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DIAGRAMA DE FLUJO
Autoclave
Horno Pasteur
En un matraz Erlenmeyer
preparar 20 mL de
suspensión bacteriana.
En una placa de agar nutritivo dividirá a la
mitad y rotularla como antes y después
Sembrar en “Antes” la suspensión
bacteriana con ayuda de un hisopo
estéril, rotulando inicialmente con una
línea media prosiguiendo de un lado
hacia otro de modo curveado sobre la
línea media.
Esterilizar el matraz de suspensión
bacteriana en Autoclave bajo las
condiciones 121°C/15 psi/15 min.
Realizando un purgado
Sembrar en “Después” la
suspensión bacteriana con ayuda
de un hisopo estéril, utilizando la
misma técnica que con “Antes”. Incubar de 24/48 hrs a 37°C en
estufa bacteriológica
Observar crecimiento
Preparar caldo nutritivoEn 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL poner
un tapón de aluminio
Y verter caldo nutritivo no estéril e incubar
30 min/37°C
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Filtración por membrana
Luz Ultravioleta (UV)
Preparación del medio de
cultivo (caldo nutritivo)Rotular agar nutritivo
Con ayuda de un filtro de .20 μm filtrar el
medio de cultivo recibiéndolo en una placa de
agar nutritivo
Incubar 24/48hrs a 37°C en estufa
bacteriológica
Sembrar caldo inoculado de
Escherichia coli en placas de agar
nutritivo rotuladas respectivamente
de 1min/ 5 min/10 min/ 15 min/30
min y 45 min que serán repartidas
por mesa
Exponer a Luz UV de acuerdo al
tiempo asignado para cada una
de las placas
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OBJETIVO GENERAL:
Seleccionar los métodos de esterilización adecuados para las diversasnecesidades del laboratorio de microbiología y poder comprobar la efectividad delproceso de esterilización.
OBJETIVOS PARTICULARES
- Explicar el concepto de esterilización y su utilidad en microbiología.- Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.- Reconocer las características de cada método de esterilización.
Resultados
UTILIZACIÓN DE LA AUTOCLAVE
FOTOGRAFÍA 1.0ENCENDIDO Y PREPARACIÓN DEL
MATERIAL
FOTOGRAFÍA 1.1NIVELACIÓN Y CERRADO DE LA
AUTOCLAVE
FOTOGRAFÍA 1.2PURGADO
FOTOGRAFÍA 1.3TOMA DE PRESIÓN Y TIEMPO
FOTOGRAFÍA 1.4 APERTURA
FOTOGRAFÍAS 1.0-1.4 UTILIZACIÓN
DE LA AUTOCLAVE
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HORNO PASTEUR
FOTOGRAFÍA 1.7 MATRAZ CON MEDIO NO ESTÉRIL DESPUÉS DE LAINCUBACIÓN COMPARADO CON MATRAZ ESTERILIZADO DE AUTOCLAVE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
FOTOGRAFÍA 1.8 PLACA DE AGARNUTRITIVO DESPUÉS DE LA INCUBACIÓN
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LUZ ULTRAVIOLETA (UV)
FOTOGRAFÍA 1.9 SECUENCIA DE TIEMPO DE AGARES NUTRITIVOSDESPUÉS DE LA INCUBACIÓN.
FOTOGRAFÍA 2.0 SECUENCIA DE TIEMPO 1, 5, 10, 15, 30 MINUTOSDESPUES DE LA INCUBACIÓN.
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ANÁLISIS DE RESULTADOS
Durante la práctica esterilización se utilizó la suspensión bacteriana “caldo nutritivo” el cual es un
medio líquido, elaborado de acuerdo a la fórmula del APHA y en el cuál se pueden desarrollar gran
variedad de microorganismos que no son muy exigentes en cuanto a sus necesidades
nutricionales como lo es laSe investigaron previamente para la realización de esta práctica conceptos básicos de los tipos de
esterilización, que en este caso se utilizó 4 métodos físicos: Calor húmedo, calor seco, filtración y
radiación no ionizante
Calor húmedo (AUTOCLAVE)
La autoclave que posee los requisitos indispensables para eliminar los microorganismos que
pudieran haber quedado en el medio ya que la acción mortal del vapor se deriva del calor latente
que se libera cuando se condensa sobre una superficie enfriada y se eleva la temperatura dedicha área, la temperatura óptima del autoclave es de 121°C/15 psi/15 min. Los microorganismos
mueren por la coagulación de sus proteínas. Es por eso que en la placa de agar nutritivo en el
“antes” hubo solo 2 UNIDADES FORMADORAS DE COLONIA (UFC) la mínima cantidad de
crecimiento bacteriano se debe a que la concentración de la bacteria era mínima. En la parte del
“ después” de haberse realizado una esterilización en la autoclave no hubo UFC (UNIDAD
FORMADORA DE COLONIA).
