Micro Resonancia Magnética e Imágenes Moleculares para la biotecnología y la farmacéutica.
Caso de la Isquemia Cerebral.
Dr. Carlos Cabal MirabalInvestigador Titular. Académico de Mérito
Unidad de RM [email protected]@infomed.sld.cu
Agradezco al Prof. Dr. Carlos O Della Védova y a la Prof. Dra. Cristina Caracoche
¡Gracias a todos Ustedes!
Comparación entre los Métodos de Imágenes
¿?
[Rudin 2003]
Literatura científica sobre ensayos y RM
R2 = 0.9486
050
100150200250300350400450500550600650700750800
1988
1989
1990
1991
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1993
1994
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1999
2000
2001
2002
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2004
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2006
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2008
Años
Can
tidad
de
publ
icac
ione
s
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
1988198919901991199219931994199519961997199819992000200120022003200420052006200720082009
Año
s
Cantidad de publicaciones
Modelo de cáncer en animal Modelo de stroke en animal
Biomundi julio 2009
Definiciones de μRM e ImRM• Las μRM son imágenes de estructuras biológicas vivas
con resoluciones espaciales del orden de decenas de micras, elevado contraste y tiempos de imágenes que permiten estudiar los detalles anatómicos y los procesos fisiológicos a nivel de células, tejidos y órganos, sin alterar estos.
• Las ImRM in vivo y no invasivas han sido definidas como la representación visual, la caracterización (estructural y funcional) y la cuantificación de procesos biológicos a niveles celulares y moleculares.
• Las ImRM y μRM detectan, cuantifican y visualizan fenómenos dinámicos moleculares y celulares, en tejidos y órganos, con resoluciones espaciales de hasta decenas de micras y temporales de milisegundos.
μRM
0.0
0.6
1.2
1.8
2.4
3.0
3.6
15-18 months 19-22 months
lumen perimeter (mm)
0.18
0.23
0.28
0.33
0.38
0.43
0.48
wall thickness (mm)
mean lumen perimetermean wall thick
μRM
La isquemia.Precede de una severa disminución de flujo:
60 mL/min/100g humano adulto90-105 mL/min/100g roedor adulto
2020--25 ml/min/100 g 1825 ml/min/100 g 18--20 ml/min/100 g20 ml/min/100 g
EEG lento Aparecen síntomas (Preocuparse) neurológicos
Desaparecen respuestas Eléctricas “Umbral de
Fallo eléctrico”
Zona de penumbra Núcleo o “Core”
1616--18 ml/min/100mg18 ml/min/100mg
Rápida muerte celular
10ml/10ml/minmin/100mg/100mg
Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones BiológicasInstituto de Farmacia y Alimentos, UH
La Zona de penumbra es RESCATABLE y si logramos restablecer las condiciones normales de funcionamiento el área de infarto puede reducirse.
Ventana terapéutica
Ventana reperfusión
Ventana neuroprotección
+
3-12h
• Buscar métodos más acordes con la ventana • Ampliar la ventana para el diagnóstico y la terapéutica adecuadas.
T2T2 ADCADC DWIDWI MTTMTT CBFCBF
Curso de la Oclusión de la ACM en una rata
• Volumen y evolución temporal del infarto.• Flujo sanguíneo local en el área infartada.
• Estudios sobre reperfusión.• Farmacología del ictus.
• Influencia de la duración de la hipoxia en la talla y localización del infarto.
• Respuestas inflamatorias después del infarto.• Necrosis y apoptosis celular.
• Actividad fagocítica y microglial en la zona de teijdoinfartado.
• Homeostasia de la barrera hematoencefálica.
Déficit de perfusión • Perfusión
HemorragiaPerturbaciones hemodinámicas
• BOLD
Degradación del tejidoEdema vasogénico
• MT
Edema Citotóxico Lisis Tisular
• DW
Perturbaciones del flujo• MRA
Daño de la barrera hemato-encefálica
• Contraste T1W
Edema vasogénico• Densidad protónica • T1W• T2W
FisiopatologíaMétodo de MRI
Métodos, condiciones fisio patológicas con μRM en modelos animales(Dijkhuizen 2003)
M Cambia de orientación
Muestra
Magnetización M
Imán
Excitación RF
Relajación Magnética T1, T2
Fem Inducida
Señal de RM
S
N
M0
S
NSCL
S
NSCLtP
B1
X´
SCL
Y´
S
N Z´
N
Y´
S
Z´
X´ 050
050t
SCL
00
2 %37)( Me
MTM XY ≈=
2Tt =
1=n
2=n
001 %6311)( Me
MTM Z ≈⎥⎦⎤
⎢⎣⎡ −=
Tiempo de correlación del agua (s)
Agua libreτc = 10-12
Proteina
Agua enlazadaen superficieτc = 10-10
Agua internaτc = 10-5
( )CfT
τ∝2,1
1
% H2O
100
80
60
20
40
Sust
anci
a gr
is
Riñ
ones
Pulm
ón
Híg
ado
Tipo de tejido
Sust
anci
a bl
anca
Piel
Hues
o
Cor
azón
Agua de los diferentes tejidos.
