. 39
Figura 14. Niveles detectables de TGF-β en ratones BALB/c y C57BL .................................. 40
Figura 15. Comparación de los niveles de IL-6, IL-10 y TGF-β entre BALB/c y C57BL
inducidos ........................................................................................................................................... 40
Figura 16. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre los testigos e
inducidos de BALB/c ....................................................................................................................... 41
Figura 17. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre los testigos e
inducidos de C57BL ........................................................................................................................ 41
Figura 18. Propuesta de interacciones que ocurren en la cavidad peritoneal del ratón
BALB/c y C57BL .............................................................................................................................. 45
ÍNDICE DE FIGURAS
Tabla 1. Proteínas totales de los ratones BALB/c y C57BL ...................................................... 31
iv
ABREVIATURAS
Ab Anticuerpos
Avidin-HRP Avidina-Peroxidasa de rábano
AcMo Anticuerpo monoclonal
BJ Proteínas de Bence Jones
BFA Brefeldina A
CP Célula Plasmática
DCs Células Dendríticas
GTRI Factor de necrosis tumoral inducido por esteroides
H-E Hematoxilina-Eosina
HFG Factor de crecimiento de hepatocitos
IGF-1 Factor-1 de crecimiento tipo insulina
IL Interleucina
LPS Lipopolisacarido
MGUS Gammapatía monoclonal de significado incierto
MIP-1alfa Proteína inflamatoria de macrófagos 1alfa
MM Mieloma Múltiple
MO Médula ósea
MP Melfalán con Prednisona
MPC Plasmocitoma Murino
OAF Factores activadores de osteoclastos
PMA Forbol 12-Miristato 13-Acetato
PGE2 Prostaglandina E2
PT Proteínas Totales
PTHrP Péptido asociado con la paratohormona
TGF- β Factor de crecimiento de transformación beta
TMB Tretrametilbenzidina
v
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa
VAD Vincristina, Adriamicina y Dexametasona
VCAM Moléculas de adhesión celular vascular
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
vi
RESUMEN
Introducción. El mieloma múltiple (MM) es un cáncer de células plasmáticas que afecta a
hombres y mujeres con una edad promedio de 65 años. La anemia, infecciones, lesiones
óseas, hiperviscosidad y daño renal, son las manifestaciones clínicas más características.
A pesar de que hoy en día existen varios medicamentos innovadores para el tratamiento
del MM, aún es una enfermedad incurable, razón por la cual, es necesario seguir
realizando investigación. Justificación. El modelo murino es útil para el estudio de las
interacciones inmunológicas que se desencadenan en la cavidad peritoneal del ratón
susceptible BALB/c, puesto que no se conocen aún. Así se espera que el estudio más
detallado de este modelo permita aplicar dicho conocimiento en la comprensión del
mieloma humano. Objetivo. Determinar la posible correlación entre las citocinas presentes
en la cavidad peritoneal y la susceptibilidad del ratón BALB/c a desarrollar mieloma.
Material y métodos. Se estudiaron 13 ratones de la cepa BALB/c y 16 ratones de la cepa
C57BL. La inducción de MM, se realizó mediante inyección intraperitoneal de 3 dosis de
0.5 mL de aceite mineral, a los 2,4 y 6 meses de edad. A los 8 meses de iniciado el
tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron el riñón, el bazo y el intestino
delgado; se obtuvo suero a partir de punción cardiaca y se realizaron lavados de la cavidad
peritoneal con medio de cultivo RPMI. De los órganos obtenidos únicamente de la cepa
BALB/c, se realizaron cortes histológicos y se tiñeron por la técnica de H-E. Se analizaron
los niveles de la fracción gamma globulina, beta globulina y alfa-2 globulina mediante la
electroforesis de proteínas en el suero de cada ratón. El líquido peritoneal, se centrifugó
para obtener los sobrenadantes de cada ratón y se determinó la concentración de las
citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β mediante un solo ensayo, por duplicado, por el método de
ELISA. Resultados. En los cortes histológicos de ratones BALB/c inducidos, se observó
una infiltración de tipo linfoide en todos los órganos estudiados. En BALB/c inducido,
únicamente el nivel de gamma globulina se observó incrementado, mientras que en C57BL
inducido, se observaron incrementados tanto el nivel de gamma globulina como los niveles
de beta globulina y alfa-2 globulina. Con respecto a la determinación de la concentración
(pg/mL) de las citocinas estudiadas, en BALB/c se observó una concentración alta de TGF-
β en inducidos y testigos, una disminución de la concentración de IL-10 cuando el ratón fue
inducido y un incremento de la concentración de la IL-6 cuando el ratón fue inducido. En
C57BL, también se observó una concentración alta de TGF-β en inducidos y testigos, sin
embargo la concentración de las citocinas IL-10 e IL-6 se incrementó cuando el ratón fue
inducido. Conclusiones. Las alteraciones histológicas encontradas en la cavidad
peritoneal y en los órganos analizados del ratón BALB/c inducido con aceite mineral, así
como la presencia de citocinas inflamatorias, son indicadores de un proceso inflamatorio
crónico evidente.
vii
ABSTRACT
Introduction. The multiple myeloma (MM) is a cancer of plasmatic cells which affect both
men and women who are 65 years old as an average. Anemia, infections, bone lesions,
hyperviscosity and renal damage are the most typical clinic manifestations. In spite of the
fact that nowadays there are several innovative medicaments for the treatment of MM, it’s
still an incurable disease, which makes necessary to go on doing research. Justification.
The murine model is useful for the study of the immunologic interactions that are triggered
in peritoneal cavity of susceptible BALB/c mouse, since it’s still unknown. Thus it is
expected that more detailed study of this model allows to apply this knowledge in the
understanding of human myeloma. Objective. To determine the possible correlation
between the cytokines present in the peritoneal cavity and the susceptibility of BALB/c
develop myeloma. Material and Methods. We studied 13 mice of the BALB/c strain and 16
mice of the C57BL strain. Induction of MM was done by means of 3 0.5 mL doses of
mineral oil intraperitoneal injection at 2, 4, and 6 months of age. At 8 months, mice were
sacrified and organs as kidney, spleen and small intestine were obtained, serum samples
were collected by cardiac puncture, and washes were performed with a RPMI culture
medium. Of the organs, that were obtained only on BALB/c strain, histological sections
were made and stained by H-E technique. We analyzed the levels of gamma globulin
fraction, beta globulin and alpha-2 globulin by electrophoresis of proteins in the serum of
each mouse. The peritoneal liquid was centrifuged to get the supernatants and the IL-6, IL-
10 and TGF-β cytokines concentrations were determined by a single assay in duplicate by
the ELISA test. Results. In histological sections of induced BALB/c mice, we observed an
infiltration of lymphoid type in all organs studied. In induced BALB/c, only the level of
gamma globulin was found increased, whereas in C57BL induced, the level of gamma
globulin and levels of beta globulin and alpha-2 globulin were observed increased. With
respect to the determination of the concentration (pg/mL) of cytokines studied, in BALB/c,
we observed a high concentration of TGF-β in induced and witnesses, a decreased
concentration of IL-10 when the mouse was induced and increased concentration of IL-6
when the mouse was induced. In C57BL, there was also a high concentration of TGF-β in
induced and witnesses, but the concentration of cytokines IL-10 and IL-6 was increased
when the mouse was induced. Conclusions. The histological alterations found in the
peritoneal cavity and analyzed organs of BALB/c mice with mineral oil, and the presence of
inflammatory cytokines, are indicators of a chronic inflammatory process evident.
1
I INTRODUCCIÓN
1.0. Generalidades del Mieloma Múltiple
El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad caracterizada por proliferación clonal de células
plasmáticas y presencia de una proteína monoclonal (proteína M) en suero y/u orina.
Constituye aproximadamente 10% de todas las neoplasias hematológicas y se caracteriza por
destrucción ósea, anemia, hipercalcemia e insuficiencia renal (Conte, 2006; Labardini-Méndez y
Díaz-Vargas, 2009).
1.1. Antecedentes del Mieloma Múltiple
La evidencia más antigua de la existencia del mieloma son los estudios realizados en las
momias egipcias. En 1489, Otto Kahler estudió un caso y publicó una revisión que se dio a
conocer como la enfermedad de Kahler (citado por Díaz-Maquero, 2006). El Dr. Samuel Sully
asignó el nombre de “mollitis ossium” y es el primero en describir la enfermedad en la literatura
moderna; el reporte médico publicado 1845, describe el primer caso de Thomas Alexander Mc
Bean de 44 años, mientras que el segundo caso corresponde a Sarah Newburg de 39 años
(citado por Díaz-Maquero, 2006). Las proteínas de Bence Jones (BJ) fueron así llamadas por el
Dr. Henry Bence Jones en 1847, quien estudio especímenes de orina proporcionados por los
Doctores Macintyre y Watson (citado por Díaz-Maquero, 2006). El Dr. John Dalrymple, informó sus
hallazgos detectados en los huesos humanos y realizó dibujos de las células encontradas en
éstos (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1873, Rutizky, describió otro paciente y utilizó por
primera vez el termino Mieloma Múltiple para resaltar las variadas lesiones óseas que estaban
presentes (citado por Díaz-Maquero, 2006). El término de célula plasmática fue utilizado por el
patólogo alemán Wilhem von Wakdeyer-Hartz (1836-1921), aunque en 1890, Ramón y Cajal
las describe con precisión (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1894, fue publicado el primer caso
en EU por los Doctores Herrick y Hekto (citado por Díaz-Maquero, 2006). Hasta 1900, James
Homer Wright (1869-1928), publica sus descubrimientos relacionados con plasmocitos, que son
células malignas que se encuentran en médula ósea (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1927
Arinkin, destacó la importancia del aspirado de médula ósea en el diagnóstico de mieloma
múltiple (citado por Díaz-Maquero, 2006). Perlzweig y cols. en 1928, reportan hiperglobulinemia
en un paciente. En ese mismo año Geschikter y Copelan, reportaron 13 casos y revisaron 412
que se habían publicado hasta entonces. Para 1938 Rusenthal y Vogel confirman dicha
aseveración (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1933 Wintrobe y Buil, reconocieron la presencia
de crioglobulinemia, sin embargo fue hasta 1947 que se introdujo este término por Lerner y
Watson (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1939 Longsworh y cols., emplearon la electroforesis
2
en el estudio del mieloma demostrando la presencia de un pico monoclonal. Kunkel demostró
que las proteínas monoclonales son producidas por los plasmocitos malignos (citado por Díaz-
Maquero, 2006). La terapia del mieloma se inició en 1958, cuando Blokhin y cols., reportaron
resultados exitosos con la mostaza I-fenilalanina, llamada en ese entonces sarcolisina (citado
por Díaz-Maquero, 2006). En 1962, ya con el nombre de melfalán, Blokhin y cols., reportaron que
inducía remisiones en un tercio de pacientes con mieloma (citado por Díaz-Maquero, 2006). En
1999, el Myeloma Trialists’ Colaborative Group demostró que solo la combinación del
Melfalán/Prednisona era eficaz (citado por Díaz-Maquero, 2006).
