CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO AIREADO
RESUMEN
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INTRODUCCION
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y
conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces importante el
conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus
productos. Para ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es
un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el
seguimiento de la cinética nos proporciona datos mucho más prácticos y exactos sobre la
velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado.
La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de
los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un
rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento
y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos
y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían
considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.
Es así que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento de
un microorganismo (Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126), iniciando desde su siembra
partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico,
empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rápida activación, para que
luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo;
es decir con los mínimos requerimientos; en el cual es más factible determinar la
cinética de crecimiento.
Dentro de su importancia en la agroindustria la Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126
es muy valiosa para la conversión de fructosa en etanol que puede mejorar la economía
de una planta transformadora de azucares naturales de frutas a etanol. Con la conversión
de la fructosa, la potencial reducción del precio está en función de tres parámetros de
fermentación: el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad. Asumiendo altos
valores para estos parámetros, la reducción máxima puede volverse de 40%. Hoy en día
es conocido que un número de levaduras fermenta sacarosa en etanol, siendo
Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126 una de las más eficientes, especialmente en relación
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con el rendimiento y la proporción volumétrica. Empleando esta levadura para la
fermentación de la D-xilosa, la reducción en el precio del etanol alcanza el 70% del
máximo asequible.
I. OBJETIVOS :
1.1. Objetivos generales:
Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA)
con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae
ATCC-4126.
1.2. Objetivos Específicos:
Diseñar el medio de cultivo.
Realizar la activación y desarrollo del inoculo.
Identificar y describir las partes, a accesorios y geometrías, conocimiento de la
operación del fermentador, esterilización, carga y descarga y toma de muestra.
Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automático,
así como la calibración de los sensores
Puesta en marcha del cultivo por lote alimentado y determinar µmax y Y x/s.
Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono y oxígeno disuelto a través
del tiempo de operación.
Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitada.
Determinar el Y x/s y Qx del CLA.
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II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL :
A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes
sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los
microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.También
es importante conocer las características de los microorganismos con el que se va a
trabajar.
Microorganismo.
La levadura usada es SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126, siendo el sustrato sacarosa
Condiciones del medio:
Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11)
Duración: 6 horas de la etapa de CLA
Usar el fermentador automáticoBiotron Modelo Liflus G X de 2 litros
Control de pH medianteelectrodo
Medición de oxigeno disuelto mediante electrodo : 1,0 vim ; 200 rpm
La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.
Utiliza macro nutrientes como: C.N.Mg,K,P
Utiliza micro nutrientes como: Ca,Na,Fe,Cu,Mn,Mo,Co,Zn
2.1. DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO
Para diseñar el medio de cultivo se realizara de acuerdo a los alcances que nos
proporciona la guía de práctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del
microorganismo, para su mantención, activación y para la fermentación del cultivo
por lote alimentado.
Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch alimentado
(BA) o fedbatch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta
continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente
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que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la
velocidad de crecimiento () del microorganismo.
El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular
y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante,
es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del
metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren
evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta
concentración de biomasa.
ESQUEMA
Donde F(t): caudal de alimentación
Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación
Vf: volumen final de trabajo
Vo: volumen al inicio de la alimentación
Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación
So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación
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El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que V o, Xo y So son las
condiciones finales de dicho batch.
Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo
de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la concentración de
sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se utilizará el sistema más
simple, es decir F=cte y Sr=cte.
Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.
Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en
batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como S r
sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o S r = Sr(t), dicha
funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas
2.2. PREPARACION DEL MEDIO:
2.2.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN
La preparación de este medio se realizara de acuerdo a los componentes que
se encuentran en la tabla Nº 01
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Nutriente So (g/l) So (g/50ml)
Extracto de Levadura 3 0.15
Extracto de malta 3 0.15
Peptona 5 0.25
Agar 20 1
Glucosa 10 0.5
Tabla N°1: Composición de medio sólido de mantención (para 50 ml de
solución)
Procedimiento
La preparación del medio de mantención se inicia de acuerdo a las
concentraciones de la tabla Nº 01.
Los nutrientes se pesan en cantidades requeridas para 50ml. De la tabla
Nº 01,por lo que el medio de mantención se necesita en cantidades
menores a 50 ml.
Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.
Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer adicionando el
agua destilada.
Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz;
agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la
aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2
minutos.
Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6ml de la
mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.
Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a
presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de
gases.
Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello
controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización.
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego
colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.
Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando con alcohol.
para tener una área estéril prendemos el mechero cinco minutos antes de
realizar la resiembra con el Saccharomycescerevisiae ATCC 4126.
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Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen, flameando para
evitar la contaminación, teniendo la aza bacteriológica calentada al rojo
vivo esperamos un momento que se enfríe.
Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar, flameamos y
cerramos el tubo y así en los 8 tubos con agar.
2.2.2. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN
Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 15 ml de solución)
Procedimiento
Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 2.
En un matraz Erlemenyer se colocó la cantidad pesada de sacarosa más
8 ml de agua destilada.
El extracto de levadura se colocó en tubo de ensayo y se agregó 10 ml
de agua destilada
En cuanto a la solución de sales también se colocó en tubo se ensayó y
se agregó 7 ml de agua.
Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un tubo de
ensayo cada uno, la sacarosa en un matraz de 125 ml todo esto en un
vaso precipitado colocado dentro de una olla a presión.
Después de haber esterilizado se dejó enfriar para luego mezclar y
realizar la activación con el microorganismo.