δδ χχ
T2*T1ρ
DTIDWI ADC
T1 T2ρ
ContrasteContraste
Tiempo de relajación Spin-retículo T1(ms)
Órgano Tejido
A 1,5 T A 0,2 T
Tiempo de relajación Spin-spin T2(ms)
Cerebro Sustancia Gris 921 495 101
Sustancia Blanca 787 390 92
Líquido encéfalo raquídeo 3000 1200 1500
Edema 1090 627 113
Meningioma 979 549 103
Glioma 957 832 111
Astrocitoma 1109 864 141
Hígado Tejido normal 493 229 43
Hepatomas 1077 580 84
Bazo Tejido normal 782 400 62
Páncreas Tejido normal 513 283 62
Riñones Tejido normal 652 395 58
Pulmón Tejido normal 830 79
Músculo Tejido normal 868 372 47
Grasa Tejido normal
Imagen sopesada en T1 (TR corto, TE corto)
IMÁGENES Sopesadas en T1
Imagen potenciada en T2 (TR largo, TE largo)Imagen potenciada en T2 (TR largo, TE largo)
IMÁGENES Sopesadas en T2
Contraste depende del tejido, su estado
fisiológico, molecular. Se hace mas o menos evidente dependiendo de los parámetros del
experimentoρρ(TE corto y (TE corto y TR largo)TR largo)
TT11(TE corto y (TE corto y TR corto)TR corto)
TT22(TE largo y (TE largo y TR largo)TR largo)
Contraste SEContraste SE
RF
TR
TE
Eco Ecoo
ImImáágenes T1 y T2 de ratagenes T1 y T2 de rata
Axial plano de 49 mm y 1 mm de espesorAxial plano de 49 mm y 1 mm de espesor
Sagital 59 mm Sagital 59 mm TT11 TT22
La difusión restringida
Difusión anisotrópica
Difusión isotrópica
TamaTamañño, Forma Orientacio, Forma Orientacióónn
Dt6 Dt6
Alta difusión Baja difusión
Difusión en las células
Imágenes DWI, ADC en ratas
Utilización del tiempo
Ejemplo 1. Dos valores de b, b= 0 (imagen base) y con b=1000 s/mm2 seleccionamos seis orientaciones de los gradientes y para cada una de las orientaciones hacemos tres acumulaciones con el fin de incrementar la relación señal/ruido tardaríamos 19 minutos en realizar el estudio.
Ejemplo 2. Fijamos tres valores de la b; b=500; b= 1000 y 1500 s/mm2 y obtenemos 7 planos para esos valores. TI = 21 minutos.
Ejemplo 3. Un corte para 20 orientaciones con un valor fijo de b=1000s/mm2
TI = 1minuto. 20 imágenes en 20 minutos implica varias opciones de empleo de esos 20 minutos → óptima planificación del experimento para aprovechar el tiempo
Tierras Raras:Ce, PrCe, Pr, Nd, Pm, Sm, EuSm, Eu, Gd, TbTb,
Dy, , Ho, Er,
326f146d106p66s2
325f145d105p65s2
324f144d104p64s2
183d103p63s2
82p62s2
21s2
1s2 2s22p6 3s23p6 4s2 3d10
Metales de Transición:Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, CuFe, Co, Ni, Cu,,
El magnetismo molecular dependede la intensidad del campo de
ligados y de su simetría alrededor del ion central
M = M = χχ ··BoBo
Susceptibilidad MagnSusceptibilidad Magnééticatica
icoParamagnét⇔⟩0χcoDiamagnéti⇔⟨0χ
ImImáágenes moleculares y celulares . genes moleculares y celulares .
Mecanismos de contrasteI. Intrínsecos.