1.2. Epidemiología, etiología y patogénesis
El mieloma múltiple (MM) es la gammapatía monoclonal más importante (Borbolla-Escoboza y
Salazar, 2006). Representa cerca del 1% de todas las neoplasias y el 10% de los tumores
hematológicos y se presenta sobre todo en pacientes mayores de 65 años de edad. Se estima
que la frecuencia de la enfermedad es de entre tres y cuatro casos por cada cien mil personas
por año. Parece que existe una mayor incidencia de mieloma entre varones de raza negra; esta
llega a ser de nueve por cada cien mil personas por año. La incidencia en pacientes femeninos
de esta misma raza se calcula en seis por cada cien mil personas por año (Borbolla-Escoboza y
Salazar, 2006; Bujan, 2006). En el año 2002, las leucemias, los linfomas y el mieloma múltiple se
ubicaron dentro de las primeras veinte causas de mortalidad por neoplasias malignas a nivel
mundial, representando el 3.6% del total de las defunciones registradas. La distribución de la
mortalidad por edad fue muy similar a la observada en la incidencia, es decir, la tendencia de la
mortalidad por estas entidades nosológicas fue ascendente de acuerdo con la edad,
alcanzando su nivel máximo en el grupo de 65 años y más. La mortalidad por leucemia linfoide
y mieloide en México, para el 2002, fue del 4.6% respecto del total de defunciones registradas,
ubicándose el MM dentro de las primeras quince causas de mortalidad por neoplasias malignas
(Tirado-Gómez y Mohar, 2007). En MM existen varias etapas, la primera es la “indolente”,
conocida como gammapatía monoclonal de significado incierto (Monoclonal gammapathy of
unknown significance, MGUS), que es asintomática. La segunda etapa es evidente por el
aumento progresivo de la proteína monoclonal o aparición y daño a ciertos órganos. En la
etapa agresiva o terminal, las células del mieloma se vuelven independientes del estroma de la
médula ósea, y hay un aumento en la velocidad de proliferación (Borbolla-Escoboza y Salazar,
2006).
3
1.3. Microambiente de la médula ósea
Por otra parte, el microambiente medular desempeña un papel importante en la patogénesis del
MM, de ahí que la destrucción ósea se presenta en la mayoría de los pacientes con MM. Una
vez que las células del MM se adhieren al estroma medular mediante moléculas de adhesión
celular vascular (VCAM-1), las células estromales, inician la producción de citocinas como las
interleucinas IL-6, IL-1, IL-11, factor de necrosis tumoral, y la proteína inflamatoria de
macrófagos 1alfa (MIP-1alfa). A su vez, las células del MM secretan otras citocinas: el factor de
crecimiento de hepatocitos (HFG) y el péptido asociado con la paratohormona (PTHrP). Todas
estas sustancias en conjunto son llamados “factores activadores de osteoclastos” (OAF, por
sus siglas en inglés). Los OAF inducen la formación de osteoclastos de forma indirecta,
mediante estimulación de las células estromales de la médula ósea, para que se expresen
niveles elevados del ligando RANK en su superficie. Este ligando se une a su receptor en las
células precursoras de los osteoclastos e inducen su maduración y diferenciación (Borbolla-
Escoboza y Salazar, 2006; Babatunde, 2007).
La secreción paracrina y autocrina de citocinas, tales como IL-6, TNFα, IL1-β y factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), son igualmente importantes en la regulación de la
biología del MM (Piazza y cols., 2007). La IL-6, es esencial en la proliferación de células
plasmablásticas normales y en la diferenciación terminal del plasmoblasto a célula plasmática.
En MM, la IL-6 es el principal factor de supervivencia celular y no induce diferenciación terminal
(Borbolla-Escoboza y Salazar, 2006). El TNFα es producido por células plasmáticas del MM, y su
actividad se debe a la sobrerregulación de moléculas de adhesión en células del MM y células
estromales de la médula ósea. El TNFα, presente abundantemente en el microambiente de la
médula ósea, activa al NF-ƘB resultando en secreción de IL-6, sobrerregulación de señales
antiapoptóticas (Bcl-XL) y expresión de moléculas de adhesión (ICAM-1 y VCAM-1) (Cavallo y
cols., 2006). El VEGF, que es producido por las células del MM y del estroma de la médula
ósea, estimula la angiogénesis, la proliferación de las células plasmáticas del MM y la
secreción de citocinas en médula ósea. El IGF-I producido en el microambiente de la médula
ósea estimula la proliferación de células plasmáticas del MM, la resistencia a fármacos e induce
migración de las células plasmáticas del MM. Otras citocinas involucradas en el crecimiento,
supervivencia y migración en MM son SCF1α, TGF-β, y la IL1β, las cuales pueden influir en el
crecimiento de las células plasmáticas del MM y en el microambiente de la médula ósea (Piazza
y cols., 2007).
Los datos obtenidos por citometría de flujo y análisis por hibridización fluorescente in situ
(FISH), indican la presencia de anormalidades citogenéticas en al menos 90% de los pacientes
4
con MM. Las translocaciones del cromosoma 14q32 que involucran la cadena pesada de las
inmunoglobulinas son un hallazgo reciente, importante en la patogenia del mieloma. La
hipodiploidía y deleción del cromosoma 13 mostró que ambas anormalidades están asociadas
de forma independiente con el mal pronóstico de la enfermedad (Borbolla-Escoboza y Salazar,
2006). Se recomienda la combinación de CD38 y CD138, como criterio eficiente para definir e
identificar de forma precisa la población de CP mediante citometría de flujo (Mateo y cols., 2006).
1.4. Oncogenes y genes supresores
La desregulación de oncogenes y genes supresores que controlan la proliferación celular,
supervivencia y apoptosis, contribuyen a la patogénesis del MM. Los genes supresores
tumorales, CDKN2A y CDKN2B se localizan en cromosoma 9p21, y codifican para los
inhibidores dependientes de ciclína-cinasa, p16 y p15 respectivamente. Tanto p15 como p16
están hipermetilados en MM, y por ello, desactivados. También los niveles de p21 y p27 se
encuentran incrementados en pacientes con MM, quizá por activación constitutiva de la vía
STAT-3. Ellos protegen a las células mielomatosas de la apoptosis induciendo paro del ciclo
celular y permitiendo la reparación subsecuente del DNA. La mutación del oncogén ras en MM
es de 40 % y es probable que dichas mutaciones provoquen independencia de las células de
mieloma de citocinas externas como IL-6 e IGF, y sea este uno de los primeros mecanismos
que adquieren las células para convertirse en estroma-independiente (Bezieau y cols., 2001). La
proteína c-myc participa en regulación de la transcripción génica de células normales y
neoplásicas. Desempeña un papel en el control de la proliferación, diferenciación y apoptosis.
La desregulación del gen c-myc es frecuente en canceres humanos y murinos; se encuentra en
más del 70% de todos los canceres incluyendo el de mama, ovario, próstata, colon, hígado, y
cáncer gástrico; neuroblastoma; mieloma y linfoma de Burkitt (Guffei y cols., 2007). Las
translocaciones más comunes asociadas con este gen son t (8; 14), t (2; 8) y t (8,22). Debido a
que en modelos de plasmocitoma murino se han encontrado con frecuencia translocaciones
que involucran a c-myc, se pensaba que ocurriría lo mismo en MM. Sin embargo, se ha
observado que esto no es así. Hoy se cree que esas alteraciones son sucesos secundarios que
ocurren en etapas tardías de la enfermedad (Santana-Dávila y Fonseca, 2006). El proto-oncogén
BCL-2 previene la apoptosis; se ha publicado que MCL-1, más que BCL-2 o BCL-X es esencial
en la supervivencia de las células de mieloma (Puthier y cols., 1999). Las mutaciones del gen o la
proteína Rb contribuyen a la transformación celular en muchos tipos de neoplasias. El gen
supresor tumoral del retinoblastoma (Rb) se localiza en el cromosoma 13q14. Algunos estudios
sugieren que la deleción de Rb es frecuente en mieloma. La incidencia total de mutaciones en
p53 es menor a 10% en pacientes con MM y se asocian con etapas terminales de la
enfermedad. La proteína CD95 (antígeno Fas) es una proteína transmembrana que induce
apoptosis cuando está unida al ligando Fas. Las células de mieloma sobrerregulan el ligando
5
Fas y conducen a apoptosis de eritroblastos, lo que sería una explicación factible, aunque con
seguridad incompleta para la anemia observada en mieloma (Borbolla-Escoboza y Salazar, 2006).
1.5. Características clínicas del Mieloma Múltiple
Cada proteína M consiste de dos polipéptidos de cadena pesada de la misma clase (γ IgG, α
IgA, µ IgM, δ IgD, ε IgE) y dos polipéptidos de cadenas ligeras (kappa o lambda) del mismo
tipo. En la electroforesis esta proteína M se detecta como un pico monoclonal (kyle, 2006). En
cerca del 60% de los pacientes con MM se puede detectar IgG monoclonal (>3.5 g/dl); 20%
tiene IgA monoclonal (>2 g/dl); y 20% sólo cadenas ligeras de inmunoglobulinas monoclonales.
Una pequeña proporción de pacientes tiene MM no secretor, en el que las células plasmáticas
neoplásicas no secretan cantidades significativas de inmunoglobulinas monoclonales. Son
raros los casos de MM de tipo IgD, IgE o IgM o biclonal. Sin embargo, un estudio realizado en
la clínica Mayo en 2004, la clase IgM es incluso mayor que la clase IgA. En general los
pacientes con MM tienen proteinuria de Bence Jones debido a la excreción por orina de
cadenas ligeras en cantidades mayores de 1 g en 24 horas (Bujan, 2006). La proteína de Bence-
Jones se forma por dímeros de cadenas ligeras, sea kappa o lambda, procedentes de
inmunoglobulinas. Esta proteína fue reconocida por Henry Bence-Jones en 1847, debido a sus
propiedades inusuales de solubilidad: precipita al calentar a 40-60oC pero se solubiliza
nuevamente cuando se calienta hasta la ebullición. El peso molecular de la proteína es bajo, de
modo que se filtra fácilmente por los glomérulos (Sister, 1987).
La presentación clínica es variada y, en ocasiones, el diagnóstico de MM sintomático se retrasa
varios meses. Los datos clínicos y de laboratorio son: síntomas óseos por fracturas vertebrales
debidas a lesiones óseas; insuficiencia renal que aparece cuando la capacidad de reabsorción
tubular se agota, lo que produce una nefritis intersticial; anemia, de manera característica
normocítica normocrómica, debido a un amento de las CP tumorales dentro de la MO;
hipercalcemia provocada por la destrucción del hueso; infecciones bacterianas recurrentes, por
deficiencia inmunitaria normal; hiperviscosidad que se debe al contenido de proteínas
monoclonales. El MM puede afectar sitios extramedulares, como hígado, ganglio, bazo,
riñones, tejidos cutáneos y subcutáneos, meninges y parénquima cerebral, lo cual genera
morfología inmunoblástica, cifras elevadas de deshidrogenasa láctica (DHL) y de β2-
microglobulina (β2-m) (Labardini-Méndez y Díaz-Vargas, 2009).
6
1.6 Evaluación diagnostica del Mieloma
El sello distintivo del MM sigue siendo la detección de la proteína M en sangre u orina (proteína
de Bence Jones).
1.6.1. Electroforesis de proteínas
La electroforesis de proteínas en suero define las siguientes bandas: banda de prealbúmina;
banda difusa, por delante de la albúmina, poco visible y constituida por la prealbúmina y la
proteína fijadora del retinol, la banda de la albúmina; representa el 50%, es la proteína más
abundante del plasma, la banda de α1-globina; está formada por α1-antitripsina, α1-
glucoproteína, transcortina, α1-lipoproteína, y α-fetoproteína, siendo las dos primeras las que
representan el mayor porcentaje de la misma; la banda de α2-globulina; está integrada por α2-
macroglobulina, haptoglobina y ceruloplasmina, la banda de las β-globulinas; las proteínas más
importantes son transferrina, hemopexina, β-lipoproteína y c3 nativo y la banda de γ-globulina;
formada por las tres principales inmunoglobulinas IgG, IgA y IgM; en ausencia de una
gammapatía monoclonal, su estimación electroforética solamente aportará información sobre la
concentración sérica, sobre todo de la IgG. Su elevación puede ser policlonal, donde las
inmunoglobulinas se elevan dando lugar a una curva simétrica, o bien moclonal, donde aparece
un pico correspondiente a la síntesis de una sola cadena de inmunoglobulinas. La elevación
policlonal de IgA da lugar a lo que se llama puente βγ-globulina (Cidoncha-Gallego y cols., 2001).
