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Evaluación de la calidad microbiológica debocaditos fritos a base de Papa (Solanum
tuberosum) que se elaboran y expenden en formaartesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito
Bellavista – Callao.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOVICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN
FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA Y DE ALIMENTOS
Evaluación de la Calidad Microbiológica deBocaditos Fritos a base de Papa (Solanumtuberosum) que se elaboran y expendenen forma artesanal en la Urb. Ciudad delPescador – Distrito Bellavista – Callao.
Blgo. – Mblgo.: ARTURO MARIANO GARCÍA MERINO.
RESOLUCIÓN: N°1383-2010-R(10 de Diciembre del 2010 al 30 de Noviembre del 2011)
BELLAVISTA –CALLAO2012
3
A mi inolvidable MADRE,A mi ESPOSA e
Hijos Luis Arturo y Gabriel Alonso,frutos de mi vida.
4
“La disciplina es el camino al éxito, pues ella demuestra el empeñoque ponemos en la meta”
“El primer paso de la sabiduría es liberarse de la necedad “
Horacio
“Lo escuche y lo olvide, lo vi y lo entendí, lo hice y lo aprendí”
“Leer sin meditar es una ocupación inútil”
Confucio
“La falta de tiempo es escusa de aquellos que pierden tiempo porfalta de métodos”
Albert Einstein
“El único hombre que no erra es aquel que nunca hace nada”
Theodore Roosevelt
“Estar preparados es importante, saber esperar lo es aun mas, peroaprovechar el momento adecuado es la clave de la vida”
Arthur Schnitzler
5
ÍNDICE
Pag.
RESUMEN……………………………………………………………….… 08
I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….. 09
1.1. Objetivos y alcance de la investigación………….................... 10
1.2. Importancia y Justificación de la investigación………………. 11
II. PARTE TEÓRICA O MARCO TEÓRICO……………………………… 12
III. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………….…………… 17
3.1. Método para la obtención de papas fritas en hojuela…….….. 17
3.2. Procesamiento de muestras para su análisis Microbiológico. 21
IV. RESULTADOS………………………………………………….………. 56
V. DISCUSIÓN……………………………………………………………….. 62
VI. CONCLUSIONES……………………………………………………….. 64
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………. 65
VIII. APÉNDICE..………………………………………………………….... 66
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PAPA FRITA EN SU PRESENTACION HOJUELA
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I. DATOS GENERALES1. TITULO DEL PROYECTO
Evaluación de la calidad microbiológica de los bocaditos fritos a base
de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma
artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista – Callao.
2. FACULTAD
Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos.
3. INSTITUTO DE INVESTIGACION
Instituto de la Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos.
4. INVESTIGADOR RESPONSABLE O JEFE DEL PROYECTO
Apellidos : García Merino
Nombres : Arturo Mariano.
Categoría : Auxiliar
Clase : Dedicación Exclusiva
Condición : Nombrado
Código : 1364
Profesión : Biólogo - Microbiólogo / Ing. Alimentario
5. PROFESORES ORDINARIOS A T.C o D.E PARTICIPANTES
Ninguno.
6. PERSONAL ADMINISTRATIVO DE APOYO
Ninguno.
7. DURACION DEL PROYECTO
12 meses.
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RESUMEN
El presente trabajo se desarrollo en el laboratorio de Microbiología - Chucuito.
Basado según la exigencia de la “Norma Sanitaria que establece los criterios
microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de
consumo humano” (R.M. N° 591– 2008/MINSA) , grupo V. GRANOS DE
CEREALES, LEGUMINOSAS, QUENOPÒDIACEAS Y DERIVADOS (harinas y
otros), (V-8): Hojuelas a base de granos (gramíneas, quenopodiáceas y
leguminosas) que requieren cocción.
Para la determinación y/o seguimiento de los microorganismos indicadores de
calidad según dicha norma, se realizaron bajo los métodos indicados por la
ICMSF; en la evaluación de muestras, se realizaron análisis cuantitativos como
cualitativos.
El Tipo de muestreo es aleatorio, las muestras se adquirió de los diferentes carrito
expendedores que circundan en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista –
Callao.- durante 11 meses: Enero (2011) a Noviembre (2011)
Las pruebas se hicieron por duplicado, se trabajó un total de 22 muestras en el
laboratorio de Microbiología de Chucuito- FIPA-UNAC.
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I. INTRODUCCION
a) Descripción y análisis del tema
La higiene de los alimentos comprende el conjunto de condiciones y
medidas necesarias para garantizar la seguridad y salubridad de los
productos alimentarios incluida la manipulación por el consumidor desde el
momento que adquiere el alimento en un punto de venta hasta que lo
prepara y consume. La seguridad alimentaria por su parte, se logra mediante
el adecuado control de la calidad de la materia prima durante su
procesamiento hasta obtener un producto manufacturado óptimo, pero
también es crucial lograr condiciones adecuadas de almacenamiento,
transporte y manipulación del producto final en los mercados donde se
comercializa.
La venta de alimentos en la vía pública es hoy una característica importante
en nuestra capital y en las ciudades más importantes al interior del país ya
constituye un factor positivo para la economía de nuestro país ya que
moviliza una gran cantidad de recursos y genera empleo informal, al mismo
tiempo que satisface la necesidad de obtención de comidas rápidas de bajo
costo, junto al lugar de trabajo, especialmente por la población de más bajos
ingresos. Además, presenta como beneficio la satisfacción de tradiciones y
hábitos de consumo de alimentos típicos.
b) Planteamiento del problema
A pesar de las ventajas conocidas del comercio informal de alimentos, durante
la elaboración pueden ocurrir posibles riesgos para la salud de la población ya
que, en la mayoría de los casos, los alimentos son preparados por personas
que carecen de adiestramiento para su adecuada manipulación y lo hacen en
condiciones precarias de higiene.
Estudios realizados en nuestro medio han demostrado que la gran mayoría de
los vendedores de alimentos no cuentan con un sistema de agua de buena
10
calidad, ni el volumen adecuado para las necesidades diarias, siendo común la
reutilización del agua para el lavado de utensilios, las manos y las superficies
de trabajo, entre otras, transformándose en una fuente abundante cantidad en
microorganismos.
c) Problema
¿Qué grado del calidad microbiológica tendrán las frituras a base de Papa
(Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden? en la Urb. Ciudad del
Pescador – distrito Bellavista – Callao?
1.1. Objetivos y alcance de la investigación1.1.1. Propósito de la Investigación.
Objetivo General Evaluar a la calidad microbiológica de las frituras a base de Papa que
se elaboran en la Av. Juan Pablo II de la Urb. Ciudad del Pescador –
Distrito Bellavista – Callao.
Objetivo Específico
Determinar la presencia microorganismos indicadores de alteración, de
higiene y patógenos en muestras de papa frita en hojuela.
1.1.2. Alcances de la Investigación Tipo de Investigación
Investigación experimental (aplicada).
Sector que s e verá beneficiado de los resultados de lainvestigación.Se beneficiaran de los resultados de la investigación.
El Ministerio de Salud. La Municipalidad de Bellavista – Callao.
El público consumidor.
Los docentes de la especialidad y aéreas afines.
Alumnos de la escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos.
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Los Sectores Industriales (Industria de alimentos e industrias
Pesqueras).
Las personas que realizan actividades afines.
1.2. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.
1.2.1. IMPORTANCIA
El aporte de la presente investigación, radica en demostrar mediante métodos
estandarizados, la presencia de microorganismos muchos de ellos patógenos,
los cuales al ser ingeridos junto con el alimento preparado estos pueden
desencadenar graves alteraciones en la salud del consumidor.
Además esta investigación nos servirá para demostrar la calidad microbiológica
de estos alimentos, por el solo hecho de presentarse coliformes o mohos ya
nos indicando la falta de higiene y salubridad que ha tenido el alimento durante
su elaboración y/o durante su expendio.
1.2.2. JUSTIFICACION
Existen razones fundamentales para realizar este tipo de investigación como
son la sola presencia de Coliformes, mohos, Bacillus y Salmonella en frituras
que ya nos indica la contaminación a partir de portadores que han manipulado
el alimento y la exposición de estos productos en plena vía pública.
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II. PARTE TEORICA O MARCO TEORICO
América Latina produce cerca de 8 millones de toneladas de papas anualmente. La
producción y el rendimiento varían considerablemente entre países. Dentro de la
Zona Andina, Perú tiene la más alta tasa de crecimiento de la producción y
rendimiento. El producto ha aumentado cerca del 300% desde los comienzos de
1960. El continuo aumento de la producción es una respuesta a la fuerte demanda
de la papa para consumo en fresco y procesada. El crecimiento en el producto ha
sido facilitado entre otras cosas por la disponibilidad de un buen sistema de manejo
de plagas y enfermedades.
Las industrias de nivel casero o semi-industrial procesan por su parte menos de 6
toneladas diarias. Los mayores niveles de urbanización reciente y una presencia
más activa de la mujer en el mercado laboral han ocasionado cambios en los
hábitos de consumo que se reflejan en una mayor demanda por productos
procesados o semiprocesados. Para el caso de la papa esto ha significado un
crecimiento importante del mercado industrial en los últimos años y una previsión
para el futuro inmediato que permite esperar que el porcentaje actual de
participación de la industria de procesamiento en el mercado de la papa llegue por
lo menos a duplicarse en los próximos 10 años. (3) (2005).
Las papas fritas envasadas se obtienen de papas lavadas, peladas, cortadas y
fritas en aceite. El mercado nacional ofrece este producto en distintos tamaños y
texturas: con sal, con limón y sal, y de distintos sabores como queso o adobo
(derivados de la adición de diversos ingredientes), entre otros. Sin embargo,
estrictamente, ¿qué contienen las papas fritas, además de aceite y sal?
Acompáñenos a descubrirlo.
Normalmente, el contenido en materia seca determina el rendimiento del producto
terminado. Así por ejemplo, aumenta el rendimiento de las hojuelas por menores
pérdidas cuantitativas de evaporación de agua, mientras que disminuye la
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retención de aceite en la fritura. Esto es importante, tanto para la economía como
para la nutrición fisiológica. El contenido ideal es de 25% en el caso de papas fritas
referidas a materia fresca (medidas a una temperatura prefijada); en caso contrario
dejarían de ser comerciales.
En la actualidad, las papas fritas envasadas son la marca favorita de todo el
mundo, lo que explica la demanda tan alta que estos productos tienen. De hecho,
el alto consumo de papas fritas ha dado origen a la fabricación de otros productos
que no son estrictamente papas fritas, pues están elaborados a base de harina de
papa y puestos en empaques que cuidan más la presentación del producto
(rebanadas más enteras). (20).(2008).
2.1. Qué contienen
De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente estudio de calidad, las
papas fritas son productos salados y muy energéticos, por cada 100 gramos
proporcionan entre 489 a 587 kilocalorías, esto debido a su contenido de grasa
(entre 23% y 40%) e hidratos de carbono (entre 50% y 60%), aunque también
aportan otros nutrientes como proteína vegetal (de 6% a 8%) y sal (entre el 0.2% y
el 1.9%, según la marca). (20).(2008).
2.2. El estudio
En el estudio se evaluaron la calidad microbiológica 22 muestras de bocaditos fritos
a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma
artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista – Callao. (venta
ambulante), todos correspondientes a los que sólo contienen sal. Para el análisis
se tomaron 2 muestras mensual de diferentes carritos expendedores en distintos
puntos de venta.
El estudio también incluye el análisis de papas fritas a granel para informar sobre
su calidad microbiológica exigida por la Norma Sanitaria N° RM-591. Cada
producto se sometió a las pruebas que a continuación se indican.
