UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA Y ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE DEL ACEITE OBTENIDO DE LAS SEMILLAS
DEL FRUTO DEL MATE (Crescentia cujete L.).
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO
REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO
Y FARMACÉUTICO
AUTORES:
LOURIDO SALAZAR LUIGGI RAFAEL
PALADINES SANTACRUZ GEOVANNA LISSETTE
TUTOR:
PHD. ADONIS BELLO ALARCÓN
CO-TUTOR:
Q.F ZORAIDA BURBANO GOMEZ Msc.
GUAYAQUIL-ECUADOR
2017
i
APROBACIÓN DEL TUTOR
En calidad de tutor /a del Trabajo de Titulación, Certifico: Que he asesorado,
guiado y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de investigación, cuyo
título es “Caracterización físico-química y actividad antioxidante del aceite
obtenido de las semillas del fruto del mate (Crescentia cujete L.)”, presentado por
LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR, con cédula de ciudadanía N° 0920028396
y GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ, con cédula de ciudadanía
N° 0925641797, previo a la obtención del título de Químico y Farmacéutico.
Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Antiplagio
del programa URKUND. Lo Certifico. -
Guayaquil, 21 de Marzo del 2017
FIRMA TUTOR DE TESIS
iii
CERTIFICADO DEL TRIBUNAL El Tribunal de Sustentación del Trabajo de Titulación del Sr. Luiggi Rafael Lourido
Salazar y la Srta. Geovanna Lissette Paladines Santacruz, después de ser
examinados en su presentación, memoria científica y defensa oral, da por
aprobado el Trabajo de Titulación.
DR. JULIO RODRIGUEZ ZURITA MsC PRESIDENTE - MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Q.F. FERNANDA VÉLEZ LEÓN MsC DRA. AMALIA SUAREZ MsC DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL
ING. NANCY VIVAR CÁCERES SECRETARIA ENCARGADA
iv
CARTA DE AUTORIA DE TITULACIÓN
Fecha
Guayaquil, 21 de Marzo del 2017
Nosotros, LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR Y GEOVANNA LISSETTE
PALADINES SANTACRUZ, autores de este trabajo declaro ante las autoridades
de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, que la
responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, nos
corresponde a nosotros exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a
la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.
Declaro también es de nuestra autoría, que todo el material escrito, salvo el que
está debidamente referenciado en el texto. Además, ratifico que este trabajo no
ha sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en una
Universidad Nacional, ni una Extranjera.
LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR
NOMBRES DEL AUTOR C.I. 0920028396
GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ
NOMBRES DEL AUTOR C.I. 0925641797
v
AGRADECIMIENTO
En primer lugar agradezco a Dios por haberme dado sabiduría y salud para poder
culminar esta etapa en mi vida y sobre todo a mis padres por brindarme su apoyo
incondicional y aconsejándome en cada paso en esta etapa de mi vida.
Agradezco al apoyo incondicional de mi familia, tanto a mi padre como a mi madre
por haberme sabido guiar en toda mi vida, me ayudaron a formarme con buenos
sentimientos, hábitos y valores, lo cual me ha ayudado a salir adelante en los
momentos más difíciles.
Agradezco a mi compañera, amiga y más, Geovanna Paladines para poder
culminar este trabajo, ya que gracias a su curiosidad se pudo salir adelante con
esta investigación y estoy muy orgulloso de ti, Dios permitió poder realizar este
trabajo junto y nos ayudó a forjarnos como profesionales.
Agradezco a mi tutor de tesis el Lcdo. Adonis Bellos Alarcón PhD. y Co-Tutora
Q.F. Zoraida Burbano Gómez Msc. Por haberme brindado la oportunidad de
recurrir a su capacidad y conocimiento científico y a su vez poder guiarme en este
largo camino durante el desarrollo de mi tesis.
Mi agradecimiento también va dirigido al Gerente Propietario de la Empresa
GUSTAFF S.A., el Ing. Gustavo Argüello por haberme permitido poder dar mis
primeros pasos en su prestigiosa empresa y formarme como profesional.
Para finalizar, agradezco de igual manera a todas las personas que fueron mis
compañeros y amigos más cercanos de clase durante todos los niveles de
Universidad, que siempre estuvieron apoyando y aconsejando formando así un
gran vinculo duradero, ya que gracias al compañerismo, amistad y apoyo han
aportado a mis ganas de seguir adelante en mi carrera profesional.
Luiggi Rafael Lourido Salazar
vi
AGRADECIMIENTO
Gracias Dios por todo lo que me has dado, gracias por no soltar mi mano y
mantenerme a tu lado contra vientos y mareas. Gracias Dios por haber caminado
junto a nosotros , dándonos tu ayuda ,fortaleza, sabiduría y paz , para permitirnos
alcanzar una más de nuestras metas de vida.
Agradezco a mi hermosa familia, que me ha dado su total apoyo incondicional,
desde mis primeros pasos, ya que con su amor, cariño y valores me han dado la
motivación para escalar en mi vida y no desfallecer en el camino .Han sido y serán
siempre mi pilar fundamental, gracias a ellos he podido forjarme como persona, y
ser la persona que ahora soy con sus virtudes y defectos de noble corazón. Cada
uno que aporto de una forma maravillosa para que logre conseguir mi meta, ya
sea con ayuda, regaño, consejo, sonrisa o un abrazo, me hicieron saber que
siempre van a estar ahí y aunque los tiempos estén difíciles, harán que el día sea
alegre. Por eso y más siempre les estaré eternamente agradecida.
Agradezco a nuestro tutor el Dr. Adonis Bello Alarcón y Co-Tutora Q.F. Zoraida
Burbano Gómez Msc, que con su paciencia y sabiduría nos guiaron con excelencia
y disposición durante toda la etapa de desarrollo de la tesis.
Agradezco a las personas que conocí durante mi etapa Universitaria, que de
alguna manera aportaron en mí de forma positiva en mi camino hacia la meta.
Agradezco a mis compañeros, con los cuáles pasamos muchos obstáculos y
vivimos muchas aventuras y a los que hoy puedo llamar amigos. A su vez a mis
amigos más cercanos, que siempre estuvieron ahí, alentando y apoyando en toda
esta etapa. Agradezco a los docentes que me formaron como profesional e
inculcaron en mí la curiosidad de investigar.
Agradezco de manera especial a mi compañero de tesis, por haberme dado su
apoyo, soporte y entusiasmo, para seguir adelante, y estoy muy orgullosa y feliz
de decir que lo logramos y que esta meta lograda, es un paso más que nos
acerca a la meta final de lograr el éxito profesional, personal y de vida.
Geovanna Paladines Santacruz
vii
INDICE GENERAL
Pág.
INTRODUCCIÓN 1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 3
HIPÓTESIS 3
VARIABLE
VARIABLE DEPENDIENTE 4
VARIABLE INDEPENDIENTE 4
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL 4
OBJETIVO ESPECÍFICOS 4
CAPITULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.1. Antecedentes del trabajo 5
I.2. Mate, jícaro o totumo 5
I.2.1. Origen y distribución 5
I.2.2. División taxonómica 6
I.2.3. Denominaciones o sinonimias 6
I.2.4. Sinonimia botánica 6
I.2.5. Descripción botánica 7
I.3. Composición química 7
I.3.1. Ácidos grasos 8
I.3.2. Análisis fisicoquímico para aceites vegetales 11
I.4. Actividad biológica 11
I.4.1. Uso medicinal 11
I.4.2. Actividad antioxidante 12
I.4.3. Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método DPPH 13
viii
I.5. Caracterización fisicoquímica para aceites comestibles 15
I.5.1. Densidad relativa 15
I.5.2. Perdida por calentamiento 15
I.5.3. Índice de Yodo 15
I.5.4. Índice de Peróxido 16
I.5.5. Acidez 16
I.5.6. Índice de acidez 17
I.5.7. Índice de saponificación 17
I.6. Cromatógrafo de gases acoplada a espectrómetro de masas 17
CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1. Metodología 19
II.2. Extracción de aceite 19
II.3. Análisis fisicoquímicos 20
II.3.1. Densidad relativa 20
II.3.2. Pérdida por calentamiento 20
II.3.3. Índice de Yodo 21
II.3.4. Índice de peróxido 21
II.3.5. Acidez 22
II.3.6. Índice de refracción 22
II.3.7. Índice de saponificación 22
II.3.8. Contenido de ácidos grasos 23
II.4. Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método del DPPH 24
Capítulo III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1. Extracción de aceite 25
III.2. Análisis Fisicoquímicos de los aceites 25
III.2.1. Densidad relativa 25
III.2.2. Pérdida por calentamiento 25
III.2.3. Índice de refracción 25
ix
III.2.4. Índice de saponificación 26
III.2.5. Acidez 26
III.2.6. Índice de peróxido 26
III.2.7. índice de Yodo 27
III.2.8. Contenido de ácidos grasos 27
III.3. Ensayo DPPH 29
CONCLUSIONES 32
RECOMENDACIONES 33
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34
ANEXOS 40
x
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA N° Pág.