La proteína M (una cadena pesada + una cadena ligera) usualmente se observa en el trazo
densitométrico como una banda densa y discreta en el gel de agarosa, como un pico estrecho y
alto en las regiones gamma, beta o alfa-2 de las globulinas. Por el contrario, un exceso de
inmunoglobulinas policlonales (una o más clases de cadena pesada y ambas cadenas ligeras
(kappa y lambda) producen una banda ancha o pico de base ancha limitado a la región
gamma (Kyle y cols., 1981). En MM la electroforesis de proteína revela una banda localizada en
el 80% de los pacientes. El 20% restante de los pacientes presentara otra
hipogammaglobulinemia o un patrón normal (Caers y cols., 2008).
1.6.2. El ensayo de cadena ligera libre de inmunoglobulina sérica (FCL).
Este ensayo mide los niveles de los dos tipos de cadenas ligeras kappa y lambda secretadas
por las células plasmáticas. Una relación anormal de FCL Kappa-lambda indica un exceso de
un tipo de cadena ligera y tiene que ser interpretado como un desorden clonal (Caers y cols.,
2008).
7
1.6.3. Estudios en Médula ósea.
Estudios de médula ósea, sangre, orina y radiografías son necesarios para diagnosticar el
estado, seguimiento de la enfermedad y determinar el pronóstico. El diagnóstico finalmente es
confirmado por demostración de células plasmáticas malignas en el examen citológico de la
médula ósea o tejido blando con plasmocitoma, con clonalidad generalmente establecida por
inmunohistoquímica o citometría de flujo. Además de demostrar la presencia de células de MM,
en la biopsia de la médula ósea se evalúa su organización arquitectónica, índice de
proliferación, patrón de crecimiento y tipo celular, o la posible presencia de depósitos amiloides;
todos con valor pronostico (Caers y cols., 2008). La médula ósea (MO) es la fuente usual de
obtención de la muestra en MM, ya que es donde habitualmente se localizan las células
plasmáticas (CP) malignas. Para establecer el diagnóstico de MM, se debe realizar un aspirado
de médula ósea (AMO) en el que se requiere 10% de células plasmáticas anormales, aunque
puede ser más bajo, por lo que hay que hacer una búsqueda cuidadosa porque la infiltración en
MO no es homogénea, aunque tienen que mostrar la característica morfológica de CP
alteradas. En las células plasmáticas (CP) de MM, pueden llegar a observarse inclusiones
como esférulas citoplásmicas hialinas (cuerpos de Russell) y cuerpos de inclusión
intranucleares. Las células de Mott y aquéllas con forma de mórula parecen agregados de
cuerpos de Russell (Labardini-Méndez y Díaz-Vargas y Díaz, 2009).
1.7 Tratamiento para el control del Mieloma.
Entre 1958 y 1962 se inicia la era del tratamiento efectivo para MM, y el melfalán fue el primer
agente utilizado con éxito. Sin embargo, los resultados se mejoraron cuando se empezó a
utilizar la combinación de melfalán con prednisona (MP). La combinación de vincristina,
adriamicina y dexametasona (VAD) tiene mejores resultados. Sin embargo, este tratamiento es
costoso y puede presentarse neuropatía por vincristina y cardiotoxicidad. La combinación de
talidomida con dexametasona se puede considerar hoy como una terapia útil y de primera
elección para pacientes que serán sometidos a un trasplante autólogo de células
hematopoyéticas. Hoy en día existen otros medicamentos innovadores como el bortezomib,
lenalidomida, anticuerpos monoclonales anti Bcl-2, y otros (Gómez-Almaguer, 2006). Sin
embargo, el MM sigue siendo una enfermedad incurable con una mediana de supervivencia de
aproximadamente 33 meses. El mayor problema en MM es la resistencia a la terapia larga de
quimioradiación junto con la enfermedad ósea, las cuales son fuentes de gran morbilidad
(Piazza y cols., 2007).
8
2.0. Respuesta inmunológica en el mieloma
Una respuesta antitumoral adecuada depende de la correcta detección de células tumorales y
de la capacidad para provocar una respuesta efectiva del sistema inmune del individuo. En los
pacientes con MM ninguna de estas dos condiciones se cumple, debido a que existen
alteraciones fenotípicas y funcionales en linfocitos B, linfocitos T, macrófagos, células NK y
células dendríticas (Vela-Ojeda, 2006).
2.1. Linfocitos Th1 y Th2
Las clonas de células Th pueden dividirse en dos tipos principales con distintos fenotipos de
secreción de citocinas. Esto tiene sentido biológico, ya que las células Th1 que producen
citocinas como IFNγ serían especialmente eficaces contra infecciones intracelulares producidas
por virus y microorganismos que crecen en macrófagos, mientras que las células Th2 son muy
buenas colaboradoras de las células B, y parecieran estar adaptadas para la defensa contra los
parásitos que son vulnerables a IgE inducida por IL-4, eosinofilia inducida por IL-5 y
proliferación de mastocitos estimulada por las IL-3 y 4. Las células presentadoras de antígeno,
y en particular las células dendríticas, parecen ser fundamentales para impulsar la
diferenciación hacia un fenotipo Th1 o Th2. La IL-12 es particularmente importante para la
producción de células Th1, y la IL-4 para la producción de células Th2. La invasión de las
células fagocíticas por patógenos intracelulares induce la secreción de IL-12, que a su vez
estimula la producción de IFNγ. Estas dos citocinas impulsan de forma selectiva la
diferenciación del desarrollo de Th1 e inhiben las respuestas Th2. La cantidad de IL-4 en
relación con las de IL-12 e IFNγ tienen importancia fundamental para determinar la
diferenciación de las células Th0 en Th1 o Th2 (Roitt, 2001).
2.2. Linfocitos Th17
Hace pocos años se detectó una nueva célula, Th17 CD4+, esencialmente caracterizada por la
producción de IL-17 (Romagnani, 2008). La IL-17 (también conocida como IL-17A) fue
identificada en 1995 como una citocina producida por células T de memoria activadas
CD45RO+. La IL-17F presenta una secuencia de aminoácidos homologa a la IL-17A, por lo que
se considera que ambas interleucinas están estrechamente ligadas. La IL-17 (A y F) induce la
producción de un amplio rango de citocinas y quimiocinas proinflamatorias incluyendo la IL-6,
9
factores estimulantes de colonias, quimiocinas, 2-defensina-β y metaloproteasas (Voo y cols,
2009). Por lo tanto, ambas citocinas son muy importantes para la producción, activación y
migración de los neutrófilos. Las células Th17 están presentes en ratones y humanos, pero sus
características fenotípicas y funcionales, así como los mecanismos responsables para su
desarrollo en las dos especies parecen ser diferentes (Romagnani, 2008). Así las Th17 en ratón
promueven la autoinmunidad y en humano están implicadas en la patogénesis de las
enfermedades inflamatorias (Zhou y cols., 2008). En humanos los niveles de IL-17 se han
asociado con enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide, esclerosis, uveítis,
asma y lupus eritematoso sistémico. En ratones, la IL-17 contribuye al desarrollo de encefalitis
autoinmune, artritis y colitis (Voo y cols., 2009). La diferenciación de las células Th17 es
inducida por la combinación de IL-6 y TGF-β y se incrementa por inducción de IL-21, la cual
actúa de manera autocrina (Voo y cols., 2009). Algunos reportes indican que la IL-23 parece ser
requerida para amplificar o estabilizar el fenotipo de las células Th17. La IL-1β y el TNF,
también se encontraron amplificando la respuesta de Th17 inducida por TGF-β e IL-6. Algunos
investigadores, encontraron que la IL-6 y el TGF-β sobrerregulan la expresión del RORγt, pero
no inducen diferenciación de Th17 en humanos. Contrariamente, la IL-23 promueve la
generación de células Th17 en humanos, y también es un inductor de otras citocinas
proinflamatorias (Romagnani, 2008). La IL-23 se produce por la activación de células dendríticas
(Zhou y cols., 2008). Algunos investigadores, encontraron que la IL-1 β o IL-23 son suficientes
para inducir el desarrollo de células productoras de IL-17. La función principal de las citocinas
producidas por las células Th17 es la de ser quimioatrayantes para diferentes tipos celulares a
través de la inducción de otras citocinas y quimiocinas. Las células Th17 también producen IL-
22 e IL-26, pero la función de esta última no se conoce claramente, por otro lado la IL-22, es
miembro de la familia IL-10 que se encontró está fuertemente sobre regulado en desordenes
inflamatorios crónicos (Romagnani, 2008). La IL-22 puede producir psoriasis y acantosis. La
diferenciación de las células Th17 se induce por combinación de IL-6 y TGF-β y se aumenta
por inducción de IL-21, la cual actúa de manera autocrina. La señalización inducida por dichas
citocinas resulta en fosforilación de STAT3 y expresión del receptor huérfano ROR γt, factor de
transcripción que se requiere para la expresión de IL-17 (Voo y cols, 2009).
Ahora se sabe que en respuesta a algunos patógenos o sus componentes, las células
dendríticas que son responsables de presentar antígenos a las células T, también secretan
interleucina IL-6 y TGF- β para la diferenciación de las células Th17. Algunos experimentos
muestran que las células dendríticas que fagocitan células apoptóticas infectadas o células B
apoptóticas, secretan TGF- β, IL-6, IL-23, las cuales inducen diferenciación de las células Th17
encargadas de promover la inflamación. Mientras que las células dendríticas que fagocitan
10
células apoptóticas no infectadas producen TGF- β e IL-10, promoviendo la diferenciación de
células T reg. Debido a esto se propone que la resolución de la inflamación seguida de
fagocitosis de células apoptóticas se acompaña de supresión activa de las citocinas que
estimulan la inflamación (Stockinger, 2009).
2.3. Linfocitos T reguladores
Las células T reguladoras se caracterizan por su capacidad para controlar la reactividad
inmune contra antígenos propios de las células T que han escapado de la apoptosis como
resultado de la alta afinidad por péptidos propios (Douglas y cols., 2008). Además, varias
funciones se han sugerido; prevención de enfermedades autoinmunes por estabilización y
mantenimiento de la tolerancia inmunológica a lo propio, supresión de alergia y asma,
Inducción de la tolerancia materna al feto, regulación de la clase efectora de la respuesta
inmune, supresión de la activación de células T desencadenada por estimulo débil, control de
retroalimentación de la magnitud de la respuesta inmune por células Th efectoras y protección
de bacterias comensales por eliminación del sistema inmune (Corthay, 2009). Al menos tres
grupos distintos de células Treg se han definido; células Treg Foxp3 positivas, células Th3
Foxp3 negativo y células Treg tipo 1 (Tr1). Las células Tr1 producen principalmente IL-10 y por
lo tanto, suprimen varias respuestas inflamatorias (Yanagawa y cols., 2008). Las células Treg
pueden derivar del timo (naturales) aunque también pueden desarrollarse de células CD4+ en
la periferia (Treg inducidas o adaptativas). Las células T reg derivadas del timo requieren
mecanismos de contacto célula a célula para ejercer su función y son esencialmente
independientes de citocinas, mientras que las células Treg inducidas por antígenos median su
función inmune por liberación de citocinas, especialmente el factor de crecimiento
transformante-β y la Interleucina IL-10 (Douglas y cols., 2008). Las células Tr1 se generan en la
periferia a partir de células CD4+CD25- naïve tras la estimulación antigénica en condiciones de
coestimulación limitante. Entre los factores inductores mejor establecidos están la IL-10 y las
células dendríticas inmaduras. Mientras que las células Treg CD4+CD25+ actúan a través del
contacto celular, las Tr1 lo hacen a través de citocinas supresoras como IL-10 y TGF-β. Por
otro lado, las células Tr1 parecen no expresar FOXP3. Además, mientras que las células Treg
migran a los ganglios linfáticos (por ello expresan niveles elevados de CD62L), las células Tr1
migran hacia sitios de inflamación. Las células Tr1 suprimen la respuesta de células T naïve y
de memoria, así como la expresión de moléculas coestimuladoras y la secreción de citocinas
proinflamatorias de las células presentadoras de antígeno (San Segundo y cols., 2007).