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Según la “Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad
sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano” (R.M. N°591– 2008/MINSA) Protocolo para los análisis microbiológicos de Granos de
Cereales, leguminosos, quenopodiáceos y derivados (harinas y otros), según
DIGESA grupo V. GRANOS DE CEREALES, LEGUMINOSAS,
QUENOPÒDIACEAS Y DERIVADOS (harinas y otros) (V-8): Hojuelas a base de
granos (gramíneas, quenopodiáceas y leguminosas) que requieren cocción: (22)
2.3. PARAMETROS DE EVALUACION
Categoría.- Escala relativa al riesgo que representa un alimento y a lamanipulación posterior prevista. Grado de riesgo que representan losmicroorganismos en relación a las condiciones previsibles de manipulación yconsumo del alimento. (22)
Componentes del plan de muestreo"n" (minúscula): Número de unidades de muestra, seleccionadas al azar de unlote, de acuerdo a normas nacionales o internacionales referidas a alimentos ybebidas apropiadas para fines de realizar el análisis microbiológicos. (22)
Agentes Microbianos Categoría Clases N cLimite por g
m M
Aerobios mesófilos 2 3 5 2 104 106
Mohos 2 3 5 2 103 104
Coliformes 5 3 5 2 102 103
Bacillus cereus 8 3 5 1 102 104
Salmonella sp. 10 2 5 0 Ausencia/25g -
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"c": Número máximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan demuestreo de 2 clases o unidades de muestra provisionalmente aceptables en unplan de muestreo de 3 clases. Cuando se detecte un número de unidades demuestra mayor a “c” se rechaza el lote. (22)
"m" (minúscula): Límite microbiológico que separa la calidad aceptable de larechazable. En general, un valor igual o menor a “m”, representa un productoaceptable y los valores superiores a "m” indican lotes rechazables en un plan demuestreo de 2 clases. (22)
"M" (mayúscula): Los valores de recuentos microbianos superiores a "M" soninaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud. (22)
Clase.- Son los planes de muestreo que se expresan en términos de clase son doso tres.- Los de planes de muestreo dependen del grado del peligro involucrado. (22).
Tipos de plan de muestreo para lote o lotes:
A. Plan de 2 clases: Es un plan de muestreo por atributos, donde puedeestablecerse únicamente la condición de "aceptable" o "rechazable".- Se usacuando no se puede tolerar la presencia o ciertos niveles de un microorganismo enninguna de las unidades de muestra.Un plan de 2 clases queda definido por “n” y “c”;
Para microorganismos patógenos:Condición de "aceptable" = ausenciaCondición de "rechazable" = presencia
Para otros microorganismosCondición de "aceptable" = menor o igual al nivel crítico establecido, “c”Condición de "rechazable" = mayor al nivel crítico establecido, “c”
B. Plan de 3 clases: Es un plan de muestreo por atributos.- Se usa cuando se
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puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades demuestra que queda definido por "n", "c", "m", "M"; donde se establece: Condición de "aceptable":
Cuando todas las unidades de muestra presentan recuentos igual o inferiores a"m".Cuando hasta "c" unidades de muestra pueden tener recuentos entre "m" y "M"(incluido "M").
Condición de "rechazo":Cuando más de "c" unidades de muestra presentan recuentos entre "m" y "M"(incluido "M").Cuando al menos 1 de las unidades de muestra presentan recuentossuperiores a "M".(22)
La realización del presente trabajo servirá como un aporte para la mejora delexpendio ambulante de estos alimentos en dicha zona. No se han reportadooficialmente trabajos realizados en la zona.Contenido de sodio. La Organización Mundial de la Salud recomienda no consumirmás de seis gramos de sal al día (2,400 mg de sodio), por lo que se considerónecesario consignar en las tablas de resultados el aporte que proporcionan losproductos analizados.
Calidad sanitaria. Para comprobar la inocuidad del producto, se determinó laausencia de microorganismos patógenos y de microorganismos indicadores demanejo sanitario deficiente.
2.4. Determinación del Universo Las muestras para el análisis se obtuvieron de los carritos expendedores que
circulan por la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista - Callao. El tipo de muestreo es aleatorio. Tamaño de muestra = 22 muestras.
2.5. Métodos experimentalesLa parte experimental se desarrollo en el laboratorio de Microbiologia –Chucuito, se adquirió los medios y reactivos específicos para cadamicroorganismo, para la identificación bioquímica y serológica de los mismos.
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III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Método para la obtención de papas fritas en hojuela
Dentro de las múltiples posibilidades de la papa en Perú, la más interesante es la
transformación en hojuelas (Chips). La gran diversificación de la industria
procesadora obliga a un mejoramiento genético de la papa para asegurar un buen
rendimiento y la máxima calidad en papas fritas (hojuelas)).
Los requerimientos de calidad que hay que cumplir son: color aceptable (bajo
contenido en azúcares menos del 0.1%), alto contenido en materia seca (más del
20%), excelente textura y sabor del producto final, libre de enfermedades y daños y
tamaño entre 40 y 80 mm.
El color tiene una relación directa con el contenido en azúcares reductores. En su
apariencia externa y evolución, el color debe ser: desde un color blanco-
amarillento, (aceptable) pasando por un color amarillo-oro (deseable) hasta un
color marrón-negruzco (rechazable), que viene dado por una alta concentración de
azúcares reductores (2%) y que hace un producto indeseable en sabor y
apariencia.
La buena apariencia, textura crujiente y sabor agradable son puntos importantes de
cara al consumidor y a la venta del producto. Ello se consigue, lógicamente,
procesando papas de alta calidad, supervisadas y clasificadas para este tipo de
procesamiento. (5)(1998).
Los factores que influyen directamente en la calidad final de las papas fritas y
prefritas son, fundamentalmente, la temperatura en almacenamiento, variedad
empleada y madurez fisiológica del tubérculo y, con menor trascendencia, la
composición del suelo, la fertilización, el medio ambiente y el riego.
PARDEAMIENTO POR COCCION DE PAPAS PARA CONSUMO FRESCO En
diferentes variedades de papas para consumo en fresco aparece el pardeamiento
por cocción, la cual es la coloración azul-grisácea que presentan los tubérculos
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después de cocinarlos. En esta coloración están involucradas sustancias químicas
como: hierro, ácido clorogénico, ácido cafeico, fenoles totales, ácido cítrico, etc.(2)(1997).
3.1.1. Materialesa. Cinco variedades de Papas nativas
b. Aceite vegetal de soya: 2 litros
c. Freidora eléctrica de capacidad de fritura 150 - 200 grs/batch de hojuela cortada
d. Hervidor eléctrico
e. Papel absorbente
f. Sal refinada
g. Cortadora manual para hojuelas
h. Selladora de bolsas
i. Balanza
j. Bolsas de polipropileno
k. Coladores de plástico
l. Detergente
m.Ácido cítrico
n. Cloros
o. Baldes de plástico
p. Diversos recipientes.
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Diagrama de Flujo para Obtener Hojuelas de Papa
Recepción y pesado
Selección y clasificación
Lavado y desinfectado(con 20 ppm de cloro)
Agua Cortado
Agua a 50 ºC Escaldado
Escurrido Agua
Fritado: Temperaturas 170, 180 y 190 ºCTiempo 5, 6 y 7 minutos
Enfriado
Envasado y pesado
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3.1.2. Descripción del proceso:
a. Recepción y pesado: Se realiza esta operación con la finalidad de determinar elrendimiento conversión de la materia prima a hojuelas o chips de papa.
b. Selección y clasificación: En este proceso se retira del proceso, aquellaspapas que tiene defectos externos visibles.
c. Lavado y desinfectado: El objetivo es eliminar la suciedad que viene inherenteal producto por sucesivos lavados con la ayuda de esponjas; después se añadecloro al agua para reducirla carga microbiana.
d. Cortado: Se cortó en forma de laminas cuyo espesor debe fluctuar entre 1 a 1.2mm. variando el diámetro en función a las características fenotípicas de lavariedad.
e. Escaldado: Se considera como una operación crítica. Las rodajas de papa sonescaladas enagua para inactivar enzimas y cuya temperatura no deberá deexceder los 50 ºC por un tiempo de 3 a 5 minutos; un exceso de calor y tiempopuede modificar las características del producto.
f. Oreado: En lo posible eliminar el sobrenadante del agua que queda en lashojuelas porque encaso contrario en el fritado se formaran bolsas de aire, el cualle resta calidad.
g. Fritado: Tiene por finalidad de la cocción y brindar las característicasorganolépticas y principalmente crocantes debido a la baja humedad que quedaen el producto, se ensayaron diferentes tiempos y temperaturas de fritado.
h. Enfriado: Las hojuelas fritas previo escurrido del aceite se enfriaron en bandejaslos cuales contenían papel para absorber el aceite adherido a las hojuelas.
i. Salado: Con la finalidad de resaltar el sabor de las hojuelas se le agrega unapizca de sal finamente molida a gusto del cliente.
j. Envasado y pesado: Con la finalidad de mantener las característicasorganolépticas del producto como crocantes, textura y el crounch las hojuelas depapa son envasadas en bolsas de polipropileno. (2) (1997), (6) (1989).
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3.2. Procesamiento de las muestras de papa en hojuela para su análisis
Microbiológico.
3.2.1. Triturado de la muestra
Se trata de una operación importante dentro de la preparación de la muestra
para su análisis. En el triturado hay que evitar la destrucción de los gérmenes
por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo.
Además de una perfecta trituración de los alimentos, es necesario obtener una
mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los gérmenes y
sus toxinas. (10) (2000).
3.2.2. Técnica del Triturador de paletas (Stomacher) (*)(Método ICMSF).
Que actúa golpeando rítmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha
sido introducida previamente en una bolsa de plástico estéril. Los choques
producidos por las paletas dislaceran el alimento y ponen a las bacterias en
suspensión.
3.2.2.1. Material y Aparatos
1. Stomacher Colworth, o aparato similar, operando a unas 230 r.p.m. y con
una capacidad de 400 ml.
2. Bolsas de polietileno de paredes delgadas (aproximadamente del calibre
200), de unos 18 x 30 cm y con el fondo soldado.
3. balanza de una capacidad no inferior a 2.5 g y de una sensibilidad de 0.1 g.
4. Instrumentos para prepara las muestras: cuchillos, tenedores, pinzas,
tijeras, cucharas, espátulas depresores linguales, todo ello previamente
esterilizado en autoclave o por aire caliente.
5. Frigorífico, a 2 – 5 ºC.
6. Pipetas bacteriológicas estériles de 1 y 10 ml.
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7. Agua de peptona para diluciones o agua de peptona salina para diluciones.
El diluyente se repartirá en volúmenes de 9 o de 90 ml en tubos de cultivo o
en frascos de dilución. Tanto el diluyente como los recipientes en los que se
reparten deben estar convenientemente esterilizados.
3.2.2.2. Técnica
1. Comenzar a trabajar tan pronto como sea posible después de la toma de
muestras. Pesar, en un bolsa de polietileno previamente tarada, al menos
10g representativos de la muestra total (ICMSF, 1974). Los alimentos
congelados no precisan ser previamente descongelados a no ser que ello
resulte necesario para pesar las unidades de muestra. Tampoco es
necesario picar, antes de homogeneizar, alimentos como la carne. Si es
preciso descongelar la muestra, esta se mantendrá en su envase original (o
en el recipiente en que llego al laboratorio) en un frigorífico a 2 – 5 ºC y se
iniciara el análisis tan pronto como la descongelación permita tomar
adecuadamente las unidades de muestra (el tiempo máximo de
descongelación no superara las 18 horas).
2. Añadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra. Así se obtiene
una dilución 10-1.
