TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Propagación in vitro de Pinus caribaea var. caribaea por organogénesis
Autora: Ing. Maité Chávez Milián
Tutor: Dr. C. Manuel de Feria Silva
Consultante: Dr. C. Raúl Barbón Rodríguez
Santa Clara, CUBA
2010
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RESUMEN
Con el objetivo de desarrollar la organogénesis de Pinus caribaea var. caribaea como una
alternativa para su propagación, se realizaron experimentos para establecer in vitro brotes
obtenidos de plantas donantes cultivadas en casa de cultivo, determinar el efecto del 6-
BAP y agentes gelificantes en la fase de multiplicación y definir la influencia de las
concentraciones de sacarosa y nutrientes inorgánicos en el desarrollo de las plantas
obtenidas in vitro. Los resultados demostraron que se logró establecer in vitro brotes
apicales obtenidos de plantas donantes cultivadas en casa de cultivo y se definieron las
características que debe tener este tipo de brote. En la fase de multiplicación, el 6-BAP
influyó en el desarrollo de las plantas in vitro, con una concentración de 6,66 µM se
lograron los mejores resultados en cuanto al número (6,75) y longitud de los brotes por
plantas (2,70 cm), con un coeficiente de multiplicación de 2,38. Se demostró que el agente
gelificante y su concentración, fueron factores que influyeron en el desarrollo in vitro de las
plantas en la fase de multiplicación, con 4,0 g.L-1 de Gelrite se obtuvo el mayor coeficiente
de multiplicación (2,87). Al incrementar la concentración de sacarosa a 60 g.L-1 en el último
subcultivo de la fase de multiplicación, se produjeron plantas con un color verde más
intenso, acículas más desarrolladas y diferenciadas, y el olor característico de los aceites
esenciales que se puede percibir al macerar tejido de árboles adultos, estos cambios, le
confirieron a estas plantas mejores características para ser subcultivadas a la fase de
enraizamiento. Al reducir la concentración de nutrientes inorgánicos en el medio de cultivo
de enraizamiento, se lograron los mayores porcentajes de residuos en la paredes celulares
de los tallos. Con 50% de nutrientes inorgánicos, se logró el mayor porcentaje de residuos
acumulados en la pared celular (47,95%) y con ello plantas con una mayor diferenciación
celular.
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ÍNDICE
Página
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
2.1 Generalidades sobre el cultivo 4
2.1.1 Origen y distribución 4
2.1.2 Clasificación taxonómica 5
2.1.3 Características botánicas 6
2.1.4 Importancia económica 7
2.2 Propagación en forestales 7
2.3 Propagación in vitro 10
2.3.1 Regeneración de plantas por organogénesis 11
2.3.1.1 Establecimiento in vitro 13
2.3.1.2 Multiplicación in vitro 14
2.3.1.2.1 Etapa de elongación 16
2.3.1.3 Fase de enraizamiento 18
2.3.1.4 Fase de aclimatización 25
3. MATERIALES Y MÉTODOS 28
3.1 Fase de establecimiento 28
3.1.1 Selección del tipo de brote 29
3.1.2 Efecto del 6-BAP 30
3.2 Fase de Multiplicación 31
3.2.1 Efecto del 6-BAP 32
3.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración 32
3.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite 33
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3.2.4 Efecto de la sacarosa 33
3.3 Fase de enraizamiento 34
3.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB 34
3.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos 35
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 38
4.1 Fase de establecimiento 38
4.1.1 Selección del tipo de brote 38
4.1.2 Efecto del 6-BAP 40
4.2 Fase de Multiplicación 43
4.2.1 Efecto del 6-BAP 43
4.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración 45
4.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite 48
4.2.4 Efecto de la sacarosa 50
4.3 Fase de enraizamiento 53
4.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB 53
4.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos 56
5. CONCLUSIONES 61
6. RECOMENDACIONES 62
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63
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Introducción _________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 1
1. INTRODUCCIÓN
Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barret y Golfari, es una variedad endémica de
la región occidental de Cuba, específicamente de la provincia de Pinar del Río y
del municipio especial Isla de la Juventud. Es la principal especie de pino plantada
en el país. Sin embargo, por el declinar marcado de sus plantaciones debido a la
deforestación, está clasificada como una variedad vulnerable en la lista roja
publicada por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza y los
Recursos Naturales (IUCN, 2010).
Económicamente resulta importante para la producción de madera y resina,
aunque se han desarrollado metodologías para la obtención de cera conífera,
pasta clorofila-caroteno y residuo forrajero a partir del empleo del follaje después
de la tala (Díaz et al., 2007).
La Empresa Forestal, en Cuba, propaga el pino de manera tradicional a partir de la
siembra de posturas obtenidas de semillas seleccionadas, pero este sistema no
garantiza la demanda del país (Cantillo et al., 2006 a), y no siempre se logra un
desarrollo homogéneo y con calidad de muchos de los árboles plantados. Una
alternativa que podría contribuir a solucionar esta problemática, es el empleo del
cultivo in vitro de órganos y tejidos vegetales. En Cuba, existen algunas
investigaciones sobre el tema en el género Pinus (Cantillo et al., 2006 a,b), pero no
se han desarrollado protocolos que se apliquen comercialmente para la
propagación in vitro de ninguna de las especies de pinos sembradas en el país.
A nivel mundial, la mayoría de los trabajos realizados para la propagación in vitro
del género Pinus, han utilizado embriones cigóticos inmaduros y maduros como
material vegetal inicial (Nehra et al., 2005; Lelu et al., 2006; Pullman y Skryabina,
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Introducción _________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 2
2007), a partir de los cuales, se han regenerado plantas por organogénesis (Tang
et al., 2004; Tang y Newton, 2005) y embriogénesis somática (Nehra et al., 2005;
Vales et al., 2007).
La regeneración de plantas por organogénesis, ha sido un método que ha
demostrado ser eficiente en la propagación comercial de muchas especies
vegetales (Zhang et al., 2006). Sin embargo, el establecimiento in vitro de brotes
apicales de pino, ha sido una alternativa poco abordada. Fundamentalmente
porque la respuesta in vitro del material vegetal depende en muchos casos del
genotipo, la edad en campo y las características de las plantas donantes (Li et al.,
2010). Por otra parte, los coeficientes de multiplicación y los porcentajes de
formación de raíces in vitro que se han obtenido para muchas especies, han sido
bajos (Oliveira et al., 2003; Stojicic y Budimir, 2004).
Desarrollar la propagación in vitro por organogénesis a partir de plantas donantes
obtenidas de semillas, permitirá mantener la diversidad biológica de P. caribaea
var. caribaea fruto de muchos de años de evolución, moldeada por los procesos
naturales y cada vez más, por la influencia del ser humano y multiplicar los nuevos
clones de esta variedad, obtenidos mediante trabajos de selección y mejoramiento
genético durante más de 40 años, los cuales presentan incrementos de hasta 30%
en la producción de madera y rinden entre 20-40% más de oleorresinas que los
árboles originales (Pérez, 2008, comunicación personal).
Atendiendo a la problemática abordada y los antecedentes presentados, se planteó
como hipótesis de trabajo la siguiente:
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Introducción _________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 3
“Es posible a partir de brotes obtenidos de plantas donantes cultivadas en casas
de cultivo, desarrollar la organogénesis de Pinus caribaea var. caribaea como una
alternativa para su propagación”.
Objetivos:
1. Lograr el establecimiento in vitro de brotes obtenidos de plantas donantes
cultivadas en casa de cultivo.
2. Determinar el efecto de las concentraciones de 6-BAP y agentes gelificantes
en la multiplicación in vitro de esta variedad.
3. Definir la influencia de las concentraciones de sacarosa y nutrientes
inorgánicos en el desarrollo de las plantas obtenidas in vitro.
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Revisión Bibliográfica _________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Generalidades sobre el cultivo
2.1.1 Origen y distribución
Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barret y Golfari, es una variedad endémica
del oeste de Cuba (específicamente de la provincia de Pinar del Río y el municipio
especial Isla de la Juventud), es la principal especie de pino plantada en el país,
fundamentalmente sobre suelos arenosos y latosólicos (García et al., 2009).
La figura 1 muestra, según García et al. (2009), ocho de las zonas de distribución
natural más importantes de la variedad en la provincia de Pinar del Río.
Figura 1. Zonas de distribución natural de Pinus caribaea var. caribaea en el 2009
en la provincia de Pinar del Río.
Esta limitada y escasa área de distribución natural comprende sólo 811 ha, que
también comparte con le especie Pinus tropicalis.
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Revisión Bibliográfica _________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 5
Es de destacar las afectaciones que han sufrido las áreas con poblaciones
naturales de esta variedad, provocadas fundamentalmente por factores como: los
incendios naturales o artificiales y el aprovechamiento maderero, convirtiéndose
los incendios forestales en el principal enemigo de estas poblaciones (García et al.,
2009), por lo que sería recomendable redoblar los esfuerzos en aras de conservar
todo el fondo genético y poner en práctica acciones que contribuyan de manera
sustancial a su conservación, por la importancia particular que tiene para la
variedad continuar habitando en estos sitios.
Por todo lo explicado anteriormente, a finales del 2006 la variedad fue clasificada
como vulnerable en la lista roja publicada por la Unión Internacional para la
Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales (IUCN, 2010).
2.1.2 Clasificación taxonómica
En 1851 el naturalista francés Pierre Marie Arthur Morelet clasificó esta especie de
pino como Pinus caribaea. Barrett y Golfari (1962), teniendo en cuenta el gran
interés que había despertado la especie en los planes de reforestación de
numerosos países del hemisferio sur, hicieron un minucioso estudio de la misma y
llegaron a la conclusión de que existían suficientes razones para considerar las
poblaciones geográficamente aisladas de Pinus caribaea Morelet como entidades
diferentes, aunque no merezcan el rango específico. Por lo tanto, se subdividió a
la especie en tres variedades: P. caribaea Morelet var. caribaea Barrett y Golfari,
de Cuba (típica); P. caribaea Morelet var. hondurensis Barrett y Golfari, de
Centroamérica (Pino de Honduras); y P. caribaea Morelet var. bahamensis Barrett
y Golfari, de las Islas Bahamas (Pino de Bahamas).