II. Extrínsecos.
Δ
yzxzxy ddd ;;
222 ; yxz dd−
Simetría tetraédrica
Simetría octaédrica
Δ = EL ( intensidad del campo de Ligando)I-<Br-<Cl-<F-<H2O<C2O4
2-<piridina~NH3< Etilendiamina<NO2-<CN-
SimetrSimetrííaa e Intensidade Intensidad del Campo de ligandosdel Campo de ligandos
EnergEnergíía de apareamientoa de apareamiento
Alto spinAlto spinΔ<δBajo spinBajo spinΔ>δ
Δ
yzxzxy ddd ;;
222 ;yxz
dd−
S = 0S = 0
Bajo spinBajo spinΔ<δ
S = 2S = 2Alto spinAlto spinΔ>δ
DiamagnDiamagnééticoticoParamagnParamagnééticotico
Oxi HbDesoxi Hb
Resonancia MagnResonancia Magnéética funcional.tica funcional.
Zonas Zonas activadasactivadas
Imagen Base Imagen con estímulo Imagen funcional
A. MotoraA. MotoraA. SensorialA. Sensorial A. CognitivaA. CognitivaMETABOLISMO AUMENTADO
VASODILATACIONIncremento
Flujo sanguíneoIncremento
Consumo de O2
Agentes contrastantes exógenos
ácido dietilenotriaminopentaacético
ácido 1,4,7,10 tetraazaciclododecane 1,4,7,0 acido tri acético
La dificultad fundamental: acumular suficiente cantidad en el área de interés mantener el mínimo nivel de esta en otros órganos o tejidos.
S=7/2S=7/2
Mecanismo de acciMecanismo de accióón Gd(DTPA)n Gd(DTPA)
• No pasa a través de la BHE en cerebros sanos.
• Disminuye los T1 dentro del sistema vascular y por ende aumenta la intensidad de la señal de RM en imágenes sopesadas en T1.
• Crea gradientes de χ entre lo intra vascular y extra vascular → T2* GRE y SE
Gd (DTPA)
Agentes contrastantes exógenos
Polímeros biocompatibles:poliaminas, polisacáridos, PLL, albúminas, alteran sus propiedades biofísicas y farmacológicas.
Los biopolímeros reducen la toxicidad, aumentan la persistencia en sangre e incrementan el contraste
J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053
ácido dietilenotriaminopentaacético
Actividad enzimActividad enzimááticatica
Marcador del Gen lac Z
Afinidad por el [CaAfinidad por el [Ca2+2+ ] ~ ] ~ µµmm
Afinidad proteAfinidad proteíínas, pH, COnas, pH, CO2, 2, OO22
b) La identificación de los tractos neuronalesa) El estudio de la cito arquitectura cerebral
c) La determinación de las regiones de excitación neuronal.
• Mn2+ se introduce en células nerviosas excitadas por mecanismos de transporte de Ca2+ . Su comportamiento intracelular ha sido estudiado.
• Mn2+ metal pesado esencial como cofactor de enzimas incluyendo la superoxidimutasa , Piruvato carboxilasa , Glutamina sintetasa.
• La relación T1/ T2 es similar a la de los tejidos.
Mn2+
2211
3344
11 2233
44
PartPartíículas super paramagnculas super paramagnééticas = Nano partticas = Nano partíículas culas magnmagnééticas (npm).ticas (npm).Dominios magnDominios magnééticos y partticos y partíículas monodominioculas monodominio
dc
SuperficieSuperficie
NNúúclecleoo
NanopartNanopartíícula cula MagnMagnéética (MNP)tica (MNP)
Cubrimiento Cubrimiento polimpolimééricorico
PartPartíícula monodominio, cula monodominio, dd < < ddcc
EnergEnergíía de anisotropa de anisotropííaaEEaa = KV= KV
TTcc
TTBB
Sistema de MNP con anisotropía uniaxial, d < dc , Sistema de MNP con anisotropSistema de MNP con anisotropíía uniaxial, a uniaxial, d < dd < dcc , , Hext = 0HHextext = 0= 0
Encapsulado de nano partículas magnéticas
a) SPIO superiores a 50 nm.b) USPIO menores de 50 nm.
Sus propiedades magnéticas cambian con las dimensiones.
J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053
MPI = ImMPI = Imáágenes de Partgenes de Partíículas Magnculas Magnééticasticas, , Physics in Medicine and Biology, Marzo 2009 Physics in Medicine and Biology, Marzo 2009
Funciones d e las Nano partículas supermagnéticas (NPM)
Mejorar permeabilidad
Agente terapéutico Núcleo nano partícula
Agente diana
cápsula de Biopolímero
• Aumento de contraste.• Direcciona a la diana.