3. Si se sabe o se sospecha que el alimento contiene gérmenes patógenos,
es conveniente colocar la bolsa conteniendo la muestra y el diluyente dentro
de otra bolsa como precaución frente a la posibilidad de que se rompa la
primera.
4. Para alimentos con un elevado contenido en grasa (superior al 20%) como
ocurre por ejemplo en ciertas carnes, es necesario añadir un 1 % de Tween
80 o de otro tensoactivó no toxico.
5. Colocar la bolsa en el “Stomacher” y hacer funcionar el aparato durante 60
segundos.
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6. Agitar energéticamente la bolsa con las manos y pipetear 10 ml en un frasco
conteniendo 90 ml de diluyente, o bien pasar 1 ml a un tubo conteniendo 9
ml de diluyente. De este modo se obtiene la dilución 10-2
7. Agitar energéticamente la suspensión de 100 ml 25 veces en un arco de 30
cm, o aspirar 10 veces la suspensión de 10 ml con una pipeta estéril.
Pipetear 10 ml en un nuevo blanco de dilución de 90 ml o 1ml en uno de 9
ml, obteniendo de esta forma la dilución 10-3. Repetir esta operación para
preparar las diluciones 10-4 y 10-5, o las necesarias, según indique la
experiencia, para el alimento que se va a analizar.
(*) Este método no es utilizado específicamente en ninguna región determinada del mundo, pero está adquiriendo
cada vez mayor popularidad debido a las ventajas que presenta sobre todo en lo que se refiere a ahorro de trabajo.El Stomacher Colworth 400 puede obtenerse de la firma A. J. Seward and Co. Ltd., BlacKfriars Road, Londres,Inglaterra. (10) (2000).
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3.2.3. Recuento Estándar en placa de Microorganismos Aerobios (MétodoICMSF).
3.2.3.1. Material y Aparato1. Los señalados anteriormente en la práctica, para la preparación y dilución
de los homogenizados de alimentos.
2. Placas petri de vidrio (100 x 15 mm) o plástico (90 x 15 mm).
3. Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10 ml (de idénticas características a las
exigidas para diluciones de muestras de leche; Hausler 1972).
4. Baño de agua o estufa de aire para templar y mantener el medio fundido a
44 - 46°C.
5. Estufa de incubación, 29-31°C. (Nota: la constancia y uniformidad de la
temperatura en las estufas son notoriamente deficientes. Para comprobar
el primer factor, mantenimiento de una temperatura constante, deben
realizarse lecturas continuas o frecuentes de la temperatura interior,
durante un periodo de tiempo de varias horas, utilizando pares términos o
termómetros adecuados. Para comprobar la uniformidad de la temperatura
en el interior de la estufa, deben hacerse lecturas similares, también en un
periodo de varias horas y en distintos lugares, cuando se encuentre llena
de placas petri {véase también Hausler, 1972}. Al colocar las pilas de
placas de petri dentro de la estufa hay que tener presente que estas
deben estar separadas entre sí y también de las paredes y del techo de la
estufa. Cada montón o pila debe estar formado como máximo por seis
placas, siendo preferible que su número no sea superior a cuatro).
6. Contador de colonias (se recomienda el modelo Quebec de campo oscuro
o equivalente).
7. Dispositivo de registro automático del número de colonias contadas.
8. Agar para recuento en placa Plate Count: P.C.(Agar de los Standards
Methds;).
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3.2.3.2. Técnica
1. Preparar la muestra de alimentos por el procedimiento recomendado en la
sección sobre preparación y dilución de los homogenizados de alimentos.
2. Pipetear por duplicado, en placas de petri, alícuotas de 1ml de las
diluciones 10-1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y una alícuota de 0,1 ml de la dilución
10-5, lo que supone la siembra por placa de 10-1 a 10-6g de alimentos. Se
aconseja esta serie de disoluciones en aquellos casos en que se
desconoce el número aproximado de gérmenes presentes en el alimento,
pero el rango de diluciones preparadas y sembradas puede modificarse en
función a la cifra de microorganismos esperada. De todos modos, siempre
deben sembrarse tres diluciones distintas.
3. Fundir el agar para recuento en placa utilizando vapor de agua hirviendo y
procurando que este en tratamiento térmico no sea excesivamente
prolongado. Templar el medio a 44-46ºC y controlar cuidadosamente su
temperatura para que al mezclarlo con la dilución del alimento no sean
inactivados los gérmenes. Verter inmediatamente en las placas de petri 10-
15 ml de medio fundido y templado. El periodo de tiempo transcurrido
entre la realización de las diluciones y el vertido del medio no debe
superar los 20 minutos y es preferible que sea inferior a 10 minutos.
4. Acto seguido, mezclar el inocuo con el medio fundido, inclinando y girando
las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la
siguiente: (a) imprimir a la placa movimiento de vaivén 5 veces con una
dirección, (b) hacerla girar 5 veces en sentido de las agujas del reloj, (c)
volver a imprimir movimientos de vaivén en una dirección que forme
ángulo recto con la primera y (d) hacerla girar 5 veces en sentido contrario
a las agujas del reloj.
5. Con el fin de controlar la esterilidad, preparar una o varias placas
conteniendo medio y el diluyente sin inocular. Transcurrido el periodo de
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incubación, el numero de colonias presentes en estas placas no debe
modificar el recuento en más de una unidad en la segunda cifra
significativa (véase el apartado 8).
6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-31ºC por
48+3 horas.
7. Calcular el recuento estándar en placa o el recuento estándar en placa
estimado de acuerdo con las directrices recogidas en las apartados 8 y
9.Tener en consideración todas las instrucciones relativas al cálculo, a los
datos que deben anotarse a la presencia de inhibidores y de colonias de
crecimiento difusivo en superficie, a los informes e interpretación y a la
reproductibilidad y error personal, que se presenta en los puntos 10 a 14.
8. Calculo del recuento estándar en placa
(a) Elegir las dos placas, correspondientes a una dilución, que presenten
entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada placa utilizando
el contador de colonias y el dispositivo de registro automático. Hallar la
media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución
(la inversa de la dilución cuyas placas han sido seleccionadas). Dar el
valor obtenido como el recuento estándar en placa (véase el apartado 10,
más adelante).
Ejemplo: Dilución 10-2
Placa 1 : 72 colonias x 102 = 7.200
Placa 2 : 76 colonias x 102 = 7.600
Se promedia: 7.200 + 7.600 = 7.400 colonias
2
Se reporta: 74 x 102 u.f.c./g. o mL.
27
(b) Si una de las placas de la dilución elegida presenta algo menos de 30
colonias o algo más de 300, deben contarse también todas las colonias
de ambas y como en el caso anterior, hallar la media aritmética y
multiplicarla por el factor de dilución. El valor obtenido se dará como el
recuento estándar en placa.
Ejemplo: Dilución 10-2
Placa 1 : 22 colonias x 102 = 2.200
Placa 2 : 46 colonias x 102 = 4.600
Se promedia: 2.200 + 4.600 = 3,400 colonias
2
Se reporta: 34 x 102 u.f.c./g. o mL.
(c) Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre
30 y 300 colonias, deben hallarse los recuentos estándar en placa de
cada dilución tal como se ha señalado anteriormente y se dará como
resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser que uno de
ellos sea superior al doble del otro, en cuyo caso se dará como recuento
estándar en placa el valor más bajo.
Ejemplo 1: Dilución 10-1 = Nº promedio de colonias contadas : 290
Dilución 10-2 = Nº promedio de colonias contadas: 35
Se relaciona el cómputo de los 2 recuentos : 3.500 = 1.2
2.900
En este caso se reporta el promedio: 2,900 + 3,500 = 3,200 col.
2
Se reporta: 32 x 102 u.f.c./g. o mL.
28
Ejemplo 2: Dilución 10-2 = Nº promedio de colonias contadas : 170
Dilución 10-3 = Nº promedio de colonias contadas : 45
Se relaciona el cómputo de los 2 recuentos: 45.000 = 2.2
17.000
En este caso se reporta el recuento menor es decir: 17.000 col.
Se reporta: 17 x 103 u.f.c./g. o mL.
9. Cálculo del recuento estándar en placa estimado (R.E.P.E.)
(a) Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, el valor
calculado se da como el recuento estándar en placa estimado y el
cálculo del número de gérmenes presentes en el alimento se lleva a
cabo en los distintos casos en la forma en la que se indica en los
apartados (b), (c) y (d), a continuación.
(b) Si todas las placas presentan más de 300 colonias, dividir las dos
placas, correspondientes a la dilución más elevada, en secciones
radiales (2,4 u 8) y contar todas las colonias que se hallan en una o
más secciones. Multiplicar el conseguir una estimación del número
total de colonias presentes en la placa.
Hallar la media de valor estimado por las dos placas y multiplicar
por el factor de dilución correspondiente. El valor obtenido se da
como el recuento estándar en placa estimado.
(c)Si en las placas inoculadas con la dilución menos concentrada se
encuentran más de 200 colonias en una sección correspondiente a
la octava parte de la placa, multiplicar 1.600 (procedente de 200 x 8)
por el factor de dilución y expresar el recuento estándar en placa
estimado con superior (>) al valor obtenido. Ejemplo: 1,600 x (103) =
> 1’600,000 u.f.c./g. o mL. En estos casos resulta aconsejable
señalar entre paréntesis la dilución utilizada.
29
(d) Cuando no se encuentran colonias en las placas correspondientes a
la dilución más concentrada, expresar el recuento estándar en placa
estimada como inferior a (<) 1 multiplicado por el factor de la
dilución más concentrada. Ejemplo: 10-1 = 0 colonias. Se reporta
como <10 u.f.c./g. o mL.
10. Calculo y representación de los resultados
Cuando se dan los valores del recuento estándar en placa o
recuento estándar en placa estimado, deben utilizarse únicamente
dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dígitos
primera y segunda (empezando por la izquierda) de la media de la
colonias halladas o estimadas. Los dígitos restantes tienen que ser
sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado fue de
523.000, este a de darse como 520.000 (52 x 104). Si el tercer
digito empezando por la izquierda es 5 o superior, se le añade una
unidad al segundo digito (se redondea). Por ejemplo, si el valor
calculado es 83.600, este debe hacerse como 84.000 (84 x 103).
11. Presencia de colonias de crecimiento difusivo en superficie
(a) Cuando las placas elegidas aparezca estas colonias y siempre que
el área ocupada por ellas no supere la mitad de la placa, contar las
colonias de otro tipo que se encuentran fuera de esta zona.
Corregir la cifra obtenida teniendo en cuenta el área en que no se a
podido contar las colonias.
(b) Siempre que la zona ocupada por este tipo de colonias supere la
cuarta parte de la superficie de la placa hay que anotar su
presencia. Si este problema lo presenta más que una placa de cada
veinte hay que tomar las medidas necesarias para evitar su
aparición (como, por ejemplo reducir la humedad de la estufa de
30
incubación o mezclar el inóculo con el medio fundido y templado de
forma mas completa).
12. Presencia de inhibidores
En algunos casos se puede sospechar la presencia de inhibidores.
Las sospechas surge cuando el numero de gérmenes en la dilución
más concentrada es notablemente menor de los que cabria esperar.
Para la detección de los posibles inhibidores pueden utilizarse
diversas pruebas, recomendándose las descritas por la International
Dairy Federation (IDF, 1970b).
13. Presentación e interpretación de los resultados
(a) Los resultados obtenidos deben darse como recuento estándar en
placa o como recuento estándar en placa estimada por gramo o por
mililitro de alimento, según corresponda.