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Revisión Bibliográfica _________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 6
Desde el punto de vista taxonómico la variedad cubana está clasificada de la
siguiente forma:
Reino: Plantae División: Tracheophyta Clase: Coniferopsida Orden: Coniferales Familia: Pinaceae Género: Pinus Especie: caribaea Nombre binomial Pinus caribaea Nombre científico Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barrett y Golfari Nombre común Pino macho
2.1.3 Características botánicas
Según Dobler y Torres (1995) y Betancourt (1999), las características botánicas de
esta variedad son las siguientes:
Las hojas están comúnmente en grupos de dos a tres por fascículo, raramente
cuatro, de 15 a 25 cm de largo, de 0,1 a 0,13 cm de espesor, agudas, con bandas
estomáticas en todas las caras, de tres a seis canales resiníferos internos,
hipodermis biforme con tres a cinco hileras; vainas de 1,0 a 1,3 cm de largo,
castañas a negruzcas cuando adultas.
La corteza de los árboles jóvenes es grisácea, rugosa y resquebrajada en surcos
más o menos profundos; en los adultos se puede mantener esta característica o
bien formar placas grandes de color castaño, con fisuras poco profundas,
descascarándose en finas láminas.
Las características generales de la madera son: textura media, grano típicamente
recto, con albura poco diferenciable del duramen. La madera recién aserrada tiene
un lustre medio y es grasienta al tacto, en consonancia con la cantidad de resina
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Tesis de Maestría 7
que posea. Esta madera presenta anillos visibles, diferenciándose notablemente la
madera tardía de la temprana.
La flor es monoica. Las flores masculinas en amentos tienen de 2,0 a 3,0 cm de
longitud; las flores femeninas (estróbilos) son reflejos. Las flores masculinas
abundan más en las ramas bajas, las femeninas en la parte superior del árbol.
Las flores femeninas se transforman en conos (frutos), que son ligeramente
asimétricos, de 12 a 15 cm de longitud y entre 1,3 y 4,0 cm de diámetro; cónicos
cuando están cerrados, oblongos cuando abiertos. Los conos permanecen en el
árbol, si no se tumban, durante un año o más después de la diseminación de las
semillas. Los frutos contienen un promedio de entre 60 y 75 semillas. Las semillas
son de 0,6 cm de largo, 0,3 cm de ancho y 0,2 cm de espesor, angostamente
ovoides y triangulares, de color gris moteado a pardo claro. Las semillas contienen
de cuatro a ocho cotiledones.
2.1.4 Importancia económica
Económicamente resulta importante por su producción de madera y resina, aunque
se han desarrollado metodologías para la obtención de cera conífera, pasta
clorofila-caroteno y residuo forrajero a partir del empleo del follaje después de la
tala (Díaz et al., 2007).
2.2 Propagación en forestales
La clonación o propagación vegetativa de árboles ha sido una herramienta útil en
el mejoramiento forestal tradicional, y según Gronroos (1987), prometía ser la base
de la revolución en lo concerniente a la producción forestal.
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Tesis de Maestría 8
Si bien, la mejora genética clásica involucró selecciones, cruzamientos y pruebas
genéticas (de familias, híbridos o clones). Según López (2000), a corto plazo con
los nuevos avances en el campo de la biotecnología vegetal (organogénesis,
embriogénesis somática, mapeo de genes, selección asistida por marcadores
moleculares e ingeniería genética), sería posible incrementar aun más la
productividad y la competitividad que demandaba el mercado regional e
internacional al mejorar significativamente la homogeneidad de las plantaciones e
incrementar los rendimientos.
La aplicación de las técnicas de propagación vegetativa para la industria forestal es
importante porque permite aumentar el número de hectáreas plantadas con
material genético superior. Esto implica incrementar el rendimiento por hectárea de
plantación y mejorar así la rentabilidad del proceso (Niella y Rocha, 2004). En el
ámbito forestal, la mayor parte de los métodos de cultivo de tejidos han sido
utilizados para producir árboles directamente para reforestación, pero estas
técnicas son también un requisito básico para la producción de árboles
genéticamente modificados (Yanchuk, 2001). Las técnicas de cultivo de tejidos
comúnmente utilizadas en especies leñosas se basan en la regeneración de
plantas por organogénesis y embriogénesis somática. Estas técnicas permiten
obtener distintas respuestas, existiendo diferencias en función del genotipo, incluso
dentro de una misma especie.
En la propagación in vitro de pino por organogénesis, se han utilizado brotes
juveniles de 0,5 a 1,0 cm de longitud que son cultivados en medios de cultivo para
promover la brotación lateral a partir de yemas pre-formadas. Estos nuevos brotes
obtenidos pueden continuar siendo multiplicados y enraizados para lograr la
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Tesis de Maestría 9
formación de una planta normal (Niella y Rocha, 2004). La micropropagación tiene
el potencial de multiplicar rápidamente genotipos de alto valor para la
reforestación. Según Nandwani et al. (2001), estudios relacionados con la
regeneración de especies coníferas a partir de brotes adventicios habían permitido
obtener importantes progresos.
La embriogénesis somática es una técnica que utiliza embriones inmaduros
extraídos de las semillas (Lelu et al., 2006; Pullman y Skryabina, 2007) que son
cultivados en medios de cultivo específicos para obtener embriones somáticos.
Esto permite acelerar el proceso de multiplicación dado que no existe la etapa de
enraizamiento posterior como en el caso de organogénesis o multiplicación axilar.
Con la regeneración de plantas por embriogénesis somática se habilita también la
posibilidad de encapsular los embriones somáticos dando lugar a las semillas
artificiales, con las consecuencias positivas que esto significa para el
mantenimiento, transporte del material genético, automatización y mecanización de
los diferentes procesos.
Los tejidos embriogénicos obtenidos pueden ser crioconservados en nitrógeno
líquido a -196°C y ser guardados indefinidamente hasta su nueva utilización.
Simultáneamente el material vegetal crioconservado puede ser sometido a
ensayos clonales a campo. Luego de la evaluación en campo, los clones
superiores pueden recuperarse de los tanques de crioconservación y ser utilizados
para la producción de plántulas clonales de alto valor genético (Park, 2002; Niella y
Rocha, 2004; Pullmann et al., 2005).
La aplicación de estas técnicas a escala comercial está limitada a pocas coníferas,
en la última década han existido avances en la mayoría de las especies forestales
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Tesis de Maestría 10
de interés, y ya es una tecnología disponible para algunas especies del género
Pinus (Klimaszewska et al., 2007). Sin embargo, los gastos de desarrollo de tales
tecnologías de cultivo de tejido avanzadas son altos comparado con los de
macropropagación, lo que no la convierte en una tecnología disponible para todos
(Yanchuk, 2001).
2.3 Propagación in vitro
La propagación in vitro en coníferas se logrado por organogénesis y embriogénesis
somática. En el caso de la organogénesis, a través de la brotación de yemas
axilares y la inducción de yemas adventicias. La primera emplea ápices, yemas
laterales y microestacas. La inducción de yemas adventicias se produce sobre el
explante, previa formación de callo, a partir de meristemos preexistentes o tejido no
meristemático. Estas yemas se originan de una o varias células cuando se cultivan
con concentraciones elevadas de citoquininas. En la embriogénesis somática se
pueden emplear como explante embriones cigóticos maduros e inmaduros, que en
la mayoría de los casos se originan en forma indirecta a partir de callos
embriogénicos, o bien, directamente desde el explante (Echenique et al., 2004).
A nivel mundial, la mayoría de los trabajos realizados para la propagación in vitro
del género Pinus, han utilizado embriones cigóticos inmaduros y maduros como
material vegetal inicial (Nehra et al., 2005; Lelu et al., 2006; Pullman y Skryabina,
2007), a partir de los cuales, se han regenerado plantas por organogénesis (Tang
et al., 2004; Tang y Newton, 2005) y embriogénesis somática (Nehra et al., 2005;
Vales et al., 2007).
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Tesis de Maestría 11
En pino, la embriogénesis somática ha sido el método de regeneración de plantas
más estudiado y desarrollado (Pullman et al., 2005; Salanova et al., 2007;
Klimaszewska et al., 2007). Sin embargo, se ha descrito que en ocasiones se limita
la formación del callo y se producen pocos embriones somáticos por gramo de
masa fresca (Lelu et al., 2006; Maruyama et al., 2007). Estos autores explicaron,
que entre otras razones, estos resultados se deben a la influencia del genotipo, la
composición del medio de cultivo y al difícil control del desarrollo uniforme de todas
semillas en un lote de conos.
Además, para aplicar con fines comerciales la regeneración de plantas por
embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos es necesario haber
desarrollado programas de mejoramiento genético a partir de pruebas de
progenies, realizar selecciones genéticas y luego establecer huertos para producir
las semillas de las plantas mejoradas genéticamente (Klimaszewska et al., 2007).
En este sentido, en Cuba este programa aun no está disponible y se están
estableciendo los huertos semilleros de segunda generación a partir de plantas de
P. caribaea var. caribaea seleccionadas de las mejores combinaciones y de los
individuos más sobresalientes en cada familia (Pérez, 2008, comunicación
personal).
2.3.1 Regeneración de plantas por organogénesis
Los órganos como tallos, raíces y flores son inducidos a partir de una célula o
grupo de células, que según las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de
mantenerse en activa división. Esta totipotencia de las células somáticas puede
regenerar brotes, raíces y flores. La regeneración comprende diferentes fases:
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Tesis de Maestría 12
adquisición de competencia, inducción, y realización (De Klerk, 2002). En la
primera fase las células no responden al estímulo organogénico, pero adquieren la
competencia durante la desdiferenciación; en la fase de inducción, las células son
receptivas al estímulo morfogenético y hay una relación directa entre el tipo,
concentración y combinación de reguladores del crecimiento adicionados al medio
de cultivo y el órgano a desarrollar; y en la fase de realización la célula sufre las
sucesivas divisiones (Echenique et al., 2004). La organogénesis se caracteriza por
la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con el subsecuente
desarrollo de este en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre
los nuevos brotes y el tejido paterno.
Se reconocen cinco fases:
Fase 0: Preparativa: se selecciona la planta madre y se le realizan tratamientos
fitosanitarios, con el objetivo de mejorar la eficiencia en la implantación y el
desarrollo posterior de los cultivos in vitro.