11
Existe un segundo tipo de células TCD4+ reguladoras inducidas que se denominan Th3 y que
son superponibles a las Tr1 en muchas características, salvo que secretan TGF-β. Tampoco
existen marcadores fenotípicos que las identifiquen (San Segundo y cols., 2007).
La IL-10 es una citocina inmunoreguladora potente que inhibe las respuestas innata y adquirida
indeseables. Esta puede ser producida por varios tipos celulares incluyendo las células B,
monocitos/macrófagos, células dendríticas (DCs), células Th2 y Treg. La IL-10 es responsable
de limitar y terminar la respuesta inflamatoria, la cual reduce el daño al tejido propio en el
proceso de erradicación patógena. Adicionalmente, la IL-10 juega un papel importante en la
tolerancia inmune y protección de la autoinmunidad. También inhibe la activación subsecuente
a la producción de citocinas y sobrerregulación de moléculas coestimuladoras. En contraste, se
ha reportado que el IFN-γ suprime la inducción de IL-10 mediada por receptores tipo Toll
(Yanagawa y cols., 2008).
El fenotipo de las células Treg es CD4+CD25+, y la sobreexpresión de FoxP3, el cual actúa
como un represor transcripcional y parece ser un marcador para su identificación (Douglas y
cols., 2008). Años después de su descripción inicial, se supo que CD25 no es un marcador
propio de estas células, pues también se expresa en células T activadas. Recientemente se
demostró que dos genes se expresan de manera predominante en estas células y que
pudieran ser específicos de ella: el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por
esteroides (GTRI) y el factor de transcripción Foxp3 (Vela-Ojeda, 2006). La transcripción del
factor NFAT, induce la expresión del FOXP3 por la unión a su promotor (Solomou y cols., 2007).
El antígeno asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), el Gen 3 de activación de los
linfocitos (LAG-3) también son marcadores ampliamente usados para la identificación de las T
reg (Corthay, 2009). Las células T reg incluyen a las llamadas células T reg Foxp3+ naturales
que son inducidas en el timo, las células T reg Foxp3+ adaptativas o las Foxp3- que son
inducidas en la periferia y producen TGF-Β y/o IL-10. Por otro lado, el Foxp3+ también se
encuentra induciendo la generación de las células T ROR γt+ productoras de IL-17 y de IL-10,
las cuales tienen funciones proinflamatorias y reguladoras respectivamente (Lochner y cols.,
2008).
El factor de crecimiento transformante-β es un factor de diferenciación crítico en el desarrollo
de las células Treg adaptativas, pero su acción es inhibida por la IL-6. Los cambios de células
Th17 a células Treg parece ser mutuamente exclusiva en los ratones, sin contar con datos
semejantes en humanos. Sin embargo, niveles altos de IL-6 juegan un papel importante en el
mieloma como factor necesario para crecimiento de las células plasmáticas y por lo tanto, en la
12
inhibición de células Treg en el mieloma. En humanos, el mantenimiento del número y función
de las células Treg se ha demostrado que depende de interacciones con células dendríticas
(DCs) y tiene una implicación importante para la inmunoterapia (Douglas y cols., 2008).
En la actualidad, hay desacuerdo significativo concerniente al número y función de las T reg en
mieloma (Douglas y cols., 2008). Hace poco, Prabhala y cols., publicaron que se encuentran
disminuidas en pacientes con MM. Estos investigadores reportaron cantidad significativamente
reducida de células FoxP3 en MGUS y mieloma, y esto fue confirmado por inmunohistoquímica
y Western blotting (Prabhala y cols., 2006). En contraste, Beyer et al encontró que las Treg se
incrementaron y asociaron con una fuerte función inhibitoria en MGUS tanto en mieloma tratado
como en no tratado. El incremento en los niveles de FoxP3 fue documentado por la expresión
de mRNA y citometría de flujo (Beyer y cols., 2006). La discrepancia en función y numero de Treg
en estos reportes puede deberse a diferencias en ensayos y técnicas de purificación (Douglas y
cols., 2008).
3.0 El Modelo de Plasmocitoma en ratón BALB/c
3.1. Importancia del modelo de plasmocitoma murino
Los plasmocitomas son inducidos en ratones BALB/c por inoculación intraperitoneal de un
agente químico específico. Tal agente, inicialmente provoca formación de un granuloma en la
superficie peritoneal y posteriormente desencadena el desarrollo de tumores que producen
inmunoglobulinas monoclonales (Armstrong y cols., 1978). Los estudios de plasmocitomas
realizados por Potter, aportaron una era de intensa investigación durante la cual algunas de las
preguntas más confusas en la inmunología fueron resueltas. La base estructural y genética de
la especificidad y diversidad de los anticuerpos se estableció por investigación de los
plasmocitomas murinos (MPC). Puesto que debido a que los plasmocitomas de BALB/c
producen el componente M en suero, estos tumores presentan una oportunidad única para
investigar la estructura y función de las inmunoglobulinas molecularmente homogéneas. Los
inmunoquímicos fueron inmediatamente atraídos por los plasmocitomas debido a que les
proporcionaron una fuente ilimitada de inmunoglobulina homogénea. Las proteínas
monoclonales producidas por la mayoría de los MPC fueron de clase IgA o IgG. Algunos
produjeron solamente cadenas ligeras Kappa o lambda, y raramente se produjeron IgM o IgD
(Lynch, 2005). Kohler y Milstein, desarrollaron un ingenioso sistema de hibridoma, en el cual las
células de MPC fueron fusionadas con células del bazo para inmortalizar clonas que producen
esencialmente cantidades ilimitadas de un anticuerpo único de especificidad definida (Kölher y
Milstein, 1975). Su trabajo tuvo un amplio impacto en las ciencias biológicas y la medicina
13
humana. Los plasmocitomas también fueron un elemento fundamental en la investigación de
Hozumi y Tonewaga, quienes fueron pioneros en aplicar tecnología recombinante en
inmunología (Hozumi y Tonewaga, 1976).
3.2. Estandarización del Plasmocitoma Murino
En 1962 Michael Potter y colaboradores sistemáticamente desarrollaron el método para
provocar y caracterizar mielomas en ratón. Los plasmocitomas pueden ser inducidos con alta
frecuencia en cepas de ratones susceptibles por administración intraperitoneal de plásticos o
aceites. En una serie de experimentos paralelos Potter utilizó el aceite de maíz, el pristano (2,
6, 10, 14 – tetrametilpentadecano); componente inductor principal del aceite mineral, el aceite
de silicón y el gel de silicón obtenido de implantes mamarios y los inyecto en ratones de las
cepas BALB/c, C57BL, C3H/Hej, DBA/2N y F1 (BALB/c x DBA/2). Posteriormente a la
inoculación, él encontró que el pristano, fue capaz de inducir el plasmocitoma y solo la cepa
BALB/c resultó ser susceptible a desarrollar mieloma, mientras que las otras cepas resultaron
ser resistentes. Las características del desarrollo de tumor en este modelo de ratón son las
siguientes: 1) Se requiere un genotipo susceptible, especialmente encontrado en los ratones
BALB/c, 2) La formación de las translocaciones cromosómicas t(12;15) y t(6;15) en células B
resulta en combinaciones con c-myc o pvt-1. 3) Inflamación crónica ocasionada por el aceite;
principalmente el aceite pristano, 4) Desarrollo del tumor después de que el agente irritante
persiste por un periodo muy largo en la cavidad peritoneal del ratón (Potter y cols., 1994).
3.3. Plasmacitogénesis
Este modelo es el más ampliamente utilizado y ha proporcionado la mayoría de datos de la
plasmocitogénesis hasta el momento. Este modelo da la oportunidad de estudiar el papel de la
desregulación del c-myc, los mecanismos que llevan a cambios citogenéticos que involucran
genes de Ig, el papel de los factores inflamatorios crónicos, de la interleucina IL-6, el factor-I de
crecimiento tipo insulina, prostaglandinas y las vías de señalización de transducción en el
proceso neoplásico. Aunque el crecimiento del MPC está restringido al microambiente
peritoneal, la inyección intraperitoneal de la suspensión de células del MPC puede reproducir
las características de diseminación de la enfermedad humana en los receptores (Gado y cols.,
2001). En la mayoría de los plasmocitomas murinos, la desregulación del transcrito myc es
activado por la translocación que yuxtapone el locus c-myc/Pvt-1 en el cromosoma 15 con un
loci de la inmunoglobulina (Ig) en el cromosoma 12 (IgH), 6 (IgƘ) o 16 (Igλ). El hallazgo de que
la expresión myc es desregulada en el plasmocitoma murino indica que es un evento crítico
obligatorio requerido para la transformación de linfocitos B a plasmocitoma murino. Se ha
sugerido que la generación de t (12;15) está restringida a las células precursoras en un estado
14
mayor de diferenciación, a células B inmaduras/maduras y también a células plasmáticas,
mientras que los tipos variantes, t(6;15) y t(15;16), ocurren en células en un estado más
temprano de diferenciación, tal como la célula B progenitora (pro-B) y células precursoras B
(pre-B) (Ohno y cols., 1999). Una característica que une a las células neoplásicas plasmáticas
del ratón y humano es el papel crítico de IL-6, como un factor de crecimiento, diferenciación y
de supervivencia (Kovalchuk y cols., 2001).
Interleucina-6
La interleucina (IL-6) es una citocina proinflamatoria que carece de un dominio
transmembranal, es secretada directamente como una proteína soluble. Es producida
tardíamente en la respuesta inflamatoria e importante en la fase de resolución temprana de la
respuesta innata y en la inducción de la inmunidad adquirida (Manderson y cols., 2007). Aunque
la IL-6 fue identificada como un factor producido por los linfocitos T, no sólo éstas células la
producen, sino también una amplia variedad de tipos celulares que incluyen macrófagos,
células endoteliales, gliales, queratinocitos o fibroblastos. La IL-6 es un polipéptido pequeño, de
homología con una familia de citocinas más amplia: IL-11, factor ciliar neutrófico (CNTF),
caridiotrofina-1 (CT-1), citocinas similar a la cardiotrofina (CLC), factor inhibidor de la leucemia
(LIF), neuropoyetina (NPN) y oncostatina M (OSM), recientemente ampliada por IL-27 e IL-31.
Todas ellas comparten la utilización de un receptor celular muy común, presente en casi todas
las células del organismo: gp130, capaz de transmitir señales intracelulares a través de la
fosforilación de proteínas asociadas a su dominio intracelular. Sin embargo, la IL-6 no es capaz
de unirse a gp130 en ausencia de un segundo receptor específico denominado IL-6R, de
expresión mucho más restringida a hepatocitos, neutrófilos, monocitos/macrófagos y algunos
linfocitos (Pablos-Álvarez). La unión de IL-6 a su receptor IL-6R/GP80 induce la fosforilación y
homodimerización de gp130 llevando a la activación de las tres principales cascadas de
señalización: la vía janus quinasa 2 / señal del transductor y activador de la transcripción 3
(JAK2/STAT3), la vía de la quinasa fosfatidilinositol-3 (PI-3K) y la vía de la proteína quinasa
activada por mitógeno/Ras. La vía STAT3 esta constitutivamente activada en las células
mononucleares en médula ósea de pacientes con mieloma múltiple y de la línea celular de
mieloma U266 dependiente de IL-6 (Cavallo y cols., 2006). El tipo de señal que transmite gp130
es de fosforilación de una proteína intracelular denominada jak (Jano cinasa 2) que a su vez
fosforila a STAT-3 (transductor de señal y activador de transcripción), un factor de transcripción
capaz de trasladarse al núcleo y activar la expresión de sus genes diana. Uno de ellos es el
gen del inhibidor SOCS (supresor de la señalización de citocinas) que actúa como un
mecanismo de retroalimentación negativa, interfiriendo con la fosforilación de STAT3, con lo
que se cierra esta cascada. Además de esta señal especifica de STAT3, la activación de gp
15
130 se conecta lateralmente con dos importantes cascadas intracelulares y las activa: la vía de
las MAPK (cinasas activadas por mitógenos) y la mediada por lípidos IP3k/AKt (fosfatidil inositol
cinasa), ambas de enorme relevancia en la inducción de factores proinflamatarios y de
supervivencia celular (Pablos-Álvarez).