(b) Siempre que se utilice el método de recuento en placa para
decidir si una partida de alimentos se acepta o se rechaza,
debe tenerse en consideración únicamente de recuento
estándar en placa y nunca en recuento estándar en placa
estimada. Desde el punto de vista de un organismo oficial, el
recuento estándar en placa estimado es solo útil como una
aproximación inicial para valorar la calidad bacteriológica de un
alimento.
(c)En el caso de que se utilice el recuento en placa para establecer si un
alimento determinado (por ejemplo, leche) se cumple una norma
microbiológica, véase la obra de la comisión sobre planes de
muestreo (ICMSF, 1974).
31
3.2.4. Método de Recuento de Levaduras y Mohos por siembra en placa en
todo el medio (Método ICMSF).
3.2.4.1. Material y Aparatos
1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de
alimentos (Primera práctica).
2. Placas de Petri, de vidrio (100 × 15mm) o de plástico (90 × 15mm).
3. Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10 ml.
4. Baño de agua o estufa de aire forzado para templar el agar fundido, 44-
46ºC.
5. Estufa de incubación, 20 - 24º C.
6. Contador de colonias (tipo Quebec de campo oscuro o similar).
7. Dispositivo de recuento con registro automático.
8. Agar Oxitetraciclina Gentamicina extracto de levadura glucosa OGY1.
3.2.4.2. Técnica
1. Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos
recomendados en el capítulo sobre preparación y dilución de los
homogeneizados de alimentos.
2. Pipetear en placas de Petri alícuotas de 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2,
10-3, 10-4, 10-5, utilizando dos placas por cada dilución. Se propone esta
serie de diluciones para los casos en que no se conozca el número
aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra.
Por supuesto, las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre
serán función del recuento esperado.
3. Rápidamente, verter en las placas de Petri 10 -15 ml del agar oxitetraciclina
gentamicina extracto de levadura glucosa, fundido y templado a 44-46º C.
4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el agar balanceando la placa de
izquierda a derecha cinco veces, rotándola en el sentido de las agujas del
32
reloj otras cinco veces, realizando otras cinco veces el movimiento de
vaivén en sentido perpendicular al primero y rotándola, finalmente cinco
veces en sentido contrario a la agujas del reloj.
5. Invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 20-
24ºC durante 3-5 días.
6. Con ayuda del contador de colonias y del dispositivo de recuento con
registro automático, contar las colonias en aquellas placas que
contengan entre 30 y 300, llevando a cabo un examen microscópico cuando
sea necesario para identificar las colonias de levaduras.
7. Calcular el número de levaduras y mohos por gramo o mililitro de alimento.
3.2.4.3. Lectura y Expresión de Resultados
1. Proceder la lectura, como en la Numeración de Microorganismos Aerobios
Mesofilos Viables.
2. Elegir para el reporte las placas que contengan entre 30-300 UFC/ g. o ml.
Se cuentan todas las colonias de Mohos y de Levaduras por separado
3. Reportar como Levaduras / gr o ml de muestra.
4. Reportar como Mohos / gr o ml de muestra.
1 Preparar 900 ml de Agar base extracto de levadura-glucosa, luego distribuir en volúmenes de 90 ml y esterilizar
por autoclavado.; luego al momento de su utilización adicionar 10 ml. de Oxitetraciclina (10 mg por cada 100
ml de medio).
La oxitetraciclina se prepara en condiciones estériles, en la proporción de 100 mg de oxitetraciclina por cada
litro de medio.
33
3.2.5. RECUENTO DE COLIFORMES: TÉCNICA DEL NÚMERO MÁSPROBABLE (NMP) MÉTODO ICMSF 11 (Norteamericano)
3.2.5.1. Material y Aparatos
1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de
alimentos, (Primera práctica).
2. Estufa de incubación, 35-37ºC.
3. Pipetas bacteriológicas de 1ml.
4. Asa de inoculación, con alambre de nicrom o de platino-iridio.
5. Caldo lactosa bilis (2%) verde brillante, volúmenes de 10ml en tubos de 150
x 15mmm, conteniendo tubos de fermentación de Durham invertidos (75x
10mm).
6. Caldo lauril sulfato triptosa, volúmenes de 10ml en tubos de 150 x 15mm,
conteniendo tubos de fermentación de Durham invertidos o viales similares
de vidrio( 75 x 10 mm)
7. Agar eosina azul de metileno (EMB) o agar de ENDO, para placas.
3.2.5.2. TÉCNICA
1. Preparar las muestras de alimentos por uno de los procedimientos
recomendados en la sección sobre preparación y dilución de los
homogeneizados de alimentos. Para hacer las diluciones pueden utilizarse
los blancos de dilución o frascos de diluyentes sobrantes del método de
recuento en placa.
(Importante: una vez hechas las diluciones del alimento, debeprocurarse que transcurra el menor tiempo posible hasta que serealizan las siembras, pues así se evitan la multiplicación o la muerte delos microorganismos suspendidos en el diluyente).
34
2. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogeneizado del alimento
en tubos de caldo lauril sulfato triptosa, utilizando tres tubos por cada dilución.
3. Incubar los tubos a 35-37ºC durante 24 y 48 horas.
4. Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren producción de
gas2
Volver a la estufa los tubos negativos para su incubación durante 24 horas
más.
5. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas2.
6. Elegir la dilución más alta en la que sean positivos de formación de gas los
tres tubos y las dos diluciones superiores más próximas. Por ejemplo, si la
dilución más alta en la que aparecen los tres tubos positivos es la 1:100 y en
la 1:1.000 hay un tubo positivo y en la 1:10.000 ninguno, el resultado se
anotaría del siguiente modo: dilución 1:100=3, dilución 1:1000=1 y dilución
1:10.000=0. Estos resultados corresponden en la tabla del NMP para series
de tres tubos a un NMP de 400.
Si no hubiera ninguna dilución que presentase los tres tubos positivos,
seleccionar las tres diluciones más altas con algún tubo positivo fueran 1:10,
1:100, 1:1.000 y 1:10.000 con 2, 2, 1 y 1 tubos positivos , respectivamente ,
los resultados se anotan como 1:100=2, 1:1.000=1 y 1:10 .000=1. Este
resultado corresponde en la tabla del NMP a 200.
Cuando no se hayan hechos diluciones más altas, de forma que la ultima
presente también los tres tubos positivos , seleccionar las tres últimas
diluciones realizadas. Por ejemplo, si las tres últimas diluciones realizadas
fueran 1:100, 1:1.000 y 1:10.000, y el número de tubos positivos fuera 3, 3 y
3, respectivamente, los resultados se anotarían como 1:100=3, 1:1.000=3 y
1:10.000=3. En este caso el NMP es igual o mayor de 11.000.
7. Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato triptosa seleccionados en el
paso 6 son positivos de organismos coliformes, transfiriendo un asa de cada
tubo a otro tubo de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante o sembrando por
estría en placas de Agar eosina azul de metileno o de Agar de Endo. Incubar
35
los tubos de confirmación durante 24-48 horas a 35-37ºC y observar la
producción de gas. La formación de las confirma la presencia de organismos
coliformes. Observar los medios sólidos de confirmación para ver si existen
colonias típicas de coliformes después de 24 y 48 horas de incubación a 35-
37ºC.
La formación en el Agar eosina azul de metileno de colonias negras o con el
centro negro, o bien de colonias de colonias mucoides de color rosa – naranja
confirma la presencia de organismos coliformes .De modo semejante, en
Agar de Endo las colonias de coliformes son rojas y están rodeadas también
de halos rojos.
8. Anotar el número de tubos confirmados como positivos de organismos
coliformes en cada dilución.
9. Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada una de las
tres diluciones seleccionadas el número de tubos en los que se confirmo la
presencia de coliformes. Buscar en la tabla del NMP (tabla 6) y anotar el NMP
que corresponda al número de tubos positivos de cada dilución. Así, si en el
primer ejemplo dado en el punto 6 anterior todos los tubos positivos en las
tres diluciones seleccionadas (1:100, 1:1.000 y 1:10.000) resultasen
confirmados de presencia de coliformes, los valores de cada dilución serian 3,
1 y 0, respectivamente. Para calcular el NMP de organismos coliformes por
gramo de alimento, se multiplica el valor que figura en la tabla por 10(en este
ejemplo 40 x 100 = 400 por gramo).
1 Este método sigue el recomendado para el agua (APHA y col., 1976) y los alimentos (APHA, 1966; Lewis yAngelotti, 1964; AFDOUS, 1966; USFDA, 1972; AOAC, 1975).
36
TABLA 01.Numero Más Probable (NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilución. b
Numero de tubos positivos en cadadilución Limites de confianza
Dilución10-1
Dilución10-2
Dilución10-3
NMP/gramo 99% 95%
0 1 0 3 <1 23 <1 11 0 0 4 <1 28 1 21 0 1 7 1 35 2 21 1 0 7 1 36 2 21 2 0 11 2 44 4 32 0 0 9 1 50 2 32 0 1 14 3 62 5 42 1 0 15 3 65 5 52 1 1 20 5 77 8 62 2 0 21 5 80 8 63 0 0 23 4 177 7 123 0 1 40 10 230 10 183 1 0 40 10 290 20 213 1 1 70 20 370 20 283 2 0 90 20 520 30 393 2 1 150 30 660 50 513 2 2 210 50 820 80 643 3 0 200 <100 1.900 100 1.4003 3 1 500 100 3.200 200 2.4003 3 2 1.100 200 6.400 300 4.800
a Calculada a partir de los datos de Manb De cada dilución se inoculan tres tubos de medio, cada uno con 1ml. Para calcular el NMP de diluciones
mayores que las figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor adecuado: 10,100,1.000,etc. Por ejemplo, silos tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10-2,10-3 y 10-4, multiplicar por 10; si las diluciones son10-3,10-4 y 10-5, multiplicar por 100.
37
3.2.6. Recuento de presuntos Bacillus cereus (Metodo ICMSF).
3.2.6.1. Material y Aparatos
1. Los señalados anteriormente en la práctica, para la preparación y dilución de
los homogenizados de alimentos.
2. Placas petri de vidrio (100 x 15 mm) o plástico (90 x 15 mm).
3. Pipetas, 1, 5 y 10 ml, graduada en unidades de 0,1 ml
4. Difusor de varillas de vidrio (por ejemplo, palo de hockey) 3-4 mm de diámetro
con un área mm 45-55 difusión
5. Incubadoras, 30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C
6. Cuenta Colonia
7. Mechero Bunsen
8. Asas de alambre, N º 24 de nicrom o alambre de platino, 2 mm y 3 mm de
diámetro
9. Vortex mezclador
10. Microscopio, portaobjetos y cubreobjetos
11. Tubos de cultivo, 13 x 100 mm, estéril
12. Tubos de ensayo, 16 mm x 125, o la placa de punto
13. Botellas, 3 onzas, estéril
14. Recipiente de anaerobios, BBL GasPak, con H 2 + CO 2 sobres generador y
catalizador
15. Baño de agua, 48 a 50 ° C
16. Bastidores tubo de cultivo
17. Baño de agua o estufa de aire forzado para mantener el agar fundido, 44-
46 C.
18. Estufa de incubación, 35-37 C.
19. Agar yema de huevo polimixina rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal
polimixina cloruro de trifeniltetrazolio o agar sangre de caballo, para placas.
38
3.2.6.2. Técnicas1. Preparar las muestras de alimento por el método propuesto en la presente
guía para la preparación de los homogeneizados de alimentos. Preparar las
diluciones de 10 -1 a 10-4, o más altas si fuera preciso.
2. Sembrar uniformemente por estría 0,1 ml de cada una de las diluciones
decimales en la superficie seca de placas de agar yema de huevo polimixina
rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio
o de agar sangre de caballo (previamente secados), utilizando dos placas para
cada dilución.