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NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (G/L) PESAR (G)
Sacarosa 15 0.225
Extracto de
Levadura
3 0.045
Extracto de Malta 5 0.075
Solución de Sales 5 ml/L 0.075ml
Al mezclar estos componentes (las sales y la levadura con la sacarosa)
se procedió a activar el microorganismo “bajo mechero” para evitar la
contaminación.
Sacamos dos azadas y colocamos en el medio de activación, luego
tapamos con el tapón previamente elaborado.
Colocar en el shaker por un tiempo de 12h.
2.2.3. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN
Tabla N° 3: Composición Del Medio De Fermentación I
Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 100ml. El diseño del medio se realizó en un matraz Erlenmeyer de 500ml.
Elemento Nutriente % en Celula
% en nutriente
Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l) pesar (gr)
C Sacarosa (C12H22O11)
45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478 0.3847
N Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4
9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457 0.1146
K Fosfato Potasico (KH2PO4)
0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471 0.0047
Mg Sulfato de Magnesio
Heptahidratado (MgSO4.7H2O)
0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095 0.0195
P Fosfato Potasico (KH2PO4)
2 22,79 11,395 0,1580 0,2369 0.02369
- Extracto de Levadura
- - - - 1,8 0.18
- Solucion de sales - - - - 10 ml/L 1
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Condiciones de Cultivo :
pH inicial : 4,2SHAKER
Temperatura: 35ºC
Velocidad de agitación : 200 rpm
La fermentación se realizara en un matraz de 500 ml.
Tabla N° 4: Composición Del Medio De Fermentación I
Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 800ml
Elemento Nutriente % en Celula
% en nutriente
Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l)
C Sacarosa (C12H22O11)
45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478
N Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4
9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457
K Fosfato Potasico (KH2PO4)
0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471
Mg Sulfato de Magnesio
Heptahidratado (MgSO4.7H2O)
0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095
P Fosfato Potasico (KH2PO4)
2 22,79 11,395 0,1580 0,2369
- Extracto de Levadura
- - - - 1,8
- Solucion de sales - - - - 10 ml/L
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Condiciones de Cultivo :
pH inicial : 4,2SHAKER
Temperatura: 35ºC
Velocidad de agitación : 200 rpm
La fermentación se realizara en el fermentador de 2000 ml.
FERMENTACIÓN DEL CULTIVO
Inocular el caldo (medio rico + biomasa) a un matraz conteniendo medio de
fermentación, para el la adaptación del crecimiento
Durante el desarrollo del cultivo, para las evaluar el crecimiento de biomasa,
tomar una muestra inicial, al que se le mide la absorbancia y se centrífuga,
guardando el sobredanante en viales y la masa sedimentada en capachos que
serán expuestos a la estufa.
Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de
alimentación de tal manera que en tiempos determinados, se provoque en el
comportamiento del crecimiento.
Luego se llevara a cabo la alimentación, se llevara a cabo una segunda
fermentación para un volumen final del medio a 1600 ml de solución
Tabla N° 5: Composición Del Medio De Fermentación II
Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 3.65 g/l. para un volumen de 1600ml. Entonces se tendrá: ΔX=3.425gr/l
Elemento
Nutriente YX/SSo
(gr/l)S´o
(gr/l)Pesos (g)
Extracto de levadura
1.8002.880
N (NH4)2SO4 2.361.45
42.181
3.489
P KH2PO4 11.380.30
10.451
0.722
K KH2PO4 57.470.06
00.089
0.143
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MgMgSO47H2O
24.660.13
90.208
0.333
Extracto de sales10.00
0 16.000
La fermentación se realizara en el fermentador de 2000 ml.
2.3. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O.
El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la
concentración de microorganismos a medida que avanza el tiempo, esto puede
ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640nm. Para ésta
determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado,
para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son
determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:
Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200rpm.
Durante 20 minutos.
Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua
destilada.
Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de
sustrato que pudiera alterar la determinación.
Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en la estufa
a 80ºC hasta peso constante.
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Condiciones de Cultivo :
pH inicial : 4,2SHAKER
Temperatura: 35ºC
Velocidad de agitación : 200 rpm
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PREPARACION DE SALES
Se peso todas las sales
en la balanza analítica.
CaCl2 .2H2O: 1.12 g/L
ZnSO4.7H2O: 0.11 g/L
FeSO4.7H2O: 0.06 g/L
CuSO4.5H2O: 0.05 g/L
CoCL2.6H2O: 0.01 g/L
MoO3 : 0.0005 g/L
MnCl2.6H2O: 0.027 g/L
NaCl : 0.28 g/L
Cada sal me mezclo con agua y se le echo a la fiola de un litro.
2.4. AEREACION
Algunas consideraciones que se debe tomar son:
Proporcionar a los microorganismos el oxígeno necesario para llevar a cabo su proceso respiratorio.
La solubilidad del O2 es baja < 10mg/l Þ se necesita alimentar en forma continua este “nutriente”, dado que su demanda es aproximadamente de 1g/l.
Se pueden tener sistemas donde los microorganismos crecen con múltiples sustratos, pero en el caso que todos son limitantes. Ej, C, N, O2 , luego la cantidad de cada uno de ellos afecta la cinética de crecimiento.
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Luego de haber pesado todas las sales y de haberlo echado a la fiola; a esta fiola se le enrazo con agua.
Se mezcló todas las sales y luego se vació a un pomo de vidrio.
Al pomo de vidrio se le llevo a la refrigeradora.