Fase I: Establecimiento in vitro: el objetivo de esta fase es establecer cultivos
asépticos y viables con los cuales iniciar el proceso de propagación.
Fase II: Multiplicación in vitro: aquí se garantiza la propagación de los brotes y la
estabilidad genética de las plantas producidas. Se realiza el escalado.
Fase III: Enraizamiento: Puede ser in vitro o ex vitro y es donde se preparan las
plantas para su transferencia al suelo.
Fase IV: Aclimatización: es la fase final del proceso y por lo tanto, su meta es
lograr plantas listas para el transplante definitivo a campo.
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Tesis de Maestría 13
2.3.1.1 Establecimiento in vitro
La propagación in vitro a partir de árboles adultos siempre ha sido difícil debido a
problemas tales como el establecimiento de cultivos asépticos (severa
contaminación microbiana), la influencia de la época del año en la respuesta in
vitro, o a la acumulación de determinados metabolitos secundarios que provocan
fenolización (Agrawal et al., 2002).
Según Korban y Sul (2007), en algunas especies de coníferas las plantas
obtenidas de semillas pueden servir como plantas madres en casas de cultivo y ser
fuentes de material vegetal, si se mantienen y crecen bien, ya que proporcionan
gran cantidad de nuevos brotes como material vegetal para establecer in vitro.
En varias especies e híbridos del género Larix, un árbol conífero que se caracteriza
por su rápido crecimiento, Ewald (2007) empleó plantas de semilleros para obtener
los brotes que finalmente estableció in vitro.
Este autor también demostró que fue posible establecer plantas in vitro a partir de
árboles adultos pero al final del invierno ya que por la pérdida de las agujas en esa
época del año se facilitó y fue más efectiva la desinfección del material vegetal.
Entre los reguladores del crecimiento en plantas, las citoquininas han sido las que
mejores respuestas han permitido obtener durante el establecimiento in vitro de
muchas especies vegetales. En árboles adultos de Holarrhena antidysenterica,
Kumar et al. (2005) estudiaron el efecto de varias citoquininas en el
establecimiento in vitro de los brotes y las mejores respuestas las lograron con 6-
BAP.
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Tesis de Maestría 14
2.3.1.2 Multiplicación in vitro
Según Bonga y Von Aderkas (1992), en algunas coníferas, la regeneración de
plantas por organogénesis a partir de yemas axilares, fue eficaz. En años más
recientes se ha podido desarrollar este proceso incluso a partir de árboles adultos
(De Diego et al., 2008), pero en general, a lo largo de los años se ha observado
que no ha ocurrido así con la mayoría de las especies coníferas y en la práctica,
con el empleo de este método de regeneración, no se ha podido llegar a una etapa
de aplicación (Bonga et al., 2010).
La regeneración de plantas por organogénesis, ha sido un método que ha
demostrado ser eficiente en la propagación comercial de muchas especies
vegetales. Sin embargo, en Cuba, con respecto al género Pinus existen pocas
investigaciones sobre el tema (Cantillo et al., 2006 a,b) y no se han desarrollado
protocolos que se apliquen comercialmente para la propagación in vitro de ninguna
de las especies de pino plantadas en el país.
Esto se debe fundamentalmente, a que la respuesta in vitro del material vegetal
durante el proceso de propagación in vitro, depende en muchos casos del
genotipo, de la edad en campo y las características de las plantas donantes, y a
que los coeficientes de multiplicación y los porcentajes de formación de raíces in
vitro que se han obtenidos para muchas especies, han sido bajos.
Existen numerosas investigaciones que refieren la regeneración de plantas de pino
por organogénesis, pero a partir de embriones cigóticos (Tang et al., 2004; Tang y
Newton, 2005; Alonso et al., 2006). Sin embargo, el empleo de explantes tales
como brotes apicales, yemas axilares, acículas, etc., para el establecimiento in
vitro de plantas de pino han sido alternativas menos estudiadas. Por lo tanto,
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pocos trabajos describen resultados en la fase de multiplicación a partir de haber
establecido in vitro estos tipos de explantes.
Las citoquininas son reguladores del crecimiento muy eficaces para estimular la
iniciación directa o indirecta de brotes in vitro (van Staden et al., 2008). Según
estos autores, sus efectos en el cultivo de tejidos y órganos pueden variar según el
tipo de citoquinina, la concentración empleada en el medio de cultivo, si el material
vegetal a establecer in vitro se obtiene de tejido juvenil o tejido adulto, puede variar
además en función de la especie vegetal y del método de regeneración de plantas
empleado.
Según van Staden et al. (2008), cuando se utilizan altas concentraciones de
citoquininas en la fase de multiplicación, los brotes que se producen reducen su
desarrollo en longitud. Autores como Kumar et al. (2005), estudiaron el efecto de
varias citoquininas en la multiplicación in vitro de brotes apicales obtenidos de
árboles adultos de Holarrhena antidisentérica y las mejores respuestas las lograron
con 6-BAP.
Estos autores, al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP,
comprobaron que al igual que en muchas otras especies, las respuestas in vitro
para la mayoría de las variables evaluadas dependieron de las concentraciones
estudiadas.
Una determinada concentración de Agar puede ser considerada inadecuada si no
ayuda al desarrollo in vitro de los brotes o si favorece la aparición de plantas con
síntomas de hiperhidricidad. (Thorpe et al., 2008). Estos autores plantean que la
hiperhidricidad se puede reducir si se incrementa la concentración de Agar en el
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medio de cultivo, pero este incremento, regularmente está acompañado de una
disminución en el desarrollo y crecimiento de las plantas in vitro.
No obstante, se ha demostrado que existen diferencias en la composición y
características de cada uno de estos compuesto, por ejemplo, el Gelrite como
producto comercial está libre de impurezas orgánicas que si se encuentran en el
Agar (Thorpe et al., 2008) y tiene entre otras ventajas para la propagación in vitro
de plantas a gran escala, que su costo por litro es menor al del Agar y se emplea
en menor concentración que este, además, produce un gel más claro que el Agar y
con ello permite detectar más fácil cualquier contaminación microbiana.
2.3.1.2.1 Etapa de elongación
Muchos estudios en la propagación in vitro por organogénesis en el género Pinus
mencionan el desarrollo de esta etapa dentro del proceso y es que para lograr la
iniciación y crecimiento de brotes vigorosos para enraizar y aclimatizar existen tres
pasos necesarios:
a) Estimular de la división celular.
b) Desarrollar los brotes.
c) Lograr el crecimiento de los brotes.
Esta tricotomía es necesaria mencionarla dado que los tratamientos que estimulan
la división celular son antagonistas con los que provocan el crecimiento y
desarrollo. Lo mismo sucede durante el enraizamiento; aquí también los
tratamientos que estimulan la división celular en la base de los tallos son opuestos
a los que producen el crecimiento de las raíces in vitro (Amerson et al., 1982).
Existen varios factores que tienen un papel determinante en esta etapa:
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• Tipo de explante inicial
Con respecto al tamaño de brote que se utiliza para iniciar la etapa de elongación,
Coke (1996); Frampton et al. (1998) y Mathur et al. (2001) coinciden en que es
necesario partir de brotes que tengan un tamaño mayor a 0,5 cm. Otros autores en
trabajos más recientes sugieren utilizar brotes mayores de 2,0 cm para iniciar la
etapa de elongación (Prehn et al., 2003; Zhang et al., 2006); y esto permitirá la
obtención de brotes con mayor desarrollo en longitud para enraizar, en menor
tiempo.
Mathur et al. (2001) explican que cultivar grupos de brotes en lugar de brotes
individuales actúa en detrimento del desarrollo en longitud de los brotes.
• Tipos y concentración de nutrientes inorgánicos
Según Gamborg et al. (1976) el medio de cultivo basal es uno de los factores más
importantes que determinan el éxito del cultivo in vitro. Muchos de los medios de
cultivo utilizados en Pinus spp., han sido creados para otras especies, incluso
angiospermas, como el MS (Murashige y Skoog, 1962), el SH (Schenk y
Hildebrandt, 1972), el DCR (Gupta y Durzan, 1985) y el LP (Aitken Christie et al.,
1986). También se han utilizado esos medios de cultivo basales con distintas
concentraciones de nutrientes; y a partir de experimentos se han seleccionado los
medios de cultivo que mejores respuestas han dado. En la actualidad, uno de los
medios de cultivo basales más utilizado en pino es el Westvaco (WV5) descrito por
Coke (1996), con buenos resultados en el cultivo de tejidos in vitro, con una mejor
combinación de nutrientes inorgánicos, apropiada fuente de carbohidratos,
reguladores de crecimiento y carbón activado.
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• Reguladores del crecimiento
No es común encontrarlos en el medio de elongación; sin embargo, Tang et al.
(1998) suplementa el medio de cultivo con 0.5 mg.L-1 de ácido 3-indolbutírico (AIB)
y 1 mg.L-1 de ácido giberélico (AG3) obteniendo en seis semanas brotes de Pinus
taeda de 1,0 cm para enraizar in vitro. Con estos brotes obtuvo el 46% de
enraizamiento. La adición de auxinas al medio de elongación podría generar un
brote con mayor potencial de enraizamiento en la siguiente fase por inducir la
formación de raíces adventicias; además junto con el AG3 podría favorecer la
elongación de brotes ya que actúan en el alargamiento celular.
2.3.1.3 Fase de enraizamiento
• Enraizamiento in vitro
El enraizamiento de brotes de gimnospermas en condiciones in vitro, es
ampliamente reconocido como difícil de lograr (Nandwani et al., 2001;
Schestibratov et al., 2003; Parasharami et al., 2003; Prehn et al., 2003; Zhang et
al., 2006). Es un proceso lento; debido a que los brotes de la mayoría de las
coníferas, especialmente Pinus spp. enraízan a partir de un callo o tejido cicatricial
o directamente del tejido vascular, después de un tratamiento con auxinas.
El enraizamiento directo pocas veces se produce espontáneamente (Stojicic y
Budimir, 2004). Las raíces se generan siempre a partir de tejido meristemático, ya
sea por fuera de los conductos resiníferos en el enraizamiento directo, o por el
tejido meristemático que rodea el callo, en el indirecto. El cultivo in vitro no impide
la iniciación radicular en coníferas; los tratamientos con auxinas usualmente tienen
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Tesis de Maestría 19
un efecto positivo en el enraizamiento; es más rápido, más sincronizado y resulta
en más raíces por brote; pero la elongación radicular es severamente inhibida.