3. Si se observase el crecimiento de microorganismos del género Proteus, con su
característico crecimiento extendido por la placa, o se sospechase su
existencia en el alimento en estudio, inhibir su difusión añadiendo sobre la
superficie de cada placa de medio 1 ml de alcohol etílico del 96 % y dejar que
se evapore dentro de la estufa, o bien aumentar la concentración de cloruro
sódico en los medios hasta aproximadamente el 1,5 %.
4. Incubar las placas de agar yema de huevo polimixina rojo fenol o de agar yema
de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio durante 24 horas, y la placa
de agar sangre de caballo durante 24-48 horas. Frecuentemente, los
microorganismos contaminantes enmascaran las colonias de B.cereus
después de las 24 horas de cultivo en estos medios (Kim y Goepfert, 1971
a,b).
5. Dar como recuento de presunto B. cereus las colonias con las reacciones
caracteríticas siguientes : (a) en agar yema de huevo polimixina rojo fenol
amplias zonas de precipitado sobre un fondo rojo-violeta, (b) en agar yema de
huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio colonias de color rojo-púrpura
brillante, con una amplia zona de precipitado, (c) en agar sangre de caballo
hemólisis alfa o beta.
6. Prepare diluciones seriadas de 10 -2 a 10 -6 mediante la transferencia de 10 ml
de muestra homogeneizada (dilución 1:10) a 90 ml de dilución en blanco,
mezclando bien con agitación vigorosa, y continuando hasta 10 -6 dilución se
39
alcanza. Inocular las placas duplicadas PAI agar con cada dilución de la
muestra (incluyendo 1:10) mediante la difusión de 0,1 ml de manera uniforme
sobre la superficie de cada plato con una varilla de vidrio estéril difusión.
Incubar las placas 24 horas a 30 ° C y observar las colonias de la zona
rodeada por precipitado, lo que indica que se produce lecitinasa. B. cereusColonias son normalmente de color rosa que se vuelve más intenso después
de una incubación adicional.
Si las reacciones no son claras, las placas se incuban durante 24 h adicionales
antes del recuento de colonias. Seleccionar las placas que contienen un
estimado de 15 a 150 eosina rosa, lecitinasa productores de las colonias.
Parte inferior de las placas de la marca en zonas con rotulador negro para
facilitar el conteo y recuento de colonias que son típicos de B. Cereus. Este
es el recuento en placa de presunción de B. Cereus. Pick 5 o más colonias
presuntamente positivo de las placas de agar del PAI y la transferencia de
inclinaciones de agar nutritivo para su confirmación como B. Cereus.Confirmar los aislamientos como B. cereus como se describe en F y G, a
continuación. Calcular el número de B. Cereus células / g de la muestra,
basada en el porcentaje de las colonias de prueba que se confirman como B.Cereus. Por ejemplo, si el recuento de media obtenida con 10 -4 dilución de la
muestra fue de 65 y 4 de 5 colonias de prueba fueron confirmados como B.Cereus, el número de B. Cereus células / g de alimento es de 65 x 5.4 x
10.000 x 10 = 5.200.000. (NOTA: El factor de dilución es diez veces mayor
que la dilución de la muestra, ya que sólo 0,1 ml fue probado).
3.2.6.3. Confirmación de B. cereus
Además de B. cereus, otras especies dan reacciones positivas o débilmente
positivas en medios con yema de huevo (Gordon y col., 1973). Tanto el ácido
formado a partir del manitolcomo las enzimas reductores del cloruro de
trifeniltetrazolio pueden difundir en el medio hasta colonias negativas.
Finalmente, la actividad hemolítica no es exclusiva de B. cereus. Por estas
40
razones, deben someterse a confirmación colonias representativas
procedentes de estos medios.
Sin embargo, en las pruebas de rutina son suficientes frecuentemente los
recuentos, en particular si las reacciones típicas aparecen bien marcadas. Si
estás no fuesen completamente típicas, llevar a cabo pruebas confirmatorias.
Por ejemplo, confirmar las colonias que son yema de huevo y manitol positivas,
e inversamente aquéllas que son yema de huevo y manitol negativas.
Siguiendo el esquema de identificación de Gordon y col. (1973), confirmar
todas las colonias que producen hemólisis alfa en agar sangre.
41
3.2.7. AISLAMIENTO DE SALMONELAS (Metodo ICMSF).Los métodos para el aislamiento e identificación de salmonelas a partir de losalimentos pueden considerarse divididos en seis etapas sucesivas:
1. Enriquecimiento no selectivo.2. Enriquecimiento selectivo.3. Siembra en placa de medios sólidos selectivos y diferenciales.4. Estudio de las características bioquímicas de las colonias sospechosas, en los
medios adecuados.5. Análisis antigénico, en dos fases: (a) empleo del antisuero polivalente O y del
antisuero polivalente H, y (b) utilización de los antisueros específicos de grupoO y H.
6. Tipificación por medio de bacteriófagos.
Los pasos 1 al 3 se refieren al aislamiento y los 4 al 6 a la identificación. El paso 1tiene como fin la revitalización de las salmonelas dañadas por las diferentescondiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento. El paso 2 es deenriquecimiento selectivo y sirve para favorecer el crecimiento de las salmonelasen un ambiente que puede contener gran número de bacterias diferentes de ellasmismas. El paso 3 permite la «visualización» de las colonias sospechosas, por suaspecto característico. El paso 4 se refiere a la identificación bioquímica. El paso 5conduce, por medio de pruebas serológicas, la identificación definitiva de lascepas sospechosas como miembros del género Salmonella. El paso 6 logra aúnmás exacta identificación de los gérmenes aislados, identificación que es departicular interés para propósitos epidemiológicos, ya que los tipos serológicos deun grupo fágico común suelen tener el mismo origen y, a la inversa, las cepas quepresentan igual estructura antigénica, pero diferente grupo fágico, sonprobablemente de diferente origen.Antes, el enriquecimiento no selectivo se utilizaba solamente cuando se creía queun tratamiento como el calentamiento, la deshidratación, la irradiación o lacongelación, o ciertas condiciones como el bajo pH, habían lesionado lassalmonelas en los alimentos. Recientemente, Edel y Kampelmacher (1973) yGabis y Silliker (1974a) han señalado que incluso en muestras de alimentos talescomo carnes crudas y huevo líquido, el preenriquecimiento de la muestra en un
42
medio no selectivo da como resultado el que se aíslen más salmonelas que en elcaso de siembra directa en un medio de enriquecimiento selectivo. Actualmente,basándose en estos descubrimientos, la Comisión recomienda que todas lasmuestras sean preenriquecidas en un medio no selectivo antes de pasarlas auno de enriquecimiento selectivo.El enriquecimiento no selectivo se ha realizado tradicionalmente por cultivo de lasmuestras en caldo lactosado. Esta práctica fue iniciada por North (1961) en elanálisis de la clara de huevo desecada. Con posterioridad, diversos investigadoreshan estudiado modificaciones en la composición del medio de preenriquecimientoy han llegado a la conclusión de que su composición no es tan crítica como sesuponía. Así, por ejemplo, los investigadores europeos han utilizado normalmenteagua de peptona tamponada en vez de caldo lactosado (Edel y Kampelmacher,1968). En algunos alimentos, como la levadura desecada, la composición de lamuestra sólo requiere su reconstitución en agua destilada. En el caso de la lecheen polvo descremada, la muestra se reconstituye en agua destilada
conteniendo el colorante verde brillante. Los caramelos y bombones sereconstituyen en leche descremada con verde brillante. Con alimentos ricos engrasas, tales como los subproductos grasos de origen animal, la inclusión deTergitol 7 facilita la dispersión de la grasa en el medio no selectivo. Engeneral, el caldo lactosado y el agua de peptona tamponada son intercambiables.La Tabla 8 presenta un resumen parcial de los medios utilizados para elpreenriquecimiento.Un caldo de enriquecimiento selectivo estimula la multiplicación de las salmonelasy reduce o inhibe el crecimiento de los organismos competitivos, tales como loscoliformes, Proteus y Pseudomonas, cuyo crecimiento superaría al de lassalmonelas, en particular si estos organismos competidores están presentes en elalimento en un número mucho mayor que las salmonelas. El uso de más de uncaldo selectivo, así como la temperatura de incubación, pueden afectar de formaimportante el porcentaje de recuperación de Salmonella. Datos de Edel yKampelmacher (1968) señalaron que fue posible recuperar un mayor número deSalmonella a partir de muestras de carne cuando los caldos selectivos seincubaban a 43°C que cuando se incubaban a 37°C, sobre todo en muestras que
43
contenían un alto nivel de organismos competidores. Estos resultados han sidoconfirmados por Silliker y Gabis (1974).
Tabla 02.Métodos de enriquecimiento previo para Salmonellas.
Producto Caldo de preenriquecimiento
Huevos completos desecados, yemas de
huevo desecadas, claras de huevo
desecadas, huevos líquidos
pasterizados y congelados, mezclas
preparadas en polvo, galletas, fórmulas
para niños, huevos crudos, carnes
crudas, pasta conteniendo huevo, tintes
y sustancias colorantes.
Caldo lactosa o agua de peptona
tamponada (medios 51 y 22,
respectivamente).
Levadura desecada (inactiva). Agua destilada.
Leche en polvo descremada y leche en
polvo entera.
Agua destilada con 2 ml de solución al
1% de verde brillante por litro3
(Reactivo 5).
Caramelos y bombones. Leche en polvo reconstituida con verde
brillante (Medio 95).
Subproductos grasos animales fundidos,
coco.
Caldo lactosa con 1% de Tergitol
(Medio 52)
o agua de peptona tamponada con
0,22% de Tergitol (Medio 23).
a Pesar asépticamente 100 gramos de la muestra en un matraz de 2 litros estéril (o en un frasco de tapón de roscacon boca ancha de una capacidad similar). Añadir 1 litro de agua destilada estéril y mezclar bien. Determinar el pHmediante papel reactivo (si el pH es < 6,6, ajustar a 6,8 ± 0,2 con NaOH 1N). Añadir solución de verde brillante ymezclar bien. Incubar como se indica en el texto.
44
Debido a que es necesario restringir el número de variables de selección, la
Comisión recomienda el uso de caldo selenito-cistina y de caldo tetrationato verde
brillante, ambos incubados a 43°C.
Los agares selectivos generalmente contienen sustancias inhibidoras que hacen
que los medios sean selectivos, y un sistema indicador que colorea las colonias o
el medio que las rodea, lo que hace al medio diferencial, es decir, capaz de
diferenciar caracteres bioquímicos de las colonias que crecen en él. Los
laboratorios tienen, a veces, preferencias por determinados medios diferenciales;
pruebas realizadas en colaboración muestran que cada laboratorio obtiene los
mejores resultados con aquellos medios con los que está más familiarizado.
Respetando este hecho, la Comisión recomienda que cada laboratorio utilice un
medio diferencial de su elección, pero que adicionalmente utilice agar sulfilo de
bismuto y agar verde brillante. Entre otros medios que pueden utilizarse, están el
agar verde brillante sulfadiazina, el agar verde brillante de MacConkey, el agar
desoxicolato citrato, el agar Salmonella-Shigella y aun otros medios selectivos y
diferenciales a gusto del propio laboratorio.
El valor de los resultados, como en cualquier procedimiento analítico, dependerá
de la adecuada elección de la muestra en representación del lote y de la cantidad
de alimento muestreado. La National
Academy of Sciences-National Research Council de los EE UU (1969) han
recomendado planes de muestreo para la detección de Salmonella en alimentos
basados en el grado de riesgo que presenta un
determinado alimento. Estos mismos planes, ligeramente modificados, han sido
recomendados por la ICMSF (1974).