TABLA N° I. Compuestos obtenidos en la hoja 8
TABLA N° II. Ácidos grasos saturados 9
TABLA N° III. Ácidos grasos monoinsaturados 10
TABLA N° IV. Ácidos grasos poliinsaturados 10
TABLA N° V. Composición de ácidos grasos del aceite 28
TABLA N° VI. Relación entre la conc. del blanco estandarizado Trolox y la absorbancia 29
TABLA N° VII. Datos de la absorbancia del blanco y la muestra 30
ÍNDICE DE GRÁFICAS
FIGURA N° Pág.
FIGURA N° 1. Estructura del DPPH antes y después de reacción antioxidante 14
FIGURA N° 2. Curva de regresión lineal obtenida del Trolox 29
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO Nº Pág.
ANEXO Nº 1. Herbario guay, descripción taxonómica del mate 40
ANEXO Nº 2. Fotografías de la fase experimental 41
ANEXO Nº 3. Gráficas del GC-MS 47
ANEXO Nº 4. Decoloración de solución DPPH 48
ANEXO Nº 5. Certificado de presentación de tema en II Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología 49 ANEXO N° 6 Certificado de análisis del Laboratorio PROGECA 50
xi
RESUMEN
El interés científico por el empleo de los aceites vegetales muestra una tendencia
ascendente. La necesidad de desarrollar nuevos alimentos funcionales y la
creciente demanda de la industria de los nutracéuticos hacen que estos
compuestos constituyan diana de investigación de muchos grupos fitoquímico del
mundo. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar desde el punto de
vista físico-químico el aceite obtenido de las semillas del fruto Crescentia cujete L.
Los procedimientos para el análisis de las características fisicoquímicas se
llevaron a cabo en PROGECA; Laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad de Guayaquil.
La metodología empleada en esta investigación fue de tipo experimental, donde
se emplearon alrededor de 30 frutos de mate con un rendimiento de 250 a 500
semillas. La obtención del aceite se realizó por Soxhlet utilizando hexano como
solvente. La caracterización físico-química se realizó por triplicado siguiendo la
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN para grasas y aceites comestibles. La
extracción por Soxhlet permitió obtener un rendimiento promedio de 36,57%. Los
análisis fisicoquímicos del aceite obtenido están dentro de la norma ecuatoriana:
densidad relativa (0,9045 g/ml), pérdida por calentamiento (1.38%), índices de
refracción (1,464), índice de saponificación (191,39 mgKOH/g), índices de acidez
(1,32 % como ácido oleico), índice de peróxidos (3,997 %) e índice de yodo
(120,97 mg/100g aceite). El análisis de CG-EM muestra más de un 80% de ácidos
grasos insaturados, siendo el ácido oleico el componente mayoritario con un 63,9
%, el cuál cumple numerosas funciones favorables a nivel fisiológico y metabólico
en nuestro organismo. Además, se realizó el ensayo del DPPH de este aceite.
xii
ABSTRACT
The scientific interest in the use of vegetable oils shows an upward trend. The need
to develop new functional foods and the growing demand of nutraceutical
industries, made that these compounds constitute a target for many phytochemical
research groups. The present study aims to characterize from the physical-
chemical point of view the oil obtained from the seeds of the fruit of Crescentia
cujete L. Procedures for the analysis of physicochemical characteristics were
carried out in PROGECA; Faculty of Sciences Chemical laboratory of the
Guayaquil University.
The methodology employed in this research was of experimental type, where were
use around 30 fruits of Crescentia cujete L. which had around 250 to 500 seeds.
The oil was obtained by the method of Soxhlet using hexane as solvent. The
physical and chemical characterization was performed in triplicate according to the
standard technique Ecuadorian NTE INEN for fats and edible oils. The Soxhlet
extraction allowed to obtain an average yield of 36, 57%. The physico-chemical
analysis of the oil obtained are within the Ecuadorian standard: relative density (0,
9045 g/ml), loss on heating (1.38%), refractive index (1,464), saponification value
(mg KOH/g 191, 39), rates of acidity (1.32% as oleic acid), peroxides (3,997%) and
rate of iodine (120, 97 mg / 100 g oil). The analysis of CG-EM shows more than
80% of unsaturated fatty acids, being the oleic acid the majority component with
63.9%, which is known for its favorable physiological and metabolic functions in
our organism. In addition, the DPPH assay of this oil was carried out.
xiii
LISTA DE SÍMBOLOS μg microgramos
μL microlitros
mL mililitros
mg miligramos
μm micrómetros
μM micromolar
mm milímetros
nm nanómetros
ºC grado centígrado
cm centímetro
m metro
ppm partes por millón
N normalidad
I Índice
meq miliequivalentes
KOH Hidróxido de Potasio
NaOH Hidróxido de Sodio
ClH Ácido Clorhídrico
ATP Trifosfato de adenosina
ADN Ácido Desoxirribonucleico
AOCS American Oils Chemist´s Society
VLDL Lipoproteína de muy baja densidad (Español)
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
OPS Organización Panamericana de la Salud
OMS Organización Mundial de la Salud
IEPI Instituto Ecuatoriano de Propiedad Intelectual
INVIMA Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamento
INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización
ERO Especie Reactivas del Oxígeno
1
INTRODUCCIÓN
Los productos naturales han sido de preferencia en las personas, desde la
antigüedad, pero en el mercado existe una gran competencia de productos
sintéticos que a pesar de su gran acogida no han logrado reemplazar, en varios
casos, los beneficios que un producto natural puede ofrecer. Pero a pesar de ello,
todavía se desconoce en qué medida puede ser utilizado un producto natural,
siendo este muchas veces abandonado en el transcurso de su estudio y a su vez
no investigado debido a la falta de interés o por el desconocimiento y simplemente
creyendo que solo se lo puede utilizar para un solo fin (Pomilio, 2012; Jimenez,
2013).
Los aceites fijos están constituidos por mezclas de ácidos grasos unidos
mediante enlace covalente a moléculas de glicerol. En general se trata de
compuestos insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos, cuya
composición no se ve alterada al ser expuestos al calor o la destilación. En los
vegetales los aceites se encuentran principalmente en las semillas de los frutos;
de los cuales pueden ser extraídos por dos métodos: expresión en frío o en
caliente en prensas hidráulicas o extracción con el empleo de disolventes
orgánicos (Etong et al., 2014).
Los árboles del género Crescentia de la familia Bignoniaceae, son muy
abundantes en los hábitats secos tropicales. En toda América se les conoce con
diferentes nombres como mate, jícaro o totumo, siendo un árbol originario de
México y Centroamérica, que puede alcanzar entre 5 a 10 m de altura. Su vida
oscila entre los 100 y 200 años, presentan una forma irregular con copa ligera y
muchos intersticios entre las ramas (Hernandez-Rivas & Campos-Sosa, 2007).
Estudios químicos y nutricionales demuestran que la semilla del mate es una
fuente potencial de proteínas y aceite carente de toxicidad, con un olor y sabor
muy parecido al aceite de olivo (Figueroa, 2000). Según Figueroa (2000) las
semillas poseen un 33.4% de grasa, 16.8% de fibra cruda y 25.1 % de proteína,
sin especificar la composición química de la fracción lipídica, a diferencia del
2
reporte de Luna (2007) que señala un 37% de aceite con un 59.4% de ácido oleico
como componente mayoritario. Finalmente Espitia-Baena (2011) indica que las
semillas contienen un 20% de aceite.
En la región costera del Ecuador, éste fruto es comercializado de forma
artesanal, donde se utiliza su cáscara, fuerte y resistente, como base para elaborar
utensilios de cocina, joyerías e instrumentos musicales como las maracas (Bravo
et al., 2016).
