Mosaicismo en PGT-A Dr. Carles Giménez Reprogenetics, Barcelona Múrcia Abril 2018
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MUCHAS FELICIDADES
Team Barcelona Directors:
Carles Giménez, PhD Mireia Sandalinas, MSc
Quality & Lab director: Elena Garcia, MSc
Biologists: Estefania Toro, BSc Èlia Alsina, BSc Montse Palahí, MSc Diana Campos, BSc Maria de Acha, BSc Marta Sánchez, PhD
Laboratory technicians: Enric Balius Laura Álvarez Laia Echevarría, BSc
Administrative: Mònica Llagostera
Madrid Directors:
Carles Giménez, PhD Mireia Sandalinas, MSc
Technical Director: Esther Fernández, PhD
Quality & Lab director: Álvaro Gómez, BsC
Biologists: María del Lidón Carretero, BSc Nerea Ugartemendia
Laboratory technicians: Esperanza Martín Verónica Hellín
Administrative: Emilio Yuste
Reprogenetics fabulous team Pioneers and Global Leaders in Reproductive Genetics
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DEFINICIÓN
Presencia de 2 o más líneas celulares con diferente componente cromosómico
en un embrión
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DIVISIÓN CELULAR Mecanismo de reproducción celular mediante el cuál una célula inicial se divide para formar células hijas. Meiosis /Mitosis
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DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS
• Proceso de reproducción celular post-zigótico
• A partir de una célula se generan dos células hijas con el mismo número de cromosomas e información genética que la célula madre.
Mitosis (neologismo creado por el biólogo alemán Walther Flemming (1843-1905) usando la palabra griega μίτος (mitos = tejido, originalmente hilo, ver: mitocondria) y el sufijo -ωσις (-osis = formación, impulso o conversión))
MAURIZIO DE ANGELIS/Science Photo Library/Getty Images, http://www.cell.com/pictureshow/cell-cycle, Alvaro Esteves Migotto, Universidade de Sâo Paulo, http://www.cell.com/pictureshow/embryogenesis
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DIVISIÓN CELULAR: MEIOSIS
• Proceso de división celular propio de las células reproductoras, en el que se reduce a la mitad el nº de cromosomas.
• Recombinación • Formación gametos • Células distintas
Meiosis (del griego μείωσις meíōsis 'disminución‘)
Extreme Asymmetric Division By Sybille Pfender and Melina Schuh, MRC, UK Image: Immunofluorescence micrograph of mouse oocyte during the first meiotic division. Microtubule and cortical actin are labeled blue and red, respectively, while DNA is stained cyan. The image was recorded on a scanning confocal (Zeiss LSM 710) with a 63x 1.2 NA water immersion objective. The diameter of the oocyte is 75 micron. Learn more in Pfender et al. (2011).
http://www.cell.com/pictureshow/reproduction
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ERRORES EN LA DIVISIÓN CELULAR
meiosis
Gametos aneuploides
embriones aneuploides (+21; +13; +18; …)
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ERRORES EN LA DIVISIÓN CELULAR
mitosis
Coexistencia de ≥ 2 líneas celulares
embriones mosaico
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MECANISMOS
• Origen mitótico • Mecanismos
No disyunción: fallo en la separación de cromosomas homólogos
Anaphase-lag: pérdida de un cromosoma mediante la formación de micronúcleos causada por el retraso en el movimiento del cromosoma durante la anafase
Otros mecanismos: Endorreduplicación, deleción, duplicación …