Algunos autores afirman que el desarrollo de raíces in vitro usualmente aumenta la
supervivencia al transplante dado que las raíces funcionales generan un balance
hídrico favorable. Estas raíces compensarían la pérdida de agua causada por
estomas no funcionales, y facilitarían la absorción de nutrientes. Una buena
respuesta y un aumento en la masa seca de estas plantas enraizadas in vitro
pueden favorecer una mejor toma de nutrientes. Sin embargo la presencia de raíces
durante el cultivo in vitro no siempre mejoraría el éxito al trasplante (Seelye et al.,
2003).
• Enraizamiento ex vitro
Un rápido enraizamiento mejoraría la calidad de las plantas, incluso es probable
que las plantas con un buen sistema radicular y una vigorosa conexión vascular
tengan una mayor tasa de crecimiento inicial en la fase de aclimatización. La
mayor parte de la bibliografía consultada cita el enraizamiento ex vitro de estacas
de Pinus taeda vía macropropagación, con distintos porcentajes de éxito en
función de la técnica empleada. Todos los trabajos mencionan la aplicación de un
tratamiento inductivo corto con auxinas en distintas concentraciones. Es importante
mencionar que entre los factores que podrían afectar el enraizamiento se
encuentran los siguientes:
• Tipo y concentración de la auxina
Durante estudios realizados para la formación de raíces in vitro, se demostró que
es fuertemente dependiente del tipo de auxina utilizada y su concentración. Varias
combinaciones, concentraciones y duración de tratamientos con auxinas han sido
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Tesis de Maestría 20
probadas con diferentes porcentajes de éxito. Las auxinas más utilizadas son el
AIB y el ANA para las distintas especies del género Pinus spp. (Kalia et al., 2007).
En los trabajos que utilizan ANA, las concentraciones oscilan desde 0,1 a 20 mg.L-1
desde minutos hasta varias horas (Nandwani et al., 2001) o tratamientos continuos
con concentraciones desde 0,01 mg.L-1 a 0,5 mg.L-1 de ANA pero generalmente
combinado con AIB en concentraciones de 1,0 a 20 mg.L-1 (Schestibratov et al.,
2003; Prehn et al., 2003), aunque son numerosos los trabajos que utilizan
solamente AIB para obtener mejores resultados en concentraciones que varían de
0,1 a 1000 mg.L-1 (Tang y Ouyang, 2000; Parasharami et al., 2003; Zhang et al.,
2006).
El ácido 3-indolacético (AIA) es la auxina menos potente siendo necesaria su
adición en concentraciones superiores a 5,0 mg.L-1, debiéndose su baja actividad a
la degradación que la luz produce de la misma.
Los resultados son variables, y mayormente se refieren a enraizamiento in vitro
con pulsos de auxinas seguidos de un periodo de elongación de raíces in vitro sin
reguladores, logrando porcentajes de supervivencia entre 0,0 y 90% en función del
tratamiento y la especie. Se observa en muchos de estos trabajos que los
porcentajes de enraizamiento pueden ser muy bajos o casi nulos si no se encuentra
la concentración óptima del regulador de crecimiento para la especie o variedad con
que se trabaja.
• Formas de aplicación de la auxina
Al comparar tratamientos de enraizamiento por pulsos o continuos, debe medirse
no solo el porcentaje de enraizamiento sino también el tiempo requerido para
enraizar. Los resultados con exposición continua varían entre 20% y 47% de
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Tesis de Maestría 21
enraizamiento en 12 semanas en un medio de cultivo con la mitad de los nutrientes
inorgánicos GD o DCR con 0,1 mg.L-1 de 6-BAP y 0,1 mg.L-1 de ANA o 2,0 mg.L-1
de AIB. En contraste, un tratamiento en forma de pulso con el mismo medio de
cultivo con 0,1 mg.L-1 de 6-BAP y 0,5 mg.L-1 de ANA durante seis a trece días
hasta el subcultivo en un medio de cultivo sin reguladores del crecimiento, produjo
un 85% de enraizamiento. El enraizamiento posterior a un pulso se completa en
cinco o seis semanas, por lo que el proceso completo requiere entre seis y ocho
semanas. En general los tratamientos por pulso brindan un mayor porcentaje de
enraizamiento en un período más corto de tiempo (Mathur et al., 2001).
Tratamientos cortos (10-30 minutos) con altas concentraciones de AIB (200 mg.L-1)
han sido suficientes para inducir la formación de raíces. La respuesta declina
rápidamente con un tiempo de exposición más prolongado a la mencionada
concentración, causando daños a los tejidos e inhibiendo el enraizamiento.
Una incubación prolongada en un medio de cultivo rico en auxinas puede causar
una callosidad excesiva, iniciación radicular retardada o una inhibición de la
elongación de las raíces iniciadas (Selby et al., 1991).
• Número de subcultivos
Se ha demostrado que la formación de raíces puede declinar con los subcultivos
sucesivos que han sufrido los brotes antes de su enraizamiento. Sin embargo, la
formación de raíces adventicias sería mas difícil de lograr de tejidos maduros que
de tejidos juveniles; y las condiciones in vitro probadas para diferentes especies
leñosas serían mas favorables para enraizar brotes maduros que las condiciones
ex vitro. Esto se debe a la posibilidad de rejuvenecer el tejido maduro a través de
sucesivos subcultivos en medios de cultivo apropiados, que inducen
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Tesis de Maestría 22
progresivamente a un aumento del potencial de formación de raíces adventicias
(Parasharami et al., 2003).
• Tipo de brote
Manteniendo todos los parámetros iguales, el tamaño del brote tiene una marcada
influencia en el enraizamiento. Los brotes mas largos enraízan mejor que los
brotes cortos, por lo que se recomiendan los mayores a 1,5 cm para enraizar. Sin
embargo, Coke (1996) demuestra que para realizar el enraizamiento ex vitro, son
necesarios brotes de longitud mayor a 4,0 cm, es decir, de mayor tamaño que el
requerido para enraizar en laboratorio.
• Concentración de las sales
Las etapas de inducción y crecimiento radicular se realizan, según la bibliografía,
en medios de cultivo con la concentración de nutrientes inorgánicos reducidos a la
mitad y cuando las raíces alcanzan los 0,5 cm de longitud ya están preparadas
para su trasplante a la fase de aclimatización (Mathur et al., 2001; Nandwani et al.,
2001; Parasharami et al., 2003).
• Influencia de la sacarosa
En las plantas, los carbohidratos tienen varias funciones esenciales. Ellos
constituyen sustratos para la respiración, juegan un importante papel en la vía de
síntesis de muchos compuestos, son elementos básicos de las macromoléculas y
controlan además, otros muchos procesos relacionados con el desarrollo de las
plantas (Gibson, 2000; Smeekens, 2000).
La sacarosa probablemente ha sido la fuente de carbohidratos más utilizada en el
cultivo in vitro de tejidos vegetales y numerosos estudios la han señalado como la
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Tesis de Maestría 23
fuente de carbono óptima (Alkhateeb, 2001). No obstante, no se debe olvidar que
existen enzimas invertasas que son liberadas al medio de cultivo por las plantas
cultivadas in vitro y que actúan en la hidrólisis de la sacarosa dando lugar a la
glucosa y la fructosa (Thorpe et al., 2008), con lo cual, es importante tener en
cuenta que las plantas in vitro dispondrán para su desarrollo no sólo de la
sacarosa, sino también de sus dos monosacáridos constituyentes.
Se conoce que los azúcares intervienen en diferentes procesos morfogenéticos,
una de las funciones más interesante se ha descrito en el desarrollo de las semillas
(Calamar y De Klerk, 2002). Otros estudios han demostrado que la glucosa se ha
asociado con la división celular y la sacarosa con la acumulación de sustancias de
reservas (Weber et al., 1998) y la inducción de la floración (Hong et al., 2006).
La capacidad de las plantas para metabolizar los diferentes tipos de carbohidratos
es diferente (Alkhateeb, 2008). Se ha descrito por algunos investigadores, que la
respuesta in vitro de los cultivos a diferentes tipos y concentraciones de
carbohidratos parece ser, en cierta medida, genotipo dependiente (Cuenca y
Vieitez, 2000) y se han realizado estudios para definir estas posibles
dependencias.
Se conoce que las altas concentraciones de sacarosa (>6.0%) en el medio de
cultivo han sido capaz de reducir la capacidad fotosintética de las plantas (Arigita
et al., 2002). También se ha descrito que estas altas concentraciones pueden
reprimir la expresión de genes y reducir el contenido de clorofila, afectar el Ciclo de
Calvin, así como reducir la actividad Rubisco y la concentración de Rubisco, lo que
conlleva a bajas tasas fotosintéticas (Premkumar et al., 2002; Sinha et al., 2002).
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Tesis de Maestría 24
Diferentes estudios han demostrado que existen efectos opuestos al aplicar
sacarosa al medio de cultivo ya que en algunos casos hay una respuesta favorable
y en otros se produce una inhibición del crecimiento (Van et al., 2001). A pesar de
que se ha examinado el efecto regulador de los azúcares, en particular, el papel de
la sacarosa en el desarrollo de la latencia, en la formación de órganos de
almacenamiento y la maduración de embriones somáticos, su papel como
molécula reguladora aun no ha sido totalmente dilucidado (Calamar y De Klerk,
2002).
Con relación a la acción de la sacarosa en la formación de órganos adventicios se
han realizado pocos estudios (Calamar y De Klerk, 2002). Según Warren et al.
(1994) la sacarosa incrementó la regeneración de tejido vascular en Lactuca sativa
(Lechuga), mientras que, en Malus domestica (Manzano), Pawlicki y Welander,
(1995) demostraron que el tipo de azúcar influyó en la formación de raíces.
Varios han sido los estudios encaminados a comprender mejor la respuesta de
diferentes especies coníferas para formar raíces in vitro. La adición al medio de
cultivo de auxinas, por lo general, en forma de AIB o ANA, ha sido una práctica
general para inducir la formación de raíces in vitro en coníferas (Niemi et al., 2002).
