Insert sensitivity risk
Agriculture Division of DowDuPont
Nuevas Tecnologías de Mejoramiento (NBT) y Edición Génica
Situación Regulatoria y aplicaciones en mejoramiento de maíz.
Lic Gustavo Abratti, MSc. MBA
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17 de Octubre 2018
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Temario
• Contexto: el proceso desde el explanto a los millones de hectáreas; Marco regulatorio de OGM en Argentina.
• Las Nuevas Técnicas de Mejoramiento (NBT-New Breeding Techniques)
• Edición génica mediada por Crispr Cas9: Ejemplos concretos de productos NBT vía edición génica en Corteva
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Del plásmido al lote……pasando por la bolsa
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Etapas Fase Discovery Prueba
conceptoDesarr. Temprano
Des. avanzado
Pre lanzamiento Ventas
Años 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Descubrimiento.temprano
Optimización
Descubrimiento.avanzado
Eventos comerciales.
Producir y seleccionar.
Registration & Gov Affairs
Introgresión, breeding y testing en múltiples ambientes
Ensayos regulatorios
PVP, registrovaridedades, etc
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Marcos RegulatoriosSituación en Argentina y el mundo
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De que hablamos cuando hablamos de regulación?
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Reglas:
Resoluciones, leyes, articulos.
Normas voluntarias. Tratados
internacionales.
Riesgo –Incertidumbre
Rol de los estados:
Protección de bienes
comunes
“Principio Precautorio”
Complejidad-
Novedad
Incertidumbre-Miedo
Reducir el riesgo
controlando la exposición.
Impacto en ecosistemas
• Organismos no blanco
• Eficacia
• Desarrollo de resistencia
• Nuevos usos.
• Invasividad
Uso alimento
Humano y animal
• Toxicidad
• Alergenicidad
• Efectos largo plazo
• Impacto composición
• Efectos no deseados
Comercio
• Situación en otros países
• Coexistencia
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Organismos y responsabilidades
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Secretario de
agricultura
Aprobación final
Mercados: Riesgo comercial
Senasa: Uso alimentario
Conabia: Riesgo
ambiental
Inase : Poder policía, verifica cumplimiento de normas
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Análisis de riesgo en OVGM
• Descripción del evento:• Fuentes de las secuencias.• Historia de uso seguro• Método de obtención• Estructura del inserto (Southerns, secuenciación)• Método de detección
• Estudios de laboratorio• Toxicidad o alergenicidad de las proteínas (crónica y aguda)• Equivalencia nutricional, composición.• Bioinformática
• Datos de campo• Eficacia del evento• Características agronómicas• Impacto en agroecosistema• Expresión del carácter de interés (fenotipo, ELISA, otros)
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Las Nuevas Técnicas de MejoramientoNew Breeding Techniques (NBT) o Plant breeding innovations (PBI)
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Mejora tradicionalMutagénesisSelección asistida por marcadoresGermoplasmaPVP, Breeding
Cultivos OGMCreación de
“traits”
PatentesBiotech
New
breeding
techniques: procesos largos,
múltiples
generaciones,
desarrollos y
descubrimientos,
casos no previstos
por las regulaciones
del siglo XX
??
Advanced Plant Breeding
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Mutagénesis dirigida por Oligonucleótidos (ODM)
Nucleasas Dedos de Zinc (ZFNs)
Mejoramiento reverso
RNA-dependent DNA Methylation
Cisgénesis e intragénesis
Genómica Sintética
Infiltración con Agrobacterium
Injerto (no GM sobre un patrón GM)
ODM
ZFNs
Meganucleasas
TALENs
CRISPR-Cas
Técnicas para edición de
genes
2007 2018
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OVGM: Organismo vegetal que posea una combinación de material genético que se haya obtenido mediante la aplicación de la biotecnología moderna. (idem protocol de Cartagena)
Evento: la inserción en el genoma vegetal en forma estable y conjunta, de UNO (1) o más genes o secuencias de ADN que forman parte de una construcción genética definida”
Para que un cambio genético sea considerado una nueva combinación de material genético, se analizará si se ha producido una inserción en el genoma en forma estable y conjunta de UNO o más genes o secuencias de ADN que forman parte de una construcción genética definida.
Definiciónes de OGM según Res. 173/15
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Cualquier producto que se obtenga mediante NBTS que usan
biotecnología moderna deben pasar por el proceso de Consulta
Previa o se los considerará OGM.
Si el producto contiene “eventos” (inserciones estables…) es OGM.
La progenie de cualquier OVGM es considerada una planta OGM
hasta que se aporte evidencia científica de lo contrario.
Criterios de CONABIA
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Requerimientos de Información
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Los solicitantes que consultan mediante ICP deben describir:
Técnica de mejoramiento usada para obtener y seleccionar el producto.
Breve descripción y explicación del fenotipo buscado.