La IL-6 es la citocina más importante con efectos a distancia u “hormonales”. Los tres focos a
distancia de mayor interés en la respuesta sistémica a la inflamación mediada por IL-6 son: el
sistema nervioso (respuesta febril), el hígado (aumento de reactantes de fase aguda) y la
médula ósea (respuesta hematológica), aunque no son los únicos (Pablos-Álvarez). La IL-6 es
uno de los principales factores de crecimiento para las células del mieloma y tiene un papel
importante en la supervivencia de las células plasmáticas malignas. La inducción de los MPC
es favorecida por la presencia de IL-6 y otros factores de crecimiento en el microambiente
granulomatoso. Lattanzio y cols., encontraron que la deficiencia de esta citocina en ratones
BALB/c, los protege contra el desarrollo del tumor que se induce con aceite pristano (Lattanzio y
cols, 1997). Es concebible que, durante el curso de la expansión de células plasmáticas
policlonales inducida por la IL-6, pueda ocurrir la translocación Ig/myc en una o pocas clonas
que finalmente generaran plasmocitomas monoclonales (Gado y cols., 2001).
En presencia de TGF-β, el destino de la célula T hacia proinflamatoria (Th17) o antiinflamatoria
(Treg) depende de que en el medio haya o no citocinas proinflamatorias, fundamentalmente IL-
6. La IL-6 no solo favorece la generación de células Th17, sino que bloquea la diferenciación
de células Treg, de efectos antiinflamatorios e inmunosupresores (Pablos-Álvarez, 2009;
Pasquinelli, 2008).
Prostaglandinas
Las prostaglandinas E2 (PGE2) han mostrado tener un número de efectos reguladores en la
actividad de células B. El principal efecto biológico es inhibir la proliferación y activación de
células B. Las prostaglandinas pueden ser detectadas en niveles altos en el granuloma de
aceite y es más probable que sean producidos por los macrófagos y fibroblastos. Puesto que la
PGE2 estimula la producción en macrófagos y otras células inflamatorias de IL-6, llega a ser
un factor relevante durante la génesis de MPC. Si se requieren niveles altos de IL-6 para el
desarrollo de MPC, entonces la inhibición de la síntesis de PGE2 puede jugar un papel
importante en el microambiente permisivo de la formación de MPC (Gado y cols., 2001).
16
El factor-1 de crecimiento tipo insulina
El factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) se ha encontrado que estimula la proliferación de
líneas celulares de mieloma humano. El IGF-1 también posee un efecto antiapoptótico en
células de mieloma (Gado y cols., 2001).
El factor de crecimiento transformante β
El factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) es un regulador general de las
actividades celulares con múltiples efectos biológicos. Actualmente se sabe que es sintetizado
por diferentes tipos celulares incluyendo linfocitos, macrófagos, fibroblastos, miocitos,
condrocitos, astrocitos, células epiteliales, células de riñón, células de placenta y plaquetas, así
como por algunas células tumorales. A esta citocina se le denominó como el TGF-β por su
función de inducir reversiblemente la transformación e inhibir la proliferación de fibroblastos
normales, pero actualmente ha sido posible aislarlo de fuentes como el glioblastoma humano y
de médula ósea bovina. Los miembros de la superfamilia de TGF-β son reguladores
multifuncionales de la proliferación y diferenciación de una amplia variedad de tipos celulares.
Existen varias isoformas de los TGF-β designadas como TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 y
TGF-β5. Adicionalmente, un heterodímero del TGF-β1.2, se ha identificado en plaquetas
porcinas. Las isoformas 1, 2 y 3 se encuentran codificadas en los cromosomas humanos
19q13, 1q41 y 14q24, mientras que las isoformas 4 y 5 se han identificado en aves y en
anfibios, respectivamente. El TGF-β1 y el TGF-β2 son sintetizados por muchos tipos celulares,
mientras que el TGF-β3 es expresado por células mesenquimales. Las isoformas TGF-β 1, 2 y
3 comparten una alta homología de secuencia de aminoácidos, tienen distintos patrones de
expresión y sus funciones son mediadas por los mismos receptores. Se han identificado cinco
diferentes tipos de receptores para TGF-β que incluyen a los receptores funcionales, como son
el tipo I (TβRI) y el tipo II (TβRII) y los receptores no funcionales que incluyen el tipo III (TβRIII),
el tipo IV (TβRIV) y el tipo V (TβRIV). El TGF- β1 es el miembro de la familia más ampliamente
estudiado y puede actuar como un mitógeno indirecto sobre células mesenquimales o como
estimulador de la síntesis de proteínas de matriz extracelular. Sin embargo, también es un
potente inhibidor de la proliferación de de células epiteliales, endoteliales, linfoides y mieloides
(Peralta-Zaragoza y cols., 2001). Sin embargo las células del PCT son refractarias al efecto de
inhibición y apoptosis porque carecen del receptor funcional para TGF-β (Gado y cols., 2001).
Por otro lado, Maeda y cols, demostraron en sus trabajos en modelos murinos con timomas
que el TGF- β1 estimula la producción de IL-10 por parte de macrófagos (Maeda y cols, 1995).
Estas evidencias apoyan que los tumores son capaces de producir el TGF-β1 y, en
17
consecuencia, inducir el desarrollo de mecanismo de escape de la vigilancia inmune (Peralta-
Zaragoza y cols., 2001).
3.4. Características de diagnóstico
El diagnostico de MPC es establecido siguiendo los resultados de 10 o más características del
las células plasmáticas tumorales en el líquido de ascitis. Las células de plasmocitoma pueden
ser identificadas por su gran tamaño, abundante citoplasma basófilo, un retículo endoplásmico
y aparato de Golgi bien desarrollado, junto con un núcleo no picnótico en forma de riñón con
una zona clara perinuclear (Gado y cols., 2001).
3.5. Agente inhibidor del MPC
Potter demostró que la Indometacina, un agente no esteroideo anti inflamatorio, inhibe
fuertemente el desarrollo de la formación de MPC en ratones BALB/c tratados con pristano
(Potter y cols., 1985). Se sabe que los blancos bioquímicos de este inhibidor son las enzimas
ciclo oxigenasas, COX-1 y COX-2.
18
1.0. JUSTIFICACIÓN
El modelo murino es útil para el estudio de las interacciones inmunológicas que se
desencadenan en la cavidad peritoneal del ratón susceptible BALB/c, puesto que no se
conocen aún. Así se espera que el estudio más detallado de este modelo permita aplicar dicho
conocimiento en la comprensión del mieloma humano.
19
5.0. HIPOTESIS
La concentración de citocinas presentes en la cavidad peritoneal del ratón BALB/c inducido
que promueven la diferenciación de las células Th17, es mayor respecto a la concentración de
citocinas que inducen a la diferenciación de las Treg.
20
6.0. OBJETIVO GENERAL
Determinar la posible correlación entre las citocinas presentes en la cavidad peritoneal y la
susceptibilidad del ratón BALB/c a desarrollar mieloma.
6.1. OBJETIVOS PARTICULARES
Realizar cortes histológicos del bazo, riñón, e intestino a los 8 meses post-inducción en
ratones BALB/c.
Identificar la banda monoclonal por medio de electroforesis de suero a los 8 meses
post-inducción en ratones BALB/c y C57BL.
Cuantificar las citocinas: IL-6, IL10 y TGF-β por el método de ELISA a los 8 meses post-
inducción en el líquido peritoneal de ratones de las cepas BALB/c y C57BL.
21
II MATERIAL Y MÉTODOS
Diagrama General de Trabajo
* *
*
*Se trabajaron ratones inducidos y sus respectivos testigos
INDUCCIÓN CON
ACEITE MINERAL
Electroforesis de
Proteínas séricas
Histología: riñón, bazo,
hígado e intestino
Cuantificación de
citocinas IL-6, IL-10 y
TGF-β por ELISA
OBTENCIÓN
DE SUERO
OBTENCIÓN
DE ÓRGANOS
OBTENCIÓN
DEL LÍQUIDO
PERITONEAL
BALB/c
y
C57BL
BALB/c
22
A) PROCEDIMIENTO DE INDUCCIÓN DEL RATÓN POR VÍA INTRAPERITONEAL.
Se utilizaron dos cepas de ratones: BALB/c y C57BL. Cada una de estas cepas, fue dividida en
dos grupos: los Inducidos y los testigos; n=10 para cada grupo. La administración de aceite se
realizo únicamente en los grupos denominados Inducidos por vía intraperitoneal. En total se
aplicaron 3 dosis de 0.5 mL de aceite mineral. La primera, segunda y tercera dosis se realizó a
los 2, 4 y 6 meses de edad respectivamente (Figura1).
Esquema de Inducción de mieloma en ratones de las cepas BALB/c y C57BL
Figura 1. Esquema de Inducción de mieloma en ratones de las cepas BALB/c y C57BL. La primera inducción con aceite mineral se realizó a los 2 meses de edad, la segunda a los 4 meses de edad y la tercera a los 6 meses de edad. Se estudiaron dos grupos de ratones de la cepa BALB/c, uno inducido y el otro control. De la cepa C57BL también se estudió un grupo inducido y otro control.
23
B) OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
i) Procedimiento para la obtención de suero de BALB/c y C57BL
Los ratones fueron anestesiados con éter etílico y sujetados en la tabla de disección, lo que
facilitó la obtención de sangre por punción cardiaca. Primero se localizó el corazón,
posteriormente se limpió con alcohol la zona elegida para la punción y se introdujo la aguja
(22 x 32 mm) en la cavidad cardiaca, el embolo de la jeringa se jaló suave y rápidamente
para la extracción de la sangre. La sangre depositada en tubos eppendorf se coaguló y se
centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos, transcurrido este tiempo el suero fue
recuperado y conservado a -70ºC hasta su uso.
ii) Procedimiento para la obtención del líquido peritoneal de BALB/c y C57BL
Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y colocados en la tabla de disección.
Se inició limpiando con alcohol la parte anterior del ratón y se procedió hacer una incisión
vertical en la parte inferior del abdomen separando la piel con tijeras de punta roma sin romper
las capas más profundas (el peritoneo). Una vez expuesto el peritoneo, se inyectaron los
primeros 5 mL de medio de cultivo de células (RPMI) dando un ligero masaje en el peritoneo.
En seguida se aspiró con la misma jeringa el líquido contenido en la cavidad peritoneal y se
recolecto en un tubo estéril con tapón de rosca de 15 mL. Posteriormente se realizó un
24
segundo lavado con otros 5 mL del medio RPMI siguiendo el mismo procedimiento. La cantidad
obtenida del líquido peritoneal de los dos lavados fue aproximadamente 8 mL, el cual fue
centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos, transcurrido este tiempo, los sobrenadantes
fueron conservados a -70ºC hasta su uso.
iii) Procedimiento para la obtención de órganos de BALB/c
La obtención de los órganos se realizó una vez que fueron obtenidos los lavados de la
cavidad peritoneal. Se separo la piel del cuerpo del ratón utilizando la parte roma de la tijera
y se cortó el peritoneo. Una vez que estuvieron expuestos los órganos: riñón, bazo e
intestino delgado, se realizó su extirpación quitando cuidadosamente el tejido conectivo que
los fijaba a la cavidad peritoneal. Los órganos fueron conservados en viales que contenían
formol al 10%.