Sin embargo, se conoce que el éxito final de esta fase del proceso de propagación
in vitro, no solo depende de la adición al medio de cultivo de determinadas
concentraciones de auxinas. Por ejemplo, es importante tener en cuenta el efecto
que pueden ejercer las altas concentraciones de citoquininas (0.5-10 mg.L-1)
empleadas durante la fase de multiplicación, pues pueden inhibir o retrazar la
formación de raíces y también limitar los efectos estimuladores de las auxinas en
esta fase del proceso (Ben-Jaacov et al., 1991).
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Tesis de Maestría 25
En ocasiones, ha sido necesario realizar más de un subcultivo en medio de cultivo
libre de citoquininas, hasta que las concentraciones endógenas de este regulador
del crecimiento se han reducido lo suficiente en el tejido de la planta (van Staden et
al., 2008).
Otro elemento que se ha demostrado que es importante evaluar, está relacionado
con la influencia de la concentración de sacarosa, pues influye en la calidad
funcional de las plantas cuando estas son transferidas a condiciones ex vitro para
su aclimatización (Fuentes et al., 2005).
Se conoce que los carbohidratos juegan un papel importante en el cultivo in vitro
como fuentes de energía y carbono, así como agentes osmóticos, pero también,
están vinculados con la diferenciación de los elementos del xilema y floema
(Thorpe et al., 2008).
Ha sido descrito que al aumentar la concentración de sacarosa en el medio de
cultivo se incrementa el porcentaje de materia seca en las plantas (Kubota et al.,
2002; Shim et al., 2003). Lo anterior se debe, a que al aumentar el contenido de
sacarosa, el potencial osmótico del medio de cultivo disminuye (Cárdenas y
Villegas, 2002), se limita la absorción de agua, pero se favorece la asimilación de
sacarosa y con ello el incremento de materia seca.
Este incremento en el porcentaje de materia seca, está asociado al desarrollo de
los tejidos vasculares de las plantas, en particular con el proceso de lignificación.
2.3.1.4 Fase de aclimatización
Manipulando el ambiente in vitro las hojas, con mayor resistencia al estrés hídrico y
competentes fotosintéticos, pueden desarrollarse en el laboratorio, en una
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Tesis de Maestría 26
preaclimatización, preparando las plantas para la transferencia fuera del
laboratorio. Las raíces formadas in vitro pueden favorecer el crecimiento inicial ex
vitro; aunque la tasa de crecimiento óptima no ocurrirá hasta que las nuevas hojas
y raíces se desarrollen en el ambiente ex vitro (Seelye et al., 2003).
La aclimatización induce cambios morfológicos, anatómicos y fisiológicos que
hacen a la planta parecerse a una planta normal. Esta etapa es casi siempre
estresante y suele asociarse a la muerte de las plantas, generalmente por fuerte
deshidratación. En angiospermas la principal causa de muerte al transferir las
plantas a condiciones no estériles es la cutícula reducida y una pobre regulación
estomática ante la perdida de agua. Sin embargo, en algunas gimnospermas como
el género Pinus la regulación cuticular y estomática ante la pérdida de agua es
relativamente normal.
De esto se desprende que son otros los factores que producen la muerte de las
gimnospermas durante la fase de aclimatización. Se le ha prestado atención a la
morfología, anatomía interna y fisiología de las plantas obtenidas in vitro,
concluyendo que para lograr el éxito en la supervivencia y el crecimiento hay
características a tener en cuenta, como la longitud del brote; la calidad de los
brotes y la morfología del sistema radicular. Lo interesante es determinar la
morfología de plántula óptima y su relación con la supervivencia y crecimiento.
Para Pinus taeda, la calidad del brote es mucho más importante en la
supervivencia, que el número de raíces. En P. caribaea var. hondurensis x P.
tecunumanii, Haines et al. (2000), encontraron que porcentaje de enraizamiento y
número de raíces por planta estuvo relacionado con el genotipo; mientras que,
dentro de los parámetros morfológicos, la longitud de acículas primarias fue el
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Tesis de Maestría 27
mejor indicador. Estos autores concluyeron, que los brotes con mayor
enraizamiento, fueron aquellos que presentaron acículas primarias mayores a 2,5
cm de longitud, con el ápice activo y un diámetro basal mayor a 0,1 cm.
Existe poca información en relación al crecimiento en suelo de plántulas de
coníferas originadas in vitro, dado que muy pocas especies tuvieron éxito en este
sentido.
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Materiales y Métodos ________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 28
3. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente trabajo se desarrolló en el Instituto de Biotecnología de las Plantas de
la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas entre los años 2008 y 2010.
3.1 Fase de establecimiento
Condiciones generales
Brotes de P. caribaea var. caribaea con aproximadamente 3,0 cm de longitud
fueron cortados en horas tempranas de la mañana y se colocaron en 200 mL de
una solución estéril de ácido cítrico con una concentración de 500 mg.L-1. En el
laboratorio, los brotes fueron lavados con detergente comercial (2,0 g.L-1) y agua
común, el enjuague se realizó también con una solución de ácido cítrico similar a la
descrita anteriormente. Como agente desinfectante se empleó el Hipoclorito de
sodio al 2,0% y los brotes se expusieron a su acción durante 20 minutos en un
agitador orbital a una velocidad constante de 180 rpm.
Trascurrido este tiempo, se realizaron en una cabina de flujo laminar tres
enjuagues con la solución de ácido cítrico y antes de ser colocados los brotes en
contacto con el medio de cultivo en los tubos de ensayo, se eliminó la parte de la
base que se afectó por la acción del Hipoclorito de sodio.
El medio de cultivo basal estuvo compuesto por los nutrientes inorgánicos
propuestos por Coke (1996), los cuales se conocen comercialmente como
Westvaco (WV5) según la presentación comercial del catalogo Duchefa (2008),
este medio de cultivo también incluyó en su formulación inicial 1,0 g.L-1 de mio-
inositol y 0,4 mg.L-1 de tiamina y le fueron adicionados 0,6 mg.L-1 de tiamina para
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Materiales y Métodos ________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 29
completar a 1,0 mg.L-1 la concentración de este compuesto, 1,0 g.L-1 de L-
glutamina, 3,0 g.L-1 de carbón activado, 20 g.L-1 de sacarosa y 2,5 g.L-1 de Gelrite
con pH ajustado a 5,8 antes del proceso de esterilización.
Se dosificaron 10 mL de medio de cultivo por tubo de ensayo y se esterilizaron
durante 15 minutos en autoclave a 1,2 kg.cm-2 de presión y 121°C. Los
experimentos fueron repetidos tres veces en el tiempo. La temperatura de la
cámara de crecimiento fue de 28 ± 2,0°C, con una densidad de flujo de fotones
fotosintéticos que osciló entre 38 y 47,5 µmol.m-2.s-1.
Para el procesamiento estadístico de todos los resultados se empleó el Statistical
Package for the Social Sciences (SPSS) para Windows versión 18.0. En cada
experimento se especificó el tipo de análisis y las pruebas aplicadas.
3.1.1 Selección del tipo de brote
Con el objetivo de lograr el establecimiento in vitro de P. caribaea var. caribaea, se
evaluó la respuesta in vitro de cuatro tipos de brotes que fueron cortados de las
plantas donantes con diferentes tiempos (días) de brotados, los cuales presentaron
diferentes características morfológicas (Figura 2).
El brote tipo (A) se caracterizó por tener un color verde más intenso, mayor número
de acículas y una menor distancia de inserción al tallo entre las acículas (Figura 2).
Los brotes tipo (A1) y (A2) tenían el mismo origen que el tipo (A), pero con 28 y 35
días de brotados en la planta donante, mientras que, el brote tipo (B) en
comparación con los anteriores, presentó un color verde menos intenso, un menor
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Tesis de Maestría 30
número de acículas en igual longitud del tallo y por consiguiente una mayor
separación entre las acículas.
Figura 2. Características morfológicas de los diferentes tipos de brotes de P. caribaea var. caribaea utilizados como material vegetal de partida para el establecimiento in vitro de esta variedad.
En este experimento, se colocaron 30 brotes por tratamiento y al medio de cultivo
basal descrito anteriormente se le adicionaron 4,44 µM de 6-BAP, a los 30 días de
cultivo se evaluó, el número de brotes vivos y el número de brotes sin afectaciones
por necrosis.
Por no cumplirse los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza de los
datos se aplicó de Mann Whitney.
3.1.2 Efecto del 6-BAP
Este experimento tuvo como objetivo evaluar la influencia de diferentes
concentraciones de 6-BAP en la respuesta in vitro de los brotes durante la fase de
establecimiento.
Los tratamientos fueron 0,0; 2,22; 4,44; 6,66 y 8,88 µM de 6-BAP y se colocaron un
total de 30 brotes por tratamiento.
((AA)) ((AA11)) ((AA22)) 20 días 28 días 35 días
((BB)) 20 días
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Tesis de Maestría 31
Las evaluaciones se realizaron a los 30 días de cultivo y se determinó la longitud
de los brotes (cm) y el número de brotes desarrollados.
Como brotes desarrollados se consideraron aquellos que presentaron cambio en
su longitud, engrosaron o desarrollaron sus yemas axilares.
Para la comparación de la longitud media de los brotes se realizó un análisis de
varianza simple y se empleó la prueba de Tukey.
El número de brotes desarrollados se expresó en porcentaje y en este caso, para
el procesamiento estadístico de los resultados por no existir normalidad de los
datos se empleó la prueba de Kruskal Wallis y la comparación entre parejas de
grupo se realizó con prueba de Student Newman Keuls (SNK).
3.2 Fase de Multiplicación
Condiciones generales
Como material vegetal para iniciar los estudios en esta fase del proceso, se
emplearon plantas con 30 días de establecidas in vitro. El medio de cultivo basal
fue similar al descrito para la fase de establecimiento, pero con 30 g.L-1 de
sacarosa, en todos los tratamientos se colocaron 60 plantas y se consideró cada
planta como una réplica.
Se dosificaron 30 mL de medio de cultivo por frasco y se esterilizaron durante 20
minutos en autoclave a 1,2 kg.cm-2 de presión y 121°C. Los experimentos fueron
repetidos tres veces en el tiempo, se colocaron tres plantas por frasco de cultivo y
la temperatura de la cámara de crecimiento fue de 28 ± 2,0°C, con una densidad
de flujo de fotones fotosintéticos que osciló entre 38 y 47,5 µmol.m-2.s-1.
