ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO
PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA
ESPECIALIDAD TECNOLOGÍA AMBIENTAL
GRUPO
QU-301
MATERIA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
Reporte de diagnóstico microbiológico en sitio alterado Presa Blanca Compuerta 2 de acuerdo a la NMX-AA-42-SCFI-1987 y PROY-NMX-AA-042/1-SCFI-2008
PRESENTAN:
Cruz Romo Diana Laura
Gaona Aboytes María Alejandra
González Sánchez Carla Valeria
Mireles Villasana Alejandra
Pérez Gómez Cynthia Sarai
Generación: 2014-2016
León, Guanajuato. 24 JUNIO 2015
ANTECEDENTES
En el municipio de León Guanajuato cuenta con Presas de aguas negras y residuales un ejemplo
muy claro es la Presa Blanca (Figura 1 y 2) ubicada al suroeste de la ciudad y la cual se encuentra a
1784 metros sobre el nivel del mar (snm).
En donde desembocan todo tipo de desechos industriales y domésticos, el agua de dicha presa
se conduce a través de un canal a cielo abierto, hacia las comunidades de Santa Rosa Plan de Ayala en
donde su estructura económica es de un total de 1027 hogares en donde estos tienen 967 viviendas, 23
tienen piso de tierra y unos 48 consisten de una sola habitación, 910 de todas las viviendas tienen
instalaciones sanitarias, 933 son conectadas al servicio público, 957 tienen acceso a la luz eléctrica.1
En San Pedro del Monte en cual su estructura económica es de un total de 173 hogares. De
estas 166 viviendas, 2 tienen piso de tierra y unos 8 consisten de una sola habitación, 141 de todas las
viviendas tienen instalaciones sanitarias, 166 son conectadas al servicio público, 164 tienen acceso a la
luz eléctrica.2
En la presa blanca, los riesgos y vulnerabilidad, se pueden ver como de mayor importancia por
las consecuencias a la población, que hacen vulnerable el entorno urbano son los riesgos por fugas de
los ductos de Pemex ya que alrededor de la presa se encuentra una planta de Pemex y los riesgos
implícitos por la colindancia a la carretera, por falta de accesos y salidas adecuadas que den seguridad a
la población.
En la comunidad se presentan usos de suelo tales
como:
uso urbano-habitacional
uso agrícola potencial.
uso mixto agrícola
En donde su destino final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas están fuertemente
contaminadas química y bacteriológicamente, al no sufrir ningún tratamiento de remediación.
Figura 1. Recuperado el 20 de junio de 2015 de:
https://www.google.com.mx/maps/@21.0857414,101.7137486,2970m/data=!3m1!1e3
Figura 2 Ubicación de La Presa Blanca.
1San Pedro del Monte (La Huizachera) - Guanajuato. Consultado el 20 de junio del 2015. Recuperado de: http://www.nuestro-
mexico.com/Guanajuato/Leon/San-Pedro-del-Monte-La-Huizachera/
2 Plan de Ayala (Santa Rosa) - Guanajuato. Consultado el 20 de junio del 2015. Recuperado de:
http://www.nuestro-mexico.com/Guanajuato/Leon/Plan-de-Ayala-Santa-Rosa/
PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE MUESTRA Y SIEMBRA IN SITU
MUESTREO
Materiales, equipos y reactivos.
2 Frascos o recipientes para colectar la muestra de condición estéril.
4 Hisopos en condición estéril
2 Jeringa estéril
2 cajas Petri con agar
2 Metros de Aluminio esto es para envolver las muestras recolectadas.
1 Hielera pequeña
Hielo (para la preservación de las muestras recolectadas).
Medio de cultivo de Agar de bilis y rojo violeta
Nota: Los frascos o los recipientes de muestreo deben estar estériles esto es para el material no
se contamine ya que en la esterilización elimina todo tipo de microorganismos.
Preparación de medios de cultivo
Agar de Bilis y rojo violeta
Ingredientes
Extracto de levadura 3 g
Peptona de gelatina 7 g
Mezcla de sales biliares 1.5 g
Lactosa 10 g
Cloruro de sodio 5 g
Agar 15 g
Rojo neutro 0.03 g
Cristal violeta 0.002 g
Agua para llevar a 1000 mL
pH 7.4± 0.2
Método de preparación
Se suspendieron 4.98 g de Agar de bilis y rojo violeta en 120 mL de agua destilada y se mezcló
perfectamente, posteriormente se procedió a esterilizarlo en autoclave a 121° C por 15 minutos.
