NúcleoRE rugoso
Síntesis Proteínas
Vesícula de transporte
REliso
Complejo de Golgi
Lado CIS
Lado TRANS
Vesícula secreción
Exocitosis (proteínas,mensajeros químicos…)
Endocitosis
Endosoma
Lisosoma
Introducción a las membranas biológicas
Compartimentación celular
Mantenimiento composición específica
Flujo energético celular
Reconocimiento celular
Transducción de señales
Movilidad celular
La correcta funcionalidad de las mbs
depende de la función coordinada del
componente lipídico y proteíco
Funciones Membranas Biológicas
Introducción teórica - Metodología y Experimentación Bioquímicas IV (Curso 2004/2005)
Potencial deMembrana-50/-70 mV
Citosol [K+] = 140 mM[Na+]= 12 mM
Espacio extracelular:[K+] = 4 mM[Na+]= 145 mM
Cadena respiratoria de transporte electrónico mitocondrial
Espaciointermb
NADH + H+succinato
fumarato½ O2 + 2 H+
H2ONAD+
Excitabilidad celular y compartimentación
Modelos de membrana
Movilidad de los lípidos de mb
Movimiento translocación,“flip-flop”
Movimiento dedifusión lateral Flipasas, facilitan la translocación
Son movimientos lentos (poco probable)
Módelo de mosaico fluido,(Singer & Nicholson, 1972)
Oligosacárido deglicoprot
Glicolípido
Cabezas polaresde PLs
Prot integral(1TM)
Proteínas integrales(nTM)
Protperiférica
Zonahidrofóbica
Ch
Prot periféricaunión covalentemente
Ch PLs SFLsProteínas de membrana monotópicas y politópicas
Estructura general de los ≠ lipidos de mb
Asimetría de membrana
Monocapainterna
Monocapaexterna
PEPCSMPSPI
PI 4-PPI 4,5-bP
PA
0100 100
% de distribución en mbplasmática
Com
posi
ción %
to
tal en
mb
Mb plasmática
Mb Mitocondrial interna
Mb Mitocondrial externa
Mb lisosomal
Mb nuclear
Mb RE rugoso
Mb RE liso
Mb Golgi
0 100
Existe además distribución asimétrica composición lipídicaen ≠ mbs celulares
Ch, ↓ % en mbs orgánulosCL, en mb mitoc intPIs, imp en función pero minoritarios
Ca2+
ScramblasaAminofosfolípidotranlocasa
Flipasa
PS, PE
SM, PC
Sistemas enzimáticos implicados en el mantenimiento de asimetría de membrana
Debido a que es energeticamentedesfavorable que se expongan dominios hidrofóbicos de las proteínas a un entorno polar, los lípidos de membrana se adaptan localmente al espesor de estas zonas de interacción Lipido-Proteína
Las MBs Biológicas NO son uniformes:
Existen dominios de membrana. Esta segregación puede venir condicionada por la composición lipídica y también por proteínas de mb. Ej. Muestra los dominios en mbmodelo formada por dilaurilPC (estado fluido, desordenado; en verde) y dipalmitoil PC (estado gelordenado; en rojo)
caveolaraft
Glicoesfingolípido
Esfingomielina
Colesterol
Fosfolípidos
Caveolina
caveolaraft
Glicoesfingolípido
Esfingomielina
Colesterol
Fosfolípidos
Caveolina
Rafts y Caveolas
La monocapa externa de mb rica en SM y Ch, crea una barrera de permeabilidad pero permite difusión lateral
Raft, dominio lipídico de mb rico en SM/Ch monocapa externa y Ch en monocapa internaConcentran proteínas ancladas vía GPI y proteínas de señalización (GTPasas, PKsaciladas…). La existencia de caveolina-1 define las caveolas
Fosfatidilcolina
Zona polar(hidrofílica)
Zona apolar(hidrofóbica)
Los PL son moléculas anfipáticas:
Esfingomielina
Constituyentes y aspectos estructurales
Interioracuoso
Vesícula lipídica(Liposoma)
PL
Micela
LisoPL
Monocapa
∆G’o < 0PL, forma geométrica
cilindrica
Bicapa
∅ 25 nm ∅ 2,5 µm
Lamelaridad: Multilamelares (MLV)Oligolamelares (OLV)Unilamelares (ULV)
Tamaño: pequeñas (SUV) (diámetro <100 nm)grandes (LUV) (diámetro > 100 nm)
AG saturadoej. Palmítico, C16:0
AG insaturadoej. Oléico, C18:1 (∆9)Cabeza polar
GliceroPL:
-O-CH2-CH2-N+(CH3)3
Grupo polar (X) puede ser:
Colina → PC
-O-CH2-CH2-NH3+Etanolamina → PE
-O-CH2-CH-NH3+
C00-
Serina → PS
Fosfatidil-DAG → CL Inositol-4,5-bisP → PI
# Como veremos durante la parte práctica de la asignatura esta estructura confiere a cada PL carga neta específica a pH fisiológico que influyen en su comportamiento.
