PRODUCCIÓN DE BIOPLÁSTICOS A PARTIR DE BACTERIAS EMPLEANDO SUSTRATOS NO
CONVENCIONALES.
Autores Mariana Cardona Betancur. Msc.
Lina María Agudelo Escobar MsC.
Grupo de Biotransformación Escuela de Microbiología
10 de Septiembre de 2012
Contenido
Introducción
Planteamiento del Problema
Producción de bioplásticos empleando bacterias
Objetivos
Metodología
Resultados y Discusión
Conclusiones
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Planteamiento del Problema
LOS PLÁSTICOS
Su producción es de aprox. 260 millones de ton/año.
En su elaboración se consumen anualmente cerca de 270 millones de
toneladas de petróleo y gas.
Poseen tiempo de uso corto, por lo cual representan del 35-55% de los residuos no biodegradables que van a los rellenos
sanitarios.
No son degradados fácilmente por medio de procesos naturales y tardan en
descomponerse hasta 300 años.
El 11% de nuestra basura son desechos plásticos, y esto aumenta un 1% desde
1960.
Hay más de 18.000 piezas de bolsas plásticas que flotan en cada kilómetro cuadrado de los océanos del mundo.
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…”El mayor porcentaje de este material se convierte directamente en basura al usarse y ser desechado”…
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Metodologías que permitan la degradabilidad de los plásticos
Origen y Producción Ejemplos
Obtenidos naturalmente biomasa. Celulosa, Almidón, Quitosan
Sintetizados a partir de fuentes renovables.
Poli-ácido láctico(PLA), poli-
ácidos glicoles(PGA), poli-caprolactonas(PCL)
Producidos por microorganismos o modificados genéticamente.
Poli-hidroxialcanoatos(PHAs), poli-3-hidroxibutarato (PHB)
Mezclas de polímeros biodegradables.
Polivinilalcohol (PVOH) +
policaprolactonas (PCL)
Plásticos oxo-degradables
Plásticos bio-degradables
Fuente: European Bioplastic, 2009,
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Polímeros Biodegradables
Fuente: European Bioplastic, Mayo 2011
Producción mundial de Bioplásticos
Biodegradable
No Biodegradable
Total
Polihidroxialcanoatos (PHAs)
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Fermentación
Obtención, Extracción y
purificación PHAs
Productos Bioplásticos
Biodegradación (Compostaje)
Agua
Oxígeno
Energía
Moldeo
Reciclaje
Agua
CO2
Sustratos
agroindustriales
Los PHAs son bioplásticos producidos intracelularmente por bacterias, poseen propiedades termoplásticas, son biodegradables, biocompatibles, además, poseen un alto grado de polimerización y de cristalización.
La síntesis bacterial de Polihidroxialcanoatos (PHAs) en diversas especies, más de 300 en total, permite acumular intracelularmente grandes cantidades de polímero (aproximadamente 90% del peso celular) debido al metabolismo y a los requerimientos energéticos empleados por éstas bacterias.
Microorganismos productores de PHAs
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Bacterias que acumulan PHAs
Bacteria % peso seco
Ralstonia eutropha 96
Ralstonia eutropha ATCC 17699 80-90
Rhodobacter 80
Azospirillum 75
Azotobacter 73
Methylocystis 70
Leptothrix 67
Pseudomonas 67
Baggiatoa 57
Rhizobium 57
Fuente: http://www.biopolymer.net
Ralstonia eutropha ATCC 17699
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Ralstonia eutropha ATCC 17699
Material celular
La bacteria Ralstonia eutropha ATCC 17699 es la más estudiada para la producción de PHAs, debido a su excelente capacidad para acumular una gran cantidad de polímero como el ácido Polihidroxibutirato (PHB) a partir de fuentes de carbono simples como fructosa, glucosa, ácido acético y fuentes de carbono no convencionales como almidones, melazas y suero de leche.
PHAs scl: PHB PHA con 3HV
PHAs mcl: Poly(3HA)
PHAs mcl: PHA con 4HB PHA con HH
Azúcares
Malonil-CoA
(R)-3-Hidroxiacil-CoA
Ácidos
Grasos
Otras Rutas Metabólicas Dependiendo de la fuente de
carbono.
Ruta Metabólica I
Ruta Metabólica II
Ruta Metabólica III
Acetil-CoA
Los scl – PHA tiene propiedades cercanas a los plásticos convencionales, mientras que los mcl – PHA son considerados como elastómeros y gomas.