Evidencia de los cambios presentes en el producto final.
Evidencia de la eliminación de cualquier trasngén usado temporariamente o transientemente para obtener el producto
La Dirección de Biotecnología y la Conabia se reservan el derecho
de pedir información adicional sobre cualquier punto.
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1. Procedimiento de consulta previa
CONABIA
(comité de bioseguridad)
2. ¿Existe una nueva
combinación de
material genético?
Regulado
bajo la
normativa
vigente
NO
3. ¿Se utilizan
transgenes en
el proceso?
NO
4. ¿Posee
transgenes el
producto final?
NO
SI
SI
SI
OGM
No OGM
No
necesita
regulación
especial
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Proceso Simple para definir si un producto es o no alcanzado por las normativas de OGM.
El análisis es caso a caso y basado en criterios científicos.
No hay una lista restringida a las NBT existentes . Flexible a nuevas técnicas todavía desconocidas.
Permite tener certezas en la fase de diseño (producto hipotético) .
La evaluación debe completarse en 60 días.
Según el tipo de fenotipo buscado, la CONABIA puede recomendar medidas de seguimiento adicionales tomando en cuenta aspectos científicos y técnicos.
Puntos destacados
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Experiencias y expectativas 2015-2018
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Argentina:Numerosas ICP para NBTS
Productos reales (ya desarrollados): Todos tipo SDN1, todos considerados NO GMOProductos Hipotéticos(Casos en etapa de diseño, SDN1 o SDN2): se concluyó que no serian considerandos OGM, si el solicitante puede aportar evidencia de que no se insertaron construcciones .
Otros países:Latinoamérica: Procesos símil Argentina: Chile, Brasil, Colombia.Firma de acuerdo de consejo agropecuario del sur Norteamérica: Lista de exclusión de USDA.Europa: Opinión del Fiscal general: “las técnicas de mutagénesis están excluidas de las
normativas de OGM, siempre que el producto no contenga inserciones”Corte suprema: todos los productos obtenidos por métodos de PBI son OGM.Suecia: Alamo
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Edicion génica mediada por Crispr Cas 9
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INSERT
(Inserción construcción)
Con Molde
de reparación
SDN2
Gene EDIT
(Edición- cambio)Gene OFF
(Eliminación)
SDN1 SDN3
Sin Molde
de reparación
Maiz Waxy Maiz NLB-R Maiz Nuevo BT?
CRISPR-CAS9
corte de la doble hebra de ADN
en los sitios objetivo (blanco)
Formas de Edición con CRISPR-Cas
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Tecnología CRISPR-Cas • Enzima que aporta actividad endonucleasa de alta
efectividad y selectividad programable
Capacidad para transformar material elite• Transformar y regenerar cualquier material de la especie, incluyendo las mejores líneas agronómicas (solo se logrado recientemente).
Genómica• Disponibilidad de métodos de secuenciación de
nueva generación (NGS) y secuencia completa de genomas de líneas elite.
• Infraestructura y herramientas informáticas para análisis, seguimiento y trazabilidad.
Requisitos para aplicar Edición Génica vía CRISPR-cas
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Obtención y Caracterización de Producto Editado
Caracterización complete de los productos, incluyendo información a nivel de secuencia de ADN para confirmar, :
(1) Éxito en la Edición
(2) Ausencia de cualquier inserción de ADN de los plásmidos usados en la transformación
El desarrollo y el análisis se realiza para cada nueva línea CRISPR-Cas que se edita.
Solo avanzan a status comercial aquellas líneas que pasan todos los controles moleculares
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Uso de CRISPR-Cas como herramienta
de mejoramiento
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CRISPR-Cas Enabled Breeding
Move STRESS TOLERANCE gene
Mejora convencional por retrocruza
Resistente a Stress
Pocopotencialrinde
Genes de tolerancia a stress incorporados en germoplasma elite de alto potencial de rinde
5…5…
Linea A
Sensiblea Stress
Buenpotencial rinde
Linea B100% B
100% A
Requiere multiples generaciones
25%
7…
12%
88%
7
%93%
3
%97%
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Productos desarrollados por Pioneer® de lanzamiento cercano:
Maíz Waxy- CrisprCas9
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Dos vías de síntesis de almidón en el grano de maíz normal :
Polisacárido cadena lineal: Amilosa
Polisacárido Cadena ramificada: Amilopectina
Tipos de Almidón de maíz:
“Normal” : 75% amilopectina + ~25% amilosa
“Waxy” (Alta amilopectina): > 97% amilopectina
Producto comercial de alto valor :
“Speciality”: Mercado nicho de alto valor
Aplicaciones alimentarias e industriales derivadas de propiedades fisicoquímicas:
Alta viscosidad a alta temperatura
Geles mas claros y estables a baja temperatura
Buena estabilidad en ciclo congelado/descongelado.