Figura 3. Toma de muestra microbiológica en
matriz de agua.
Procedimiento
Muestreo en cuerpos receptores (agua):
1. Tomar 1 mL de muestra con la jeringa estéril sumergiéndola en el agua sin sacarla evitando
contaminar en todo momento.
2. Verter el volumen tomado con la jeringa en una caja Petri preparada un día antes del muestreo
con agar de bilis y rojo violeta.
3. Llenar un frasco de vidrio (previamente debe de estar esterilizado) hasta 2/3 partes de su
volumen (cantidad menor sería insuficiente, mayor, disminuiría el espacio de aire disponible),
evitar contaminar en todo momento.
NOTA: El volumen suficiente para efectuar el análisis bacteriológico, debe de ser de un aproximado de
100mL.
4. Para tomar el volumen de muestra en el frasco quitar el papel aluminio del cuello del frasco e
introducir el frasco aproximadamente 30 mL bajo la
superficie del agua. (figura 3).
5. Destapar el frasco dentro del agua. (La boca del envase
debe quedar en sentido contrario al flujo de la corriente, si
no existe corriente, crearla empujando el frasco
horizontalmente, en dirección opuesta al movimiento de la
mano).
6. Tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el
papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la botella.
7. Si no es posible la recolección de muestras en las
condiciones antes anunciadas; fijar un lastre al frasco, al que se hace descender en el agua.
Procedimiento
Muestreo en cuerpos receptores (suelo):
1. Tomar con ayuda de un hisopo estéril la muestra de suelo de forma rápida, y cultivarla en la
placa de cultivo preparada un día antes del muestreo con agar de bilis y rojo violeta el cual es
usado para el crecimiento de organismos coliformes.
2. En el frasco receptor almacenar la muestra del suelo cerca y rápida para no contaminar el
recipiente.
NOTAS: Se recomienda tomar la muestra de suelo cerca al área de la muestra de agua.
3. Los frascos estériles para el muestreo no se deben destapar sino hasta el momento en el que se
efectúe el muestreo.
4. Evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material
contaminante.
5. Realizar el muestreo lo más pronto posible, para evitar proliferación o muerte de las bacterias.
6. Cuando se practica dos horas después de tomar la muestra, los resultados empiezan a ser
inciertos.
PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE COLIFORMES TOTALES (NPM): PRUEBA PRESUNTIVA
Fundamento:
El caldo lactosado es un medio rico en nutrientes, y no contiene inhibidores del crecimiento bacteriano.
Sus ingredientes como el extracto de carne y la peptona, son la fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la lactosa es el hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa requieren de la acción de dos enzimas: la permease de lactosa y la β galactosidasa, la primera es necesaria para ingresar la molécula de lactosa a la célula bacteriana y la segunda hidroliza el enlace glucosídico y produce glucosa y galactosa. Por la fermentación de la lactosa, (la cual es llevada a cabo por los coliformes totales) se produce ácido y gas, y éste último se demuestra al usar las campanas Durham. Para bacterias coliformes debe incubarse de 35 a 37 °C durante 24-48 horas.
Materiales, equipos y reactivos.
9 Tubos de cultivo 1 Gradilla 5 Vasos de precipitados de 250 mL 9 Campanas Durham 8 Pipetas de diferentes volúmenes 1 Espátula 3 Matraz Erlenmeyer 250 mL 1 Incubadora 1 Autoclave Balanza analítica Agua destilada Caldo lactosado Preparación de medios de cultivo
Caldo lactosado
Medio de doble concentración:
Ingredientes
Peptona de gelatina 5 g
Extracto de carne 3 g
Lactosa 5 g
Agua para llevar a 1000 mL
pH final 6.9 ± 0.2
Método de preparación
Se suspendieron 1.56g de caldo lactosado en 120 mL de agua destilada y se mezcló
perfectamente y se distribuyó en 9 tubos de cultivo con campana Durham. Esterilizar a 121°C de 12 a 15
minutos.
