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Preparación de muestras:
Simplificando la Extracción en Fase Sólida
Xavier Rodríguez Piró
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Cuestiones previas
Es imprescindible activar el sonido en su ordenador
Les recomendamos abrir la ventana del chat: – Durante el webinario quizás les enviaremos algún mensaje por esta
vía – Si tienen preguntas las deben realizar por esta vía
La presentación durará unos 45 minutos. Al final habrá tiempo para comentar alguna pregunta
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Agenda
Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras
Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) – Introducción a “Simple Prep”
Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”
Conclusiones
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Retos actuales de la Industria
Retos empresariales
– Aumentar los beneficios – Disminuir los costes – Maximizar el uso de los
recursos
Retos científicos
– Hacer más con menos – Muestras/analitos diversos – Dar resultados más
rápidamente
Necesidades de los laboratorios hoy en día…
¿Cómo afrontar estas necesidades?
vs.
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Comparativa de distintas Técnicas de Preparación de Muestra
Menor Mayor Sensibilidad
Precipitación de proteínas
Extracción Líquido / Líquido
Extracción Líquida en soporte
sólido (SLE)
Extracción en Fase Sólida
(EFS)
Más rápida Más limpia Preparación de Muestra
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Técnicas de Preparación de Muestra: Motivos para su elección
Precipitación de proteínas
Extracción Líquido / Líquido
Extracción Líquida en
soporte sólido (SLE)
Extracción en Fase Solida
(EFS)
Opción simple
Económica
Rápida
Reduce la complejidad de la
muestra
“Suficiente”
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Técnicas de Preparación de Muestra: Percepciones
Precipitación de proteínas
Extracción Líquido / Líquido
Extracción líquida en
soporte sólido (SLE)
Extracción en Fase Sólida
(EFS)
La Precipitación de Proteínas es “Simple”
La percepción de LLE & SLE es
que son técnicas “Simples”
La percepción de la EFS es que es
una técnica “Compleja”
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Técnicas de Preparación de Muestra: Percepciones
Precipitación de proteínas
Extracción Líquido / Líquido
Extracción líquida en
soporte sólido (SLE)
Extracción en Fase Sólida
(EFS)
La Precipitación de Proteínas es “Simple”
La percepción de LLE & SLE es
que son técnicas “Simples”
La percepción de la EFS es que es
una técnica “Compleja”
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Técnicas de Preparación de Muestra: Un nuevo enfoque
Precipitación de proteínas
Extracción Líquido / Líquido
Extracción Líquida en
soporte sólido (SLE)
Extracción en Fase Sólida
(EFS)
La EFS es percibida como una técnica “Compleja”:
Demasiadas etapas
Múltiples sorbentes disponibles Necesidad de desarrollar el
método
¿Podemos simplificar el proceso?
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Historia – Simplificando la EFS
Desde 1996, Waters ha intentado simplificar el proceso de preparación de muestra mediante EFS con sorbentes y protocolos genéricos – Oasis HLB: introducido en el mercado en 1996 como el primer
sorbente de EFS polimérico y humectable – Sorbente de referencia en preparación de muestra durante los
últimos 18 años – Técnica de preparación de muestra de elección para análisis
por LC-MS por la limpieza de sus extractos y su carácter genérico.
– Tecnología de EFS conocida – Protocolo genérico con 5 etapas
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Hydrophilic-Lipophilic Balanced Copolymer
Sorbentes Oasis: HLB
• Humectable • Retención de polares • Estable a todos los pH’s (1-14) • Sin interacciones con silanoles • Area superficial específica elevada (810 m2/g) • Recuperaciones elevadas para ácidos, bases y neutros
Monomero Hidrofílico
Monomero Lipofílico
N O
Retención por Fase Inversa Retención de Polares
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Oasis HLB: Importancia de la humectabilidad
Procainamide
Acetaminophen (polar) Ranitidine
Propranolol Doxepin
% S
PE
Rec
over
y
En sorbentes no humectables el secado de los poros tiene como resultado la no retención de los analitos en el paso de carga recuperaciones bajas e irreproducibles Con Oasis el secado del sorbente no impacta las recuperaciones
C18 (1cc/100mg) HLB (1cc/30mg)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 Drying Time (minutes)
0
20
40
60
80
100
0 5 10 Drying Time (minutes)
Acetaminophen (Polar)
• Sorbente acondicionado con MeOH • Equilibrado con agua • Secado durante tiempos distintos • Carga de la muestra • Elución
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Oasis HLB Protocolo Genérico
Preparar la muestra
Acondicionar/Equilibrar 1 mL metanol, 1 mL agua
Carga de la muestra
Lavar 1 mL 5% metanol/agua
Eluir 1 mL metanol
Evaporar, Reconstituir
Oasis® HLB Protocolo EFS
Condiciones para cartuchos de 1 cc 30 mg
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¿Cómo se comportan otros sorbentes poliméricos de EFS?