Maíz Waxy
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Current Pioneer® Waxy Corn Product
El gen de maíz Wx1codifica almidón sintasa unida a gránulos. El alelo actual wx1 proviene de una variedad de maíz de
descubierta en 1908, cultivada comercialmente desde 1940 y vendida por Pioneer desde los años 80.
• DuPont Pioneer es el proveedor líder en el mercado de semillas de maíz Waxy en USA
• Problemas de maíz waxy actual:
• Retraso para la introgresión del alelo wx1 en las líneas élite actuales
• Algunas pérdidas de rinde, en parte debido a ligamiento (linkage drag)
Solución: Interrumpir el gen Wx1 usando tecnología CRISPR-Cas editando las lineas élite
Eliminación de 30bp
Disrupción del gen ~100% amilopectina FenotipoWAXY
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Maíz Waxy Crispr Cas: Diseño de la Edición (Deleción)
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Interrupción del gen
~100%amilopectina
Fenotipo Waxy
3'UTR
TSSExón7CR4 CR8
5'UTR
ATG TG
A
Región promotora
CR4 Y CR8 –RNAs de guía que dirigen dos cortes dobles en la hebra de ADN
Posición de la deleción
30bp en el maíz Waxy
convencional
Eliminación de gen , via CRISPR-Cas
Deleción de 3000 bp en
el maíz Waxy Crispr
cas9
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Maíz NLB- CrisprCas9
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Tizón del Norte (NorthernLeaf Blight) en Maíz
Enfermedad causada por Exserohilum turcicum (Helminthosporium turcicum)
Impacto económico global: Pérdida 18% - 98%*
Diversidad: múltiples líneas de Maíz con alelos resistente, otras alelo sensible
a NLB . La resistencia a NLB puede mejorarse con la incorporación de loci de
resistencia.
Gen NLB18 : clonado a partir de líneas elite de DuPont Pioneer y validado de
diversas formas
Propuesta para aumentar la tolerancia de híbridos de maíz sensibles a NLB:
Reemplazar directamente por edición génica el alelo sensible del locus NLB18 con el alelo resistente
** Li B, Wilson WA, inventors. 29 Dec 2011. World Intellectual Property Organization, Application No. PCT/US2011/041822
***Díaz C et al (2012) . In 29 Congresso Nacional de Milho e Sorgo, Águas de Lindóia, Brazil, pp 0805-0812
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Zonas típicas de prevalencia en Argentina(Díaz C et al (2012)*** y datos propios)
Baja
Intermedia
Alta
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Reemplazo Alélico NLB18 mediado por CRISPR-Cas9
NLB18-RLinea
donante
NLB18-SLinea elinte
susceptible
NLB18-R Línea elite resistente
Edición tipo SDN2 (EDIT)• Dos cortes en el ADN, Molde de reparación: alelo NLB18-R del gen de
interés• Resultado:
• Alelo alternativo para el mismo gen, reemplaza alelo susceptible• En su misma ubicación genómica sin agregado de secuencias de otra
especie ni construcciones. • Teóricamente posible por breeding tradicional (pero mucho mas difícil)
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Los productos, sus beneficios y los conceptos descriptos no estarán disponibles ni se ofrecerán para la venta o distribución hasta no completar ensayos a campo y se obtengan todas las autorizaciones regulatorias aplicables
CRISPR-Cas Advanced Breeding:
Múltiples aplicaciones en agricultura.
El uso de CRISPR-Cas
facilita la Innovación en
productos Corteva
Cultivo
Res
iste
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en
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ed
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Maíz
Soja
Canola
Arroz
Trigo
Girasol
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El mejoramiento vegetal se nutrió y se nutre de todas conocimiento
disponible en cada época histórica para desarrollar nuevos
productos.
La aceleración de los cambios del ambiente y la sociedad exige no
dejar ninguna opción de lado para acelerar el ritmo de la
innovación. La edición génica es una de muchas herramientas
necesarias para innovar y sintetiza avances en múltiples áreas del
conocimiento.
Licencia social y aceptaciónMas allá de conformar al regulador: Conversaciones con los consumidores y la sociedad en la era de las fake news y las anti vacunas
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La seguridad los productos y el tutelaje (stewardship) son cimientos en los desarrollos de Corteva.
La seguridad del consumidor es condición sine qua non.
Es imprescindible asegurar comunicaciones abiertas, transparentes y oportunas acerca del uso de las tecnologías con otros sectores de la sociedad (stakeholders)
Apoyamos el desarrollo de marcos regulatorios apropiados y basados en ciencia para la regulación de plantas, proporcionales a las exigencias aplicables a otras clases de plantas.
Nos interesa facilitar el acceso a terceros de tecnologías, IP, infraestructura y experiencias
Algunos conceptos
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http://crisprcas.pioneer.com/https://openinnovation.pioneer.com/
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www.corteva.com
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