La determinación de propiedades fisicoquímicas de un aceite vegetal no
conocido puede dar como resultado una nueva fuente de ácidos grasos, cuyo
contenido en ácidos saturados e insaturados determina su capacidad para
intervenir en el funcionamiento fisiológico y cumplir un papel importante en el
funcionamiento del organismo. Los ácidos grasos insaturados desempeñan roles
en la prevención de enfermedades cardiovasculares, mediante la reducción de
acumulación de lípidos en las paredes arteriales y reducción de la presión arterial
(Moreno, 2010).
Tomando como base todo lo anteriormente expuesto, la presente investigación
tiene como objetivo evaluar las características fisicoquímicas y antioxidantes del
aceite que se obtiene a partir de las semillas de los frutos de Crescentia cujete L.,
mediante una extracción por Soxhlet utilizando n-hexano como disolvente.
3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El interés científico de la presente investigación, se basa en la obtención y la
caracterización fisicoquímica del aceite de las semillas de los frutos de C. cujete
L. y evaluar la capacidad antioxidante in vitro de los componentes presentes.
Basándose en experiencias anteriores, con estudios del fruto Espitia et al. (2011)
un tamizaje preliminar fitoquímico muestra la presencia de alcaloides cuaternarios,
altos contenidos de lípidos, compuestos polifenoles, saponinas y naftoquinonas.
Además se detectaron y aislaron ácidos orgánicos como el ácido cianhídrico,
ácido tánico y ácido crescéntico.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
El interés científico de la presente investigación, se basa en la obtención y
caracterización del aceite de las semillas de Crescentia cujete L. Por todo lo
anterior, este trabajo plantea la siguiente problemática: ¿Podrá obtenerse
mediante extracción por método de Soxhlet, el aceite de la semilla del fruto del
mate con capacidad antioxidante?
HIPÓTESIS
Las semillas del Mate (Crescentia cujete L) presentan aceites fijos con capacidad
antioxidante al ser evaluados por un modelo farmacodinámico in vitro: DPPH.
4
VARIABLES
VARIABLES DEPENDIENTES
Rendimiento de aceite fijo
Características del aceite fijo
Capacidad antioxidante in vitro del aceite fijo
VARIABLE INDEPENDIENTE
Condiciones de extracción
Propiedades fisicoquímicas del aceite
Condiciones experimentales del método de DDPH
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar las propiedades fisicoquímicas y antioxidante in vitro del aceite
obtenido de las semillas del fruto de Crescentia cujete L,
OBJETIVOS ESPECÌFICOS
Determinar el rendimiento de aceite obtenido por método de Soxhlet de la
semilla del fruto de C. cujete L.
Determinar las propiedades fisicoquímicas del aceite obtenido.
Evaluar la actividad antioxidante in vitro del aceite de las semillas por
captura de radicales libres de DPPH.
5
I.1. ANTECEDENTES DEL TRABAJO
El árbol del mate está distribuido en toda la América intertropical, desde la
Florida hasta Brasil, en África y Asia tropical. Es utilizado como medicina y fuente
de alimento de animales, e igualmente, de utilería de cocina (Botero et al., 2015).
En Nicaragua se han creado técnicas Industriales para obtener productos a
partir de este fruto como alcohol a partir de la pulpa; aceite comestible de uso
industrial, torta y harina de las semillas y carbón de las cáscaras. En la medicina
natural se emplea la pulpa de Mate como laxante, emoliente y expectorante
(Recalde, 2015).
Por otro lado, estudios químicos y nutricionales demuestran que las semillas
tienen un alto porcentaje de aceites. En la región caribeña de Colombia se utiliza
el totumo desde tiempos ancestrales en la alimentación de bovinos, cerdos y
gallinas con buenos resultados nutricionales (Botero et al., 2011). La semilla del
mate seca contiene 33,4% de grasa, 16,8% de fibra cruda y 25,1 % de proteína
(Figueroa et al, 2000).
I.2. MATE, JÍCARO O TOTUMO
I.2.1. ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN
El totumo se adapta a diferentes ecosistemas y siendo probablemente nativa
de las sabanas del sur de México, América Central y zona norte de Sudamérica,
donde es cultivado o aparece por regeneración natural. Su distribución latitudinal
varía de 0 a 1000 metros sobre el nivel del mar y temperaturas de 16 a 33ºC
(Salazar, 2001). Su amplia diversidad se expresa, por ejemplo, en la variedad de
formas y tamaños de las hojas, frutos y de los árboles mismos. Se desarrolla mejor
en suelos profundos, aunque también crece en suelos arcillosos, pesados y con
drenaje típicos de las sabanas sujetas a inundaciones frecuentes. Tolera suelos
6
bajos en nutrientes, es resistente y estimulada en su germinación por el fuego
(Botero et al., 2012; Lim, 2012).
I.2.2. DIVISIÓN TAXONÓMICA
CLASE: Equisetiopsida C. Agardh
SUBCLASE: Magnoliidae Nóvak ex. Takht
SUPERORDEN: Asteranae Takht
ORDEN: Lamiales Bromhead
FAMILIA: Bignoniaceae Juss
GÉNERO: Crescentia L.
NOMBRE CIENTÍFICO: Crescentia cujete L
(Herbario GUAY, 2016) I.2.3. DENOMINACIONES O SINONIMIAS
En el continente americano, se reconoce con diferentes nombres vulgares entre
los que están: Calabash, Calabash tree en Estados Unidos; Cujete, Cirián,
Tecomate, Guaje en México; Jícaro, Morro, Guacal, Calabacero totumo en
América Central, Higuero en Puerto Rico, Calabasa en Cuba, Taparo en
Venezuela, Mate, Pilche en Ecuador, Huingo en Perú, Cuite en Brasil (Salazar,
2001; Lim, 2012).
I.2.4. SINONIMIA BOTÁNICA
Crescentia acuminata Kunth; Crescentia angustifolia Willd. ex
Seem; Crescentia arborea Raf; Crescentia cujete var. puberula Bureau & K.
Schum; Crescentia cuneifolia Gardner; Crescentia ovata Burm.f; Crescentia
cuneifolia Gardner; Crescentia spathulata Miers; Crescentia fasciculata Miers
(Lim, 2012).
7
I.2.5. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
Es un árbol que alcanza una altura que oscila entre los 5 a 12 m y diámetros
de hasta 30cm. Su vida oscila entre los 100 y 200 años, presentan una forma
irregular, copa amplia y muchos intersticios entre las ramas, estas siguen un
patrón dicotómico en su tronco y a medida que crecen se dividen a su vez en dos.
Hojas simples, fasciculadas, de varios tamaños en cada fascículo, láminas
espatuladas a oblanceoladas de 5-20*3-6cm, base cuneada, ápice usualmente
obtuso hasta redondeado y corto-acuminado, cartáceas, 5-14 pares de venas
laterales, glabras. Inflorescencia caulinar, una flor solitaria, o en pares, pedicelos
lepídotos. Cáliz bajo bilabiado, verde. Corola gamopétala verde claro, 4-7*3-
4.5cm. Estambres 4, insertos. Ovario superior, ovoide, lepídoto, 1-locular (Jarquin
, 2012). Frutos globosos, indehiscentes, de 15 a 40cm de diámetro con un
pericarpio duro y abundante pulpa cuyo interior rodea numerosas semillas
(Salazar, 2001).
I.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA
Según estudios de Espitia et al., (2011), revelan la presencia de lapachona,
ácido gentísico, saponinas y 1,4-naftoquinonas, esta última con actividad
citotóxica. La pulpa del fruto con la semilla triturada contiene un 14% de proteína
y un 60% de carbohidratos (Botero et al., 2012). Recalde (2015) menciona que la
pulpa cruda del fruto de C.cujete L. contiene ácidos orgánicos como el cianhídrico,
clorogénico, cítrico, crescéntico, tánico, tartárico y alcaloides cuaternarios,
polifenoles y cromóforos lipófilos.
El tamizaje fitoquímico de las hojas y tallo demuestra alcaloides cuaternarios,
esteroles insaturados y polifenoles. Las hojas contienen ácido caféico. La madera
contiene naftoquinonas (Recalde, 2015). El estudio fitoquímico preliminar mostró
la presencia en el fruto de alcaloides cuaternarios y polifenoles. Como se indica
en la tabla Nº I, realizado en la hoja, se demostró que contiene diversos grupos de
compuestos cuya relación varía dependiendo del extracto utilizado (TRAMIL,
2005).