Transferencia de Oxígeno
El comportamiento de las fermentaciones está fuertemente influenciado por una serie de operaciones de transferencia.
Es posible que una determinada fermentación, en especial las aeróbicas, esté limitada en sus posibilidades de mejorar su rendimiento y productividad, no por razones propias de las características de las células sino que por problemas en el diseño que permita satisfacer la alta demanda de transferencia de masa, y en especial de oxígeno.
Necesidades de Diseño
Se diseño de un sistema de aireación-agitación debería satisfacer que:
DEMANDA DE OXIGENO = OFERTA DE OXIGENO
Por otra parte, el crecimiento microbiano se puede representar por:
1CaHbOC + m NH3 + n O2 à q CdHeOfNg + r CO2 + t H2O + u ChHiOjNk
CdHeOfNg: Biomasa
ChHiOjNk: Metabolito extracelular
De acuerdo con la ecuación anterior, el rendimiento de oxígeno en células se puede calcular por medio de la relación entre “n” y “q”
Si no se producen Metabolito extracelular, “u” igual a cero è
mws: Peso molecular de la fuente de carbono y energía
Proceso de transferencia de oxígeno (OFERTA)
Etapas
(i)Del seno de la burbuja a una capa interna de gas
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μ=μmax( GKG+G )⋅( N
K N+N )⋅( OKo+O )
Y O 2x
=32 a+8b−16 cY x
s
⋅mws
+0 .01 f −0 .03 d+0.02 g−0 . 08 e
(ii) Difusión en la capa interna de gas.
(iii) Difusión a través de una capa externa de líquido que rodea a la burbuja ¡Etapa limitante!
(iv) Transferencia al seno del líquido
(v) Difusión a través de la capa de líquido que rodea a los microorganismos ¡Etapa limitante!
(vi) Difusión en el interior de los microorganismos
Velocidad de Transferencia de Oxígeno por área interfacial
La velocidad de transferencia por unidad de área interfacial, W, está dada por:
W = kl (Ci – C)
Como en la interfase se supone que hay equilibrio entre el oxígeno en el gas y el disuelto.
W = kl (Ci – C)= kG (P – Pi)
Las cantidades Pi y Ci resultan difíciles de determinar en la práctica, se prefiere hacer uso de las relaciones de equilibrio, trabajando con las concentraciones y
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FO2
presiones de equilibrio C* y P*. Con ello se trabaja con la “ Velocidad de transferencia de oxígeno volumétrica”, NA
Velocidad de Transferencia de oxígeno volumétrica
Cuando el control de la transferencia de O2 se encuentra en el film líquido que rodea a la burbuja o a los microorganismos, la velocidad de transferencia de oxígeno, NA
se puede expresar como:
NA = kLa (C* - C) = H kLa (P – P*)
Se supone que hay equilibrio entre el oxígeno del gas y el disuelto en el líquido.
kL: Coef volumétrico de transferencia de O2 a la fase líquida (cm/hr)
a : Area interfacial específica (cm2/m3) Resulta difícil de medir è (kLa)
C*: Conc. de O2 en el equilibrio (mM/L) (Hipotético)
C : Conc. de O2 disueltro en el seno de la fase líquida (Este valor no puede ser inferior Ccrítico » 1mg/l)
P* : Presión de O2 en el equilibrio
P : Presión de O2 en el seno de la fase gas.
H : cte. de Henry..
Balance de Oxígeno
Se puede plantear una ecuación de balance de oxígeno en el fermentador:
O2 que entra – O2 que sale – O2consumido por unidad de volumen = Acumulación.
O2 que entra – O2 que sale = O2 que se transfiere = NA
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Para que el cultivo pueda crecer sin limitación de Oxígeno, el suministro debe ser igual a la demanda.
Métodos de determinación k L a
Para la adecuada operación de un fermentador se hace necesario conocer el valor del coeficiente volumétrico de transferencia de O2
kL = f (Sc, Sn, GR)
kL × a a = f (D32, H)
Medición de los flujo de Oxígeno
o Titulación
o Oxidación de sulfito de sodio
o Eliminación del O2
o Método Dinámico.
o Balances de masa
o Medición Directa con analizador de O2
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k L a⋅(C¿−C )− μ⋅xY o 2
x
=dCdt
k L a⋅(C¿−C )= μ⋅xY o 2
x
Estimado mediante Correlaciones
o Método del sulfito de sodio
Se basa en la rápida reacción química de oxidación del sulfito a sulfato mediante O2.
Se reemplaza el medio por solución de sulfito de sodio (sulfato cúprico como catalizador) y se burbujea aire por un cierto tiempo.
Sulfito + O2 à Sulfato
kLa C* : Representa la máxima velocidad volumétrica de transferencia de O2 en un sistema dado (fermentador).
o Método dinámico
En este caso la medición se realiza en el fermentador durante el crecimiento de un cultivo activo, registrándose el oxígeno disuelto. El proceso tiene 2 etapas.
Etapa 1: Durante la fermentación se corta el suministro de aire (T1) y se registra la disminución de O2 disuelto. En este caso el suministro es nulo.
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k L a⋅C ¿=Sulfitoinicial−Sulfito final
Δt
μ⋅xY o 2
x
=dCdt
k L a⋅(C¿−C )=0
La pendiente de la curva es la demanda de O2:
El flujo de aire se repone antes que se alcance la concentración crítica de oxígeno, Cc (bajo este valor la velocidad de metabolismo se hace dependiente de la concentración C, pudiéndose causar daños irreversibles en los m.o.).