Investigaciones patrocinadas por la ICMSF y otros organismos han mostrado que
no es necesario analizar cada una de las muchas muestras o unidades analíticas
obtenidas de un determinado lote de alimentos (Silliker y Gabis, 1973). Estas múl-
tiples unidades analíticas pueden ser combinadas o «mezcladas», a fin de obtener
unidades mayores para realizar las pruebas. Por ejemplo, 60 unidades de 25 g se-
45
leccionadas de un lote de producto concreto pueden ser combinadas o
«mezcladas» para obtener tres muestras de 500 g para el análisis. Si se encuentra
que estas tres muestras de 500 g dan resultados negativos, se deduce que el nivel
de Salmonella no es mayor de 1 en 500 g. De modo similar, las muestras que
presenten un menor grado de riesgo para el consumidor, como son las que
requieren el análisis de 30 muestras de 25 g, pueden ser «mezcladas» para el
análisis en un menor número de unidades. Para muestras de 25 g, podrán ser
analizadas dos mezclas de muestras, cada una de 375 g. Si las dos fueran
negativas, habría una probabilidad del 95% de que el nivel de contaminación en el
lote analizado no fuera mayor de una Salmonella en 250 g, lo que es la misma
probabilidad que existiría si cada una de las 30 muestras de 25 g hubiera sido
analizada y encontrada negativa. Es evidente la importancia práctica de este
procedimiento por «mezcla» que permite un control de calidad estadístico del
riesgo o defecto de presencia de Salmonella con unos costos de análisis que son
económicamente posibles.
AISLAMIENTO DE SALMONELAS (Metodo ICMSF).
Esta parte incluye tres etapas fundamentales: (i) enriquecimiento no selectivo, (ii)
enriquecimiento selectivo, (iii) siembra en placa en medios de agar selectivo.
3.2.7.1. Material y Aparatos
1. Homogeneizador mecánico que trabaje a 8.000 r.p.m. como mínimo y a
45.000 r.p.m. como máximo.
2. Vasos para el homogeneizador, de 1 litro de capacidad, con tapas,
resistentes a la temperatura de pasterización, un recipiente por cada muestra
de alimento a analizar.
3. Balanza con pesas, de al menos 2.500 g de capacidad y de 0,1 g de
sensibilidad.
46
4. Instrumentos para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas,
tenedores, tijeras, cucharas, espátulas, todos ellos previamente esterilizados
o pasterizados.
5. Estufa a 35-37°C.
6. Baño con agua circulante, a 43 ± 0,05°C.
7. Recipientes con tapa, resistentes a la temperatura de pasterización, o esterili-
zación, con capacidad suficiente para contener el volumen del medio de enri-
quecimiento que se utilice, incluyendo la muestra.
8. Pipetas bacteriológicas de 1 ml.
9. Aguja y asa de inoculación con alambre de nicrom o de platino-iridio.
10. Placas de Petri de vidrio de 100 x 15 mm, u otras equivalentes.
11. Caldo lactosado, sin distribuir.
12. Agua de peptona tamponada.
13. Leche descremada en polvo, con verde brillante, reconstituido.
14. Caldo lactosado con 1% de Tergitol 7.
15. Caldo selenito cistina, sin distribuir y en tubos con 10 ml.
16. Caldo tetrationato verde brillante, modificación de Kauffmann, sin distribuir y
en tubos con 10 ml, según se precise.
17. Agar verde brillante, para placas.
18. Agar bismuto sulfito, para placas.
19. Medio «elegido por el propio laboratorio», para placas.
20. Agua de peptona tamponada con 0,22% de Tergitol.
21. Agar triple azúcar hierro (TSI) inclinado.
22. Agar lisina hierro inclinado (LIA).
3.2.7.2. Enriquecimiento previo de Salmonelas
1. Mézclese la muestra con 9 volúmenes del medio de enriquecimiento escogido
de la Tabla 8, en proporción peso/volumen. Si la muestra no es soluble en el
medio de enriquecimiento o si no se produce su rápida dispersión, mézclese
47
la muestra con volumen apropiado de medio y añádase la muestra mezclada
al volumen total del medio de enriquecimiento.1
2. Incúbese el medio de enriquecimiento previo durante 18-24 horas a 35-37°C.
3.2.7.3. Enriquecimiento selectivo de Salmonelas
1. Pipetear 1 ml del cultivo de preenriquecimiento en 10 ml de caldo selenito
cistina. Incúbese en un baño de agua a 43 ± 0,05°C durante 24 horas.
2. Pasar 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato
verde brillante. Incúbese a 43 ± 0,05°C durante 24 horas.
1 Esterilícese el medio de preenriquecimiento en el autoclave; en el caso de que esto sea difícil, debido a que el
volumen de líquido sea demasiado grande, pasteurícese en su propio recipiente. Simplemente es necesariodestruir todas las bacterias no esporuladas, lo que ocurre a, o por encima de, 80°C. Diversos tipos de recipientesde plástico, de bajo precio, pueden resistir este calentamiento. Utilícese el medio pasterizado el mismo día de supreparación. Enfríese o témplese el medio de preenriquecimiento a 35-37°C, antes de proceder a inocularlo. Si lamuestra contiene una alta concentración de azúcar o de sal, u otra sustancia inhibidora, ajústese cuidadosamenteel volumen del medio de preenriquecimiento para promover el crecimiento de las salmonelas. De manera similar,si el pH de la muestra es tan alto o tan bajo que pueda perjudicar el crecimiento de las salmonelas en el medio depreenriquecimiento, ajústese el pH del medio por adición de una solución al 1% de ácido sulfúrico o de hidróxidopotásico. El pH del medio inoculado debería ser de 6,6 a 7,0 antes de proceder a la incubación.
48
3.2.7.4. Siembra en placa en medios de agar selectivo para Salmonelas
1. Pasar un asa de 5 mm de cada uno de los dos medios de enriquecimientoselectivo a la superficie de una placa de cada uno de los tres medios de agarselectivo señalados a continuación y extender de tal manera que se obtengancolonias aisladas.
2. Incubar las placas de agar verde brillante durante 24 horas a 35-37°C. Lascolonias típicas de Salmonella son incoloras, rosa o fucsia o traslúcidas aopacas, con el medio que las rodea de color rosa a rojo.
3. Incubar las placas de agar sulfito de bismuto a 35-37°C durante 48 horas. Lascolonias típicas de Salmonella en agar sulfito de bismuto aparecen marroneso grises a negro, a veces con un brillo metálico. El medio que rodea lascolonias es, generalmente, marrón al principio, cambiando a negro segúntranscurre el tiempo de incubación. Algunas cepas producen colonias verdes,con el medio que las rodea muy poco o nada oscurecido.
4. Incubar e interpretar las «placas del medio elegido por el laboratorio» segúnlas indicaciones del fabricante.
3.2.7.5. Identificación de Salmonelas
En esta sección se incluyen las tres etapas seguidas en la identificación de culti-vos sospechosos de pertenecer al género Salmonella: (1) comprobación de las co-lonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas determinativas, (2) identifica-ción serológica de las cepas sospeehosas mediante el uso del antisueropolivalente O, del antisuero polivalente H, de los antisueros O específicos de grupoy de los antisueros H de Spicer-Edwards, (3) tipificación por bacteriófagos.
La identificación de una cepa como miembro del género Salmonella está dentrode la capacidad de cualquier laboratorio que posea los medios y antisueros de quese dispone en el comercio. Los laboratorios que realicen la detección rutinaria desalmonelas en alimentos, deben utilizar pruebas bioquímicas para explorar las ce-pas sospechosas y posteriormente someter dichas cepas a pruebas serológicaspara determinar si son efectivamente salmonelas. La identificación definitiva de las
49
salmonelas, como pertenecientes a un determinado serotipo, requiere el envío delas cepas a un centro especializado en tipificación.
3.2.7.6. Exploración bioquímica para la identificación de Salmonellas
3.2.7.6.1. Material y Aparatos1. Asa de inoculación, preferiblemente de alambre de platino-iridio o de nicrom.
2. Baño de agua termorregulado a 35-37°C.
3. Colonias sospechosas de ser salmonelas en placas de agar verde brillante,
agar sulfito de bismuto o el agar «escogido por el propio laboratorio».
4. Agar lisina hierro inclinado en tubos con columnas de agar de 25-30 mm.
5. Agar triple azúcar hierro, inclinado en tubos con columnas de agar de 25-30
mm.
3.2.7.6.2. Métodos
1. Tomar con una aguja de inoculación estéril dos o más colonias de cada tipo
sospechoso, del agar verde brillante, del agar sulfito de bismuto y del medio
«elegido por el propio laboratorio» y pasar a tubos de agar triple azúcar hierro
y de agar lisina hierro, inclinados. Inocular los medios mediante siembra en
estría atrás y adelante en la superficie inclinada y, a continuación, por
picadura en la columna de agar. Inocular primero un medio y, sin flamear la
aguja, inocular el segundo medio de la misma manera.
2. Incubar los tubos de ambos medios durante 24 horas a 35-37°C. Los cultivos
sospechosos de ser Salmonella muestran en agar triple azúcar hierro las
partes inclinadas alcalinas (color rojo) y las columnas de medio acidas (color
amarillo), con o sin producción de SH2 que da lugar al ennegrecimiento del
agar. Los cultivos sospechosos de ser salmonelas presentan en agar lisina
hierro una reacción alcalina (color púrpura) en todo el medio, con o sin
producción de SH2 (ennegrecimiento). La reacción «sospechosa» en agar
triple azúcar hierro indica que el organismo fermenta la glucosa (columna
amarilla) pero que no fermenta la lactosa ni la sacarosa (parte inclinada roja),
50
reacciones típicas de las salmonelas. Sin embargo, algunas salmonelas
pueden fermentar la sacarosa o la lactosa y producir acidez (color amarillo)
tanto en la parte inclinada como en la columna de medio.
Por contraste, la reacción «sospechosa» en agar lisina hierro es resultado
de la descarboxilación de la lisina, produciéndose una reacción alcalina
(púrpura) en la columna de medio. Los organismos que no son capaces de
descarboxilar la lisina, pero que fermentan la glucosa, producirán una
reacción acida (amarilla) en la columna de medio. Los microorganismos que
ni fermentan la glucosa ni descarboxilan la lisina, darán lugar a una parte
inclinada y a una columna alcalina (púrpura). Los organismos que presentan
esta reacción son, generalmente, aerobios estrictos del género
Pseudomonas. Estas cepas pueden no presentar crecimiento en la columna
de medio en razón de su metabolismo aeróbico. Tales cepas pueden ser
«exploradas» más ampliamente por medio de la prueba de la oxidasa. Las
salmonelas fermentadoras de la lactosa y de la sacarosa darán reacciones
típicas «sospechosas» en agar lisina hierro, ya que este medio no contiene ni
lactosa ni sacarosa. Los organismos del género Arizona pueden dar en agar
triple azúcar hierro reacciones sospechosas de ser salmonelas, debido a una
fermentación tardía de la lactosa. Estos organismos pueden dar reacciones
sospechosas de ser salmonelas en agar lisina hierro ya que descarboxilan la
lisina y fermentan la glucosa. La mayor importancia es el que ambos géneros,
Arizona y Salmonela, fermentadores de la lactosa y/o de la sacarosa pueden
dar reacciones típicas de Salmonella en agar lisina hierro, incluso aunque las
mismas cepas puedan no presentar aspecto de Salmonella en los cultivos de
agar triple azúcar hierro inclinado. Del mismo modo, determinadas cepas de
Salmonella pueden no descarboxilar la lisina y, debido a esto, mostrar la
columna de medio acida y la parte inclinada alcalina, en agar lisina hierro.