Calor seco (HORNO PASTEUR)
El horno Pasteur es un equipo que está dentro del grupo de esterilizaciones con el calor seco. El
airé ardiente generado por el calentamiento a base de resistencia eléctricas produce; La disecación
de la células, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos. Por tal motivo provoca procesos
oxidativos, fusión de membrana, y desnaturalización de la membrana. Se le considera un método
de estilización ya que alcanza temperaturas de hasta 250 °C, considerando que los
microorganismos y las esporas se mueren a los 121°C.
A diferencia de la autoclave, el horno Pasteur no utiliza presión y el tipo de calor que genera es
seco. Esto permite que gracias a que utiliza resistencias para generar el calor puede alcanzar
temperaturas mayores a comparación del autoclave.
En nuestra práctica esterilizamos un matraz Erlenmeyer, con un tapón de aluminio; Debido que a
altas temperaturas el papel se calcinera.
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Para poder tener una estilización eficiente y homogénea solo se colocan dentro del horno Pasteur
en la carga, objetos iguales. Debido a que sino por la diferencia del tamaño el calor no es
homogéneo y no permite una estilización adecuada.
Las condiciones para la esterilización del Horno Pasteur son de:
100 °C por 2 horas
180 °C por 1 hora
250 °C por 5 horas (despirogenacion)
Para corroborar que nuestro equipo fue esterilizado, se utiliza indicadores. En caso del Horno
pastear. Se utilizan indicadores biológicos y certificaciones.
Las certificaciones las realiza un técnico especializado, que coloca varios termómetros en puntos
clave del Horno Pasteur. Y corrobora que el calor circule a la misma temperatura en todos los
puntos del Horno (homogéneo).
Los controles bilógicos para el Horno Pasteur son bacterias Extremopphilas: Se colocan en forma
de ampolletas que están separadas en dos. De un lado contiene un medio óptimo para el
crecimiento de las bacterias y del otro tienen a la bacteria Bacillus Subtilis o Clostina. Se colocan
junto a la carga que se esteriliza. Cuando se sacan del Horno Pasteur que finalizo el tiempo. Se
rompe la ampolleta y se unen los dos compartimentos. Si las bacterias sobrevivieron crecerán en el
cultivo a 37°C en el medio. Se manifestara provocando un cambio de color en la ampolleta debido
a un cambio en el pH. Esto significará que la estilización no funciono.
Filtración por membrana
En nuestra práctica utilizamos la técnica de filtración para esterilizar un caldo bacteriano. El
principio de la filtración es eliminar por remoción completa los microorganismos particulares
dependiendo el diámetro del poro, que se encuentra en un líquido o en un gas.
En la esterilización por filtración existen dos tipos; por profundidad. Que se utiliza para materiales
fibrosos o glándulas que se usan para formar una capa grasosa rellena de canales o, por
membrana. Que con una capa o gasa ligeramente superior a 0.1 mm fabricado a partir de acetato
de celulosa, nitrato de celulosa o policarbonato.
En nuestra filtración utilizamos una membrana con un poro de 0.22 Nanómetros. Esto permite que
nuestras bacterias queden atrapadas. Y nuestro caldo sea esterilizado. Sin embargo los virus y
bacterias sin capa. Ya que estas son más pequeñas o se pueden escabullir entre los huevos. Para
eso se utilizan membranas mucho más pequeñas.
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Radiación no ionizante (Luz Ultra violeta)
El sembrado de caldo inoculado de Escherichia coli en placas de agar nutritivo rotuladas
respectivamente de 1min/ 5 min/10 min/ 15 min/30 min y 45 min fueron expuestas a luz UV la cual
es una radiación no ionizante, esta luz lesiona el DNA de las células expuestas por que forman
enlaces entre bases de pirimidina adyacentes. La longitud de onda UV más eficaz para eliminar a
los microorganismos es de alrededor de 260nm, el poder de penetración de estoy rayos es muy
bajo por lo que los microorganismos deben estar expuestos directamente para que mueran. La
dosis que se requiere para matar 99.19% de E. Coli, es de 12,000 micro vatios/segundo/cm2.
Las placas salieron con crecimiento bacteriano ya que el caldo nutritivo del que fueron extraídas
era no estéril.
CONCLUSIONES:
Por medio de esta práctica se logró identificar los tipos de esterilización realizando los métodos
físicos más óptimos y accesibles con el fin de poder comprobar la efectividad de cada uno, ya que
posteriormente en las prácticas siguientes podamos utilizar la que más nos convenga.
BIBLIOGRAFIA
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 4ª ed. HHS Publication abril
1999.
Proposed Guidelines for Goals for Working Safely with Mycobacterium tuberculosis in Clinical,
Public Health, and Research Laboratories.
Seguridad para los Laboratorios Biomédicos. Lineamientos, prevención y protección. Castellanos
C, López M-Marín LM, Rosales C, Ladrón de Guevara O, Herion P, Osorio A, Garduño Soto G.
Instituto de Investigaciones Biomédicas. UNAM, 1999.
Guidelines for preventing the transmission of Mycobacterium tuberculosis in health-care
facilities. CDC, Atlanta, 1994. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. publication
No. (CDC) 93-8395. MMWR 1994; 43 (No. RR-13). 3a ed. USA Department of Health and Human
Services, Public Health Service. CDC y NIH. Atlanta, 1994.