25
C) REALIZACIÓN DEL MÉTODO HISTOLÓGICO
i) Inclusión en parafina
Antes de incluir en parafina los órganos que fueron conservados en formol al 10%, estos se
mantuvieron en diferentes soluciones, durante 1hr en cada solución. Primero estuvieron en
cuatro soluciones de etanol al 96%, después en dos soluciones de etanol absoluto y por
ultimo en tres soluciones de xilol. Posteriormente los órganos fueron mantenidos en dos
soluciones de parafina fundida entre 60 y 65ºC durante 1 hora en cada solución. Una vez
solidificada la parafina, el bloque fue moldeado y enfriado en el refrigerador durante media
hora.
ii) Corte en micrótomo
El bloque de parafina de 4-6 micras fue cortado con el micrótomo hasta obtener los cortes
de tejido deseados. Los cortes fueron sumergidos en baño de flotación a 37ºC,
posteriormente se montaron en portaobjetos y se mantuvieron en la estufa a 60ºC durante
30 minutos.
iii) Tinción con H-E
Los cortes se desparafinaron sumergiendo los portaobjetos en dos soluciones de xilol
durante 5 minutos en cada una. En seguida se realizaron tres baños de etanol absoluto,
después 3 baños en tres soluciones diferentes de etanol al 96% y finalmente baños con
agua corriente. Terminada la desparafinación, se realizó la tinción, los cortes se
sumergieron en hematoxilina de Harris durante 5 a 10 minutos y se lavaron con agua
corriente, la diferenciación se realizó con alcohol-ácido y en seguida se lavaron con agua
corriente, después los cortes se viraron en una solución saturada de carbonato de litio e
hidróxido de amonio y en seguida fueron lavados con agua corriente. Entonces, los cortes
se colocaron en baños de eosina y posteriormente en tres soluciones de etanol al 96%.
Después se realizaron 3 baños en una solución de etanol absoluto y 3 baños en dos
soluciones de xilol. Una vez que los cortes fueron lavados y secados se observaron en el
microscopio.
26
D) REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
i. Cuantificación de Proteínas Totales
La cuantificación de proteínas totales presentes en el suero de ratón, se realizó de forma
automatizada en el equipo ADVIA 1200. Este equipo utilizó el sistema ADVIA Chemistry, el cual
se basa en el método de Weichselbaum que utiliza el reactivo de biuret (sulfato cúprico en una
solución alcalina). El principio de este procedimiento es que los enlaces peptídicos de las
proteínas interaccionan con los iones de cobre y forman un complejo morado que se mide a
545nm como reacción de punto final (Weichselbaum, 1946). La reacción es la siguiente:
Proteína + CuSO4 Complejo cuproproteinato
ii. Corrimiento electroforético
El corrimiento electroforético se realizó de forma automatizada utilizando el equipo SPIFE 3000.
Este equipo utilizó el kit QuickGel Split Beta. Primero se colocaron 60 µl del suero de cada
ratón en una cámara que se introdujo en el equipo. También se colocó el aplicador de muestras
y cuidadosamente el gel en el interior del equipo. Una vez limpios los electrodos con agua
desionizada, la muestra fue aplicada durante 10 minutos a 21ºC y el corrimiento durante 8
minutos a 21ºC a 350V, transcurrido este tiempo el gel fue removido para eliminar la parte
sobrante, posteriormente el gel fue secado a 54ºC. Entonces, el gel fue colocado en el plato de
tinción con Acid Blue durante 4 minutos, automáticamente fue secado y desteñido con tres
lavados consecutivos de 1 minuto en la solución para desteñir Citric Acid Destain,
automáticamente fue secado y quedando listo para ser removido después de 5 minutos. Una
vez removido el gel, se realizó el escaneado en el QuickScan 2000 y se obtuvo el análisis
densitométrico (Alper, 1974).
OH⁻
27
E) REALIZACIÓN DE LA DETERMINACIÓN DE CITOCINAS POR EL MÉTODO DE ELISA
Para la determinación de citocinas: IL-6, IL-10 y TGF-β en los sobrenadantes de líquido
peritoneal de cada ratón, se realizó un solo ensayo por duplicado por el método de ELISA
utilizando un kit ELISA eBiosciences para cada citocina. Primero se realizó una curva de
calibración de cada citocina. Posteriormente se adicionaron 100µL de cada dilución de la curva
de calibración (únicamente para la curva de calibración de TGF-β se adicionaron 20 μl de HCl
1N e incubaron 10 minutos y finalmente 20 μl de NaOH 1N) y de cada una de las muestras en
la placa de 96 pozos específica de cada citocina. La placa se cubrió e incubó toda la noche a
4ºC. Al día siguiente, la placa se aspiró, se lavo 5 veces y se secó sacudiendo fuertemente en
la mesa de trabajo. Una vez seca, se adicionaron 100µL de conjugado específico, se cubrió e
incubó 1 hr a temperatura ambiente. Transcurrida la incubación, la placa se aspiró, se lavo 5
veces y se secó sacudiendo fuertemente en la mesa de trabajo. Después se adicionaron 100µL
de la enzima Avidin-HRP, se cubrió e incubo 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se
aspiró, se lavo 7 veces y se secó sacudiendo fuertemente en la mesa de trabajo.
Posteriormente se adicionaron 100µL de sustrato TMB y se incubó por 15 minutos a
temperatura ambiente. Se adicionaron 100µL de solución de paro y finalmente se realizó la
lectura a 450nm en el lector de ELISA y a partir de la curva de calibración, se determinaron las
concentraciones (pg/mL) particulares de cada citocina presente en el líquido peritoneal de cada
ratón.
28
III RESULTADOS
1. RESULTADOS DEL ANÁLISIS HISTOLÓGICO
1.2. RIÑÓN
Los cortes histológicos del riñón teñidos con H-E, no mostraron alteración importante en la
estructura del glomérulo renal del ratón BALB/c con 8 meses post-inducción (I), con
respecto al ratón BALB/c testigo (T) (Figura 2). Sin embargo en la zona perivascular del
ratón inducido se puede observar una infiltración linfocitaria importante (Figura 3).
Figura 2. Imagen del glomérulo renal de ratones BALB/c. A) Imagen que
muestra glomérulo de ratón no inducido denominado testigo, 10x. B)
Imagen que muestra el glomérulo de ratón inducido con aceite mineral, 10X.
C) glomérulo de ratón testigo, 40x. D) glomérulo de ratón inducido, 40X.
Técnica de hematoxilina-eosina, 10 y 40x. g=glomérulo renal, tr=túbulos
renales, cp=capsula de Bowman
g
g
tr
g g
A) B)
C) D)
cp
29
1.3. BAZO
Los cortes histológicos correspondientes al bazo mostraron disminución de la pulpa roja con
incremento de pulpa blanca en los ratones tratados durante de 8 meses post-inducción con
aceite mineral respecto al grupo testigo (Figura 4).
Figura 3. Imagen de la zona perivascular en riñón de raton BALB/c. A) Imagen que
muestra un vaso sanguíneo libre de infiltrado celular en el ratón BALB testigo, 10X. B)
Imagen que muestra infiltrado celular de tipo linfoide en el vaso sanguíneo del ratón
inducido con aceite mineral, 10X. C) Misma imagen que B) a 40x. Técnica de
hematoxilina-eosina, 10 y 40x. vs=vaso sanguíneo, inf=infiltración celular tipo linfoide
vs
vs
inf
inf
A)
B)
.
C)
.
Figura 4. Imagen del corte histológico de bazo de ratones BALB/c. A) Se
muestra la proporción de pulpa roja y de pulpa blanca en un ratón testigo.
B) Imagen correspondiente a un ratón inducido con aceite mineral y se
muestra disminución de la pulpa roja con incremento de la pulpa blanca.
Técnica de hematoxilina-eosina, 10x. pr=pulpa roja, pb=pulpa blanca.
pr
pb
pr pb
A) B)
30
1.4. INTESTINO DELGADO
Los cortes histológicos correspondientes al intestino delgado de ratones BALB/c, muestran
morfología normal en la lámina propia, las placas de Peyer y la capa muscular en los
testigos sin tratamiento. También se muestran los cambios histológicos en los mismos sitios
caracterizados principalmente por una infiltración de tipo linfoide en ratones tratados con
aceite mineral. Además de esta infiltración linfoide también se observó la participación de
macrófagos espumosos en la capa serosa, que posiblemente se encuentran fagocitando
partículas de aceite y engrosamiento de la capa muscular (Figura 5).
Figura 5. Cortes histológicos de intestino delgado de ratones BALB/c. A) Imagen de una placa de Peyer
normal en un ratón testigo, 10X. B) Placa de Peyer infiltrada por gran cantidad de células linfoides, 10X. C)
Imagen de la lámina propia de un ratón testigo, 10X. D) Imagen de la lámina propia alterada por infiltración
linfoide en un ratón inducido, 10X. E) Capa muscular normal en un ratón testigo, 10X. F) Engrosamiento de la
capa muscular en ratón inducido 10X. G) Misma imagen que en F) a 40X, en donde se aprecian los
macrófagos espumosos. Técnica de hematoxilina-eosina, 10 y 40x. pp=placa de peyer , lp=lamina propia,
inf=infiltración de tipo linfoide, m=capa muscular, s=capa serosa, mθ=macrófago espumosos
A) B)
.
C)
.
D)
.
E) F) G)
.
pp
pp
inf
lp
lp
inf
m
m
s
mθ
31
2. RESULTADOS DEL ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO
a) Cuantificación de Proteínas Totales
La determinación de proteínas totales (PT) se realizó por método automatizado. En la tabla 1,
se muestran los valores obtenidos de proteínas totales de los ratones testigos e inducidos de
las cepas BALB/c y C57BL. De la cepa BALB/c se trabajó con 8 ratones inducidos y 5 ratones
testigos, mientras que de la cepa C57BL se trabajó con 5 ratones inducidos y 8 testigos.
Tabla 1. Proteínas totales de los ratones BALB/c y C57BL.
RATONES BALB/c RATONES C57BL
TESTIGOS INDUCIDOS TESTIGOS INDUCIDOS
Clave PT (g/dl). Clave PT (g/dl). Clave PT (g/dl). Clave PT (g/dl).
BT1 5.7 BI1 6.5 CT1 5.6 CI1 3.6
BT2 8.3 BI2 6.9 CT2 5.0 CI2 5.8
BT3 6.2 BI3 5.7 CT3 5.3 CI3 5.6
BT4 5.6 BI4 6.3 CT4 6.7 CI4 5.5
BT5 6.5 BI5 5.2 CT5 5.7 CI5 5.6
BI6 7.6 CT6 5.7
BI7 7.1 CT7 5.2
BI8 6.1 CT8 6.7
PT= Proteínas Totales, BT= Testigo de BALB/c, BI= Inducido de BALB/c, CT= Testigo de C57BL y CI= Inducido
de C57BL.