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Ruta Metabólica de Ralstonia eutropha ATCC 17699 para la producción de PHAs
Polihidroxialcanoatos (PHAs)
O CH2 O (CH2)n O CH2
CH C CH C CH
CH3 O R O CH3
R = hidrógeno Poly(3-hidroxipropionato)
R = metil Poly(3-hidroxibutirato)
n=1 R = etil Poly(3-hidroxivalerato)
R = propil Poly(3-hidroxihexanoato)
R = pentil Poly(3-hidroxioctanoato)
R = nonil Poly(3-hidroxidodecanoato)
n=2 R = hidrógeno Poly(4-hidroxibutirato)
R = metil Poly(4-hidroxivalerato)
n=3 R = hidrógeno Poly(5-hidroxivalerato)
R = metil Poly(5-hidroxihexanoato)
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Todos los PHAs se caracterizan por tener el mismo monómero con diferente radical alquilo que varía de 1 a 14 carbonos. Los PHAs pueden ser divididos en tres extensos grupos: Short chain length (scl - PHA) Medium chain length (mcl - PHA) Long chain length (lcl – PHA).
Objetivos
Objetivo General
Evaluar la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) empleando sustratos no convencionales.
Objetivos Específicos
Evaluar los sustratos harina de yuca y banano de rechazo para la producción de PHAs a nivel de erlenmeyer y a nivel de 5L.
Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.
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Metodología
Separación y Obtención del
Metabolito
Caracterización del PHA
Extracción y
Purificación del PHA.
Cuantificación del PHA.
Activación y Conservación del microorganismo.
Determinación de
la relación C/N
mínima para el
microorganismo.
Producción de PHAs en sustratos
convencionales. Producción de
PHAs empleando banano de rechazo a
diferentes C/N.
Caracterización estructural y termo-
mecánica del polímero.
Producción de PHAs
Obtención y estandarización del inóculo.
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Metodología
Análisis macroscópico de la colonia y microscópico de la bacteria y la formación intracelular del polímero.
Resultados
Por medio del cultivo en caja Petri se realizó un análisis Macroscópico de la colonia bacteriana y por medio del método de siembra en superficie de la caja se realizó un análisis Microscópico del microorganismo para determinar la morfología de la colonia . Se realizó tinción Gram
Se hizó el análisis de la formación y polimerización intracelular del polímero en el tiempo, por medio de Espectroscopía Raman.
Se realizó un análisis cualitativo de la acumulación del polímero por medio de tinciones con Negro Sudán
Análisis Macroscópico de la Colonia
Análisis Microscópico del microorganismo
TFY TSB LB
400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200
Bacteria 32 h
Bacteria 24 h
Bacteria 12 h
Bacteria 6 h
Bacteria 3 h
Bacteria 0 h
Inte
ns
ida
d (
u.a
)
Nْ mero de onda (cm-1)
PHB patrَ n
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Resultados
Determinación de los requerimientos nutricionales mínimos para el microorganismo
C6H12O6 + 2,87O2 + 0,744NH3 = 3CH1.77O0,5N0,248 + 4,366H2O + 3CO2
Con base en está ecuación la relación Carbono/Nitrógeno para no limitar el crecimiento celular será: 6,91gC/gN. Al emplear Glucosa como fuente de carbono y Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno la relación C/N determinada fue 3,4562 g C/g N.
Balance Global: CH2O + oO2 + aNH3 = Yx/s CH1.77O0,5N0,248 + wH2O + cCO2
Balance de Carbono: 1 = Yx/s + c Balance de Nitrógeno: a = 0,248Yx/s Balance de Oxígeno: 1 + o = 0,5Yx/s + w + c Electrones disponibles: Гs + o ГO2 = ГxYx/sc
De este modo la ecuación de crecimiento para Ralstonia eutropha ATCC 17699 será: CH2O + 0,4781O2 + 0,124NH3 = 0,5CH1.77O0,5N0,248 + 0,7276H2O + 0,5CO2
1
2
3
4
Luego: De 4: o = 0,4781 De 1: c = 0,5 De 2: a = 0,124 De 3: w = 0,7276
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Metodología
Evaluación de diferentes relaciones C/N para la producción de PHAs
Resultados
Se realizó un diseño experimental multifactorial categórico, empleando el paquete estadístico Statgraphics centurión XVI.I, se evaluaron cinco relaciones Carbono/Nitrógeno (5; 6,9; 10; 20; 40) para dos medios de cultivo empleando fuentes de carbono convencionales como la glucosa y la fructosa. Los treinta experimentos que arrojó el diseño de experimentos fueron llevados a cabo bajo las mismas condiciones operacionales establecidas, 30oC, 150 rpm y 36 horas. La extracción y purificación del polímero, se realizó empleando la metodología descrita. Las variable respuesta fue la concentración de PHA en (g/L).
Producción de PHAs empleando Glucosa y Sulfato de Amonio a diferentes relaciones C/N.