Cc ≈ 0.1*Concentración de Saturación
Bajo estas condiciones se cumple:
Desde la cual se despeja el término (-1/kLa)
Depende de la velocidad de respuesta de los electrodos
o Método medición directa
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μ⋅xY o 2
x
=dCdt
C=C ¿− 1k L a [ μ⋅x
Y o2x
+ dCdt ]
Para aplicar este método se utiliza un electrodo de oxígeno disuelto y sistemas para determinar oxígeno en la fase gaseosa.
En este método se calcula la demanda de oxígeno midiendo el flujo de aire y la concentración de oxígeno en las corrientes gaseosas de entrada y salida.
Con estos valores y la lectura de oxígeno disuelta, se calcula kLa.
O2 que entra – O2 que sale = O2 que se transfiere = kL a (C* - C)
Método de alto costo debido al equipamiento analítico requerido.
2.5. AGITACIÓN
La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.
La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para la eliminación del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.
Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases:
Dispersión del aire en la solución de nutrientes. Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración de
nutrientes, en el fermentador. Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos. Dispersión de los líquidos inmiscibles.
Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el daño celular.
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La agitación es una operación muy importante tanto del punto de vista técnico como económica.
La agitación es importante para:
• un mezclado homogéneo
• Una buena transferencia de masa y de calor, permite disminuir el espesor de la película líquida estática.
Diseño del sistema de agitación
El sistema de agitación tiene la función de generar la potencia necesaria para producir una mezcla perfecta para el sistema de cultivo y producir un régimen de agitación adecuado que, maximice la difusión de gases en el líquido y minimice la producción de esfuerzos cortantes y la presión hidrodinámica local y global, para optimizar los fenómenos de transferencia de momentum, calor y masa.
Un sistema de agitación consta de cuatro partes mecánicas:
Motor Impulsor: suministra la potencia al eje de potencia; debe ser de corriente alterna (a.c), preferiblemente de inducción y su potencia debe calcularse para manejar el doble (200%) de la potencia teórica requerida para agitar el fluido y el cultivo a Re≥3000. Motor de Inducción (A.C): dado que un biorreactor debe operar de forma continua durante todo el proceso de cultivo; se requiere un motor capaz de resistir largos periodos de operación continua y trabajo duro; por eso, el motor debe ser de inducción de corriente alterna (a.c) y debe ser acorazado, preferiblemente en acero inoxidable.
Eje trasmisor de la potencia: es una barra cilíndrica de acero inoxidable 316L y por lo general se diseña en diámetros estándar: ¾”, ½”, etcétera para mayor facilidad de ajuste a los estándares de motores a.c. Su longitud depende de la profundidad del contenedor (tanque).
Acople del Eje Transmisor: ajusta y fija al motor, el eje transmisor de potencia. Existen dos tipos de acople:
Acople-adaptador de tipo taladro: el puerto de entrada se acopla al eje del motor por fijación directa. El puerto de salida es un dispositivo que se adapta a varios diámetros de broca y sujeta o abraza firmemente el eje transmisor de potencia por presión y abrasión; similar al que utilizan los taladros mecánicos.
Acople-ajustador de tipo tornillo-rosca: el puerto de entrada se “enrosca” o se fija firmemente al eje del motor. El puerto de salida es un dispositivo que “abraza” el eje transmisor de potencia por un mecanismo de tornillo-rosca.
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En ambos casos, el diámetro del puerto de entrada del acople que es la unión de éste con el eje del motor debe ser de diámetro interno igual al diámetro externo del eje del motor y el diámetro del puerto de salida que es dispositivo sujetador del eje transmisor de potencia debe ser el mismo que el diámetro externo del respectivo eje.
2.6. ESTERILIZACION
Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía.La razón fundamental para efectuar la esterilización en Microbiología Industrial es para evitar la competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos específicos.
Métodos de esterilización
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
a) Por destrucción total de microorganismos
Por destrucción total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino olas bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto ésta metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su empleo.
b) Por muerte o inactivación
La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación. En el caso de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmósferas. En escala grande el equipo de producción es esterilizado con vapor saturado bajo presión, y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre también en el caso de los autoclaves)
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porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Después de la esterilización se mantienen las condiciones asépticas, haciendo pasar vapor por las válvulas y sellos.
c) Por eliminación con medio físicos.
La eliminación física está restringida a la esterilización de gases líquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de los microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.
Cinética de la esterilización por calor
La cinética de la esterilización por calor húmedo, que es la única que consideraremos en ésta monografía por su aplicación a la esterilización de medios de fermentación, está caracterizada bastante aproximadamente por una reacción cinética de primer orden.
Si No es el número de organismos viables presentes inicialmente y N es número viable al final tendremos que la ecuación de velocidad de muerte será:
(1)e integrando entre los límites
No a tiempo = 0 y N al tiempo t = t, se obtiene
N/No es la fracción de organismos viables que sobreviven después del tratamiento por calor durante el tiempo t y K = constante de velocidad de destrucción, que depende de la temperatura según la clásica ecuación de Arrhenius:
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Donde: A = constanteE = energía de activaciónR = Constante general de los gasesT = Temperatura en grados Kelvin
Si se gráfica el In k en función de 1/T se obtendrá una línea recta, siendo la inclinación igual a -E/R y la intersección de la recta con la ordenada, el valor de la constante de Arrtherius.