32
b) Corrimiento Electroforético
De la cepa BALB/c se trabajó con 8 ratones inducidos y 5 ratones testigos, mientras que de
la cepa C57BL se trabajó con 5 ratones inducidos y 8 testigos. Las lecturas densitométricas
muestran las fracciones correspondientes a albúmina, alfa globulinas 1 y 2, beta globulinas y
las gamma globulinas. En la figura 6, se muestra el proteinograma representativo del suero
humano utilizado como control. En la figura 7b, se muestra el proteinograma representativo
del suero de ratón BALB/c inducido, donde se observa un ligero incremento de la región de
gamma globulinas y un pico más estrecho en la región de beta globulinas, respecto al
proteinograma representativo del ratón BALB/c testigo en la figura 7a. En la figura 8b, se
muestra el proteinograma representativo del suero de ratón C57BL inducido, observándose
un ligero incremento en la región de gamma globulinas y un pico más estrecho en la región
alfa-2 y beta globulinas, respecto al C57BL testigo en la figura 8a. Las figuras 9, 10 y 11,
corresponden al análisis estadístico realizado por la prueba U de Mann Whitney, de los
porcentajes de las fracciones gamma, beta y alfa globulinas respectivamente, en suero de
ratón BALB/c y C57BL. En la figura 9a, se muestra la comparación de la fracción gamma
entre los ratones BALB/c testigos e inducidos, en donde se obtuvo una mediana de 9.7 y
10.9 % respectivamente, y una p=0.2144. En la figura 9b, se muestra la comparación de la
fracción gamma entre los ratones C57BL testigos e inducidos, en donde se obtuvo una
mediana de 8.7 y 9.9 % respectivamente, y una p=0.8192. En la figura 9c, se muestra la
comparación de la fracción gamma entre los ratones BALB/c y C57BL inducidos, en donde
se obtuvo una mediana de 10.9 y 9.9 % respectivamente, y una p=0.2353. En la figura 10a,
se muestra la comparación de la fracción beta entre los ratones BALB/c testigos e inducidos,
en donde se obtuvo una mediana de 25.9 y 24.3 % respectivamente, y una p=0.9385. En la
figura 10b, se muestra la comparación de la fracción beta entre los ratones C57BL testigos e
inducidos, en donde se obtuvo una mediana de 21.1 y 29.2 % respectivamente, y una
p=0.2206. En la figura 10c, se muestra la comparación de la fracción beta entre los ratones
BALB/c y C57BL inducidos, en donde se obtuvo una mediana de 24.3 y 29.2 %
respectivamente, y una p=0.5924. En la figura 11a, se muestra la comparación de la fracción
alfa-2 entre los ratones BALB/c testigos e inducidos, en donde se obtuvo una mediana de
8.3 y 7.3 % respectivamente, y una p=0.2079. En la figura 11b, se muestra la comparación
de la fracción alfa-2 entre los ratones C57BL testigos e inducidos, en donde se obtuvo una
mediana de 7.6 y 14.7 % respectivamente, y una p=0.0031. En la figura 11c, se muestra la
33
comparación de la fracción beta entre los ratones BALB/c y C57BL inducidos, en donde se
obtuvo una mediana de 7.3 y 8.3 % respectivamente, y una p=0.2079.
Figura 6. Análisis densitométrico del suero humano como
control. Resultado representativo del proteinograma de
suero humano con 5.7 g/dl de proteínas totales, en donde se
muestran las fracciones albumina, alfa, beta y gamma.
Figura 7. Análisis densitométrico del suero de ratón BALB/c. a) Resultado representativo del proteinograma de
suero de ratón BALB/c testigo con 6.5 g/dl de proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina,
alfa, beta y gamma. b) Resultado representativo del proteinograma de suero de ratón BALB/c inducido con 7.1 g/dl
de proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina, alfa, beta y gamma. En esta figura, se observa
un ligero incremento en la región de gama globulinas y un pico más estrecho en la región de beta globulinas,
respecto al ratón testigo.
34
Figura 8. Análisis densitométrico del suero de ratón C57BL. a) Resultado representativo del proteinograma de
suero de ratón C57BL testigo con 6.7 g/dl de proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina, alfa,
beta y gamma. b) Resultado representativo del proteinograma de suero de ratón C57BL inducido con 5.6 g/dl de
proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina, alfa, beta y gamma. En esta figura, se observa un
ligero incremento en la región de gamma globulinas y un pico más estrecho en la región de beta y alfa-2 globulinas,
respecto al ratón testigo.
35
a) b)
Gamma globulinas en BALB/c Gamma globulinas en C57BL
c)
Gamma globulinas en Inducidos
Figura 9. Niveles de la fracción
Gamma globulinas. a) % de Gamma
globulinas en BALB/c testigos e
inducidos, p= 0.2144, b) % de Gamma
globulinas en C57BL testigos e
inducidos, p=0.8192, c) Comparación
del % de Gamma globulinas entre los
ratones BALB/c y C57BL inducidos, p=
0.2353. Análisis estadístico por U de
Mann Whitney que muestra las
medianas de los % obtenidos de la
fracción gamma.
36
a) b)
Beta globulinas en BALB/c Beta globulinas en C57BL
c)
Beta globulinas en Inducidos
Figura 10. Niveles de la fracción
Beta globulinas. a) % de Beta
globulinas en BALB/c testigos e
inducidos, p=0.9385, b) % de Beta
globulinas en C57BL testigos e
inducidos, p=0.2206, c) Comparación
del % de Beta globulinas entre
ratones BALB/c y C57BL inducidos, p=
0.5924. Análisis estadístico por U de
Mann Whitney que muestra las
medianas de los % obtenidos de la
fracción beta.
37
a) b)
Alfa-2 globulinas en BALB/c Alfa-2 globulinas en C57BL
c)
Alfa-2 globulinas en Inducidos
Figura 11. Niveles de la fracción Alfa-
2 globulinas. a) % de Alfa-2
globulinas en BALB/c testigos e
inducidos, p= 0.2079, b) % de Alfa-2
globulinas en C57BL testigos e
inducidos, p=0.003, c) Comparación
del % de Alfa-2 globulinas entre los
ratones BALB/c y C57BL inducidos,
p=0.2079. Análisis estadístico por U
de Mann Whitney que muestra las
medianas de los % obtenidos de la
fracción Alfa-2.
38
3. RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE CITOCINAS POR ELISA
La determinación de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β, se realizó en líquido peritoneal de 7 ratones
inducidos y 6 ratones testigos de la cepa BALB/c, y de 7 ratones inducidos y 9 testigos de la
cepa C57BL. Las concentraciones en pg/mL, fueron obtenidas mediante un solo ensayo por
duplicado por el método de ELISA. El análisis estadístico para comparar las concentraciones
obtenidas en los grupos testigos e inducidos de los ratones BALB/c y C57BL, se realizó por la
U de Mann Whitney. En la figura 12, se presentan los resultados de la concentración de IL-6 y
solo se muestran valores detectables en el grupo de los inducidos, en ambas cepas de ratón.
En la figura 12a, se comparan las concentraciones entre testigos e inducidos de BALB/c, en
donde se obtuvo una p=0.0010 y mediana de 7.1 pg/mL en el grupo inducido. En la figura 12b,
la cepa C57BL muestra una p=0.0286 y mediana de 12.9 pg/mL en los inducidos. En la figura
13, se muestran las concentraciones obtenidas de IL-10 en ambas cepas de ratón. En la figura
13a, se muestra la concentración de IL-10 en testigos e inducidos de BALB/c, y se obtuvo una
p=0.2542 y mediana de 24.3 pg/mL en el grupo testigo, mientras que en el grupo inducido no
hay niveles detectables. En la figura 13b, se muestra la concentración de IL-10 en testigos e
inducidos de C57BL, en donde se obtuvo una p=0.0653 y mediana de 2.0 y 48.7 pg/mL
respectivamente. En la figura 14, se muestra la comparación de la concentración de TGF-β
entre BALB/c y C57BL. En la figura 14a, se muestra la concentración de TGF-β en testigos e
inducidos de BALB/c, en donde se obtuvo una p=0.4452 y mediana de 982.6 y 842.4 pg/mL
respectivamente. En la figura 14b, se muestra la concentración de TGF-β en testigos e
inducidos de C57BL, y las medianas obtenidas fueron 701.3 y 676.3 pg/mL respectivamente y
se obtuvo una p=0.7104. En la figura 15, se representa la comparación de las citocinas
estudiadas entre BALB/c y C57BL, ambas cepas inducidas. En la figura 15a, se muestra la
concentración de IL-6 en BALB/c y C57BL, y se obtuvo una p=0.7012 y mediana de 7.1 y 12.9
pg/mL respectivamente. En la figura 15b, se muestra la concentración de IL-10 en BALB/c y
C57BL, y se obtuvo una p=0.0089 y mediana de 42.0 solo en C57BL. En la figura 15c, se
muestra la concentración TGF-β en BALB/c y C57BL, y se obtuvo una p=0.4954 y mediana de
638.8 y 676.3 pg/mL respectivamente. En la figura 16, se muestra la comparación de IL-6, IL-10
y TGF-β en ratones testigos e inducidos de BALB/c. La figura 16a, corresponde al grupo testigo
y presenta una p=0.0009. La figura 16b, corresponde al grupo inducido y presenta una
p=0.0006. En la figura 17, se muestra la comparación de IL-6, IL-10 y TGF-β en ratones
testigos e inducidos de C57BL. La figura 17a, corresponde al grupo testigo y presenta una
p<0.0001. La figura 17b, corresponde al grupo inducido y presenta una p=0.0009.
39
a) IL-6 en BALB/c b) IL-6 en C57BL
Figura 12. Niveles detectables y no detectables de IL-6 en líquido peritoneal de ratones BALB/c y C57BL. a) Análisis de
IL-6 en BALB/c testigos e inducidos, p= 0.0010, b) Análisis de IL-6 en C57BL testigos e inducidos, p= 0.0286. Se muestran
niveles detectables de IL-6 solo en ratones inducidos. Análisis estadístico por la U de Mann Whitney que muestra las
medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de la IL-6.
a) IL-10 en BALB/c b) IL-10 en C57BL
Figura 13. Niveles detectables y no detectables de IL-10 en líquido peritoneal de ratones BALB/c y C57BL. Análisis
de IL-10 en BALB/c testigos e inducidos, p= 0.2542, b) Análisis de IL-10 en C57BL testigos e inducidos, p= 0.0653. Se
muestran niveles detectables de IL-10 en ratones BALB/c testigos, un incremento de IL-10 en ratones inducidos
C57BL, y una disminución de IL-10 en ratones inducidos BALB/c. Análisis estadístico por la U de Mann Whitney que
muestra las medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de la IL-10.
40
a) TGF-β en BALB/c b) TGF-β en C57BL
Figura 14. Niveles detectables de TGF-β en líquido peritoneal de ratones BALB/c y C57BL. Análisis de TGF-β en
BALB/c testigos e inducidos, p= 0.4452, b) Análisis de TGF-β en C57BL testigos e inducidos, p= 0.7104. Los niveles de
TGF-β en los testigos de BALB/c fueron ligeramente mayores que en los otros grupos. Análisis estadístico por la U de
Mann Whitney que muestra las medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de TGF-β.
a) IL-6 en INDUCIDOS b) IL-10 en INDUCIDOS
b) TGF-β en INDUCIDOS
Figura 15. Comparación de los niveles de IL-6,
IL-10 y TGF-β entre BALB/c y C57BL inducidos.
a) Análisis de IL-6 en BALB/c y C57BL, p=0.7012,
b) Análisis de IL-10 en BALB/c y C57BL, p=0.0089,
c) Análisis de TGF-β en BALB/c y C57BL,
p=0.4954. No hay diferencias importantes en los
niveles de IL-6 y TGF-β, pero en el caso de IL-10,
se observa incremento en C57BL y disminución
en BALB/c. Análisis estadístico por la U de Mann
Whitney que muestra las medianas de las
concentraciones en pg/mL obtenidas de
citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β.
41
a) BALB/c TESTIGOS b) BALB/c INDUCIDOS
Figura 16. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre los testigos e inducidos de BALB/c. a)
Análisis de IL-6, IL-10 y TGF-β en testigos, p=0.0009, b) Análisis de IL-6, IL-10 y TGF-β en inducidos, p=0.0006. Se
observan niveles altos de TGF-β en testigos e inducidos, la IL-6 no es detectable en testigos pero se incrementa en
inducidos y la IL-10 se detectó en testigos pero fue indetectable en inducidos. Análisis estadístico por la U de Mann
Whitney que muestra las medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β.
a) C57BL TESTIGOS b) C57BL INDUCIDOS
Figura 17. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre testigos e inducidos de C57BL. a) Análisis de
IL-6, IL-10 y TGF-β en testigos, p=<0.0001, b) Análisis de IL-6, IL-10 y TGF-β en inducidos, p=0.0009. Se observan niveles
altos de TGF-β en testigos e inducidos, y los niveles de IL-6 e IL-10 no fueron detectables en testigos, pero ambas
citocinas se incrementaron en inducidos. Análisis estadístico por la U de Mann Whitney que muestra las medianas de las
concentraciones en pg/mL obtenidas de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β.