Estructura de Lípidos
Nomenclatura
LisoPLPL nombre genérico; especificar AG posición 1 y 2 AG 18:n (número de atomos de C: número de insaturaciones)si existen varias estas ocurren normalmente cada 3C debido al mecanismo biosintético
AGsaturados
Mezcla de AG saturadose insaturados
Grupo carboxilo(polar)
Cadena alifática(apolar)
Estructura de los AG
Nomenclatura de los átomos de C de un AG
Por el tipo de ruta biosintética los AGs en general están formados por número par de atomos de C.Estas insaturaciones pueden tener conformación cis o trans
Mayor grado de insaturación menor punto de fusiónMayor longitud mayor punto de fusión (Aceites vs grasas)
Conformaciónej. cis ∆9
# Predicción estructural de una bicapa di(C18:1)PC. Se indica la probabilidad de encontrar los distintos elementos estructurales en la zona hidrofóbica y acuosa.
Estas propiedades son claves en funcionamiento de mbs. La ≠ tendencia a formar un tipo de
estructuras u otras será esencial en procesos de fusión de mbs, transporte vesicular, endo- y
exocitosis etc
Forma del Lípido OrganizaciónEjemplo
CilindroPLs (sin gran repulsión
grupos polares)PC, SM, PS, PI, PG, PA
Bicapa
Conoinvertido
LisoPls,Detergentes
Micela
ConoPLs (↑repulsión grupos polares)
PA-Ca2+,PA y PS pH ácido < 3-4 PE
Fase hexagonalinversa HII
Distintos tipos de estructuras anisotrópicas: A) fase hexagonal normal HI, fase lamelar Lα, fase
hexagonal reversa HII
Interviene de forma activa también el PtdIns(4,5) P2 que atrae las proteína necesarias parael proceso y posteriormente es desfosforilado a PtdIns-4P
La transformación de PA (forma ~ cono) en LPA (forma ~ conoinvertido) por transferencia de AA (C20:4) catalizada por endofilina I (LPA aciltransferasa) – PLA2 favorece la curvatura de membrana y el proceso de endocitosis en vesiculas revestidas de clatrina.
conocono invertido
LPA AA-CoA PA
Por ejemplo:
Procesos de fusión de membranasFactor
desencadenante
Agregación
Semifusión Fusión
Ensayos de mezcla de lípidos y contenidos acuosos
Estructura general deesfingolípido
Descubiertos por J. Thudichum sXIX, lípidos enigmáticos “sphinx”
Ceramida
Esfingomielina
Glucosilcerebrosido
Lactosilceramida
Gangliosido
Fosfocolina
Glucosa
Oligosacárido(di, tri o tetra-)
Oligosacáridocomplejo
Enlace amida
Esfingosina
AG
Protocolo experimental para obtención de liposomas:
““extruder”extruder”
Formación de Formación de liposomasliposomas por extrusiónpor extrusión
No se emplean disolventes orgánicos
Se obtiene una población homogénea de vesículas
Tamaño controlado
Aplicable a una gran variedad de sistemas lipídicos
Temperatura controlada
Altas eficacias de encapsulación
La composición lipídica afecta a las propiedades físicas de las mb:
Longitud y grado de insaturación de AG
Composición en Ch
Composición en SFL
Temperatura de transición de fase
Estudios de calorimetría
Características cabezas polares: impedimentos estéricos, carga …
Fase GelAltamente ordenada, compacta
Gel CristalLíquidoFase Cristal-LíquidoFase menor grado de orden, más fluida, movimientos moleculares, más desordenado
# Efecto del Ch en la transición de fase de bicapas de DPPC
# Efecto de la longitud de los grupos acilo:L, lauril;M, miristoil; P, palmitoil;
S, estearoil; A, araquidonoil
Mezcla de lípidos (sistema NBD-PE/Rh-PE)
Donador: NBD-PEAceptor: Rh-PE
Experimento tipo
nm480 520 560 600 640
IF
0.0
0.4
0.8
NBD-PE NBD/Rh
Ensayos clásicos de interacción en Ensayos clásicos de interacción en liposomasliposomas
1- Agregación de vesículas lipídicas:- Medidas de turbidez (Absorción aparente)- Medidas de Dispersión de luz (light scattering)
2- Mezcla de lípidos:- Medidas de transferencia de energía de resonancia
3- Liberación de contenidos acuosos:- Carboxifluoresceína, ANTS/DPX, etc....