Prueba presuntiva
1. Preparar la muestra para el análisis para lograr una distribución uniforme de los microorganismos
(agitando, mezclando la muestra).
NOTA: Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones.
2. A partir de una muestra de 100 mL de agua o una dilución del suelo con 1 g de suelo, inocular los
tubos de con 10 mL de medio de cultivo líquido a doble concentración (caldo lactosado) con 3
volúmenes diferentes de agua o dilución de suelo los volúmenes son de 10 mL, 1 mL y 0.1 mL,
tomándolos con pipetas estériles en cada caso. Cada tubo de ensayo con su respectiva campana
Durham.
NOTA: Se harán 3 réplicas del medio que será incubado.
3. Incubar los tubos de 24 a 48 horas ya sea a 35 °C ó a 37 °C.
4. Posterior a la incubación examinar los tubos después de haber transcurrido de 18 a 24 horas y
considerar como resultados positivos a aquellos en los que se produjo gas dentro de la campana
Durham, turbidez. Si es necesario reincubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos
cambios y examinarlos nuevamente a las 48 horas.
5. Mediante tablas estadísticas llevar a cabo el cálculo del número más probable (NMP) de organismos
coliformes, organismos coliformes fecales y E. coli que puedan estar presente en 100 mL de muestra,
partiendo del número de tubos que resultaron positivos por réplica así como de la concentración de
donde proviene.
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA LA IDENTIFICACION DE COLIFORMES TOTALES
Fundamento:
La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de
la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de
resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud
pública al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la
presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de
otros animales de sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros
del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse
para estimar el grado de contaminación fecal.
EL caldo lactosa bilis verde brillante Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el
aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos,
y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.
Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o
alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas
En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de
nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el
rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la
fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa
como agente selectivo.
La prueba confirmativa consiste en analizar los tubos una vez que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
Materiales, equipos y reactivos
Pipetas de diferentes volúmenes
1 Matraz Erlenmeyer 250 mL
2 Asa de nicromo
2 Mechero
2 Vasos de precipitados 250 mL
1 Gotero
1 Autoclave
1 Incubadora
Caldo lactosa bilis verde brillante
Agua destilada
Reactivo Kovacs
Peptona
Preparación de medios de cultivo
Agar verde brillante bilis
Ingredientes:
Bilis de buey 20 g
Lactosa 10 g
Peptona de gelatina 10 g
Verde brillante 13.3 mg
Agua para llevar a 1000 mL
Método de preparación
Disolver 3.2 g del medio deshidratado en 80 mL de agua destilada, agitando frecuentemente
para disolver el producto, disperse en tubos con campana de Durham. Esterilizar a 121° C durante 15
minutos.
Solución salina de peptona
Ingredientes
Peptona 1.0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 g
Agua para llevar a 1000 mL
Método de preparación
Disolver los componentes en agua hirviendo. Si es necesario ajustar el pH de modo que al
terminar la esterilización sea de 6.7. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min.
Prueba confirmatoria
1. Reinocular con un asa de nicromo (esterilizándola en mechero) en caldo lactosa bilis verde
brillante un volumen (0.1 mL) del contenido de los tubos que resultaron positivos en la
prueba presuntiva.
2. Incubar los tubos por 48 horas a 37 °C para la detección de organismos coliformes y a 44°C
por 24 horas para organismos termotolerantes (fecales). Para confirmar la presencia de E.
coli. presuntiva, incubar un tubo de agua de peptona tanto para agua como para suelo para
detectar la formación de indol a 44°C durante 24 horas.
3. Después de incubación examinar los tubos, observar si se produjo gas en la campana
Durham esto para confirmar la presencia de coliformes pero para la presencia de E.coli se
podrá ver el desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar así como después de
haber añadido el reactivo de Kovacs.
PRUEBA CONFIRMATORIA DE INDOL PARA E. coli PRESUNTIVA
Fundamento:
En la realización de la prueba de indol, el reactivo Kovacs y el agua peptona son los que
detectan la presencia del microorganismo E.coli presentes en la muestra de agua y suelo de La Presa
Blanca. Su detección fue instantánea tanto en agua como en suelo.