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Recuperaciones (4 réplicas) Comparativa
Competitor S Competitor S-X Competitor P Oasis HLB
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Historia – Simplificando la EFS
Introducción de los sorbentes de modo mixto: Fase inversa e intercambio iónico – Simplificar los métodos de preparación de muestra complejos con
protocolos genéricos – 2 Protocolos para 4 sorbentes: estrategia de 2x4
Introducción de Ostro: preparación de muestras en modo pass-
through …
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Simplificando la EFS: preparación de muestra en modo pass-through
Cargar la muestra
Analitos de interés
Retención de fosfolípidos Sorbente
Ostro
Retención de Proteínas
Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas y los fosfolípidos
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¿Qué es Ostro?
Ostro es una producto para la preparación de muestra diseñado para eliminar las proteínas y los fosfolípidos presentes en la muestra gracias a una combinación de filtración e interaccción con el sorbente
Beneficios: – Muestras más limpias en menos tiempo – Protocolo sencillo y genérico que elimina la necesidad de desarrollo
de métodos
Ostro proporciona métodos consistentes, robustos y rápidos utilizando un protocolo simple y fácil de implementar
Matrices y campos típicos de aplicación: – Suero, plasma, sangre total, leche, tejidos y otras matrices que
contengan proteínas y lípidos – Toxicología, Clínica, Bioanálisis, Alimentación, Medio Ambiente etc.
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Ostro: Campos de aplicación y pretratamiento según matrices
Clínica / Toxicología sangre total
• Sangre total: lísis con
Sulfato de Zinc
Bioanálisis / Clínica Plasma/Suero
• No necesario
Alimentación Leche/Tejido
• Extracción con
acetonitrilo
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Ostro: ¿Cómo funciona?
Clinica / Toxicología sangre total/plasma
• Sangre total: lísis con
Sulfato de Zinc
Bioanálisis Plasma/Suero
• No necesario
Alimentación Leche/Tejido
• Extracción con
acetonitrilo Cargar la muestra
Añadir solvente
Mezclar
Analitos pasan
Colectar & Inyectar
Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas, los fosfolípidos y el material particulado
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Ostro en Toxicología: Análisis de opiáceos en sangre total
Los laboratorios de toxicología-forense requieren a menudo analizar drogas en sangre total
Muchas estrategias de preparación de muesta se han usado para el análisis de sangre total
Ostro representa una alternativa simple que permite realizar todo el proceso en los pocillos de la placa
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Ostro en Toxicología: Protocolo de preparación de muestra
Añadir 150 μL de solución 0.1 M ZnSO4 /0.1 M NH4CH3COOH
Añadir 50 µL of sangre total
Mezclar (para lisar las células)
Añadir 600 µL de ACN
Vortex
Pass through (vacío o presión positiva)
Evaporar (N2)
Reconstituir con 50 µL de 0.1% ácido fórmico en 2% acetonitrilo
Analizar
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Ostro en Toxicología: Recuperaciones de opiáceos en sangre total
Ostro proporciona recuperaciones reproducibles
Recuperaciones medias en sangre total (n=4)
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Removal of phospholipids from whole milk using Ostro
Ostro en Alimentación: análisis de drogas veterinarias en leche
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Agenda
Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras
Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) – Introducción a “Simple Prep”
Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”
Conclusiones
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Introducción a “SIMPLE PREP”
¡ Convierta la preparación de muestra en algo rápido y sencillo !