• Mejorar permeabilidad.• Transportador y dosificador de agente terapéutico. • Marcaje, direccionamiento y seguimiento celular .
(Wiart et al., 2007)
ratas Wistar
Marcaje con nano partMarcaje con nano partíículas sculas súúper paramagnper paramagnééticasticas
Tumor en un ratón transgénico.(Cherry 2004)
••EvaluaciEvaluacióón de dan de dañño de la Barrera Hematoencefo de la Barrera Hematoencefáálicalica..•• DeterminaciDeterminacióón de la Densidad celular y los espacios n de la Densidad celular y los espacios intracelulares.intracelulares.••Micro vascularizaciMicro vascularizacióón en el tumor y sus alrededores.n en el tumor y sus alrededores.••FracciFraccióón del volumen sanguino.n del volumen sanguino.••Efectividad de la terapia( quirEfectividad de la terapia( quirúúrgica, radio quirrgica, radio quirúúrgica, rgica, ACM,...)ACM,...)••Marcaje y rastreo de las cMarcaje y rastreo de las céélulas cancerlulas canceríígenasgenas..
Npm multifuncionales. Otras estructuras
Bicapa Fosfolipidica
Polyetilen glycol
Droga
npm multifuncionales = propiedades super paramagnéticas + colorantes fluorescentes ↔ detección a nivel celular con imágenes ópticas de fluorescencia y de las IRM. IRM realiza la planificación quirúrgica y se asiste el acto quirúrgico con la visualización por ambos métodos de las fronteras del tumor en modelos animales para su extirpación precisa.
Ligandos
Los ACM primeros agentes dianas.Dimensiones→ paso dificultoso por la BBB
Restricciones de los agentes contrastantes.
•• Caros.Caros.•• Compleja su sCompleja su sííntesis.ntesis.•• Bio disponibilidad. Bio disponibilidad. •• Sitio de acciSitio de accióón selectiva.n selectiva.•• Efectividad del paso a travEfectividad del paso a travéés de la Barrera s de la Barrera
HematoencefHematoencefáálica y las membranas lica y las membranas celulares.celulares.
•• Relativa invasividad. Relativa invasividad.
Control genético del contraste de RM
GenGen
Proteína
Iones metálicosendógenos
Enzima
Agente contrastante
exógeno
Proteínas superficiales
Agente contrastante
exógeno
Vesícula
Proteína
Molécula diana
Tipos de Flujo. Medición de velocidad
Velocidad del flujoConducto
Fino 1 Medio 2 Semi grueso 3 Grueso 4
V = ddTRTR
1 23 4
H2OH2O H2O
Eritrocito Capilar
Gran vaso sanguíneo
Coeficiente de DifusiCoeficiente de Difusióón n Aparente. Aparente.
ADC. ADC. DifusiDifusióón media.n media.
Difusión anisotrópica
Difusión isotrópica
TamaTamañño, Forma Orientacio, Forma Orientacióónn
Métodos de Perfusión MR
PMR
EndEndóógenosgenos
ExExóógenosgenos
ASL Arterial Spin LabelingAST Arterial Spin Tagging
↓CBF
DSC Dinamic Suceptibility Contrast → CBV
Pulso Pulso PASLPASL
Continuo CASLContinuo CASL
2D y 3D2D y 3D _
Cerebro sano CBV=CBF
Isquemia cerebral CBV↑≠CBF↓
DSC Dinamic Suceptibility Contrast
agente exógeno
ASL Arterial Spin LabelingAST Arterial Spin Tagging
agente endógeno
Lugar de marcadoLugar de marcado
arteria Vena
Tejido
capilares
Imagen
Imagen
Marca
NoMarcado
Imagen Marcada
Imagen control
Lugar de Imagen Lugar de Imagen
Perfusión
WFPer =
Razón de PerfusiónPf ρ=
Tiempo Medio de Tránsito
mttmtt TqV
TVF 0==
0VVq ≡
Fracción de volumen de sangre
Modelo de Perfusión
Modelo CapilaresRadio promedio: 3 µm
Largo promedio: 750 µmVelocidad media a través del capilar : 300-500 µm/s.