En la práctica de la esterilización es necesario tener presente que la calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razón por la cual, es imprescindible diseñar un ciclo de esterilización lo más efectivo posible pero al mismo tiempo lo más corto posible. Podremos definir un término nabla (V) que representa la magnitud de la disminución del número de organismos viables de manera que:
Y por tanto
Sin embargo, como ya dijimos, parte de la destrucción ocurre en la etapa de calentamiento y otra parte en la de enfriamiento, de manera tal que:
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Las partes de calentamiento y enfriamiento son obtenidas a temperatura variable de manera tal que es necesario integrar la ecuación:
para el período de calentamiento y de enfriamiento con el fin de calcular la cantidad de esporos que se eliminan durante ambos períodos. Conociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a 120 °C para la esterilización completa del mismo.
2.7. MONTAJE DE EQUIPO
El biorreactor antes de ser puesto en marcha se llenara con alcohol de 96º para
ser esterilizado.
El biorreactor será puesto en marcha con un volumen inicial igual a 0.75Lt para
llegar a un volumen final de 1.65Lt y utilizando la siguiente formula:
Se determinó q el tiempo de fermentación será de 6 h para un flujo constante de
alimentación de (3/20)Lt/h.
Se trabajara con 1,5 vvm y 150 rpm como será un cultivo por lote alimentado
aireado no habrá flujo de salida.
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RESERVORIO BOMBABIORREACTOR
F(t)SR(t)
VR = Vf - V0
V0, X0, S0
Vf, Xf
2011CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO
V=V0+Ft
Para esta experiencia se utilizara un El sistema Liflus GX fermentación es un
fermentador a escala de laboratorio, que está diseñado para la fermentación de
usos múltiples. Varios esquemas de fermentación, tales como fedbatch e incluso
el cultivo de células animales pueden ser pertalined con la serie BioGM. El
monolítico monitor LCD se instala en el cuerpo de la torre controlador de
tamaño medio y se puede visualizar todos los valores medidos y los parámetros
de control.
El biorreactor del laboratorio es un biorreactor marca boitron- liflus GX.
El biorreactor del laboratorio de la universidad nacional del santa posee las
siguientes partes:
Determinación de PH (4.2)
Sensor de PH
Sensor de Tº
Sensor Oxígeno Disuelto.
Antiespumante
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Condensador
Motor de rotor
Posee cuatro bombas peristaticos: acido- base- alimentación-
espumante
2 Sensores de aire (1%)
Un vaso con capacidad de 6lt
2.8. PREPARACION DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS (1L)
Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales
concentradas para sepa de SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126 lo cual se
muestra en la guía de Práctica de Bioprocesos:
Fuente de Ca : 2,9 g CaCl2. 2H2O
Fuente de Fe : 0.6009 g FeSO4.7H2O
Fuente de Cu : 0,25 g CuSO4.5H2O
Fuente de Co : 0,24 g CoCl2.6H2O
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Fuente de Zn : 0,4015 g ZnSO4.7H 2O
Fuente de Mg : 2,20 g MgSO4.7H2O
Fuente de B : 0.06 g H3BO3
Fuente de Cl : HClconc.
Cada compuesto se pesara con cuidado.
Luego de pesar, cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de
precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador
de vidrio, la solución se colocara en una fiola de 1 litro y se enrazara con agua
destilada hasta completar 1litro.
Una vez realizado el preparado se llevara a refrigeración para su posterior
utilización.
2.9. SOLUCIÓN BUFFER O TAMPÓN
Una solución buffer o tampón o amortiguadora es una mezcla de un ácido débil y
una base débil, la cual se puede obtener mezclando un ácido débil con una de sus
sales correspondientes, “tampón ácido”, puesto que el anion del ácido es una base
débil. También se puede preparar la solución amortiguadora mezclando una base
débil con una de sus sales correspondientes “tampón básico”. El ácido débil
reacciona con cual quien cantidad de OH- agregado, mientras que el papel de la
base débil es consumir el H+ que pueda haberse introducido. Esto impide que se
perturbe en mayor grado el equilibrio:
H2O H+ + OH- y del cual dependa el PH mayor de la solución.
El efecto amortiguador de estas soluciones se presenta cuando se les agrega
pequeñas cantidades de ácidos fuertes o bases fuertes. El responsable de este efecto
es una o más reacciones que ocurren dentro del sistema y en las cuales se consume
casi totalmente el ácido o base agregados. Esta reacción puede determinarse
fácilmente sobre la base del equilibrio que predomina en el sistema aplicando el
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teorema de Chatelier y teniendo en cuenta que siempre que un ácido esta en
presencia de dos bases reacciona con aquella que produzca la sustancia más estable
o que posee la menor constante de disociación y lo mismo puede decirse si se trata
de una base en presencia de dos ácidos.
III. MATERIALES INTRUMENTOS Y REACTIVOS
3.1. Medio de mantención y resiembra del microorganismo.
Materiales y equipos
Balanza analítica
Olla a presión
Mechero Bunsen
Pipetas de 10 ml.
Aza bacteriológica
Tubos de ensayo con tapas (8 tubos)
Varilla de vidrio
Matraz Erlenmeyer (250ml)
Guantes.
Espátula
Probeta graduada
Capachos de papelmetalico
Reactivos
Muestra: Saccharomycescerevisiae ATCC 4126
Sustrato: sacarosa
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Agar.
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3.2. Medio de activaciónMateriales y equipos
Matraz de 250ml.