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Tesis de Maestría 32
3.2.1 Efecto del 6-BAP
Este experimento tuvo como objetivo determinar la influencia de diferentes
concentraciones de 6-BAP en la multiplicación in vitro de las plantas. Los
tratamientos fueron 0,0; 2,22; 4,44; 6,66 y 8,88 µM de 6-BAP.
Las evaluaciones se realizaron a los 35 días de cultivo y se determinó en cada
tratamiento, el número de brotes por planta, la longitud de los brotes (cm), la
longitud de la planta principal (cm) y se determinó el coeficiente de multiplicación.
Para la comparación de las medias se realizó un análisis de varianza simple y se
empleó la prueba de Tukey.
3.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración
Con el objetivo de evaluar la incidencia de dos agentes gelificantes y diferentes
concentraciones de estos en el desarrollo y respuesta in vitro de plantas de pino,
se estudiaron tres concentraciones de Gelrite (Duchefa Biochemie) (2,5; 3,0 y 3,5
g.L-1) y tres de Agar E (BIOCEN) (4,3; 4,8 y 5,3 g.L-1).
El medio de cultivo fue similar al utilizado en el acápite anterior y a los 35 días de
cultivo se evaluó en cada tratamiento, el número de plantas con necrosis total y
parcial y se determinó el coeficiente de multiplicación.
Por no existir normalidad de los datos en el caso del número de plantas
necrosadas, se empleó la prueba de Kruskal Wallis. La comparación entre parejas
de grupo, se realizó con la prueba de Student Newman Keuls (SNK).
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Tesis de Maestría 33
3.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite
Teniendo en cuenta que el costo por litro del Gelrite es menor al del Agar, que se
emplea en menor concentración y que además produce un gel más claro y con ello
permite detectar más fácil la contaminación microbiana. El siguiente experimento
tuvo como objetivo evaluar el efecto de cinco concentraciones de Gelrite en la
respuesta in vitro y desarrollo de las plantas de pino.
El medio de cultivo fue similar al empleado en el acápite anterior y los tratamientos
fueron 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 y 4,5 g.L-1. Después de 35 días de cultivo se evaluó en
cada tratamiento, el número de plantas con necrosis total y parcial, la masa fresca
y seca de 30 plantas por tratamiento y se determinó además el coeficiente de
multiplicación.
Por no existir normalidad de los datos en el caso de los porcentajes de materia
seca, se empleó la prueba de Kruskal Wallis. La comparación entre parejas de
grupo, se realizó con la prueba de Student Newman Keuls (SNK).
3.2.4 Efecto de la sacarosa
Este experimento tuvo como objetivo, evaluar en el subcultivo previo a la fase de
enraizamiento, la influencia de diferentes concentraciones de sacarosa (30; 40; 50
y 60 g.L-1) en las características morfológicas de las plantas obtenidas en un medio
de cultivo que fue similar al utilizado en el experimento anterior, pero sin
adicionarle 6-BAP y con 3,5 g.L-1 de Gelrite.
Las evaluaciones se realizaron a los 35 días de cultivo y se determinó en cada
tratamiento, el número de plantas que por sus características morfológicas podían
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Tesis de Maestría 34
ser subcultivadas a la fase de enraizamiento, el número de nuevos brotes que por
su desarrollo en longitud y grosor del tallo, no debían ser transferidos a la fase de
enraizamiento y se determinó el porcentaje de materia seca de 30 plantas.
Para el procesamiento estadístico de los resultados, por no existir normalidad de
los datos se empleó la prueba de Kruskal Wallis. La comparación entre parejas de
grupo, se realizó con la prueba de Student Newman Keuls (SNK).
3.3 Fase de enraizamiento
3.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB
Con el objetivo de lograr la formación de raíces in vitro, se obtuvieron plantas con
30 y 60 g.L-1 de sacarosa en un medio de cultivo similar al descrito para el
experimento anterior y a los 35 días de cultivo, antes de realizar el subcultivo a la
fase de enraizamiento, se evaluó la longitud de las plantas y se determinó el
porcentaje de materia seca de 30 plantas obtenidas con cada concentración de
sacarosa.
Para analizar los porcentajes de materia seca se realizó un análisis de varianza
simple, por cumplirse con los supuestos de normalidad y homogeneidad de los
datos.
El resto de las plantas se subcultivaron a un medio de cultivo de enraizamiento
compuesto por los nutrientes inorgánicos WV5 a los cuales le fueron adicionados
0,6 mg.L-1 de tiamina para completar a 1,0 mg.L-1 la concentración de este
compuesto, 1,0 g.L-1 de L-glutamina, 3,0 g.L-1 de carbón activado, 30 g.L-1 de
sacarosa y 3,5 g.L-1 de Gelrite con pH ajustado a 5,8 antes de realizar el proceso
de esterilización.
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Tesis de Maestría 35
Los tratamientos de AIB estudiados fueron: 0,0; 4,90; 9,80; 14,70 µM y después de
30 días de cultivo, se evaluó para cada tratamiento, el número de plantas con
raíces, el número de raíces por planta, la longitud de las raíces y la longitud de las
plantas.
En el caso de la longitud de las plantas, por existir normalidad, pero no
homogeneidad de los datos, se aplicó la prueba de comparación de medias C de
Dunnett.
3.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos
Este experimento tuvo como objetivo, determinar la influencia de dos
concentraciones de nutrientes inorgánicos (50 y 100% de WV5) en la respuesta in
vitro de las plantas en la fase de enraizamiento. Al igual que en el experimento
anterior, como material vegetal se emplearon plantas obtenidas in vitro con dos
concentraciones de sacarosa (30 y 60 g.L-1) en el subcultivo previo. En el caso del
tratamiento con 50% de WV5, fue necesario adicionar 500 mg.L-1 de mio-inositol y
0,8 mg.L-1 de tiamina para completar a 1,0 g.L-1 y 1,0 mg.L-1 respectivamente la
concentración de ambos compuestos. De esta forma, ambos tratamientos, solo
presentaron diferencias en la concentración de los nutrientes inorgánicos.
Después de 30 días de cultivo se evaluó en cada tratamiento, el número de plantas
con raíces, el número de raíces por planta, la longitud de las raíces, la presencia
de lignina a partir de visualizar las deposiciones de este compuesto en las paredes
celulares, así como la cuantificación del contenido de lignina en las bases de
segmentos de tallos (1,0 cm de longitud) de 18 plantas seleccionadas al azar.
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Tesis de Maestría 36
Para evaluar las deposiciones de lignina, se efectuaron cortes de secciones del
tallo de una misma planta en la base del tallo, aproximadamente a 0,5 cm de la
base y a 1,0 cm de la base. Estas secciones fueron teñidas con una solución de
Fluoroglucina al 1,0% (p/v) en etanol al 70%, durante 5,0 min. Según la técnica
descrita por Southerton y Deverall, (1990). Se adicionaron dos gotas de ácido
clorhídrico (HCl) concentrado a cada sección del tallo y después de un minuto se
enjuagaron y se les colocó un cubreobjeto para ser observadas con un microscopio
Olympus (400x). Ante la presencia de lignina se observaron áreas de color
rojo/rosado según fue descrito por Gahan (1984). Las observaciones fueron
fotografiadas inmediatamente.
Para evaluar el contenido de lignina, se utilizó el protocolo descrito por Kirk y Obst,
(1988). Este protocolo consistió en procesar las muestras inmediatamente después
de colectadas y homogenizarlas al macerarlas en un mortero y pistilo preenfriados
utilizando nitrógeno líquido. Después de ser extraídas cuatro veces en metanol, las
muestras fueron secadas en campana. Se tomaron 200 mg y se hidrolizaron en 4,0
mL de H2SO4 al 72% (v/v) a una temperatura de 30°C durante 1,0 h. El hidrolizado
fue diluido en 112 mL de agua y mantenido en autoclave durante 1,0 h a 121°C. La
solución final se dejó sedimentar, luego se retiró el mayor contenido posible de
agua con ayuda de una micropipeta de 5,0 mL sin extraer sedimento, las muestras
fueron secadas en una estufa a 60°C durante ocho horas y el residuo sólido se
pesó. El contenido de lignina se expresó como porcentaje de residuos de la pared
celular respecto al peso inicial (200 mg). Por no cumplirse los supuestos de
normalidad y homogeneidad de los datos, estos se procesaron directamente al
aplicar la prueba de Mann Whitney, después de haber generado hasta 10 000
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Materiales y Métodos ________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 37
muestras con distribución similar a la real mediante técnicas de Monte Carlo, para
estimar de esta forma la significación con el 99,0% de confianza.
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Tesis de Maestría 38
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Fase de establecimiento
4.1.1 Selección del tipo de brote
Los mejores resultados después de 30 días de cultivo se lograron con los brotes
clasificados como tipo (B), con el mayor porcentaje de supervivencia y el mayor
porcentaje de brotes sin afectaciones por necrosis (Figura 3).
55,6b
60b
88,9 a90 a
0
20
40
60
80
100
Supervivencia Brotes sin necrosisVariables evaluadas
Por
cent
aje
(%)
Tipo (A2)
Tipo (B)
Barras con letras distintas para una misma variable difieren significativamente
para p<0,05 según la prueba de Mann Whitney. (n=30)
Figura 3. Respuesta in vitro de dos tipos de brote de P. caribaea var. caribaea a los 30 días de cultivo en la fase de establecimiento.
Los brotes clasificados como tipo (A) y (A1), cortados de las plantas donantes con 20 y
28 días de brotados respectivamente, a los pocos días de colocados en contacto con el
medio de cultivo, comenzaron a presentar afectaciones por necrosis, estas afectaciones
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 39
se incrementaron paulatinamente hasta observarse una necrosis total en estos dos
tipos de brotes (Figura 4).
Figura 4. Manifestación de las afectaciones por necrosis que se presentó en los brotes de P. caribaea var. caribaea clasificados como tipo (A) y A(1) durante la fase de establecimiento in vitro.
Sin embargo, el brote tipo (A2), de similar origen que los anteriores (A y A1), pero
cortado de las plantas donantes a los 35 días de brotado, tuvo una mejor respuesta
durante la fase de establecimiento (Figura 3).