8
(TRAMIL, 2005)
Existe también la presencia de terpenos: α y ß-amirina, ß-sitosterol,
estigmasterol, asperulósido, aucubina, plumierida; bencenoides: ácido gentísico-
3-hidroxi metil-diona; alcanos: triacontanol (TRAMIL, 2005).
En cuanto a las semillas, (Espitia-Baena et al., 2011; Recalde, 2015) señalan
que éstas contienen un 37% de aceite fijo parecido al aceite de oliva, que está
constituido por ácidos oleico 59.4%, linoléico 19.3% y saturados 19.7%. Luna
(2007) menciona que aproximadamente en el aceite de mate, el 52 % corresponde
a ácido oleico, 17 % a ácido linoléico, 16 % a ácido palmítico y 10,6 % es ácido
esteárico; otros constituyentes de la semilla son azúcares, ácido crescéntico, b-
sitosterol, estigmasterol, glucósidos iridoides como la asperulosida y la plumierida.
I.3.1. ÁCIDOS GRASOS
Los ácidos orgánicos monocarboxílicos con estructura de cadena lineal, forman
parte de otros lípidos unidos casi siempre por medio de enlaces éster, y rara vez
amida (Luna, 2007). Tiene estructura de cadena lineal anfipática con un extremo
polar carboxilo y una cadena apolar que finaliza con un grupo metilo (Argüeso et
al., 2011). Según la naturaleza de la cadena carbonada, los ácidos grasos pueden
ser saturados o insaturados, lineales, ramificados o alicíclicos, y pueden contener
como sustituyentes grupos hidroxilo u oxo (Luna, 2007).
Tabla Nº I. Compuestos obtenidos en la hoja
Extracto Esteroide
triterpeniode
Cumarina
flavónica
Heterósido
flavónico
Compuesto
fenólico
Éter de
petróleo + - - -
Cloroformo + - - -
Etanol 90% + - ++++ ++
Infusión ++
9
Tabla Nº II Ácidos grasos monoinsaturados
Por razones de biosíntesis, en los organismos superiores sólo existen ácidos
grasos con un número par de átomos de carbono y en función de ese número se
clasifican como indican las Tabla Nº II, III y IV ácidos grasos de cadena corta (≤
10 átomos de carbono), de cadena media (12 o 14) y de cadena larga (≥16). Según
la presencia o no de dobles enlaces en su cadena, se habla de ácidos grasos
saturados cuando carecen de ellos, monoinsaturados cuando tienen un doble
enlace, y poliinsaturados cuando tienen al menos 2 dobles enlaces (Argüeso et al,
2011).
Los más abundantes son por lo general, los ácidos grasos lineales, con número
par de átomos de carbono, generalmente superior a 12 e inferior a 24. Son
frecuentes las cadenas insaturadas con enlaces dobles en cis, como el oleico, 9-
octadecenoico, o el linoléico, 9,12-octadecadienoico (Luna, 2007). Según la
posición del último doble enlace respecto al último átomo de carbono como indican
las Tablas Nº II y III, los ácidos grasos insaturados se clasifican en w3, w6, w7 y
w9. Por reacciones multienzimáticas los ácidos grasos insaturados pueden
transformarse entre sí, aunque los mamíferos carecen de enzimas desaturasa que
permitan incluir dobles enlaces en las posiciones w3 y w6 ,por lo que los ácidos
grasos de esas dos series no son interconvertibles entre sí en el hombre y sus
precursores, siendo así incorporados en la dieta (Argüeso et al, 2011).
Ca
de
na
La
rga
Nombre Símbolo y estructura Características y
procedencia
Oleico
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) cis; w9
Líquido, más
abundante en el ser
humano; presente
en oliva, aguacate
Elaídico
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) trans; w9 Semilíquido.
Hidrogenación del
ác. oleico, presente
en margarinas
(Argüeso et al, 2011)
10
Tabla Nº IV Ácidos grasos poliinsaturados
Tabla Nº III Ácidos grasos saturados
Nombre Símbolo y estructura Características y procedencia
Ca
de
na
co
rta
Capróico CH3(CH2)4COOH Líquido, incoloro y
viscoso. Grasas y aceites vegetales.
Caprílico
CH3(CH2)6COOH
Leche de mamíferos, aceite de coco y palma.
Ca
de
na
me
dia
Laúrico CH3(CH2)10COOH Sólido, aceite de semilla
de palma y coco, leche humana, vaca y cabra.
Mirístico CH3(CH2)12COOH
Líquido, incoloro, manteca de nuez moscada, aceite de palma y ballena.
Ca
de
na
larg
a
Palmítico CH3(CH2)14COOH
Sólido, blanco, presente en carnes, lácteos y aceites de coco y palma.
Esteárico CH3(CH2)16COOH
Sólido de aspecto céreo, presente en grasas y aceites vegetales y animales.
Nombre Símbolo y estructura Características y procedencia
Ca
de
na
larg
a
Linoléico
HOOC(CH2)7CH=CH–CH2CH=CH(CH2)4CH3
Ác. Graso esencial, presente en semillas de girasol, soja, huevos, aves de corral.
Docosapent
aenoico (DPA)
HOOC(CH2)5CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH3
Leche de mamíferos, aceite de coco y palma.
Eicosapentaenoico (EPA)
HOOC(CH2)3CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH=CH-CH2CH3
Aceite de pescado
α-Linolénico
HOOC(CH2)7CH=CH-CH2CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH3
Ác. Graso esencial, presente en pescado, semillas de lino y grasa animal
(Argüeso et al, 2011)
(Argüeso et al, 2011)
11
I.3.2 ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS PARA ACEITES VEGETALES
El análisis de las propiedades fisicoquímicas de los alimentos es uno de los
aspectos principales en el aseguramiento de su calidad. Este análisis cumple un
papel muy importante en la determinación del valor nutricional de los alimentos,
en el control del cumplimiento de los parámetros exigidos por los organismos de
salud y también para el estudio de las posibles irregularidades como
adulteraciones, falsificaciones, etcétera. Tanto en alimentos terminados como en
sus materias primas (Uriel, 2012).
Las grasas y los aceites son triglicéridos con diferentes composiciones de las
cadenas de alquilo en función de su origen (Salimon et al., 2012). La identificación
de las características fisicoquímicas del aceite tiene una importancia práctica y
proporciona las bases para la calidad e idoneidad de los aceites (Barkatullah et
al., 2012), en particular las cualidades físicas y el valor nutricional (Angaye et al.,
2015).
La composición química proporciona información sobre el contenido total de
ácidos grasos saturados e insaturados, que a menudo se utilizan como
indicadores de calidad para determinar la estabilidad y la oxidación de grasa y
aceite (Ogungbenle, 2014). Los aceites que contienen ácidos grasos insaturados,
son más deseables como alimentos y sirven para reducir niveles de colesterol en
suero sanguíneo. (Ogungbenle et al., 2015).
I.4. ACTIVIDAD BIOLÓGICA
1.4.1. USO MEDICINAL
El totumo en la medicina se emplea para diferentes infusiones: el extracto
hidroalcohólico (95%) de hoja (5 mg/mL) presentó una actividad antimicrobiana in
vitro contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus. La maceración
hidroalcohólica de hoja inhibió el crecimiento in vitro de Salmonella typhi. El
12
extracto etanólico de hoja y tallo mostró acción antibacteriana in
vitro contra Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus y Escherichia coli (TRAMIL, 2005). Las hojas se usan para tratar
problemas de hipertensión (Botero et al., 2011),
La pulpa cruda se consume como un antiparasitario y cocida se utiliza para
quitar la sarna a los perros y caballos (Álvarez Henao, 2010), y se ingiere para
tratar la diarrea, dolor de estómago, resfriados, bronquitis, tos, asma y uretritis
(Botero et al., 2011). En 2008, en Colombia se publicó el listado de plantas
medicinales aprobadas con fines terapéuticos por el INVIMA, donde se permite el
uso del jarabe con extracto de pulpa del fruto fresco como coadyuvante en el
tratamiento de trastornos respiratorios leves (Espitia-Baena et al.,2011).
Según un estudio realizado en el noroeste de Colombia por Otero et al., (2000)
sobre la capacidad neutralizante de extractos de plantas contra el efecto
hemorragico del veneno de Bothrops atrox, indica que el extracto del fruto
inmaduro de C.cujete L, presenta una moderada actividad antihemorrágica en
dosis de 4mg/ratón. La pulpa de fruto inhibió el crecimiento de cepas
de Streptococcus pneumoniae (TRAMIL, 2005).