Sigamos con algo más de información básica…
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Formatos de Oasis:
Carga típica: 250-1000 µL de muestra no diluida
Volumen de elución mínimo: alrededor de 200 µL
Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar
Carga típica: 25-375 μL de muestra no diluida (=50-750 µL de muestra diluida)
Volumen de elución mínimo: 25 μL
Evaporación y reconstitución no necesarias para concentrar
Placa convencional Placa µElution
Carga típica: 0,5-1000 mL de muestra
Volumen de elución mínimo: alrededor de 0,5 mL
Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar
Cartuchos
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Placa Oasis µElution
Diseñada para la limpieza y la concentración en fluidos biológicos
Contiene 2 mg/pocillo de sorbente Oasis para la extraccíón de una amplia gama de compuestos ácidos, básicos y neutros
Ideal para aquellos usuarios con volumenes de muestra reducidos (< 200 µL)
Permite la elución con <50 µL, pudiendo concentrar hasta 15 veces los analitos sin evaporación ni reconstitución
Compatible con la mayoría de sistemas robóticos de manejo de líquidos de alto rendimiento, tanto por vacío como por presión positiva
Uniendo el diseño específico de la placa con las excelentes propiedades del sorbente Oasis HLB podemos llevar la EFS a un nuevo nivel de simplicidad, no posible en la inmensa mayoría de otros sorbentes/formatos: – Protocolo con 3 únicos pasos: Carga-Lavado-Elución – Sin necesidad de Acondicionar y Equilibrar ni de Evaporar y
Reconstituir
Diseño Patentado
Compatible con el diseño estándard
ANSI
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Protocolo EFS estándard con µElution
Acondicionar • 200 µL Metanol (MeOH)
Equilibrar • 200 µL H2O
Lavado • 200 µL 5% MeOH en H2O
Elución • 25 µL*2 MeOH
Carga
• 200 µL plasma diluido y dopado (100 µL plasma + 100µL 4% H3PO4)
100 µL Plasma 5 µg/mL
Eluato 10 µg/mL
A menudo para la elución en µElution se utiliza la mezcla ACN:MeOH (6:4)
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Protocolo EFS estándard con µElution
Eliminacion de estos pasos Acondicionar
• 200 µL Metanol (MeOH)
Equilibrar • 200 µL H2O
Lavado • 200 µL 5% MeOH en H2O
Elución • 25 µL*2 MeOH
Carga
• 200 µL plasma diluido y dopado (100 µL plasma + 100µL 4% H3PO4)
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Comparativa de protocolos Oasis µElution: Estándard vs. Simplificado
Acondicionar
Equilibrar
Lavado • 200 µL 5% MeOH en H2O
Elución • 25 µL*2 MeOH
Carga
• 200 µL plasma diluido y dopado (100 µL plasma + 100µL 4% H3PO4)
• 200 µL Metanol (MeOH)
• 200 µL H2O
• 200 µL 5% MeOH en H2O
• 25 µL*2 MeOH
• 200 µL plasma diluido y dopado (100 µL plasma + 100µL 4% H3PO4)
Inyección directa del eluato Evaluación de recuperaciones, variabilidad, efecto matriz y limpieza del extracto
Estándard Simplificado
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Agenda
Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras
Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) – Introducción a “Simple Prep”
Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”
Conclusiones
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Evaluación del Protocolo Simplificado
Comparar los protocolos estándard y simplificado – Recuperaciones, Efecto Matriz y limpieza del extracto
Validación del protocolo simplificado – Reproducibilidad lote a lote (años 2005 -2013) – Capacidad de carga de plasma
Comparitivas: – Otras matrices: orina – Otros formatos: placas de 10mg y cartuchos de 30mg – Otros sorbentes: Oasis HLB vs. sorbentes C18 de base sílice y
poliméricos
Resumen
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Condiciones LC de las pruebas
Instrumento ACQUITY UPLC I class - Xevo TQ-S
Columna UPLC 1.7 µm CSH C18, 2.1 x 100mm Temperatura Columna 40°C Temperatura Muestra 10°C
Tiempo de cromatograma (Caudal) 7 minutes (0.5 mL/min)
Fase Móvil A: Agua con 0.1% ácido fórmico Fase Móvil B: ACN con 0.1% ácido fórmico