Esta respuesta diferente, pudo estar relacionada con el grado de desarrollo y las
características morfológicas que presentaron estos brotes (tipo A2), pues a pesar de
tener el mismo origen, el hecho de ser cortados con diferentes tiempos de brotados,
hizo que presentaran diferencias en su desarrollo.
A partir de este resultado, los brotes tipo (A) y tipo (B) se dejaron crecer en las plantas
donantes en la casa de cultivo y se observó que después de 90 días, los brotes tipo (A)
presentaron crecimiento plagiotrópico, es decir, crecimiento horizontal, típico de una
rama de un árbol de pino. Mientra que, los brotes tipo (B) presentaron crecimiento
ortotrópico, es decir, crecimiento vertical, típico de un brote apical que se convertirá en
el tallo principal.
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 40
Las coníferas son plantas que se caracterizan por presentar tanto crecimiento
plagiotrópico como ortotrópico (Carneros, 2009) este autor planteó que si se obtienen
plantas a partir de yemas que dan lugar a ramas con crecimiento plagiotrópico, estas
plantas pueden demorar hasta dos años en recuperar la condición de crecimiento
ortotrópico y eso afectaría el normal desarrollo de las plantaciones en campo.
Según Korban y Sul (2007), en algunas especies de coníferas las plantas obtenidas de
semillas pueden servir como plantas madres en casas de cultivo y ser fuentes de
material vegetal, si se mantienen y crecen bien, ya que proporcionan gran cantidad de
nuevos brotes como material vegetal para establecer in vitro.
En varias especies e híbridos del género Larix, un árbol conífero que se caracteriza por
su rápido crecimiento, Ewald (2007) empleó plantas de semilleros para obtener los
brotes que finalmente estableció in vitro.
Establecer brotes apicales de P. caribaea var. caribaea a partir de plantas obtenidas de
semillas, permitirá mantener la diversidad biológica fruto de muchos de años de
evolución, moldeada por los procesos naturales y cada vez más, por la influencia del
ser humano.
A partir de estos resultados, se decidió solo establecer in vitro brotes apicales que a los
20 días de brotados de las plantas donantes en la casa de cultivo, presentaron
características morfológicas similares a las descritas en el acápite 3.1.1 para el brote
tipo (B).
4.1.2 Efecto del 6-BAP
Después de 30 días de cultivo, el mejor resultado en cuanto al desarrollo en longitud de
los brotes se alcanzó en los tratamientos con 6,66 y 8,88 µM de 6-BAP (Figura 5).
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 41
2,33bc
2,26cd
2,15d
2,58a 2,44
ab
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Concentraciones de 6-BAP (uM)
Long
itud
(cm
)
0,0 2,22 4,44 6,66 8,88
Barras con letras distintas difieren significativamente
para p<0,05 según la prueba de Tukey. (n=30)
Figura. 5 Longitud promedio (cm) de los brotes de P. caribaea var. caribaea establecidos in vitro después de 30 días de cultivo con diferentes concentraciones de 6-BAP en el medio de cultivo.
Durante la fase de establecimiento, independientemente de la concentración de 6-BAP,
no se observó la brotación de yemas axilares. Sin embargo, fue en el tratamiento con
6.66 µM de 6-BAP donde se obtuvo el mayor porcentaje de brotes con yemas axilares
desarrolladas (Figura 6).
Entre los reguladores del crecimiento en plantas, las citoquininas han sido las que
mejores respuestas han permitido obtener durante la fase de establecimiento in vitro de
muchas especies vegetales (Kumar et al., 2005). Estos autores, estudiaron el efecto de
varias citoquininas en el establecimiento in vitro de brotes de Holarrhena
antidysenterica y las mejores respuestas las lograron cuando emplearon 6-BAP como
regulador del crecimiento. Al evaluar además, el efecto de diferentes concentraciones
de 6-BAP comprobaron que al igual que en muchas otras especies, las respuestas in
vitro para la mayoría de las variables evaluadas dependieron de las concentraciones
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 42
estudiadas. En la figura 7 se pueden observar brotes apicales tipo (B) después de 30
días de cultivo en la fase de establecimiento in vitro con yemas axilares desarrolladas,
respuesta importante para el posterior desarrollo de nuevos brotes durante la fase de
multiplicación.
46,6b
23,3c
50b
70a
46,6b
01020304050607080
Concentraciones de 6-BAP (uM)
Bro
tes
con
yem
as
desa
rrol
lada
s (%
)
0,0 2,22 4,44 6,66 8,88
Barras con letras distintas difieren significativamente
para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=30)
Figura 6. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en el porcentaje de brotes de P. caribaea var. caribaea que presentaron yemas axilares desarrolladas después de 30 días de cultivo en la fase de establecimiento in vitro.
Figura 7. Brotes de P. caribaea var. caribaea después de 30 días de cultivo en la fase de establecimiento in vitro con una concentración de 6,66 µM de 6-BAP, obsérvese la presencia de yemas axilares desarrolladas.
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Tesis de Maestría 43
En el presente estudio, permitió definir las características morfológicas que deben tener
los brotes apicales de P. caribaea var. caribaea obtenidos a partir de plantas donantes
producidas por semillas, para ser establecidos in vitro y además, se determinó la
concentración de 6-BAP que permitió un mejor desarrollo in vitro de estos brotes.
4.2 Fase de Multiplicación
4.2.1 Efecto del 6-BAP
Al evaluar la respuesta in vitro de las plantas cultivadas bajo la acción de diferentes
concentraciones de 6-BAP en el medio de cultivo, se determinó, que al igual que en la
fase de establecimiento in vitro, con 6,66 µM de este regulador del crecimiento se
lograron los mejores resultados, en este caso, en cuanto al mayor número y longitud
promedio de brotes por planta (Tabla 1). Estos resultados, también permitieron obtener
con esa concentración (6,66 µM) el mejor coeficiente de multiplicación (Figura 8).
Tabla 1. Respuesta in vitro de brotes de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación en presencia de diferentes concentraciones de 6-BAP en el medio de cultivo.
Tratamientos (µM de 6-BAP)
Longitud promedio planta principal (cm)
No. promedio de brotes por planta
Longitud promedio brotes por planta(cm)
0,00 6,4 a 2,25 e 1,1 d 2,22 6,2 a 3,00 d 1,3 d 4,44 5,7 b 4,50 c 1,9 c 6,66 5,1 c 6,75 a 2,7 a 8,88 5,4 bc 5,25 b 2,2 b
Medias identificadas con letras distintas en una misma columna difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de Tukey. (n=60)
Como se puede observar en la tabla 1, con 6,66 µM de 6-BAP se logró la menor
longitud promedio de la planta principal. Desde el punto de vista fisiológico, esta
respuesta puede estar relacionada con la reducción de la dominancia apical que según
van Staden et al. (2008), se produce al adicionar determinadas concentraciones de
citoquininas al medio de cultivo.
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 44
1,181,35
1,832,03
2,38
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Concentraciones de 6-BAP
Coe
ficie
nte
de
0,0 2,22 4,44 6,66 8,88
Figura 8. Coeficiente de multiplicación de plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentración de 6.BAP.
Esta concentración de 6,66 µM de 6-BAP, también estimuló el desarrollo de un mayor
número de yemas axilares (Figura 9B) y en consecuencia los nutrientes asimilados
fueron empleados para el desarrollo de toda la planta, incluyendo los nuevos brotes, lo
cual pudo influir en el desarrollo en longitud de la planta principal.
Figura 9. Desarrollo in vitro de las plantas de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación. A) Con 4,44 µM de 6-BAP, B) Con 6,66 µM de 6-BAP, C) Con 8,88 µM de 6-BAP.
Las citoquininas son reguladores del crecimiento muy eficaces para estimular la
iniciación directa o indirecta de brotes in vitro (van Staden et al., 2008). Según estos
autores, sus efectos en el cultivo de tejidos y órganos pueden variar de acuerdo al tipo
de citoquinina, la concentración empleada en el medio de cultivo, si el material vegetal a
CA B
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Tesis de Maestría 45
establecer in vitro se obtiene de tejido juvenil o tejido adulto, puede variar además en
función de la especie vegetal y del método empleado para la regeneración de plantas.
Según van Staden et al. (2008), cuando se utilizan altas concentraciones de
citoquininas en la fase de multiplicación, los brotes que se producen reducen su
desarrollo en longitud. Autores como Kumar et al. (2005), estudiaron el efecto de varias
citoquininas en la multiplicación in vitro de brotes apicales de Holarrhena antidisentérica
y las mejores respuestas las lograron con 6-BAP.
En el presente estudio, las plantas in vitro de pino, tuvieron una respuesta fisiológica
acorde con los resultados obtenidos por otros autores y explicados anteriormente, pues
en función de la concentración de 6-BAP, varió el crecimiento en longitud de la planta
principal, el número de brotes que se produjeron por planta, así como la longitud de
dichos brotes. Por todos los resultados descritos anteriormente, se seleccionó la
concentración de 6,66 µM de 6-BAP como la concentración que mejores resultados
permitió obtener en la multiplicación in vitro de plantas de P. caribaea var. caribaea.
4.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración
Se observó que el agente gelificante empleado en el medio de cultivo influyó en la
respuesta in vitro de las plantas de pino, pues independientemente de la concentración,
con Gelrite como agente gelificante se lograron los mejores resultados en cuanto al
coeficiente de multiplicación y el menor número de plantas necrosadas (Tabla 2).
No obstante, al evaluar la respuesta in vitro de las plantas obtenidas con diferentes
tratamientos de Gelrite, se observó que con 3,5 g.L-1 se lograron los mejores resultados
en las variables evaluadas con respecto al resto de los tratamientos y sólo el 6,6% de
las plantas sufrieron afectaciones por necrosis. La respuesta in vitro y desarrollo de las
plantas en el tratamiento con 3,5 g.L-1 de Gelrite, se pueden observar en la figura 10.
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 46
Tabla 2. Respuesta in vitro de brotes de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación cuando se emplearon diferentes tipos y concentraciones de agentes gelificantes.