Estos organismos presentan reacciones típicas de Salmonella en agar triple
azúcar hierro.
51
3.2.7.7. Pruebas serológicas para la identificación de Salmonellas (P. R.Edwards y Ewing, 1972; AOAC, 1967)
3.2.7.7.1. Material y Aparatos
1. Portaobjetos de vidrio de 5 x 7,5 cm o placas de Petri de 100 x 15 mm.
2. Agujas y asas de inoculación, preferiblemente de alambre de platino-iridio o
de nicrom.
3. Pipetas de 0,2 ml de capacidad, con divisiones de 0,01 ml; de 1,0 ml de
capacidad con divisiones de 0,01 ml; y de 5 ml y 10 ml con divisiones de 0,1
ml.
4. Tubos de ensayo para reacciones serológicas de 75 x 10 mm o de 100 x 13
mm.
5. Baño de agua termorregulado a 50 ± 1°C.
6. Cultivos de las presuntas salmonelas o Atizona en tubos de agar triple
azúcar hierro y de agar lisina hierro inclinados.
7. Caldo H en tubos de 100 x 13 mm con 5 ml de volumen.
8. Cloruro sódico en solución acuosa al 0,85%.
9. Solución salina formulada al 0,6% (Solución salina al 0,85% conteniendo 0,6
ml de formalina por cada 100 ml).
10. Antisueros Salmonella:
(a) Antisuero Salmonella polivalente O (somático) que contenga por los
menos aglutininas para los siguientes antígenos O: 1-16,19, 22, 23, 24,
25 y Vi.
(b) Antisueros Salmonella individuales O (somáticos) para, al menos, cada
uno de los grupos: A, B, C1, C2, D, E (E1, E2, E3, E4), F, G, H, I y Vi.
(c) Antisuero Salmonella polivalente H (flagelar) que contenga, por lo
menos, aglutininas para los siguientes antígenos H: a, b, c, d, eh, en,
enx, fg, fgt, gm, gmq, gms, gp, gpu, gq, gst, gt, i, k, lv, lw, lz13, lz28, mt, r,
y, z, z4 z23, z4 z24, z4 z32, z6, z10, z29,1, 2 ; 1, 5; 1, 6; y 1, 7.
(d) Antisueros Salmonella H (flagelares) de Spicer-Edwards consistentes en
7 antisueros mezclados que reaccionan del siguiente modo:
52
(i) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 1, que reacciona con los
antígenos a, b, e, d, eh, fg, fgt, gm, gms, gmt, gp, gpu, gq, gst, ms, mt, i.
(ii) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 2, que reacciona con los
antígenos: a, b, c, k, r, y, Z29.(iii) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 3, que reacciona con los
antígenos: a, d, eh, k, z, z4 z23, z4 z24, z4 z32, z29.
(iv) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 4, que reacciona con los
antígenos b, d, fg, fgt, gm, gms, gmt, gp, gpu, gq, gst, ms, mt, k, r, z, z10.
(v) Antisuero Salmonella H «complejo e, n», que reacciona con los antí-
genos enx y enz15.
(vi) Antisuero Salmonella H «complejo L» que reacciona con los antígenos
lv, lw, lz13, lz28.
(vii) Antisuero Salmonella H «complejo 1», que reacciona con los antígenos
1,2; 1,5; 1,6; 1,7;z6.
3.2.7.7.2. Técnica para la reacción con el antisuero polivalente O (somático),en placa o en porta
1. Diluir y ensayar primeramente los antisueros con cultivos testigo conocidos
para garantizar la eficacia de la prueba cuando se realice con los cultivos
problema.
2. Marcar con un lápiz de cera dos secciones de alrededor de 1 x 2 cm sobre la
cara interna de una placa de Petri de vidrio o sobre un portaobjetos de 5 x 7,5
cm..
3. Depositar una pequeña cantidad (un asa) de un cultivo en agar nutritivo o en
agar triple azúcar hierro inclinado de 24-48 horas, directamente sobre una
placa o portaobjetos en la parte superior de cada zona marcada.
4. Depositar una gota de una solución de NaCl al 0,85% en la parte inferior de
cada sección marcada. Emulsionar el cultivo en la solución salina con un asa
53
o aguja de inoculación limpia y estéril en una sección y repetir lo mismo en la
otra sección.
5. Añadir-una gota de antisuero Salmonella polivalente O a una de las
secciones de cultivo emulsionado y mezclar con un asa o aguja estéril.
6. Balancear atrás y adelante un minuto las mezclas de ambas secciones y
observar a continuación sobre fondo oscuro. En caso de reacción positiva, se
produce una aglutinación rápida e intensa.
7. Clasificar la reacción del siguiente modo:
(a) Positiva, cuando hay aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina-suero
y no en la mezcla cultivo-solución salina.
(b) Negativa, cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina-
suero.2 Estos cultivos deberán ensayarse también frente al antisuero
polivalente H (flagelar) (III, a continuación).
(c) No específica, cuando ambas mezclas presentan aglutinación. Este resulta-
do requiere nuevos ensayos, tal como se describe en la obra Identificationof Enterobacteriaceae de P. R. Edwards y Ewing (1972).
2 Los antisueros polivalentes O no contiene aglutininas para los antígenos de
algunas Salmonelas. Debido a esto, se dan reacciones negativas con
determinadas cepas como S. cerro grupo K (18); S. Minnesota grupo L (21);
S. alachua, grupo O (35).
3.2.7.7.3. Técnica para la reacción con el antisuero polivalente (flagelar)
1. Diluir y ensayar primeramente los antisueros con cultivos conocidos testigo
para comprobar la eficacia de los resultados obtenidos con los cultivos
problema.
54
2. Añadir 5 ml de solución salina formolada al 0,6% a 5 ml de un cultivo en caldo
H de 24 horas del organismo en estudio. Aguardar una hora antes de su
utilización. Este caldo formolado puede ser almacenado a 5-8°C durante
algunos días, en el caso de que sea necesario.
3. Depositar en un pequeño tubo serológico (de 75 x 10 mm o de 100 x 13 mm)
0,02 ml del antisuero Salmonella polivalente flagelar adecuadamente diluido
y añadir 1 ml del caldo de cultivo formolado (antígeno), del apartado 2.
4. Preparar un control sustituyendo el antisuero por solución salina formolada,
colocando 0,02 ml de solución salina formolada en un tubo serológico del
mismo tamaño que los utilizados en la prueba anterior (apartado 3) y
añadiendo 1 ml del cultivo en caldo formolizado del apartado 2.
5. Incubar la mezcla antígeno-suero (punto 3 anterior) y la correspondiente mez-
cla antígeno-solución salina (punto 4 anterior) a 50°C durante una hora en un
baño de agua. Observar los resultados preliminares a intervalos de 15
minutos y leer los resultados finales transcurrida la hora de incubación.
6. Clasificar la reacción del siguiente modo:
(a) Positiva, cuando hay aglutinación de la mezcla cultivo-solución salina
formolizada-suero (apartado 3) y no hay aglutinación en la mezcla cultivo-
solución salina formolizada (apartado 4).
(b) Negativa, cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina
formolizada-suero.3
(c) No específica, cuando ambas mezclas aglutinan. Este resultado requiere
pruebas adicionales como las descritas en la obra Identification ofEnterobacteriaceae de P. R. Edwards y Ewing (1972).
7. Los cultivos que son inmóviles o los que dan resultado negativo cuando se
ensayan de nuevo con el antisuero Salmonella polivalente H (flagelar) se
clasifican según los resultados de otras pruebas como se describe en la obra
Identification of Enterobacteriaceae de Edwards y Ewing (1972).3 El antisuero polivalente H no contiene aglutininas para los antígenos de algunas salmonelas. Además pueden
esperarse resultados negativos con ciertas cepas como S. simsbury, Z27; S. Wichita ,Z37; S. Chittagong, Z35 .
55
3.2.7.7.4. Técnica para la reacción con cada uno de los antisueros o de grupoEsta prueba se lleva a cabo para determinar el grupo O (somático) al que
pertenece el cultivo en estudio.
1. Diluir y ensayar previamente los antisueros con cultivos testigo conocidos,
para garantizar los resultados con los cultivos problema.
2. Llevar a cabo con los cultivos la reacción O de grupo como en el apartado II,
pasos 2 a 6, utilizando todos y cada uno de los antisueros O de grupo
(incluso el Vi), en vez del antisuero Salmonella polivalente O.
3. Los cultivos que dan resultados positivos con el suero Vi se suspenden en 1
ml de solución salina fisiológica para formar una suspensión densa, a
continuación se calientan en un baño de agua hirviendo durante 20 a 30
minutos y se dejan enfriar. Volver a ensayar la suspensión tratada por el calor
utilizando los antisueros O de grupo: D, C1, y Vi. Los cultivos Vi positivos que
reaccionan con el suero somático del grupo D pertenecen probablemente a
Salmonella typhi y los que lo hacen con el suero somático del grupo C, a
Salmonella paratyphi C. Los cultivos Vi positivos tratados por el calor que no
dan reacción positiva con ninguno de los sueros somáticos de grupo, pero
que continúan reaccionando con el suero Vi, pertenecen probablemente al
grupo Citrobacter y no son salmonelas.