En la ganadería se lo ha estado implementando como suplemento y fitofármaco
para tratar la mastitis, los golpes de los animales y la retención placentaria debido
a su efecto abortivo (Botero et al., 2012).
I.4.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
El estudio de la capacidad antioxidante de las plantas medicinales y
alimenticias ha crecido en las últimas décadas ya que un número importante de
productos obtenidos de éstas, como los aceites, alcaloides y los polifenoles,
poseen efectos antioxidantes, los cuales son evidenciados mediante diferentes
ensayos in vitro e in vivo (Rivas et al., 2016).
13
Los antioxidantes son compuestos que pueden inhibir o retardar la oxidación
de otras moleculas como lípidos ,proteínas y ácidos nucleicos (Angulo, 2014),
inhabilitando la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los
radicales libres (Rivas et al., 2016).
Pueden actuar de las siguientes formas:
Previniendo la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO).
Interceptando ataque de ERO.
Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndose en moléculas menos
reactivas.
Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de
ERO.
Facilitando la reparación del daño causado por ERO.
Manteniéndose un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.
(Martinez, 2011).
I.4.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO POR EL MÉTODO DEL DPPH
El ensayo consiste en determinar la capacidad capturadora del radical libre
estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) del aceite siguiendo el procedimiento
propuesto por Brand-Williams y col., (1995).
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), es un radical libre estable, el cual disuelto
en un alcohol como etanol o metanol tiene una coloración azul-violeta. En
presencia de un antioxidante el DPPH es convertido a 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
con un color amarillo (Cervato y col, 2000).
14
En su forma de radical libre, el DPPH• absorbe a 515 nm - 517 nm y cuando
sufre reducción por un antioxidante, esta absorción desaparece. En consecuencia,
la desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la capacidad del
compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la actividad
de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuación:
Donde AH es un antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de
hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares neutras
que detendrán la reacción en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical
formado (A∙) puede interactuar con otro radical para formar moléculas neutras
(DPPHA, A-A). La reacción entre el DPPH• y un compuesto depende de la
conformación estructural del mismo, por lo que las comparaciones cuantitativas
no siempre son apropiadas (Martínez, 2011).
Los resultados de este método son expresados en IC50, el cual se define como
la concentración necesaria de muestra para reducir el 50% de la cantidad inicial
de DPPH y se expresa como la relación molar de cada componente por radical.
Los niveles bajos de IC50 indican alta eficacia en la donación de hidrógeno (Silva
y col., 2000).
Figura 1. Estructura del DPPH antes y después de la reacción antioxidante
(Tovar, 2013).
15
Desde el punto de vista metodológico, el DPPH es un método fácil y exacto
para la medición de actividad antioxidante en frutas y verduras por lo que es
recomendado para medir la actividad antioxidante en este tipo de muestras (Gil y
col., 2000).
Este método presenta también la ventaja de ser una prueba no enzimática y es
utilizado para proveer información básica en la reactividad de compuestos para el
secuestro de radicales (Silva y col., 2000).
I.5. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA PARA ACEITES
COMESTIBLES
1.5.1. DENSIDAD RELATIVA A 25/25°C, (D25)
Es la relación entre la masa de un volumen dado de una sustancia y la masa
de un volumen igual de agua en las mismas condiciones de presión y temperatura
a 25°C para aceites. La densidad relativa es un número abstracto. (Norma INEN
035, 1973-08).
1.5.2. DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO
La determinación exacta de humedad es difícil, pero en los alimentos es de
gran importancia, el porcentaje de humedad en alimentos es menor en relación al
de las frutas y verduras; Incluso en los aceites existe una pequeña cantidad de
agua. Es muy importante determinar la humedad ya que sirve para conocer en
qué proporción se encuentran los nutrientes, además indica la estabilidad de los
alimentos (Recalde, 2015).
Ayuda a determinar el contenido de humedad y otras sustancias volátiles. Se
calienta el producto a 103 °C hasta eliminar completamente la humedad y las
materias volátiles (Norma INEN 039, 1973-08).
1.5.3. ÍNDICE DE YODO
16
En condiciones normalizadas, los glicéridos de los ácidos grasos insaturados
presentes en el aceite, se unen con una cantidad definida de halógeno, contenida
en la solución de Wijs, de monocloruro de Yodo. El índice de Yodo esta
correlacionado con el índice de refracción y densidad. El grado de absorción se
estima valorando el yodo en exceso con sustancias halogenadas (Rodriguez,
2013).
Es una medida del grado medio de insaturación de ciertas sustancias
orgánicas, expresada como centigramos de yodo absorbidos, bajo condiciones
determinadas, por cada gramo de sustancia (Norma INEN 037, 1973-08).
1.5.4. ÍNDICE DE PERÓXIDO
Con la medida de este parámetro, se estima el grado de oxidación inicial del
aceite, indica igualmente el deterioro que se puede haber dado en compuestos
antioxidantes, como polifenoles y tocoferoles, se expresa en miliequivalentes de
oxígeno activo por kilogramo de grasa (Norma INEN .0277, 1978-02).
Es la medida de peróxidos contenidos en el aceite. Durante el almacenaje la
formación de peróxidos es baja durante el periodo inicial. Pero puede variar en
unas pocas semanas o algunos meses, de acuerdo al aceite o grasa en particular,
la temperatura, etcétera y esto debe tomarse en cuenta, cuando se interpretan los
resultados cuantitativos (Velez de Aviles, 1998).
1.5.5. ACIDEZ
La acidez de los aceites, determina el porcentaje expresado en ácido oleico de
ácidos grasos libres de un aceite, expresado convencionalmente como gramos de
ácido oleico, laúrico o erúcico por cada 100 g de sustancia (Norma INEN 038,
1973-08).
La presencia de ácidos libres en una grasa, es la consecuencia de
fermentaciones, frutos en mal estado sanitario, frutos caídos al suelo, frutos
17
atrojados, etc., de procesos de transformación de fruto incorrectos (Jiménez,
2011).
1.5.6. ÍNDICE DE ACIDEZ
Es el número de miligramos de hidróxido de potasio requeridos para neutralizar
los ácidos grasos libres contenidos en 1 gramo de grasa o aceite (Norma INEN
038, 1973-08).
1.5.7. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN
Es el número de miligramos de hidróxido de potasio (KOH) requeridos para
saponificar 1 gramo de grasa o aceite (Norma INEN 040, 1973-08).
I.6. CROMATOGRAFO DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRO
DE MASAS (GCMS)
La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad de
conseguir la separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados,
detectados, e incluso cuantificados todos los componentes individuales de una
muestra problema, el único dato del que se dispone para la identificación de cada
uno de ellos es el tiempo de retención de los correspondientes picos
cromatográficos. Este dato no es suficiente para una identificación inequívoca,
sobre todo cuando se analizan muestras con un número elevado de componentes,
como es frecuente en cromatografía de gases (Gutiérrez et al., 2002).
Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi
inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar
los componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus
componentes, debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por
superposición de los picos de cada componente (Gutiérrez et al., 2002).
18
La unión GC-MS es sumamente propicia, sinérgica, ya que los compuestos
aptos para el análisis tanto por GC como por MS con impacto de electrones (EI,
técnica de ionización de las moléculas más usada en GC-MS), son moléculas con
temperaturas de ebullición, pesos moleculares o polaridades bajos o medianos,
presentes en mezclas en el rango de concentraciones (ppb– ppm) similar para
ambas técnicas. Además su análisis transcurre en el mismo estado de agregación
(fase vapor) (Stashenko & Martínez , 2010).
En principio, se trata de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan
una muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por lo que son muy
compatibles (Gutiérrez et al., 2002).
19
II.1. METODOLOGÍA
En el presente trabajo de titulación, se emplearon alrededor de 30 frutos de
mate o totumo con un rendimiento de 250–500 semillas por fruto, proveniente de
la ciudadela: La Kennedy en la Avenida San Jorge de la ciudad de Guayaquil,
provincia del Guayas. Estas semillas obtenidas se secaron y se procedió a la
extracción de aceite de las semillas por el método de Soxhlet con el empleo de n-
hexano como disolvente. La especie fue identificada en la facultad de Ciencias
Naturales, en el Herbario Guay y el número de herbolización asignado fue: 015
(ver Anexo 1).
Para determinar las características fisicoquímicas del aceite, se realizaron los
respectivos análisis, en los Laboratorios de Productos Naturales y PROGECA de
la Facultad de Ciencias Químicas. Para este estudio el material vegetal se
subdividió en 12 grupos de 40 g cada uno y fueron extraídos por Soxhlet por un
tiempo aproximado de 3 a 4 horas. Se realizó una investigación de tipo
experimental.