42
IV. DISCUSIÓN
El análisis histológico de ratones BALB/c inducidos con aceite mineral, mostró la presencia de
infiltración celular tipo linfoide en todos los órganos que fueron estudiados. En la zona
perivascular en el corte de riñón. En el bazo, la infiltración tipo linfoide estuvo presente en la
pulpa blanca, ya que principalmente está conformada por linfocitos, no así la pulpa roja, que se
conforma por eritrocitos. Además, se sabe que la pulpa roja es más abundante que la pulpa
blanca, pero en el caso de los ratones inducidos se observó disminuida. En el intestino
delgado, la infiltración tipo linfoide provocó alteración en la estructura normal de las Placas de
Peyer, lamina propia, capa muscular y serosa. No sabemos si las células plasmáticas malignas
se encuentran participando en los agregados de células de tipo linfoide, ya que no se realizaron
tinciones especificas de inmunohistoquímica, sin embargo, la sola presencia de células
linfoides y macrófagos en los órganos antes mencionados, puso de manifiesto la existencia de
un proceso inflamatorio que se inició en la cavidad peritoneal, sitio donde se administró el
aceite, y que se fue extendiendo a otros órganos. Pero es necesario estudiar el resto de los
órganos para saber si el proceso inflamatorio se extiende en todo el organismo del ratón
inducido, además realizar estudios histológicos en el ratón C57BL para conocer si el proceso
inflamatorio crónico persiste solamente en el ratón BALB/c. El hallazgo de infiltración linfoide en
otros órganos además de la cavidad peritoneal, apoya el modelo de mieloma murino, el cual
intenta reproducir la enfermedad de mieloma humano en donde el daño se extiende a otros
órganos.
En la tabla 1, se mostró la determinación de proteínas totales que sirvió para realizar el análisis
densitométrico una vez realizada la electroforesis de proteínas en el suero de los ratones
BALB/c y C57BL. No se realizó comparación de las proteínas totales entre los cuatro grupos de
ratones, puesto que nuestro objetivo fue analizar las diferentes regiones del proteinograma
para monitorear los cambios, sobre todo, en las bandas de gamma, beta y alfa-2 globulinas.
Cabe mencionar que los resultados no fueron significativos, pero esto se debe a que algunos
individuos no se comportan de la misma forma. Por esta razón, se utilizaron medianas en lugar
de medias para tener una aproximación del valor más real. A pesar de que es necesario
incrementar el número de ratones utilizados para que nuestros resultados sean significativos,
las medianas presentan cambios que nos dan idea de la distribución de las proteínas en los
diferentes grupos de ratones estudiados. Nosotros esperábamos observar un gran pico
estrecho de tipo monoclonal en la región de las gamma globulinas, como en mieloma humano.
Esto no fue así del todo, ya que el análisis de BALB/c inducido no revela una banda
monoclonal de este tipo, sin embargo se observó un incremento, además el pico comenzó
hacerse más estrecho, indicio de que la banda es de tipo monoclonal. Por otro lado, en C57BL
43
también se encontró un ligero aumento en la región gamma, no obstante la banda se observó
más ancha, sugiriendo que fue de tipo policlonal. Otro dato que apoyaría esto, es que el
análisis estadístico en ratones inducidos, mostró que la fracción gamma es mayor en BALB/c
respecto a C57BL. Pero el análisis estadístico de fracciones beta y alfa aportaron otros
resultados. En BALB/c la imagen representativa del análisis densitométrico, no mostró un
incremento en la región beta. Aunque el pico se va haciendo más estrecho, el análisis
estadístico mostró una ligera disminución de esta fracción respecto a ratones testigo. En el
caso de C57BL inducido, el análisis representativo de la región beta, mostró un pico más
estrecho y también un incremento en el análisis estadístico. Cuando se comparó dicha región
en ambas cepas inducidas, la fracción beta fue mayor en C57BL. Con respecto al análisis
representativo de la fracción alfa-2, no se observaron cambios en el ratón BALB/c inducido,
pero el análisis estadístico mostró una disminución de la fracción alfa-2. En C57BL inducido, el
análisis representativo de esta fracción mostró un pico más estrecho y un incremento
significativo respecto al testigo en el análisis estadístico. Además, la fracción alfa-2 de C57BL
inducido, fue mayor respecto al ratón BALB/c inducido. Estos resultados, mostraron que las
bandas de beta y alfa-2 se observaron como picos estrechos y sólo se incrementaron en
C57BL. Kyle en 1981, reportó que la proteína M se puede situar en la región gamma, beta o
alfa-2 de las globulinas, formando un pico estrecho y alto, pero una banda ancha en la región
de las gammas, es producida por un exceso de inmunoglobulinas policlonales. El ratón C57BL
inducido muestra un pico estrecho en la región beta y alfa-2, pero una banda ancha en la
fracción gamma La posible explicación a este hecho, es que C57BL probablemente presentó
un incremento de la fracción gamma, beta y alfa, porque su sistema inmunológico también
estuvo combatiendo al agente extraño, incrementando la producción de anticuerpos
policlonales. El ratón BALB/c inducido, mostró un pico estrecho en la fracción gamma y un
porcentaje más alto de dicha fracción, respecto a C57BL. Estos resultados, solo sugieren que
podría existir banda monoclonal en BALB/c pero todavía no se puede concluir nada al respecto,
puesto que no se obtuvieron picos altos que evidencien la banda monoclonal característica del
MM. La posible explicación a esto, es que se utilizó un aceite mineral de marca comercial
utilizado para el cuidado de los bebes, y esto implica que tenga menor cantidad del
componente activo debido a la gran cantidad de sustancias que constituyen dicho aceite. Es
por ello, que se deberá inducir nuevamente el mieloma en ratones BALB/c con pristano, que es
el componente activo del aceite mineral. Con ello, se espera que la banda monoclonal pueda
ser identificada en ratones BALB/c y no así en ratones C57BL que son resistentes a desarrollar
mieloma.
44
La determinación de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β del líquido peritoneal de ratones BALB/c y
C57BL, se realizó por el método de ELISA. El análisis estadístico, mostró las medianas de las
concentraciones (pg/mL) para cada una de las citocinas analizadas en ambas cepas de ratón.
A pesar, de que en la mayoría de los casos se obtuvieron resultados no significativos debido al
comportamiento disperso de algunos individuos, las medianas representan cambios evidentes
entre los diferentes grupos. La concentración de IL-6 no fue detectada en los testigos de ambas
cepas, la explicación es que la cantidad de esta citocina está por debajo de la sensibilidad del
método empleado, ya que en el caso de los inducidos de ambas cepas de ratón, se observó un
incremento en la concentración de esta citocina. En el caso de IL-10, no se detecto su
concentración en ratones C57BL testigo, pero cuando fueron inducidos se observó que la
concentración de esta citocina se había incrementado. En la cepa BALB/c, la concentración de
IL-10 se detecto en los testigos, pero no fue detectada en ratones inducidos. El análisis de
TGF-β presentó una concentración >600 pg/mL respecto a IL-6 e IL-10, que presentaron
aproximadamente <15 pg/mL y < 50 pg/mL respectivamente. La concentración de esta citocina
fue alta en todos los grupos de ratones, y no se observaron diferencias importantes entre cada
grupo. Es necesario incrementar el número de ratones para que los resultados sean
significativos y realizar más ensayos por el método de ELISA, puesto que solo se realizó un
ensayo por duplicado. Sin embargo, la diferencia observada en las citocinas estudiadas, es
muy clara y nosotros podemos tener una idea de lo que podría estar ocurriendo en la cavidad
peritoneal de ratón BALB/c y C57BL. Por lo que la posible explicación, es que el incremento de
concentración de IL-6 cuando los ratones BALB/c y C57BL fueron inducidos, y la concentración
elevada de TGF-β, podría inducir diferenciación de los linfocitos T CD4 a linfocitos Th17 en
ambas cepas. Se sugiere precisamente la diferenciación de esta población celular, porque por
un lado se sabe que estas citocinas son necesarias para su diferenciación y por otro lado, que
las Th17 favorecen el desarrollo de respuestas inmunológicas exageradas que promueven el
desarrollo de enfermedades autoinmunes y procesos inflamatorios crónicos. También se sabe
que en el sistema inmunológico participan células encargadas de suprimir dichas respuestas,
logrando mantener un equilibrio en la respuesta inmunológica. Según lo reportado, las citocinas
que favorecen la diferenciación de linfocitos T CD4 a linfocitos Treg son la IL-10 y TGF-β. De
acuerdo con esto, solo la cepa inducida que presente estas citocinas, podrá contrarrestar el
efecto de las Th17, por lo que se sugiere que la en cepa C57BL podría estar induciendo la
diferenciación de las Treg, mientras que en la cepa BALB/c, además de no inducirse la
diferenciación, las Treg podrían estar siendo disminuidas, ya que la IL-10 está presente en
testigos, pero se observa su disminución cuando los ratones son inducidos. Por otro lado, la
posible persistencia de linfocitos Th17 no controlados, la presencia de IL-6 y la posible
presencia de la mutación del gen c-myc, pudieran ser los principales factores condicionantes de
45
la persistencia del proceso crónico inflamatorio que no puede ser controlado por células Treg y
además, ser responsables de la transformación y sobrevivencia de los linfocitos B a célula
malignas del mieloma.
Figura 18. Propuesta de las interacciones que ocurren en la cavidad peritoneal del ratón BALB/c y C57BL. a) En
el ratón BALB/c testigo, hay un número incrementado de linfocitos Treg puesto que la presencia de TGF-β e IL-
10 favorecen su diferenciación. b) En el ratón C57BL testigo, hay números similares de linfocitos Th17 y Treg
puesto que no se induce diferenciación. c) En el ratón BALB/c inducido, la presencia de TGF-β e IL-6 promueve la
diferenciación de linfocitos Th0 a Th17 y su incremento promueve la persistencia del proceso crónico
inflamatorio, en el cual se originan las células plasmáticas malignas que generan por sí mismas IL-6 para su
sobrevivencia. d) En el ratón C57BL inducido, el número de linfocitos Th17 y Treg es similar, puesto que se induce
diferenciación a Th17 por la presencia de IL-6 y TGF-β pero también a Treg por la presencia de IL-10 y TGF-β
a)
.
b)
c)
.
d)
46
V. CONCLUSION
Las alteraciones histológicas encontradas en la cavidad peritoneal y en los órganos analizados
del ratón BALB/c inducido con aceite mineral, así como la presencia de citocinas inflamatorias,
son indicadores de un proceso inflamatorio crónico evidente.
47
VII. EXPECTATIVAS PARA TRABAJOS FUTUROS
Deberá utilizarse un inductor más puro y prolongarse el tiempo de observación, para
lograr el desarrollo completo de mieloma en ratón BALB/c, y poner de manifiesto la
banda monoclonal característica de MM.
Realizar histología a otros órganos de ratones BALB/c y C57BL.
Realizar inmunohistoquímica para identificar el tipo de población celular presente en el
proceso inflamatorio.
Incrementar el número de ratones BALB/c y C57BL para el estudio.
Incrementar el número de ensayos para la determinación de citocinas por ELISA
Cuantificar las poblaciones de linfocitos Th17, Treg y células plasmáticas, en el líquido
de la cavidad peritoneal por citometría de flujo.
48
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