Matraz de 125 ml
Tubos de ensayo con tapa
Algodón
Gasa
Varilla de vidrio
Balanza analítica
Espátula
Agua destilada
Pinzas
Guantes
Shaker
Mechero Bunsen, trípode y rejilla.
Olla a presión
Pipetas
Capachos de papel metálico.
Reactivos
Componentes según Tabla Nº 2
Alcohol
HClcc.
3.3.Medio de fermentación y proliferación
Materiales y equipos
Matraz de 1 L
Matraces de 125 ml
Varilla de vidrio
Capachos de papel metálico.
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Balanza analítica
Reactivos
Según la tabla Nº 3 y 5 de anexos
Agua destilada
Alcohol
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES :
Tabla Nº: Programación y actividades a realizar
ACTIVIDADES FECHA Recepción de guía de practicas 02/11/10
Explicación del procedimiento de
práctica.
02/11/10
Presentación del preinforme de
practicas
07/11/10
Esterilización de materiales preparación
de medios e inoculo para la curva de
calibrado
09/11/10
Toma de muestras para determinación
de la curva de calibrado rápido
16/11/10
Preparación de instrumentos y esterilización de los mismos
Preparación del medio de activación
22/11/10
Inoculación al medio de activación Preparación del medio de fermentación
22/11/10
Inicio de la cinética y toma de muestras 23/11/10
Discusión y conclusión de la experiencia 23 – 24/11/10
Imprevistos de la experiencia 25/11/10
Presentación del informe final 30/11/10
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2011CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO
V. BIBLIOGRAFIA
Jay, J. 1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Zaragoza, España: Acribia.
Doran M, P. Principios de Ingeniería de los Bioprocesos. Zaragoza, España:
Instituto Politécnico Nacional. 2007. Laboratorio de Biorreactores: Manual de
Prácticas. México. p. 48
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?
Mostrar=quimicos
http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf.
http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml
QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica
www.sciencedirect.com
MEDIOS DE FERMENTACION.PDF
Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos.PDF
Diseño de fermentadores o bioreactores.PDF
http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema12MI.html
http://www.monografias.com/trabajos63/fermentadores-cultivo
sumergido/fermentadores-cultivo-sumergido2.shtml
Página 33L A B O R A T O R I O D E B I O P R O C E S O S G R U P O B - 4
2011CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO
http://es.wikipedia.org/wiki/
Biorreactor#Dise.C3.B1o_de_un_Biorreactor_de_Tanque_Agitado
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ANEXOS
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En la Guía de prácticas de curso Laboratorio de Bioprocesos se parte de las siguientes condiciones:
Referencias de composición de medios de mantención, activación y cultivo para SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126
MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (GR/L)Solido de mantención
(YM solido)Extracto de levaduraPeptonaExtracto de maltaAgarGlucosa
3532010
Activación SacarosaExtracto de levaduraExtracto de maltaSolución de sales
15355 ml/L
Fermentación SacarosaExtracto de levadura(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2OSolución de salespH 4,2
1.8
10 ml/L
Condiciones de cultivo: temperatura 35°C y velocidad de agitación 200 rpm en el agitador orbital (shaker)
COMPOSICIÓN DEL M.O:
COMPONENTES % DE COMPOSICIONC 45 %N 9 %
Mg 0.4 %
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K 0.5 %P 2.0 %
µmax = 0.37 h-1 en glucosa a 35° C ( Lane, M. y Morrissey, J. 2010
COMPOSICION DE NUTRIENTE (g) PARA UN MEDIO DE
MANTENCION PARA 50ml
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN
Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 15 ml de solución)
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Nutriente So (g/l) So (g/50ml)
Extracto de Levadura 3 0.15
Extracto de malta 3 0.15
Peptona 5 0.25
Agar 20 1
Glucosa 10 0.5
NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (G/L) PESAR (G)
Sacarosa 15 0.225
Extracto de
Levadura
3 0.045
Extracto de Malta 5 0.075
Solución de Sales 5 ml/L 0.075ml
2.9.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN
Tabla N° 3: Composición Del Medio De Fermentación I
Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 100ml. El diseño del medio se realizó en un matraz Erlenmeyer de 500ml.
Elemento Nutriente % en Célula
% en Nutriente
Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l) pesar (gr)
C Sacarosa (C12H22O11)
45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478 0.3847
N Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4
9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457 0.1146
K Fosfato Potasico (KH2PO4)
0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471 0.0047
Mg Sulfato de Magnesio
Heptahidratado (MgSO4.7H2O)
0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095 0.0195
P Fosfato Potasico (KH2PO4)
2 22,79 11,395 0,1580 0,2369 0.02369
- Extracto de Levadura
- - - - 1,8 0.18
- Solucion de sales - - - - 10 ml/L 1
La fermentación se realizara en un matraz de 500 ml.
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Condiciones de Cultivo :
pH inicial : 4,2SHAKER
Temperatura: 35ºC
Velocidad de agitación : 200 rpm
Tabla N° 4: Composición Del Medio De Fermentación I
Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 800ml
Elemento Nutriente % en Célula
% en Nutriente
Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l)
C Sacarosa (C12H22O11)
45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478
N Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4
9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457
K Fosfato Potasico (KH2PO4)
0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471
Mg Sulfato de Magnesio
Heptahidratado (MgSO4.7H2O)
0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095
P Fosfato Potasico (KH2PO4)
2 22,79 11,395 0,1580 0,2369
- Extracto de Levadura
- - - - 1,8
- Solucion de sales - - - - 10 ml/L
La fermentación se realizara en el fermentador de 2000 ml.