II.2. EXTRACCIÓN DE ACEITE
Las semillas colectadas fueron lavadas y secadas en estufa MEMMERT a 40°C
antes de ser empleadas. Una vez secadas fueron molidas con el empleó de un
molino manual para grano Toolcraft Tc2541 con un tamaño de tamiz de 500 mm.
Para la extracción se empleó un equipo Soxhlet en el cual se colocó un dedal con
el polvo de las semillas (40 g) pesado en balanza de precisión marca BOECO
(Alemania). En cada proceso de extracción se utilizaron 250 mL de n-hexano, que
después de trascurrido entre tres o cuatro horas fue concentrado en
rotaevaporador Heidolph. Se realizó 12 veces el experimento.
FÓRMULA
%𝑅 =𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝐿)
𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔)∗ 100
R: Rendimiento expresado el porcentaje
V: Volumen del aceite fijo obtenido en mL
P: Peso de semillas empleado
20
II.3. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO
Los métodos empleados en esta fase experimental fueron basados bajo la
norma técnica ecuatoriana INEN para Grasas y aceites comestibles.
II.3.1. DENSIDAD RELATIVA A 25/25°C, (D25)
El ensayo se realizó por triplicado.Pesa el picnómetro limpio y seco con tapa
en balanza Analítica BOECO, el picnómetro con agua al ras con tapa . pesó la
muestra en el picnometro previamente seco y con tapa,calcular.
FÓRMULA
𝑑 =𝑚2 − 𝑚
𝑚1 − 𝑚
II.3.2. DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO
Se pesó la cápsula de vidrio vacía en la balanza analítica, luego se pesó de 2-
3 g de muestra en la cápsula de vidrio en la balanza analítica KERN. Se llevó a
la estufa MEMMERT a temperatura de 105ºC por 2 horas, luego se sacó de la
estufa la cápsula, se dejó enfriar y se pesó la cápsula con la muestra. Este ensayo
se realizó por triplicado pero reduciendo el período de calentamiento a 30 min,
hasta que la diferencia entre los resultados de dos operaciones de pesaje
sucesivas no exceda de 0,002 g.
FÓRMULA
P =m1 − m2
m1 − m∗ 100
m1: picnómetro con agua
m2 : picnómetro con muestra
m: picnómetro vacío
p: pérdida por calentamiento, en porcentaje de masa
m: masa del cristalizador, en gramos (g)
m1: masa del cristalizador, con muestra, antes del
calentamiento, en (g)
m2: masa del cristalizador, con muestra, después del
calentamiento, en (g)
21
II.3.3. ÍNDICE DE YODO
En una fiola de 125 mL se pesó de 0.5-1 g de muestra en balanza analítica
KERN, se disuelve en 10 mL de cloroformo y se añade con pipeta volumétrica 25
mL de reactivo de Wijs, se deja en una gaveta para proteger de la luz por 30
minutos, agitando de vez en cuando; en la misma forma, se procedió con un
blanco. Transcurrido el tiempo indicado, se lo sacó de la gaveta y se añadió 10
mL de solución de yoduro de potasio a 15% y 100 mL de agua destilada. Se tituló
inmódicamente con la solución de tiosulfato de sodio 0.1N, utilizando solución
reactiva de almidón, como indicador final de la titulación. Se agitó el líquido del
frasco enérgicamente mientras se tituló. Con el objeto de que reaccione el yodo
que pueda hallarse disuelto en el cloroformo. Simultáneamente, se procedió a
titular el blanco.
FÓRMULA
I1 =0.127∗(V−V1)∗N
Peso de la Muestra *100
II.3.4. ÍNDICE DE PERÓXIDO
En una fiola de 125 mL con un tapón de vidrio se pesó 5.00 ± 0.05 g de muestra
de aceite en balanza analítica KERN. Se agregó 30 mL de solución de ácido
acético–cloroformo, luego se agitó para disolver la muestra. Se Agregó 0.5 mL
de solución saturada de ioduro de potasio KI y se dejó que la solución repose,
agitando ocasionalmente 1 minuto exacto y luego se agregó inmediatamente 30
mL de agua destilada. Se realizó la titulación con tiosulfato de sodio 0.1N,
acondicionándolo gradualmente, agitando constantemente hasta que el color
amarillo casi desaparezca. Se agregó 0.5 mL de la solución de almidón, y se
continuo la titulación con agitación. Cerca del punto final se agregó el tiosulfato
en gotas hasta que desaparezca el color azul. Finalmente se hizo una
determinación con un blanco. La titulación no debe exceder 0.1 mL de la solución
de tiosulfato de sodio 0.1N.
22
FÓRMULA
I =Consumo TioSulfato ∗ N Tiosulfato
Peso de la Muestra∗ 1000
II.3.5. ACIDEZ
En una fiola se pesó la fiola en balanza analítica KERN, tarar y luego pesar 5g
de muestra. Añadir 20 mL de alcohol neutro y 20 mL de Dietil éter. Agitar y añadir
2-3 gotas de solución indicadora Fenolftaleína. Proceder a titular con Hidróxido de
Sodio 0.1N hasta aparición de color rosado.
FÓRMULA
A =Consumo Na(OH) ∗ N Na(OH) ∗ Peso Molecular en mLeq Ác. Graso
Peso de la Muestra∗ 100
II.3.6. ÍNDICE DE REFRACCIÓN
En el refractómetro THERMO Electron Corporation, se limpió con alcohol la
superficie donde se agrega la muestra, luego se agregó una gota de muestra en
el Refractómetro a 25 ˚C y anotar la medida. Realizar prueba por triplicado.
II.3.7. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN
Se pesó alrededor de 3g en balanza analítica BOECO GERMANY, dentro de
un frasco Erlenmeyer de 250 mL de capacidad. Agregue cuidadosamente por
medio de una pipeta volumétrica, 25 mL de una solución alcohólica de 0.5 N de
KOH. Calentar en baño María por 30 minutos o hasta que la muestra esté
totalmente homogenizada que indica que está totalmente saponificada, dejar
enfriar. Agregar 1mL de solución indicadora de fenolftaleína y se titula el exceso
de álcali con solución 0.5 N de HCl. Realizar determinación en blanco y muestra
por triplicado.
23
FÓRMULA
SAP =56.1 (V1 − V2) ∗ N
m
II.3.8. CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS
Se pesó 30 mg muestra en una balanza analítica BOECO (Alemania), se
agregaron 3 mL de cloruro de acetilo al 10 % en metanol (disolución metilante).
Se cerró herméticamente y se calentó a 85 °C por 2 h con agitación vigorosa
ocasional. Al cabo de ese tiempo se llevó a temperatura ambiente, se adicionaron
4 mL de n˗hexano y 4 mL de agua destilada. Agitar en una zaranda por 15 min y
dejar reposar. De la fase orgánica (superior) se extrajeron 3 mL hacia otro tubo de
ensayo, se le adicionaron 4 mL de n˗hexano y 4 mL de NaOH a 1 mol/L en
metanol, se cerró y se agitó en zaranda durante 15 min. Se dejó reposar y
extrajeron 2 mL de la fase orgánica, de la cual se tomó 1 µL para el análisis por
cromatógrafo de gases (Shimadzu, Japón) GCMS-QP2010 Plus, equipado con un
detector selectivo de masas, serie QP2010. La inyección de la muestra se realizó
manualmente por el modo “split” con una relación de 1:20, siendo la temperatura
del inyector 250 °C. La separación se realizó en una columna capilar Crossbond
de 30 m × 0,25 mm DI y 0,25 µm de espesor de película. La temperatura del horno
se programó a 100 °C (3 min), 250 °C (10 min) y 280 °C hasta completar los 30
min. Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 1 mL/min. El espectrómetro
de masas fue operado en el modo de ionización electrónica (IE) a 70 eV y con una
temperatura de la fuente iónica e interfase de 280 °C. La detección se realizó en
el modo de barrido total desde 30-500uma. Las estructuras de los ácidos grasos
fueron propuestas sobre la base del proceso de fragmentación general así como
por la base de datos NIST 21, con más un 93 % de confiabilidad en todos los
SAP: índice de saponificación del producto, en
mg/g
V2: volumen de solución de ClH o H2SO4
empleado en la titulación de la muestra, en mL
V1: volumen de solución de ácido clorhídrico o
sulfúrico empleado en la titulación del ensayo en
blanco, en mL
N: normalidad de la solución de ácido clorhídrico o
sulfúrico.
m: peso de la muestra, en g
24
casos. La cuantificación de los compuestos fue realizada por normalización
interna del área bajo la curva de cada pico cromatográfico (Indarti et al., 2005).