Solventes de limpieza (Strong y Weak)
70/30 ACN/agua con 2% ácido fórmico
Seal wash 10% MeOH Detección MS: Xevo TQ-S
Condiciones MS ESI+ MRM
CSH: Charged Surface Hybrid UPLC : Ultra Performance Liquid chromatography
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Analitos
Name pKa Log P Comments
1B Azidothymidine (AZT) 9.68 0.05 Antiretroviral drug for HIV/AIDS 2B 7-Hydroxycoumarin 7.8 1.6 Gradient in sunscreen, absorb UV 3A Phenacetin 2.2 1.6 Pain, fever reducer
4N Betamethasone -- 1.1 Anti-inflammatory and immunosuppressive
5B Protriptyline 8.2 4.4 Antidepressant 6A Alprazolam 2.4 4.9 Panic and anxiety disorders 7B Amitriptyline 9.7 4.8 Antidepressant 8A Naproxen 4.2 3.2 Pain, fever reducer 9B Propranolol 9.5 2.5 Hypertension
Drogas para distintas campos de aplicación Amplio rango de pKas y Log Ps (indicación de la hidrofobicidad)
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Recuperaciones con muestras plasmáticas: protocolo estándard vs. Simplificado
Protocolo de 5 pasos vs. protocolo de 3 pasos: Recuperaciones y desviaciones estándard
comparables Recuperaciones medias >90% y RSDs <5%
)dopada-postmuestra deRespuesta
extraídamuestra deRespuesta (100ónRecuperaci ×=
Recuperaciones
0
20
40
60
80
100
120
AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox AVG
Protocolo estándard Protocolo simplificado
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Factor de matriz (MF): Protocolo estándard vs. simplificado
* Bioanalytical Method Validation Guide de la European Medicines Agency, 2012
blancoenRespuesta matrizenRespuesta MF =*
Protocolo estándard Protocolo simplificado
Matrix factor
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
Procain N
-
acety AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox
Factores de Matriz equivalentes con ambos protocolos (MF de 1.00±0.15 obtenidos con el protocolo simplificado
(Carga-Lavado-Elución) ) Factor de Matriz:
1.0 = no hay efecto matriz >1.0 = ion enhancement <1.0 = ion suppression
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Limpieza del extracto: Comparativa
No se observan diferencias en el test de limpieza por MS entre el protocolo de 5 pasos y el de 3 pasos (Carga-Lavado-Elución)
Cromatogramas LC/MS obtenidos usando un Xevo TQ-S
Referencia: MeOH
Extractos con el protocolo simplificado
Extractos con el protocolo estándard
ESI+ MS scan 50-650
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Protocolo Simplificado: Capacidad de carga de muestra
La capacidad de carga se mantiene constante en los distintos volumenes
La capacidad de carga evaluada fue entre 25 y 375 µL de plasma
Recuperacciones entre 80 - 110% con RSDs inferiores al 5% para todos los analitos
0
20
40 60 80
100 120
Diferentes volumenes de plasma cargados
25µL 50µL 100µL 250µL 375µL
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Protocolo Simplificado: Reproducibilidad lote a lote
Recuperaciones muy consistentes entre todos los lotes
Cuatro lotes diferentes de Oasis HLB seleccionados entre 2005 - 2013 Recuperaciones medias entre todos los lotes: 90±6%
0
20
40
60
80
100
120
Batch 1 Batch 2 Batch 3 Batch 4
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Veamos ahora cómo se comportan las muestras de orina
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Protocolo Simplificado vs. Estándard: Evaluación de fármacos en orina
Recuperaciones y Factores Matriz comparables
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox
0
20
40
60
80
100
Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox
Protocolo estándard Protocolo simplificado Recuperaciones Matrix factor
Protocol estándard Protocolo simplificado
Muestras de orina diluidas 1:1 con 100 mM acetato sódico pH 5.0
Matrix factors of 1±0.2 is considered comparable
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¿Podemos aplicar esto a otros sorbentes?
¿Y a otros formatos (cartuchos o placas convencionales)?