4. Anótese como pertenecientes a este grupo los cultivos que den reacción
positiva con alguno de los sueros O de grupo. Los cultivos que no reaccionan
con ninguno de los antisueros O de grupo se anotan como negativos. (14)
56
IV. RESULTADOS
De acuerdo al cronograma del proyecto de investigación, durante todo este periodose realizaron los Análisis Microbiológicos
Mes de Enero:Resultado de Carrito Nº 01 Resultado de Carrito Nº 02 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIOAerobiosmesófilos
10 UFC/g Aerobiosmesófilos
10 UFC/g 10 UFC/g
Rcto. demohos
<10 UFC/g Rcto. demohos
<10 UFC/g < 10 UFC/g
Rcto. delevaduras
10 UFC/g Rcto. delevaduras
10 UFC/g 10 UFC/g
Bacilluscereus
<100 UFC/g Bacilluscereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes < 10 UFC /g Coliformes 4 NMP/g 7 NMP/g
Mes de Febrero:Resultado de Carrito Nº 03 Resultado de Carrito Nº 04 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIOAerobiosmesófilos
10 UFC/g Aerobiosmesófilos
10 UFC/g 10 UFC/g
Rcto. demohos
<10 UFC/g Rcto. demohos
<10 UFC/g < 10 UFC/g
Rcto. delevaduras
10 UFC/g Rcto. delevaduras
10 UFC/g 10 UFC/g
Bacilluscereus
<100 UFC/g Bacilluscereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes 4 NMP/g Coliformes 4 NMP/g 4 NMP/g
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Mes de Marzo:Resultado de Carrito Nº 05 Resultado de Carrito Nº 06 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
87 x 10
UFC/g
Aerobios
mesófilos
99 x 10
UFC/g
93 x 10 UFC/g
Rcto. de
mohos
40 UFC/g Rcto. de
mohos
30 UFC/g 35 UFC/g
Rcto. de
levaduras
10 UFC/g Rcto. de
levaduras
10 UFC/g 10 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes <3 NMP/g Coliformes <3 NMP/g <3 NMP/g
Mes de Abril:Resultado de Carrito Nº 07 Resultado de Carrito Nº 08 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
20 UFC/g Aerobios
mesófilos
20 UFC/g 20 UFC/g
Rcto. de
mohos
<10 UFC/g Rcto. de
mohos
<10 UFC/g <10 UFC/g
Rcto. de
levaduras
30 UFC/g Rcto. de
levaduras
30 UFC/g 30 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes 3 NMP/g Coliformes 3 NMP/g 3 NMP/g
58
Mes de Mayo:Resultado de Carrito Nº 09 Resultado de Carrito Nº 10 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIOAerobiosmesófilos
40 x 10UFC/g
Aerobiosmesófilos
40 x 10UFC/g
40 x 10UFC/g
Rcto. demohos
20 UFC/g Rcto. demohos
20 UFC/g 20 UFC/g
Rcto. delevaduras
30 UFC/g Rcto. delevaduras
30 UFC/g 30 UFC/g
Bacilluscereus
<100 UFC/g Bacilluscereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes 7 NMP/g Coliformes 7 NMP/g 7 NMP/g
Mes de Junio:Resultado de Carrito Nº 11 Resultado de Carrito Nº 12 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIOAerobiosmesófilos
60 UFC/g Aerobiosmesófilos
90 UFC/g 75 UFC/g
Rcto. demohos
<10 UFC/g Rcto. demohos
<10 UFC/g <10 UFC/g
Rcto. delevaduras
<10 UFC/g Rcto. delevaduras
<10 UFC/g <10 UFC/g
Bacilluscereus
<100 UFC/g Bacilluscereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes <3 NMP/g Coliformes <3 NMP/g <3 NMP/g
59
Mes de Julio:Resultado de Carrito Nº 013 Resultado de Carrito Nº 14 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
50 UFC/g Aerobios
mesófilos
38 x 10
UFC/g
20 x 10UFC/g
Rcto. de
mohos
10 UFC/g Rcto. de
mohos
30 UFC/g 20 UFC/g
Rcto. de
levaduras
30 UFC/g Rcto. de
levaduras
10 UFC/g 20 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes 3 NMP/g Coliformes 4 NMP/g 4 NMP/g
Mes de Agosto:Resultado de Carrito Nº 015 Resultado de Carrito Nº 16 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
40 x 10
UFC/g
Aerobios
mesófilos
25 x 10
UFC/g
33 x 10 UFC/g
Rcto. de
mohos
20 UFC/g Rcto. de
mohos
30 UFC/g 25 UFC/g
Rcto. de
levaduras
20 UFC/g Rcto. de
levaduras
40 UFC/g 30 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes 5 NMP/g Coliformes 3 NMP/g 4 NMP/g
60
Mes de Setiembre:Resultado de Carrito Nº 17 Resultado de Carrito Nº 18 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
50 UFC/g Aerobios
mesófilos
38 x 10
UFC/g
22 x 10UFC/g
Rcto. de
mohos
10 UFC/g Rcto. de
mohos
30 UFC/g 20 UFC/g
Rcto. de
levaduras
30 UFC/g Rcto. de
levaduras
10 UFC/g 20 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes 3 NMP/g Coliformes 4 NMP/g 4 NMP/g
Mes de Octubre:Resultado de Carrito Nº 19 Resultado de Carrito Nº 20 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
60 UFC/g Aerobios
mesófilos
90 UFC/g 75 UFC/g
Rcto. de
mohos
<10 UFC/g Rcto. de
mohos
<10 UFC/g <10 UFC/g
Rcto. de
levaduras
<10 UFC/g Rcto. de
levaduras
<10 UFC/g <10 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes <3 NMP/g Coliformes <3 NMP/g <3 NMP/g
61
Mes de Noviembre:Resultado de Carrito Nº 19 Resultado de Carrito Nº 20 Resultado
PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO
Aerobios
mesófilos
80 UFC/g Aerobios
mesófilos
14x10 UFC/g 11 x 10UFC/g
Rcto. de
mohos
<10 UFC/g Rcto. de
mohos
40 UFC/g 20 UFC/g
Rcto. de
levaduras
20 UFC/g Rcto. de
levaduras
<10 UFC/g 10 UFC/g
Bacillus
cereus
<100 UFC/g Bacillus
cereus
<100 UFC/g <100 UFC/g
Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g
Coliformes <3 NMP/g Coliformes 4 NMP/g 4 NMP/g
62
V. DISCUSION
Los resultados respecto a la calidad Microbiológica de las hojuelas de papa que se
expenden en plena vía pública no presentan contaminación microbiana,
encontrándose por debajo de los limites mínimos permisibles que contempla la
“Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e
inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano” (R.M. N° 591–2008/MINSA) Protocolo para los análisis microbiológicos de Granos de Cereales,
leguminosos, quenopodiáceos y derivados (harinas y otros), según DIGESA.
Sin embargo durante encuestas a consumidores de este producto papas en
hojuela, se quejaron de ciertas reacciones alérgicas o se habían indigestado, los
casos no son constantes sino variables.
Esta situación constituye un factor de riesgo para la salud humanapor casos de
toxiinfección alimentaria, ya que la falta de control y capacitación de los
expendedores en el manipuleo de estos productos debe ser más continuo, obligar a
que sus anaqueles de expendio en especial las superficies estén más protegidos
del aire y polvo del medio ambiente.
Cabe destacar que la calidad microbiológica de las hojuelas de papa que se
expenden en la vía publica no presentan contaminación microbiana, pero la
contaminación se puede dar en los manipuladores de este tipo de producto
alimenticio, coincidiendo con lo establecido por LARRAÑAGA, I.; CARBALLO, J.
(1998.), quien demuestra que los puntos critico de control son manipuladores,
superficies y forma de expendio; y estos no son controlados por las autoridades
sanitarias y no se le da la importancia debida
Por la manera como se expenden en plena vía pública, sería interesante realizar un
estudio microbiológico del aire donde se encuentran dichos carritos.
63
La contaminación por el aire es importante tanto por razones higiénicas y/o
económicas.
La cantidad de microorganismos añadidos al alimento por sedimentación de las
partículas que presenta el aire es significante, éste puede elevar el número total de
microbios en el alimento, más si se usa para airear el producto.
Antes de adquirir estos productos, verifique y asegúrese de que los envases se
encuentren bien cerrados y en perfectas condiciones. (9)
Continuar apoyando pruebas de fritura con otras variedades de materia prima
(camote, yuca).
64
VI. CONCLUSIONES
En el presente trabajo realizado ninguna de las 22 muestras analizadas se
detectaron microorganismos indicadores de alteración, de higiene y patógenos que
represente riesgo para la salud humana.
Con relación a los microorganismos indicadores de alteración de alimentos
como son los microorganismos Aerobios Mesofilos, Mohos y Levaduras los
resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores por debajo de “m” que
es el límite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por consiguiente la
contaminación de las muestras con tales microorganismos es pequeña.
Con relación a los microorganismos indicadores de higiene de alimentos como
son los Coliformes, los resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores
por debajo de “m” que es el límite que separa la calidad aceptable de la rechazable;
por consiguiente la contaminación de las muestras con Coliformes es mínima.
Con relación a los microorganismos patógenos que puedan contaminar los
alimentos como es Bacillus cereus y la presencia de Salmonella; los resultados de
las 22 muestras analizadas muestran valores para Bacillus cereus por debajo de
“m” que es el límite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por
consiguiente la contaminación de las muestras se encontraron exentas con este
microorganismo.
Con relación a Salmonella los resultados obtenidos de las 22 muestras
analizadas muestran ausencia para con este microorganismo.
Finalmente las papas fritas en hojuela se consideran aptos para el consumo
humano por que cumplen con la exigencias de los criterios microbiológicos
establecidos en la Norma Técnica Sanitaria (NTS N° 071-MINSA/DIGESA-V-.01)
para el grupo y subgrupo de alimentos al que pertenece.
65
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Adams, M.R Y Moss N.O.: Microbiología de los alimentos. Editorial acriba S.A.Zaragoza 1997.
2. Aguilera J M 1997. Fritura de Alimentos. En: Aguilera JM (Editor). Temas enTecnología de Alimentos. Volumen 1. Programa Iberoamericano de Ciencia yTecnología para el Desarrollo (CITED). Instituto Politécnico Nacional, México: 187-213.
3. Álvarez, M. (2005). La Fritura de los Alimentos.http://www.monografias.com/trabajos31/frituraalimentos/frituraalimentos.shtml?monosearch.
4. BANWART, George J. Microbiología básica de los alimentos Ediciones bellaterra S. A.,Barcelona 1982.
5. Bello Gutiérrez, José., 1998, Ciencia y tecnología culinaria, Ediciones Díaz de Santos,S.A., Juan Bravo, 3-A. 28006, MADRID- España. Pp.: 107-129
6. CRUEGER W. A. 1989. Biotecnología, 3° Edición. Editorial Acribia S.A. Zaragoza
7. FAO 1992 Manual para el Control de Calidad de los Alimentos.
8. FRAZIER. W.C., Westhoff, D.C. 1993 Microbiología de los Alimentos. 2° Ediccion,Editorial Acribia, Zaragoza.
9. HOBBS, ROBERTS, 1993 Higiene y Toxicología de los Alimentos.
10. International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF), 2000Microorganismos de los alimentos, Volumen 1 Editorial Acribia, Zaragoza. España.
11. JAY. J.M. 1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Edit. Acribia, S.A., 804p
12. LARRAÑAGA, I.; CARBALLO, J. 1998. Control e Higiene de los Alimentos, Editorial Mc.Graw Hill. España, 1998. 33.
13. Norman G. Marriott, 2003, Principios de Higiene Alimentaria, Editorial Acribia S.A.,Zaragoza, - 416 páginas
14. LABORATORIO PROFECO Papas fritas envasadashttp://www.profeco.gob.mx/revista/pdf/est_08/56-63%20papas.pdf
15. (R.M. N° 591– 2008/MINSA ) “Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicosde calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano”
66
VIII. APENDICE
Grafico N° 01 Recuento de Aerobios mesófilos vs tiempo
106 UFC/g
105 UFC/g
104 UFC/g
103 UFC/g
102 UFC/g
10 UFC/g
m Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov M
Grafico N° 02 Recuento de mohos vs tiempo
104 UFC/g
103 UFC/g
102 UFC/g
10 UFC/g
m Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov M
67
Grafico N° 03 Numeración de Coliformes vs tiempo
103 UFC/g
102 UFC/g
10 UFC/g
m Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov M
Grafico N° 04 Recuento de Bacillus cereus vs tiempo
104 UFC/g
103 UFC/g
102 UFC/g
10 UFC/g N E G A T I V O S
m Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov M
Grafico N° 05 Ausencia y/o Presencia de Salmonella vs tiempo
Muestra/25 g.
m M
A U S E N C I A / 25 g.
(-) Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov (-)
68
FECHA Y FIRMA DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO
CALLAO, 20 de Marzo del 2012.
FIRMA DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
-----------------------------------------------------------------------------Blgo. – Mblgo.: ARTURO MARIANO GARCÍA MERINO
Profesor InvestigadorCódigo UNAC: 1364
69
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA Y DE ALIMENTOS
Bellavista, 20 de Marzo del 2012.
SEÑOR DIRECTOR DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN DE LA F.I.P.A.Ing.: DOMINGO NIETO FREIRE.Presente.
Asunto: LEVANTAMIENTO DE OBSERVACIONES
DE PROYECTO DE INVESTIGACION
De mi especial consideración:
Tengo a bien dirigirme a usted para saludarlo cordialmente, a la vez hacerlellegar el informe final del Proyecto de Investigación Titulado: Evaluación de la calidadmicrobiológica de los bocaditos fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que seelaboran y expenden en forma artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – DistritoBellavista – Callao. Con el levantamiento de las respectivas observaciones.
Aprobado con Resolución de Decanato Nº 063-2010DFIPA
Agradeciendo la atención que le brinde al presente me despido reiterándole lossentimientos de mi especial consideración y estima personal.
Atentamente.
____________________________________Blgo.- Ing. : ARTURO GARCIA MERINO
Responsable del ProyectoCódigo: 001364
CC.: Arch.
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