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Condiciones de Cultivo :
pH inicial : 4,2SHAKER
Temperatura: 35ºC
Velocidad de agitación : 200 rpm
Tabla N° 5: Composición Del Medio De Fermentación II
Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 3.65 g/l. para un volumen de 1600ml. Entonces se tendrá: ΔX=3.425gr/l
Elemento
Nutriente YX/SSo
(gr/l)S´o
(gr/l)Pesos (g)
Extracto de levadura
1.8002.880
N (NH4)2SO4 2.361.45
42.181
3.489
P KH2PO4 11.380.30
10.451
0.722
K KH2PO4 57.470.06
00.089
0.143
MgMgSO47H2O
24.660.13
90.208
0.333
Extracto de sales10.00
0 16.000
Fuente de carbono y energía: Sacarosa (C12 H22 O11), M =342 g
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Condiciones de Cultivo :
pH inicial : 4,2SHAKER
Temperatura: 35ºC
Velocidad de agitación : 200 rpm
YX/S= % de C en el nutriente / % de C en la célula.
% de C en el nutriente = 12(12) x 100 / 342 = 42.105 %
% de C en la célula = 45 %
YX/S=(42.105/45) x0.6 (este factor por ser aireado)
YX/S = 0.936x 0.5 = 0.468g/g
1. CALCULO DE % NUTRIENTE:
Sacarosa: C12 H22 O11
PM = 342
342 100%
12x12 x
x = 42.105
KH2PO4
P:
PM = 136.1
136.1 100%
31 x
x = 22.777
KH2PO4
K:
PM = 136.1
136.1 100%
39.1 x
x = 28.73
(NH4)2SO4:
PM = 132
132 100%
28 x
x = 21.21
MgSO47H2O
PM = 246.3
246.3 100%
24.3 x
x = 9.866
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2011CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO
2. CALCULO DE YX/S:
Y x /s=%nutriente% celula
×0 . 6
Sacarosa:
Yx/s=(42.105/45)x0.5
Yx/s= 0.468g/g
KH2PO4:
P:
Yx/s=(22.777/2)
Yx/s= 11.3885 g/g
KH2PO4:
K:
Yx/s=(28.73/0.5)
Yx/s= 57.46 g/g
(NH4)2SO4:
Yx/s=(21.21/9)
Yx/s= 2.3567 g/g
MgSO47H2O
Yx/s=(9.866/0.4)
Yx/s= 24.665 g/g
3. CALCULO DE S0
Y x /s=x−x0
s0−s
Sacarosa:
0.468= 1.8/S0
S0= 1.8/0.468
S0 = 3.8462g/l
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KH2PO4
P:
S0= (1.8/11.3885)x1.5
S0 = 0.2371 g/l
K2HPO4
K:
S0= (1.8/57.46)x1.5
S0 = 0.046989 g/l
(NH4)2SO4:
S0= (1.8/2.3567)x1.5
S0 = 1.14567 g/l
MgSO47H2O
S0= (1.8/24.665)x1.5
S0 = 0.10946 g/l
Extracto de levadura :
S0= 1.8
Solución de sales
S0= 10ml/L
COMPOSICION DE SOLUCIONES DE SALES:
COMPONENTES CONCENTRACION(gr/L)
CaCL2,2H2O 1.12ZnSO4.7H2O 0.11FeSO4.7H2O 0.06CuSO4.5H2O 0.05CoCL2,6H2O 0.01
MoO3 0.0005MnCL2,6H2O 0.027
NaCl 0.28
DESARROLLO DE LA FERMENTACION (CAPACIDAD 2L)
MEDIO DE ALIMENTACIÓN: (para 1000ml de solución)
Dato del biorreactor: F = 2.67ml/ min = (0.16)L/ h
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2011CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO
X0 = 1.8 gr/L
S0 = 0
Sf = 3.77 gr/L
CONDICIONES INICIALES DADAS:
COMPOSICION ELEMENTAL DEL MICROORGANISMO
C 45% N 9% Mg 0.4% K 0.5% P 2.0%
Calculemos el Yx/s, teniendo a la fuente de Carborno (Sacarosa) como factor limitante, asi
tenemos:
Y x /s=%nutriente% celula
×0 . 6
Yx/s=(42.105/45)x0.5
Yx/s= 0.468 g/g
Así mismo, de acuerdo con las condiciones de cultivo:
umax=0.37h-1
T=35°C
Volumen Total del fermentador= 2L
Tiempo total del CLA= 6h
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Como sabemos, el CLA con aireación necesita antes el microorganismo tener un
CULTIVO POR LOTE, en el cual haya comenzado su crecimiento exponencial, hasta
obtener hemos creído conveniente una concentración de células de 2g/L.
Condiciones para el CULTIVO POR LOTE
Vo=800ml
Xo=0.2g/L
Xf=2g/L
ΔX=1.8 g/l
So=?
Supongamos que tras el inicio de la fermentación, tenemos que encontrar el tiempo óptimo
donde se inicia la fase de crecimiento exponencial, para ello hemos querido conveniente
fijar una ∆X=1.8g/L, suponiendo que se ha consumido todo el sustrato, entonces tendremos
que:
Sf=0 (inicio del CLA)
Y x/ s=X f−X 0
S0−S f
Entonces, So=?