Producción de PHAs empleando Fructosa y Sulfato de Amonio a diferentes relaciones C/N.
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Composición y Preparación del medio de cultivo de Producción empleando sustratos no convencionales
Metal
Jarabe Glucosado
Harina de
yuca
Banano de
Rechazo Potasio (% de K) 0,15±0,001 775,6±10,1
Sodio (mg de Na/kg) 18,0±0,2 1,73±0,08
Calcio (mg de Ca/kg) 16,1±0,8 8,03±0,9
Hierro (mg de Fe/kg) 6,14±0,09 0,0643±0,003
Manganeso (mg de Mn/kg) 0,605±0,006 1,84±0,01
Cobre (mg deCu/kg) Menor de
0,0045
Menor de 0,0045
Magnesio (mg de Mg/kg) 84,3±1,1 41,4±0,1
Niquel (mg de Ni/kg) 0,0254±0,002 Menor de 0,008
Cobalto (mg de Co/kg) 0,0854±0,0013 Menor de 0,01
Zinc (mg de Zn/kg) 0,428±0,008 0,279±0,001
Análisis de Absorción atómica
Determinación de Azucares reductores y glucosa
Análisis Bromatológico
Metal Harina de
yuca
Banano
de
Rechazo % Humedad 79,26 79,20
% cenizas 0,44 0,80
% proteínas 0,95 1,35
% Grasa total 0,04 0,03
% Carbohidratos 19,31 18,62
Calorías Kcal/100g 81,4 80,15
Harina de
yuca
Banano de
Rechazo Azucares Reductores (g/L) 259,16±0,001 50,16±0,4
Glucosa (g/L) 248,29±0,001 31,98±0,02
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Obtención y caracterización del jarabe glucosado obtenido a partir de Banano de Rechazo y harina de yuca.
Producción de PHAs en el medio de cultivo suplementado con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de banano de rechazo a
diferentes relaciones C/N.
Producción de PHAs en el medio de cultivo suplementado con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de harina de yuca y
sulfato de amonio a diferentes relaciones C/N.
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Obtención y caracterización del jarabe glucosado obtenido a partir de Banano de Rechazo y harina de yuca.
Producción de PHAs en el medio de cultivo sin suplementación con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de harina de yuca y
sulfato de amonio a diferentes relaciones C/N.
Producción de PHAs en el medio de cultivo sin suplementación con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de banano de rechazo a
diferentes relaciones C/N.
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Metodología
2. Objetivo Evaluar la producción de PHA en reactor de 5L empleando el mejor medio no convencional.
Resultados
Se empleó un biorreactor Bioengineering RALF plus® con un volumen útil de 3 litros, agitado mecánicamente con control de pH y Temperatura. Al reactor se le adicionó agua destilada con la fuente de carbono en una concentración de 20g/L y se esterilizó. Todos los macroelementos y microelementos fueron preparados y suministrados al reactor uno a uno. El reactor se inoculó con un cultivo previamente activado en medio de cultivo TSB. El proceso fermentativo se llevó a cabo a 30oC y 150 rpm durante 36 horas. Para el análisis de los resultados se tomaron 50 mL de muestra cada 6 horas. A cada muestra se le evaluó la concentración de biomasa en g/L, la concentración de biopolímero en g/L y el consumo de sustrato .
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Resultados
3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.
Análisis Infrarrojos
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
Numero de Onda (cm-1
)
Glucosa
Harina
Fructosa
Banano
PHB comercial
Análisis Raman
400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200
PHA empleando
glucosa
PHA empleando
Banano de rechazo
PHA empleando
fructosa
PHB patrَ n
PHA empleando
harina de yuca
Inte
ns
ida
d (
u.a
)
Nùmero de onda (cm-1)
Compatibilidad con el patrón y según base de datos del FTIR del 98%.
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Resultados
3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.
Análisis Raman Variación en la cantidad de sustrato
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Resultados
3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.
Análisis DSC Propiedades térmicas de los polímeros sintetizados por R. eutropha empleando diferentes sustratos.
Comparación de las propiedades físicas de algunos PHAs y algunos polímeros convencionales
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Resultados
3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.
Análisis DSC Propiedades térmicas de los polímeros sintetizados por R. eutropha empleando diferentes sustratos.
Tm1
Tm2
Tcc
Tg
-4
-3
-2
-1
0
1
2H
ea
t F
low
(W
/g)
-20 30 80 130 180
Temperature (°C)
Banano––––––– Fructosa––––––– Glucosa––––––– Harina––––––– PHB comercial–––––––
Exo Up Universal V4.2E TA Instruments
Algunas Referencias Bibliográficas
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GRACIAS
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