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Protocolo Simplificado: Comparativas
Comparativas realizadas: – Placas µElution, placas de 10mg y cartuchos – Oasis HLB vs. sorbente C18 de base sílice – Oasis HLB vs. otros sorbentes poliméricos
En las distintas comparativas nos centramos en 2 parámetros
– Recuperaciones – Efecto matriz
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Protocolo Simplificado: Cartuchos Oasis HLB 1cc/30 mg
Comparable (high) recoveries and (low) matrix effects with plasma when comparing 5-step protocol versus simplified 3-step (Load-Wash-Elute) protocol
Recuperaciones (elevadas) y efectos matriz (bajos) comparables entre el protocolo de 5 etapas y el de 3 (Carga-Lavado-Elución)
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Protocolo Simplificado vs. Estándard: Cartuchos Oasis HLB 1 cc/30 mg
Recuperaciones comparables entre los dos protocolos trabajando con cartuchos HLB y orina como matriz
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Oasis HLB µElution vs. C18 de base sílice µElution; Protocolo Simplificado
Únicamente HLB da buenos resultados trabajando con el protocolo simplificado de 3 etapas, tanto para plasma
como para orina
Con el sorbente C18 de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas
0
20
40
60
80
100
Plasma Oasis HLB Silica-based C18
Orina 0
5
Oasis HLB Silica-based C18
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Oasis HLB vs Sorbentes poliméricos similares; plasma - 4 réplicas
0
20
40
60
80
100
120
Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP
AZT
7 - Hydroxycoumarin
Phenacetin
Betamethasone
Protriptyline
Alprazolam
Methoxyverapamil
Terfenadine
Oasis AVG Recovery: 100% Oasis AVG RSD: 1%
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Comparativa de Efectos Matriz
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP
AZT
7 - Hydroxycoumarin
Phenacetin
Betamethasone
Protriptyline
Alprazolam
Methoxyverapamil
Terfenadine
blankin Responsematrix in ResponseMF =
Con Oasis HLB se obtienen los efectos matriz más bajos (mejores resultados)
Factor Matriz: 1.0 = efecto matriz inexistente
>1.0 = ion enhancement <1.0 = ion suppression
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Conclusiones de las comparativas con otros sorbentes
El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) únicamente funciona con Oasis HLB (un sorbente 100% humectable)
Con un sorbente C18 de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas
Con sorbentes poliméricos similares se obtienen recuperaciones inferiores.
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Próximos pasos: Protocolos simplificados para modos mixtos
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Protocolo Simplificado para Oasis MCX: Screening toxicológico en orina
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Screening Toxicológico en orina Resultados
Sistema LC: Acquity I-Class Columna: BEH Ph 2,1x100mm 1,7µm Detector: Xevo TQD
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Agenda
Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras
Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) – Introducción a “Simple Prep”
Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”
Conclusiones
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Conclusiones
El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) para Oasis HLB permite: – Mejorar el flujo de trabajo reduciendo los pasos del método de
extracción en fase sólida de 5 a 3 – Reducir alrededor de un 40% el tiempo de procesado, así como
ahorrar una media del 70% en solventes – Obtener recuperaciones elevadas, baja variabilidad y efectos matriz
bajos – Compatible con muestras plasmáticas y de orina – El protocolo funciona tanto para placas como para cartuchos Oasis – Los resultados de aplicar el protocolo simplificado a otros sorbentes
(C18 base sílice y poliméricos) son claramente peores – Trabajando con la placa µElution se puede cargar entre 25 y 375 µL
de muestra y concentrar los analitos hasta 15x
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Gracias
A continuación de este webinario: – Recepción
o Presentación en PDF
o Application Notes relacionadas • 720005140EN • 720005290EN • 720005053EN • 720004673EN
o Oferta del 30% en los productos Oasis, Ostro y Sep-Pak
Para cualquier pregunta: o Soporte Técnico Waters: 902 254 254 o [email protected] o Su Responsable de Ventas local
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Agradecimientos
Frank Marszalkowski Doug McCabe Chris Poz Mary Lame Pamela Iraneta Xin Zhang Euan Ross Erin Chambers Kenneth Fountain Gregory Lawless
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