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano y esta
reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto
triptofanasas. Para detectar la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la
prueba se realiza con el reactivo de Kovacs con el que el indol producido reacciona generando una
coloración rosa intensa.
Inoculación del medio.
1. Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento de verde brillante bilis que muestre un
resultado positivo en uno o más tubos de medio confirmativo para detectar la producción de gas
e indol.
2. Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar un tubo de Caldo Bilis Lactosa
Verde Brillante o Caldo EC a 37°C y examinarlo para ver si hay producción de gas dentro de un
período de 48 horas.
3. Para confirmar la presencia de E. coli presuntiva, incubar un tubo de agua de peptona para
detectar la formación de indol a 44°C durante 24 horas.
4. Después añadir de 0.2 a 0.3 cm3 de reactivo de Kovacs al tubo de agua de peptona; el
desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar suavemente denota la presencia de indol.
NOTA.- La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria de
contaminación fecal.
Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para la confirmación de E. coli si se considera
necesario.
PRUEBA CONFIRMATORIA DE OXIDASA PARA E. coli
Fundamento:
Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromo C
oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de
respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana,
en las siguientes líneas se dará una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de
entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromo C oxidasa, entiéndase que todo este
proceso tiene la finalidad de producir ATP.
En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones
desde sus sustratos hasta llegar al citocromo C, la enzima llamada citocromo C oxidasa le quita
electrones al citocromo C, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el
último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un
exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o
peróxido de hidrógeno.
Algunas bacterias que se encuentran en el agua pueden conformar la definición de organismos
coliformes en muchos aspectos, pero son capaces de producir gas a partir de lactosa solo a
temperaturas abajo de 37 °C.
Por consecuencia dan resultados negativos en las pruebas confirmativas de rutina para
organismos coliformes, y su presencia en agua no es usualmente considerada como significativa.
Las especies de Aeromonas, las cuales es natural que estén presentes en agua, interfieren con
la determinación sólo a temperatura de 37 °C o menor, se requiere la prueba confirmativa de la oxidasa
solo cuando se están determinando coliformes totales.
El fundamento básico es que el reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la
enzima citocromo C oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es
una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado.
Materiales y equipos
2 Papel filtro
2 Cajas Petri
1 Gotero
2 Asa metálica de platino
Reactivos
Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que
sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, Tetrametil-p-fenilendiamina.
El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%. Este reactivo
se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso.
Procedimiento
Incubación de los tubos
Incube los tubos inoculados por 48 horas ya sea a 35 °C ± 0,5 °C ó a 37 °C ± 0,5.
Revisión de los tubos en cultivo presuntivo
1. Examinar los tubos de cultivo después de incubarlos por 18 a 24 horas y registre con reacción
positiva aquellos que muestren turbidez debido al crecimiento bacteriano y/o formación de gas
en el interior del tubo invertido (Durham). Así como la producción de acido si el medio de
aislamiento contiene un indicador de pH.
2. Reincubar aquellos tubos que no muestren alguno o todos estos cambios y examínelos
nuevamente para reacciones positivas a las 48 horas.
Prueba de oxidasa
1. Lleve a cabo la prueba de la oxidasa con subcultivos puros de organismos fermentadores de
lactosa, desarrollados en medio de agar nutritivo, de la siguiente manera: Coloque dos o tres
gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente en un papel filtro colocado sobre una caja
Petri.
2. Con una varilla de vidrio, palillo de madera o asa metálica de platino (no de nicromo) de punta
redonda, unte una pequeña porción del crecimiento sobre el papel filtro preparado.
3. Considere la aparición de un color azul-morado profundo en un lapso de 10 segundos como una
reacción positiva.
NOTA: Cada ocasión en que se utilice el reactivo de oxidasa, deben realizarse pruebas control con
cultivos de organismos que se sabe dan reacción positiva (Pseudomona aeruginosa) y una reacción
negativa (E. coli).
Factores a considerar en la prueba de oxidasa.
No considerar un resultado positivo después de 30 seg, ya que el oxígeno molecular del ambiente oxida
al reactivo.
No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de
oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que
contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando
como resultado falsos negativos en la prueba.
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