II.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO POR EL MÉTODO DEL DPPH
El ensayo consistió en determinar la capacidad capturadora del radical libre
estable 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) del aceite siguiendo el procedimiento
propuesto por Brand-Williams y col., (1995).
Para la preparación del estándar Trolox se emplea metanol a partir de una
solución madre de 2 mM y posteriores disoluciones, de 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 y 0,9 mM
en metanol, para preparar la curva patrón. La absorbancia se mide con cubetas
de vidrio estándar de 10 mm a 515 nm en Espectrofotómetro UV-VIS modelo
4001/4. La absorbancia característica de este radical que posee un color violeta
intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (que sea capaz de capturar
un electrón libre) u otro radical, lo que permite cuantificar la capacidad capturadora
de radicales libres que poseen ciertos compuestos mediante la determinación del
grado de decoloración que provoca a una solución metanólica de DPPH (Brand-
Williams y col., 1995).
Muestra:
El aceite (2 mL) se mezcló en metanol en proporción 1:1 V/V, se agitó durante
una hora y se centrifuga a 2500-3000 rpm durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Del extracto obtenido se tomó 100 µL y se diluyeron en proporciones
con metanol de 1:1, 1:2 y 1:3 hasta lograr una absorbancia dentro del rango de
linealidad. Las lecturas del Trolox y los aceites se realizaron por triplicado de
manera cinética hasta 30 minutos (cada 10 minutos) para comparar las
velocidades de reacción.
25
III. 1. EXTRACCIÓN DE ACEITE
El rendimiento del aceite fijo en la extracción por Soxhlet fue de 36,57 ± 1,21
%. El valor obtenido en la fase experimental fue superior a otros reportes de la
literatura como por ejemplo 19,31 %, Luna (2007) y 28,12 % López et al. (2015).
Este resultado sugiere que la extracción por Soxhlet es un método eficiente de
extracción de aceites vegetales, con la ventaja de que los mismos pueden ser
obtenidos en cortos períodos de tiempo. El tiempo promedio de extracción fue de
3 horas.
III.2. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO
III. 2.1. DENSIDAD RELATIVA
El valor obtenido fue de 0.9045 g/mL, valor mayor a los obtenidos por Luna
(2007), siendo estos resultados de 0.8874 g/mL y 0.8876 g/mL. También es
comparable a otros de usos alimenticios e industriales como el aceite de soya
(Glycine max L.) con una densidad de 0.919g/mL, el aceite de maní (Arachis
hypogaea L.) con 0.914g/mL y el aceite de oliva (Olea europea L.) refinado con
0.910g/mL.(Stevenson et al., 2007; Sakouhi et al. 2008; Russo et al., 2012).
III.2.2. PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO
El ensayo dio como resultado un valor de 1.38 %, dicho valor resulta de la
pérdida de agua y materias volátiles presentes en la muestra.
III. 2.3. ÍNDICE DE REFRACCIÓN
El índice de refracción dio un valor de 1.46 a 25ºC, valores similares a los
obtenidos por Luna (2007) del aceite de mate obtenidos de dos regiones
Estanzuela y San Agustín, Guatemala, dando 1.46 a 25°C en ambos casos. En
relación con otros tipo de aceites, como el aceite de oliva cuya especificación dada
en la NTE INEN 29:2012 es de 1,466 -1,4685 a 25 ºC y los resultados dados por
Navas, (2010), del aceite de uva de 1.453 a 25°C.
26
III.2.4. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN
El valor promedio obtenido en el ensayo fue de 191.39 mg KOH/g, en
comparación a los valores obtenidos por Luna, (2007) que fueron de 174.78 mg
KOH/g muestra y 179.90 mg KOH/g muestra respectivamente. Según el Codex
Alimentarius para el aceite de oliva, el índice de aceptabilidad oscila de 184 mg
KOH/g -196 mg KOH/g.
III. 2.5. ACIDEZ
El valor promedio obtenido en este ensayo de ácido graso libre fue de 1.314
expresado como g de ácido oleico por cada 100 g de aceite fijo, debido a que éste
ácido graso predomina en la muestra. Siendo éste un valor mayor a los datos
obtenidos por Luna, (2007) de 0.065 % y 0.090 % en aceite de semilla de mate.
En comparación con el aceite de oliva el Codex Alimentarius, especifica un
valor máximo de 2,0 % para aceite de oliva virgen y 3,3 % para aceite de oliva
común.
III.2.6. ÍNDICE DE PERÓXIDO
El valor promedio obtenido en este ensayo fue de 3,997 meq O2/Kg ± 2.081*10-
3%, siendo un resultado superior en comparación a los valores obtenidos por Luna
(2007) de 0.43 y 0.80 meq O2/Kg ,encontrándose dentro de las especificaciones
establecidas por el Codex Alimentarius para aceites comestibles siendo aceptable
hasta 15 meq O2/Kg de aceite.
Comparada con otro tipo de aceite como el de sacha inchi, Martinez, (2011)
obtuvo 11,5313 meq O2/Kg, siendo un valor mayor al obtenido del aceite de mate.
La NTE INEN 29:2012 para aceite de oliva indica que debe tener un valor
máximo de10 y 20 meq O2/1Kg, dependiendo de la clase de aceite de oliva.
27
III.2.7. INDICE DE YODO
El valor promedio obtenido en este ensayo fue de 120,97 mg/100g aceite.
Resultado superior a los valores obtenidos por Luna (2007) de 90.95 mg/100g
aceite y 89.32 mg/100g aceite. En comparación con otro tipo de aceite como el
de girasol el Codex Alimentario establece un rango de 118-141mg/100g,
encontrándose dentro de este rango.
El valor obtenido es superior a los permitidos por la NTE INEN 29:2012 para
aceites de oliva siendo estos de 79 mg/100g aceite – 89 mg/100g aceite.
III.2.8. CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS
Como se muestra en la Tabla N° V, los ácidos insaturados son los principales
componentes del aceite, siendo el éster metílico del ácido oleico (63,9%) el
componente mayoritario, seguido del éster metílico del ácido palmitoleico (16,7%).
En general, el contenido de ácidos grasos insaturados sobrepasa el 80%, de
los cuales 77,97% corresponde a ácido oleico. Los ácidos grasos saturados en
conjunto constituyen el 17,61% del total y el éster del ácido esteárico constituye el
74,38%.
Los aceites que contienen más cantidad de ácidos grasos insaturados, son más
deseables como alimento y pueden ser utilizados en la reducción de colesterol
(Ogungbenle & Afolayan, 2015). Espitia-Baena et al., (2011) informan un
contenido de un 20% de aceite en las semillas y como componente mayoritario al
ácido oleico con un 52%. En este reporte no se establece las condiciones de
extracción, ni la forma en que fue evaluada la composición química.
28
Tabla N° V Composición de ácidos grasos (%) del aceite de C. cujete.
PICO TIEMPO DE RETENCIÓN
NOMBRE %
1 3.857 Estireno 0,02
2 20.773 n-Pentadecanoato de metilo 0,03
3 21.371 Éster metílico del ácido Palmitoleico (C16:1) 16,74
4 21.556 Éster metílico del ácido palmítico (C16:0) 0,26
5 21.791 Ácido palmítico (C16:0) 0,04
6 22.148 Éster metílico del ácido margárico (C17:0) 0,25
7 22.720 Éster metílico del ácido oleico (C18:1) 63,92
8 22.835 Éster metílico del ácido esteárico (C18:0) 13,31
9 22.905 Ácido oleico (C18:1) 0,72
10 23.045 Ácido esteárico (C18:0) 0,33
11 23.229 Ácido linoléico (C18:2) 0,10
12 23.299 Ácido behénico (C22:0) 0,10
13 23.496 Éster metílico del ácido nonadecanoico (C20:0) 0,10
14 24.107 Ácido Cis-13-eicosenoico (C20:1) 0,44
15 24.336 Ácido araquídico (C20:0) 1,91
16 25.055 Ácido lignocérico (C24:1) 0,05
17 25.360 Éster metílico del ácido heneicosanoico (C21:0) 0,10
18 26.270 Ácido pentacosanoico (C25:0) 0,22
19 26.665 Éster metílico del ácido behénico (C22:0) 0,66
20 27.810 Ácido cerótico (C26:0) 0,06
21 28.325 Éster metílico del ácido tricosanoico (C23:0) 0,06
22 29.801 Ácido montánico (C28:0) 0,07
23 30.494 Éster metílico del ácido tetracosanoico (C24:0) 0,38
29
III.3. ENSAYO DPPH
En la literatura consultada no se encontró información sobre capacidad
antioxidante in vitro para aceites obtenidos a partir de especies de C. cujete L.