• La extensión (%) del mosaicismo dependerá de en que división embrionaria tenga lugar la aneuploidía
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PGT-A: métodos de CCS, NGS
Amplificación total del genoma (WGA) de las muestras
Preparación de la librería:
• Fragmentación del DNA
• Ligado de adaptadores y códigos de barra
Amplificación de clusters
Secuenciación
Alineamiento y análisis de datos
Imagen de: An introduction to Next-Generation Sequencing Technology. Illumina. 2016 Copyright Reprogenetics 2018
Embriones euploides
PGT-A: métodos de CCS, NGS
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Embrión aneuploide
Trisomía 14
PGT-A: métodos de CCS, NGS
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Anormal complejo (= cuando se observan 3 o más anomalías)
Trisomía 22
Monosomía 2 Monosomía 19
Monosomía 21
PGT-A: métodos de CCS, NGS
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CLASIFICACIÓN
Coexistencia de líneas celulares DIPLOIDES y otras anormales
ej : 2n/M20 (40%)
Nº aneuploidías 1-2-SIMPLE
≥3 COMPLEJO
%mosaicismo (30-70%)
30-40% MODERADO
41-70% EXTENSO
Tipo aneuploidía
Completa (ej: trisomía 3)
Parcial (ej: trisomía 3q)
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MOSAICO SIMPLE 1-2 aneuploidías
MOS 2n/ane 2n/M18 65%
CLASIFICACIÓN
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MOSAICO SIMPLE 1-2 aneuploidías
MOS 2n/ane 2n/M18 65%
MOSAICO COMPLEJO ≥3 aneuploidías
MOS 2n/AC 2n/M11,M14,M16 ~50%
CLASIFICACIÓN
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CLASIFICACIÓN
Coexistencia de líneas celulares DIPLOIDES y otras anormales
ej : 2n/M20 (40%)
Nº aneuploidías 1-2-SIMPLE
≥3 COMPLEJO
%mosaicismo (30-70%)
30-40% MODERADO
41-70% EXTENSO
Tipo aneuploidía
Completa (ej: trisomía 3)
Parcial (ej: trisomía 3q)
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CLASIFICACIÓN
Coexistencia de líneas celulares DIPLOIDES y otras anormales
ej : 2n/M20 (40%)
Nº aneuploidías 1-2-SIMPLE
≥3 COMPLEJO
%mosaicismo (30-70%)
30-40% MODERADO
41-70% EXTENSO
Tipo aneuploidía
Completa (ej: trisomía 3)
Parcial (ej: trisomía 3q)
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Full monosomy 13 (mos) Mosaic embryos
Partial monosomy 9 (mos)
CLASIFICACIÓN
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PGT-A by NGS: CAMBIO DE PARAGIGMA Actual:
• Clasificar embriones como normales o anormales • Tasa de error 2-10% • Falsos negativos , falsos positivos
Nuevo: • Clasificar embriones como normales, mosaico o anormales • Mínima tasa de error • No priorizar mosaicos
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PGT-A by NGS: CAMBIO DE PARAGIGMA
No implantan, elevada tasa de abortos, descendencia afecta
Elevado potencial implantatorio, baja tasa de aborto aumento embarazo evolutivo
?¿?¿Qué hacer con los embriones mosaico ?¿?
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EMBRIONES MOSAICO • Aprox. 21% blastocistos biopsiados muestran
mosaicismo • No aumenta con edad materna
• Diferencias significativas del % de mosaicismo entre centros (embriones de ovodon) biopsia, medios cultivo, estimulación, condiciones laboratorio, etc
• 10% pacientes con sólo embriones mosaico
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EMBRIONES MOSAICO Concordancia entre TE Mosaico y MCI:
Aprox. 40% de las MCI analizadas en embriones mosaico son euploides
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EMBRIONES MOSAICO: Resultados Clínicos ¿qué pasa cuándo transferimos embriones mosaico?