So=1.8
0.468
So=3.8462 g /L
Calculando el tiempo aproximado de fermentación del Cultivo por Lote:
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t= 1umax
ln (x f
xo
)
t= 1(0.37)
ln ( 20.2
)
t=6.22horas
Condiciones para el CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO
En la zona de crecimiento exponencial de masa celular
So=0 gr/L
Xo=1.8gr/L
Vo=800ml
umax=0.37h-1
Yx/s= 0.47 g/g
BIOMASA INICIAL(XoVo)= (1.8g/l)(0.8L)=1.44gr
De acuerdo a la bibliografía revisada, hemos creído conveniente trabajar con un
volumen final de 1.60L (80% del volumen total), entonces se tendrá:
Como el tiempo total del CLA = 6horas
dVdt
=F entonces : F=V f −V 0
t=1.6−0.8
5=0.16 L/h=2.67 ml/min
Condiciones de transición
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Como se tiene dos zonas de crecimiento, por teoría sabemos que se debe cumplir:
Entonces debemos calcular el tiempo de transición, a partir de:
(XV) crecimiento exponencial= (XV) crecimiento limitado
Asimismo se debe cumplir, para un buen desarrollo del microorganismo, teniendo un tiempo de transición =2.5horas
Entonces, sabemos que:
BIOMASA ZONA CRECIMIENTO EXPONENCIAL= BIOMASAZONA
CRECIMIENTO LIMITADO
XoVo eumax.t = FSfYX/S t + SoVo + XoVo
Despejando Sf, obtenemos que:
SF=(XoVo eu max. tT−SoVo−XoVo)
F Y X /StT
Reemplazando:
SF=(1.8∗0.8 e0.37∗2.5−0∗0.8−1.8∗0.8)
0.16∗0.47∗2.5
SF=11.66 g/ L
En la zona de crecimiento limitado de masa celular
Tendremos que:
XV= FSfYX/S t + SoVo + XoVo…………………. (α)
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Biomasa producida en la zona de crecimiento exponencial
= Biomasa producida en la zona de crecimiento limitado
Como según la bibliografía revisada, se tiene que Xf= ¿
Entonces en Vf= 1.60L, se tendrá:
Asimismo, Sf=? y So=0gr/l
De la ecuación (α), reemplazamos los datos obtenidos:
XV= (0.16)*(11.66)*(0.468)*(5) + 1.8*0.8
XV=5.8055gr de biomasa
Como: Vf=1.6L
Xf= (5.8055/1.6)=3.62844 gr/L
ASIMISMO:Sf=?A partir de: Sabiendo que: ks=0.01
umax=0.37h-1
Yx/s= 0.47 g/g
Reemplazando:
SF=(0.16∗11.66∗0.467∗0.01)
0.16∗11.66∗0.467 (0.37∗5−1 )+(0+1.8∗0.8 )∗0.37
SF=0.01368 gr /L
CALCULO DEL VALOR DEL N A:
NA=µ. xyo2
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Donde:
NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno
x: Biomasa
Yo2: Rendimiento de O2
El valor de µ teórico para la Saccharomyces cerevisiae es 0,4 h -1 y el rendimiento de O2 es de 1,25 mg de O2 / L.h.
NA=(0,4
1h )( 5 gcel .
L)
(1,25gO 2L.h
)NA=1,6
g celgO 2
Calculo del valor del KLA:
KLA= NA(CL∗−CL)
Donde:
CL*: Concentración Crítica de Oxigeno disuelto
CL: Concentración de Oxigeno disuelto
El valor de CL* teórico para la Saccharomyces cerevisiae es 0,6 mg O2/L y el CL es de 20 % del valor de CL*, entonces es 0,12 mg O2/L.
KLA=(1,6 g
celgO 2
)
(0,6−0,12 ) mgO2L
KLA=3333,3 gcel /L
PREPARACION DE SOLUCION TAMPON
A= 57.5 g ácido cítrico/250 ml P.M=192.13gr/mol
Entonces: [A]= (57.5/192.13*250)=1.19M
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B= 29.41 g citrato/100 ml P.M=170.14 gr/mol
[B]= (29.41/170.14*100)=1.73M
Luego, se tomo:
157.5 ml A + 92.5 ml B ajuste pH HCl y KOH
+
250 ml Agua Destilada
Entonces tendremos que:
[A]= (1.19*157.5/500)=0.375M
[B]= (1.73*92.5/500)=0.32M
pka=3.13
pH =pka + log([sal]/[acido])
pH = 3.13 + log(0.32/0.375)
pHinicial = 3.726, se utilizó KOH para ajustar el pH a 4.2
Solución Tampón: 500 ml
pH citrato= 4.2
CÁLCULO DE LA VELOCIDAD DE AIREACIÓN ESPECÍFICA: “VVM”
vvm=2,035 ×10−4 NA ×Tε
Donde:
NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno
T: Temperatura en °K
Ɛ: Eficiencia de Absorción
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Los valores típicos de vvm:
Laboratorio: 0,5 – 2.0 vvm
El valor teórico del vvm es 0,5 g . ° KL .h
a nivel de laboratorio.
CÁLCULO DEL CAUDAL DE AIRE: “Q ”
Q=vvm ×VLDonde:
vvm: Velocidad de Aireación Específica
VL: Volumen del Líquido del Fermentador
Reemplazando: VL= 1,8 L vvm= 0,5 g.°K / l.h
Q=0,5g .° K
l. h× 1,8 L
Q=0,9Lh
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