Mezcla de lípidos: otros sistemasMezcla de lípidos: otros sistemas
Sonda fluorescente autoapagada,forma dimérica
Forma monomérica fluorescente
Liberación de contenidos acuosos: ANTS/DPXLiberación de contenidos acuosos: ANTS/DPX
DPX(apagador)
ANTS(fluorescente)
ApagamientoColisional
Fusión
Sondas hidrosolubles
Octadecil-rodamina R-18
Sondas hidrofóbicas
# Existen otros sistemas en los que se emplea una sonda débilmente fluorescente (ej. Tb3+ ) que al encontrarse como consecuencia del proceso de fusión con otro agente (ej. DPA) se produce un
aumento de la emisión de fluorescencia
2-Micelas y detergentes
Vesícula lipídica(Liposoma)
PL
Micela
LisoPL
Monocapa LPL, detergentes:forma cónica
Micela
[Detergente]
[monómero]
[micelas]cmc
Tipos de detergentes y sus aplicaciones
# Con cadena de alquilo y cabeza cargada.En general son fuertemente desnaturalizantes
- Dodecilsulfato (SDS) Aniónico
- Hexadecil trimetilamonio Catiónico
Detergentes iónicos
# Zwiteriónicos o con N-óxido en cabeza polar (detergentes suaves)- CHAPS®
- sulfobetaínas
Detergentes no iónicos
- Serie Triton-X
- Serie Lubrol
- Serie Brij
- Digitonina, interacción con colesterol
- Serie Tween
- Dodecil-β,D-maltósido
- β-D-octilglucósido
Brij 35
Digitonina
Derivados de sales biliares
- Colato (deoxicolato) sódico
Bacteriorrodopsina (1C3W.pdb):resolución 1.55 Å18 cadenas de acilo; 4 esqueletos de glicerol1 escualeno
# Mayor grado de conocimiento de la estructura de proteína de mb si se consigue hacerlo en presencia de los lípidos con los que interaccionan
# Dificultades metodológicas en la purificación de proteínas de mb y en la resolución estructural
Complejo proteína:detergenteComplejo proteína:detergente
# La solubilidad del complejo dependerá del tipo de detergente y la relación [proteína]/[detergente]
Criterios para la elección de detergentes:
Efecto en la actividad/estructura de proteínaCapacidad de solubilización de proteínaCMC
Estructura toroidal en torno a la región hidrofóbica
Dependiendo del tipo de interacción entre prots y mb se pueden separar de ≠ modo:
Prots integrales ⇒ utilización de detergentes
Prots periféricas⇒ ∆pH, fuerza iónica, agentes quelantes o
desnaturalizantes⇒ PLC (prots unidas covalentemente a GPI), esterasas
(prots aciladas)
Los lípidos y la estructura de las proteínas de Los lípidos y la estructura de las proteínas de mbmb
Tipos de estructura 2ª de proteína de mb:
- Héliceshidrofóbicas
248 aa/monómero
zona hidrofóbica
residuos básicos
oligomeriza formando trímeros
7 hélices transmembrana
Ej. Bacteriorrodopsina:
Ct
Nt
Ej. Porina FhuA,canal Fe-ferrocromo de E. coli
- Barril β
Formado por 20 segmentos TMB entorno a un cilindroEstabilizado por fuerzas semejantes a hélice hidrofóbica
Proteínas integrales de mb
Cabeza polar Pls
Grupos fosfato
Ca 2+
Ejemplo de proteína periférica:Unión de Anexina V a mb
Perfiles de hidropatía
- Permite predecir estructura de prots de mbBasados en algoritmos que atribuyen a cada aaen función de su naturaleza un valor indicativo de su probabilidad de estar en entorno hidrofóbico de Mb o en entorno polar- Importante valor parámetro calculado para aaadyacentes- Son necesarios ~7-20 aa para atravesar bicapa(ventana)
Bacteriorrodopsina
Indic
ede
hid
ropat
ía
Hidrofóbico
Hidrofílico
Nº aa
Glicoforina
Indic
ede
hid
ropat
ía
Nº aa
Hidrofóbico
Hidrofílico
3- Modelos Experimentales de
Membrana
A) Interacción Lípido-Proteínaestudios in vitro
1- Preparación de liposomas (MLV
y LUV) y determinación de sus
características
4- Agregación y fusión de
vesículas
2- Influencia parámetros físico-
químicos en la interacción L-P
Introducción a las membranas biológicas
3- Predicción y análisis de la
estructura de proteínas de
membrana
B) Interacción L-P en el contexto celular
1- Regulación de la localización subcelular
de Ras
2- Translocación a dominios preferentes,
influencia de procesos de modificación
covalente y regulación por señales
extracelulares
4- Dominios de interacción Proteína-Lípido
Seminarios sobre trabajos de investigación en el área (alumnos)
Seminarios sobre trabajos de investigación en el área (alumnos)
Papel de los lípidos en señalización celular(mensajeros inter- e intracelulares)
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