Para poder establecer una comparación de estos resultados se consideró el
procedimiento de extracción empleado en esta investigación.
La selección del Trolox como sustancia de referencia en este estudio se debió
en primer lugar a su uso reiterado en estos ensayos, a la estabilidad química de
la molécula y la disponibilidad en el laboratorio. En la tabla N° VI se presentan los
resultados obtenidos para el análisis de linealidad por el método de Lambert-Beer
a una longitud de onda de 515 nm.
TABLA N° VI. Relación entre la concentración del blanco estandarizado
Trolox y la absorbancia (Tabla Patrón)
Conc (Trolox) A(515nm) A(515nm) A(515nm) Promedio
0,1 0,146 0,143 0,147 0,145
0,3 0,302 0,298 0,304 0,301
0,5 0,458 0,453 0,460 0,457
0,7 0,613 0,607 0,617 0,613
0,9 0,769 0,762 0,773 0,768
El análisis estadístico de la recta de absorbancia contra concentración se presenta
en la figura 2.
Figura 2. Curva de regresión lineal obtenida del Trolox
y = 0,8923x + 0,0262R² = 0,9863
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9 1
AB
SOR
BA
NC
IA
CONCENTRACIÓN
30
La significación del modelo dio una p˂ 0,05 y un R2 de 0,9863. Este valor de
R2 demostró que la recta tuvo un buen ajuste en el rango de concentración de
Trolox (0,1 a 0,9 µM). Valores semejantes han sido reportados en otros estudios
con esta sustancia de referencia: R2= 0,919, (Upadhya et al., 2015) y R2= 0,992,
(Parikh et al., 2017).
El aceite se procesó según se indicó en el acápite II.4, por lo tanto se obtuvo el
comportamiento de la capacidad de captar radicales libres en tres valores de
concentración como se muestra en la Tabla Nº VII.
TABLA N° VII. Datos de la Absorbancia del Blanco y de la Muestra
Dilución Absorbancia Media: A(515) m Dif. Blanco
1:1
0,526
0,526 0,450 0,521
0,531
1:2
0,401
0,408 0,332 0,412
0,411
1:3
0,207
0,21 0,134 0,211
0,212
BLANCO 0,0768
A partir de los valores de absorbancia obtenido se calculó el porcentaje de
inhibición según la siguiente ecuación:
%DPPH:D. O. m − D. O. b
D. O. DPPH∗ 100
1) %DPPH:0.526−0.076
0.768∗ 100 ∶ 𝟓𝟖. 𝟓𝟗𝟒%
2) %DPPH:0.408−0.076
0.768∗ 100 ∶ 𝟒𝟑. 𝟐𝟐𝟗% (Valor más cercano al 50%)
3) %DPPH:0.21−0.076
0.768∗ 100 ∶ 𝟏𝟕. 𝟒𝟒𝟖%
31
Como se puede deducir de los resultados en el aceite fijo extraído de las
semillas del mate hay capacidad de capturar radicales libres, lo cual le da a este
aceite vegetal un valor agregado. Como se pudiera esperar de una sustancia con
capacidad antioxidante en la medida que disminuye la concentración disminuye la
capacidad de inhibición de la recaptura de radicales.
En la dilución 1:2 se obtuvo el valor más cercano al 50 % de inhibición por lo
que fue utilizada para calcular el valor del IC50. La absorbancia promedio a esta
dilución fue de 0,408 lo que equivale a 0,428 µM de Trolox según la ecuación de
la recta:
𝐀𝐛𝐬 = 0,8923 x Concentración (trolox) + 0,0262
Considerando que el valor de densidad relativa del aceite es 0,9045 g/mL
entonces 2 mL pesan 1,809 g. Es decir, que la capacidad antioxidante del aceite,
según la metodología realizada, corresponde a 0,236 µM Trolox/g de aceite o
como más comúnmente se expresa 236,5 µM Trolox/Kg de aceite. Este resultado
sugiere una buena capacidad antioxidante comparable con otros aceites de uso
humano. Por ejemplo el aceite de oliva en condiciones de procesamiento similares
presenta en este ensayo de DPPH un valor de 409.78 µmol Trolox/ Kg de aceite
y hasta un valor de 779.14 µmol Trolox/ Kg de aceite oliva extra virgen
(Samaniego, 2006).
La capacidad antioxidante por este ensayo del DPPH por sí solo no da un
resultado que garantice la capacidad antioxidante in vivo del aceite, pero en
muchos reportes científicos es un parámetro de referencia. Los estudios de
composición química realizados no identifican los posibles compuestos
responsables de esta capacidad de atrapar radicales de DPPH por lo que sería
muy interesante continuar el análisis del aceite del mate para caracterizar la
fracción de insaponificables. La identificación de estos compuestos conjuntamente
con la abundancia de ácidos grasos insaturados permite establecer el valor
comercial de los aceites vegetales.
32
CONCLUSIONES El presente trabajo de Tesis permitió realizar la caracterización fisicoquímica del
aceite fijo de mate (Crescentia cujete L.) y con base a los resultados obtenidos, se
puede arribar a las siguientes conclusiones:
Mediante extracción por Soxhlet se logró obtener un rendimiento promedio de
36.57% de aceite fijo de las semillas de la especie.
Las propiedades fisicoquímicas del aceite obtenido de las semillas son
similares a otros aceites vegetales de uso humano como el aceite de oliva, de
soya o maíz.
El perfil lipídico obtenido por CG-EM reveló un contenido de ácidos grasos
insaturados totales de alrededor del 80%, siendo el ácido oleico el mayor
porcentaje con 63.92%.
El aceite obtenido mostró capacidad antioxidante mediante el método DPPH,
siendo el CI50 igual a 236,5 µmol Trolox/kg de aceite.
33
RECOMENDACIONES
Realizar estudios toxicológicos del aceite de la semilla del Mate, con el fin de
garantizar su uso como productos alimenticio y/o cosmético.
Realizar los mismos análisis en otras especies del género Crescentia tomando
en cuenta su ubicación geográfica, tiempo de cosecha o madurez, para
comparar el rendimiento de aceite y los resultados obtenidos con la especie
estudiada.
Identificar los compuestos antioxidantes presentes en la fracción
insaponificable del aceite obtenido.
34
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ANEXO 2: FOTOGRAFÍAS DE LA FASE EXPERIMENTAL
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
EXTRACCIÓN DE LAS SEMILLAS
SECADO DE LAS SEMILLAS
47
ANEXO 3: GRÁFICAS DEL GC-MS
4.0
06
.00
8.0
01
0.0
01
2.0
01
4.0
01
6.0
01
8.0
02
0.0
02
2.0
02
4.0
02
6.0
02
8.0
03
0.0
0
20
00
00
0
40
00
00
0
60
00
00
0
80
00
00
0
1
e+
07
1.2
e+
07
1.4
e+
07
1.6
e+
07
1.8
e+
07
2
e+
07
2.2
e+
07
2.4
e+
07
2.6
e+
07
2.8
e+
07
3
e+
07
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8.0
14
9.3
92
9.6
74
10
.07
81
8.3
41
19
.85
42
0.5
49
20
.77
52
0.8
94
21
.00
32
1.0
40
21
.10
42
1.1
35
21
.37
3
21
.44
0
21
.55
2
21
.79
02
2.0
07
22
.15
0
22
.26
2
22
.71
22
2.8
30
22
.90
4
23
.04
32
3.2
27
23
.30
02
3.3
97
23
.49
72
3.5
70
23
.71
52
3.9
59
24
.11
0
24
.33
7
25
.05
52
5.1
98
25
.36
1
25
.95
3
26
.14
92
6.2
68
26
.66
5
27
.04
32
7.8
10
28
.32
72
8.7
38
29
.08
32
9.2
07
29
.80
0
30
.49
7
49
ANEXO 5. Certificado de presentación de tema en II Congreso
Internacional de Ciencia y Tecnología
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