Distancia recorrida en 100ms: 30-50 µmDensidad de capilares: 400-500/mm3
Número de capilares en un vóxel de 1x1x7 mm3: 3000
31cm OH 222103× D = 3,4 · 10-5 cm2 /stiene moléculas de
μ1001210,266 5 =××== −DtL
μ10=celulad
Secuencia de experimentos para ASLSecuencia de experimentos para ASL
Plano de imagen marcada
Banda de inversión con
pulso 1800
Momento 1Momento 1
Momento 2Momento 2 Banda de inversión de
compensación con pulso 1800
Momento 3Momento 3
Imag
en d
e C
ontro
l
Momento 4Momento 4
ΔΔt =T It =T I
Las flechas azules indica la dirección del flujo
Mapas de Perfusión
tiempo
inte
nsid
ad
• La integral = Volumen Sanguíneo Crebral
(CBV)
Inyeccion de contraste
0
• Deconvolucionar esta función da el Flujo Sanguíneo Cerebral (CBF)
Tiempo Medio de Tránsito (MTT)
Área =λ
10
Tiempo (s)
Área α CBV
Tiempo (s)
10 20 30 40
10 20 30 40
Proceso real
Proceso de medición
Señales de SE y GRE con agente contrastante
Spin Eco
Gradiente de Eco
100 %
80
60
40
20
0
50 ml
40
30
20
10
0↑ K++
↓ síntesis proteica
↑ expresión genética selectiva
pérdida neuronal selectiva
↑ [lactato]
liberación de glutamato , ↓ pH
infarto
↓ ATP , ↓ PCr
Umbrales de flujo sanguíneo cerebral
Los umbrales de daño cerebral por isquemia son dinámicos.
Principales eventos de la cascada isquémica
1. DisminuciDisminucióón n Glucosa y ATPGlucosa y ATP
2. Acidosis celular (desnat. Prot. Altera función de prot. dependiente de PH y la re captación de neuro trasmisores, promueve radicales libres.)
3. Liberación de Glutamato neurotransmisor excitatorio
Receptores.
NMDA: N-metil-D-Aspartato (entrada de Ca2+ y Na+)KA: KainateAMPA: alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazol-4-propionato (entrada de Ca2+ y Na+)Trans-ACPD: 1S,3R-trans-1-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxilatoL-AP4: L-2-amino-4-acido fosfonobutanóico.
4. Influjo de Ca2+ (activación de enzimas proteasas, fosfolipasas, lipasas y endonucleasasas).
5. Degradación de fosfolípidos de membrana.6. Inflamación y edema.7. GeneraciGeneracióón de radicales libresn de radicales libres..
Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones BiológicasInstituto de Farmacia y Alimentos, UH
MRS in vivo. Metabolitos
Decrecen durante la isquemiaDecrecen durante la isquemia
r
r
r
r
BBBppm
ωωωδ −
=−
= 00)(
Ejemplo de ensayo de trombolíticos para Ictus
μPliPli= Microplasmin= Microplasmin
tPAtPA = = Activador delActivador delPlasminPlasminóógenogeno
Tisular Tisular
Radiology: Vol244: N 2—August 2007
Modelo Isquémico 1.5T (22 Oct 2009)
Coronal T2. Espesor 2 mm, Resolución 140 x 140 µm.
La lesión se muestra hiperintensa
0 2 4 6 8 10 12 14 160
10
20
30
40
50
60
70
80
Planos
RS
R (U
R)
Phantom B2
Flex S coronalExtremity coronal
Instrumentos y aditamentos
Diámetros fibras nerviosas entre 1 - 10µm. Células Betz tienen diámetros entre10 - 22 µm.
( ) ( ) 627
0
2
21 −− Δ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛∝ rB
TT
RSTimag
Bobinas, Electrónica, Criogénia,Secuencias de impulsos.
Agentes contrastantes, secuencias de impulsos.
Imanes, Transferencia de Magnetización.
Para una ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
RS ( ) min51 36 =⇒⟩⟨=Δ − Timagmmr
( ) añosTimagmr 101 36 =⇒⟩⟨=Δ − μ
Resoluciones límites ≈10- 20μ
Posibilidades de las μRM e ImRM
• Herramienta efectiva en el establecimiento de la relación metabólica y genotípica con la expresión fenotípica y para comprobar diseños de moléculas activas, su relación estructura-función e interacción con blancos terapéuticos.
• Aceleran y abaratan los ensayos preclínicos y clínicos. En breve los estudios por imágenes serán ineludibles para el diseño, desarrollo y validación de nuevas drogas.
• Las técnicas y métodos de IRM desarrollados en animales son trasladables a humanos y viceversa.
• Menor consumo de animales, reactivos.• Precisión y cuantificación mayores.• Menor laboriosidad.
Unidad RMUnidad RM
Proyecto constructivo de la Unidad de Resonancia Magnética Polo
9,4 T9,4 T3,0 T3,0 T
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