Greco, Minasa, Fiorentino (2015) New Eng. J. Med
6/18
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EMBRIONES MOSAICO: Resultados Clínicos • Implantan menos • Abortan más • Pueden dar lugar a niños sanos
Mosaic Euploid
N 221 1490 Ongoing implantation 37% 76% p< 0,001 Miscarriage rate 24% 5% p< 0,001 OPR/retrieval 37% 60% p< 0,001
Fragouli et al. (2016) + Munné et al. (2016) + Genoma unpublished data
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EMBRIONES MOSAICO: Resultados Clínicos Diferente pronóstico clínico según tipo y grado de mosaicismo:
Munné et al. (2017) + Fiorentino (Genoma) data
MOSAICO TIPO % ANOMALÍAS Nº EMBRIONES TRANSFERIDOS
% EMBARAZOS EVOLUTIVOS
COMPLEJOS cualquier 32 6%
SIMPLES 20-40% 102 50%
41-80% 44 30%
PARCIALES cualquier 43 37%
TOTAL MOSAICOS 221 37%
EUPLOIDES <20% todos centros
FIV 50-70%
• No se observan diferencias entre monomía y trisomía • No se observan diferencias entre cromosomas que en PND es
probable que lleguen a término
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EMBRIONES MOSAICO: Recomendaciones i. Decidir cual va a ser nuestra política en relación a
la transferencia o no de embriones mosaico ii. Asesoramiento pre ciclo FIV-PGT-A: poner en
conocimiento de los pacientes la posibilidad de obtener embriones mosaico
iii. Priorizar transferencia embriones euploides iv. Decidir que embrión mosaico transferir en función
de las recomendaciones de las sociedades científicas
v. Únicamente transferir un embrión mosaico tras asesoramiento genético post ciclo FIV-PGT-A, la aprobación de los pacientes y la firma de un consentimiento expreso
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EMBRIONES MOSAICO: Recomendaciones vi. Tener en consideración la indicación (AMA, RIF,
RAB, …) vii. En caso de embarazo Dx Prenatal,
preferentemente mediante amniocentesis
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EMBRIONES MOSAICO: Recomendaciones Según resultados clínicos
TIPO DE MOSAICO
MODERADO (20-40%)
EXTENSO (41-70%)
PARCIALES BR/EP BR/EP
ANEUPLOIDE (1-2) BR/EP AR/BP
COMPLEJOS (≥3) AR/BP AR/BP
BR: BAJO RIESGO ABORTO/ EP: ELEVADO POTENCIAL IMPLANTATORIO AR: ALTO RIESGO ABORTO/ BP: BAJO POTENCIAL IMPLANTATORIO
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EMBRIONES MOSAICO: Recomendaciones Según resultados sociedades científicas
EUPLOIDES
*/**
**
**
*
*
*
* Cromosomas de bajo riesgo incluyen: 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 19, 20, 22. En caso de confirmarse la aneuploidía en la MCI daría lugar a fallo de implantación o aborto. ** Cromosomas de alto riesgo incluyen: 2, 7, 16 (IUGR), X Y 13 18, 21 (embarazo viables de fetos afectos), 14, 15 (UPD).
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EMBRIONES MOSAICO: Nuevos datos Spinella et al., Fertil Steril, 2018, 109(1): 77-83
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EMBRIONES MOSAICO: Nuevos datos Spinella et al., Fertil Steril, 2018, 109(1): 77-83
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EMBRIONES MOSAICO: Nuevos datos
• Evidence-based scoring system considering the outcome of 72.472 CVS and 3806 POC
• Based on: – Likelihood that a placental mosaic aneuploidy is also present in the fetus – Incidence of clinically significant fetal UPD in cases with a mosaic
aneuploidy CV – Incidence of mosaic aneuplidies in POC
• Calculed composite score for mosaicism from zero (=no risk) to 5 (=highest risk or ET best avoided)
Gratti et al., Reprod Biomed Online, 2018, 36: 442-449
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EMBRIONES MOSAICO: Nuevos datos
Gratti et al., Reprod Biomed Online, 2018, 36: 442-449
Score 0 very low risk
Score 1 slightly increased likelihood of miscarriage or a viable aneuploidy
Score 2 slightly higher risk of miscarriage or a relatively low risk for UPD
Score 3 increased risk of miscarriage, UPD or viable aneuploidy
Score 4-5 high risk of fetal involvement and a slightly increased risk for
miscarriage and viable aneuploidy
Best avoided mosaic trisomies for chromosomes 13, 14, 16, 18, 21 & 45,X
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EMBRIONES MOSAICO: Nuevos datos
Gratti et al., Reprod Biomed Online, 2018, 36: 442-449
Score 0 mosaic trisomies for chromosomes 1, 3, 10, 12 & 19
Score 1 mosaic trisomies for chromosomes 4, 5 & 47,XYY
Score 2 mosaic trisomies for chromosomes 2, 7, 11, 17 & 22
Score 3 mosaic trisomies for chromosomes 6, 9 & 15
Score 4-5 mosaic trisomies for chromosomes 8, 20, 47,XXX & 47,XXY
Best avoided mosaic trisomies for chromosomes 13, 14, 16, 18, 21 & 45,X
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PGT does not make the embryo better
(Don Leigh, PhD, sivf, PGDIS-Miami’09)
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