Gelificante (g.L-1)
No. de plantas necrosadas
Coeficiente Multiplicación
Gelrite (2,5) 9 c 1,87 Gelrite (3,0) 8 c 1,91 Gelrite (3,5) 4 d 2,28 Agar (4,3) 13 b 1,20 Agar (4,8) 23 a 1,08 Agar (5,3) 23 a 0,86
Medias identificadas con letras distintas en una misma columna difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=60)
Figura 10. Desarrollo in vitro de las plantas de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentraciones de Gelrite, A) 2,5 g.L-1, B) 3,0 g.L-1, C) 3,5 g.L-1. El tratamiento con 2,5 g.L-1 de Gelrite, además de presentar 15% de plantas con
necrosis total, siete plantas presentaron necrosis parcial, lo que representó el 11,6% del
total de plantas evaluadas en el tratamiento.
En el caso de los tratamientos con Agar, con las mayores concentraciones (4,8 y 5,3
g.L-1) se obtuvo un 38,3% de plantas in vitro que presentaron afectación por necrosis,
daño que se inició en la zona apical de la planta (Figura 11) y se extendió
progresivamente hasta provocar la muerte.
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Tesis de Maestría 47
Figura 11. Evolución de las afectaciones por necrosis que sufrieron las plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea en fase de multiplicación con Agar como agente gelificante.
Una determinada concentración de Agar puede ser considerada inadecuada si no
ayuda al desarrollo in vitro de los brotes o si favorece la aparición de plantas con
síntomas de hiperhidricidad. (Thorpe et al., 2008). Estos autores plantearon que la
hiperhidricidad se puede reducir al incrementar la concentración de Agar en el medio de
cultivo, pero este incremento, regularmente está acompañado de una disminución en el
desarrollo y crecimiento de las plantas in vitro.
Resultados similares se obtuvieron en el presente trabajo, pues al incrementarse la
concentración de Agar en el medio de cultivo se produjo un incremento en el número de
brotes necrosados y una disminución en el coeficiente de multiplicación.
Owens y Wozniak (1991) observaron grandes diferencias en el número de brotes
obtenidos in vitro en dependencia del agente gelificante empleado. Ellos encontraron
que la disponibilidad de agua, determinada por el potencial de la matriz de cada gel, fue
el factor que más influyó en ese resultado y demostraron que cuando igualaron los
potenciales de la matriz de los diferentes agentes gelificantes al utilizar diferentes
concentraciones de cada uno ellos (Bacto agar 0,7%, Agarose 0,46%, Phytagar 0,62%
y Gelrite 0,12%), obtuvieron la misma respuesta in vitro.
No obstante, se ha demostrado que existen diferencias en la composición y
características de cada uno de estos compuesto, por ejemplo, el Gelrite como producto
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Tesis de Maestría 48
comercial está libre de impurezas orgánicas que si se encuentran en el Agar (Thorpe et
al., 2008). Según estos autores, el Gelrite tiene entre otras ventajas para la propagación
in vitro de plantas a gran escala, que su costo por litro es menor al del Agar y se emplea
en menor concentración que este, además, produce un gel más claro y con ello permite
detectar más fácil cualquier contaminación microbiana.
4.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite
Se observó que para el coeficiente de multiplicación los mejores resultados se lograron
en el tratamiento con 4,0 g.L-1 de Gelrite (Figura 12).
1,771,98
2,22
2,87
2,13
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Concentraciones de Gelrite (g.L-1)
Coe
ficie
nte
de m
ultip
licac
ión
2,5 3 3,5 4 4,5
Figura 12. Coeficiente de multiplicación de plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentraciones de Gelrite en el medio de cultivo.
También en el tratamiento con 4,0 g.L-1 de Gelrite se obtuvo el menor porcentaje de
materia seca (Figura 13). Sin embargo, al analizar los resultados en su conjunto, se
puede concluir que el contenido de materia seca disminuyó en la medida que se
incrementó coeficiente de multiplicación. Este resultado está relacionado con el hecho
de que el incremento del coeficiente de multiplicación se debe a la presencia de un
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Tesis de Maestría 49
mayor número de nuevos brotes, y por consiguiente menor diferenciación de las
diferentes estructuras de la planta y con ello un menor porcentaje de materia seca.
21,82a
19,86b
14,59d
13,49d
16,53c
0
5
10
15
20
25
Concentraciones de Gelrite (g.L-1)
Mater
ia Sec
a (%)
2,5 3 3,5 4 4,5
Barras con letras distintas difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=30)
Figura 13. Porcentaje de materia seca de plantas de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentraciones de Gelrite.
Con relación al porcentaje de brotes necrosados, los mayores porcentajes se
produjeron en los tratamientos con 2,5 y 3,0 g.L-1 de Gelrite, con 11,6% y 10,0%
respectivamente. También en el tratamiento con 2,5 g.L-1 de Gelrite, se observaron
otras tres plantas (5,0%) que presentaron necrosis parcial.
A partir de estos resultados, se seleccionó como agente gelificante a emplear en la fase
de multiplicación, el Gelrite, a una concentración de 4,0 g.L-1.
4.2.4 Efecto de la sacarosa.
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Tesis de Maestría 50
Los mejores resultados se alcanzaron al añadir al medio de cultivo con 50 y 60 g.L-1 de
sacarosa, con la menor formación de brotes nuevos, los mayores porcentajes de
plantas para enraizar (Tabla 3) y los mayores porcentajes de materia seca por planta
(Figura 14).
Tabla 3. Respuesta in vitro de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo.
Sacarosa (g.L-1)
Plantas para enraizar (%)
Medias de rango
Plantas que no podían ser enraizadas (%)
Medias de rango
30 44,13 21,25 c 55,87 58,80 a 40 56,69 36,05 b 43,31 44,45 b 50 68,18 48,65 a 31,82 32,60 bc 60 75,90 56,05 a 24,10 26,15 c
Porcentajes identificados con letras distintas en una misma columna difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=60)
17.37b
19.45a
14,50c11,93
d
0
5
10
15
20
25
30 40 50 60
Concentraciones de sacarosa (g.L-1)
Mat
eria
sec
a (%
)
Barras con letras distintas difieren significativamente
para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=30)
Figura 14. Porcentaje de materia seca de plantas de P. caribaea var. caribaea obtenidas in vitro después de 35 días de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa.
Con 30 g.L-1 de sacarosa las plantas presentaron mayor formación de nuevos brotes
(Figura 15A), respuesta típica de las plantas en la fase de multiplicación. Al incrementar
la concentración de sacarosa a 40 g.L-1 se observó una disminución en la formación de
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Tesis de Maestría 51
nuevos brotes (Figura 15B), estos alcanzaron un mayor desarrollo en longitud, lo cual
favoreció el número de plantas que pudieron subcultivarse a la fase de enraizamiento,
pero como se puede observar, fueron brotes similares en sus características
morfológicas a los obtenidos con 30 g.L-1 de sacarosa.
Figura 15. Características morfológicas de las plantas de P. caribaea var. caribaea obtenidas in vitro después de 35 días de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa. A) 30 g.L-1, B) 40 g.L-1, C) 50 g.L-1, D) 60 g.L-1.
Con 50 g.L-1 de sacarosa, las plantas presentaron un menor número de brotes nuevos,
similar desarrollo en longitud de la planta principal con respecto a los restantes
tratamientos y mayor grosor del tallo (Figura 15C), características deseadas para
subcultivar plantas a la fase de enraizamiento. No obstante, fue en el tratamiento con
60 g.L-1 de sacarosa, donde se obtuvieron plantas con acículas más desarrolladas y
diferenciadas (Figura 15D), muy similares a las acículas que desarrollan las plantas de
esta variedad en condiciones naturales, estas plantas presentaron además, un color
verde más intenso y el olor característico de los aceites esenciales que se puede
percibir al macerar tejido de árboles adultos, lo cual no ocurrió con las plantas de los
restantes tratamientos. Este aspecto puede ser un posible indicador de un mayor grado
de diferenciación de los diferentes tejidos y estructuras vasculares de estas plantas,
incluyendo los canales resiníferos.
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Tesis de Maestría 52
Se conoce que los carbohidratos juegan un papel importante en el cultivo in vitro como
fuentes de energía y carbono, así como agentes osmóticos, pero también, están
vinculados con la diferenciación de los elementos del xilema y floema (Thorpe et al.,
2008).
Ha sido descrito que al aumentar la concentración de sacarosa en el medio de cultivo
se incrementa el porcentaje de materia seca en las plantas (Kubota et al., 2002; Shim et
al., 2003). Lo anterior se debe, a que al aumentar el contenido de sacarosa, el potencial
osmótico del medio de cultivo disminuye (Cárdenas y Villegas, 2002), se limita la
absorción de agua, pero se favorece la asimilación de sacarosa y con ello el incremento
de materia seca.
Según Fuentes et al. (2005), se ha demostrado que la concentración de sacarosa
influye en la calidad funcional de las plantas cuando estas son transferidas a
condiciones ex vitro para su aclimatización.
Estos autores describieron que la ausencia de sacarosa en el medio de cultivo favoreció
una mayor actividad fotosintética de plantas de Cocos nucifera (Cocotero) en respuesta
al incremento de la intensidad luminosa y el CO2, en comparación con plantas
cultivadas con altas concentraciones de sacarosa (90 g.L-1).
Sin embargo, esa mayor actividad fotosintética in vitro no fue suficiente para la
supervivencia y crecimiento de las plantas en la fase de aclimatización.
Al analizar las plantas obtenidas en ausencia de sacarosa, estos autores observaron
que no tenían formado su esqueleto de carbono, ni habían acumulado sustancia de
reserva en sus hojas, y aunque tenían hojas y raíces desarrolladas, el contenido de
carotenoides era bajo y eso contribuyó a su alta susceptibilidad cuando fueron
transferidas a condiciones ex vitro con alta intensidad luminosa.
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Tesis de Maestría 53
Fuentes et al. (2005), también describieron que con bajas concentraciones de sacarosa
(22,5 g.L-1), las plantas respondieron mejor durante la fase de aclimatización, pero el
resultado tampoco fue satisfactorio.
A pesar de que con altas concentraciones de sacarosa (90 g.L-1) obtuvieron un efecto
negativo en la actividad fotosintética, Fuentes et al. (2005), observaron que esta
concentración de sacarosa promovió la formación de raíces, así como la supervivencia
y crecimiento de las plantas en condiciones ex vitro.
Resultó significativo que cuando emplearon una concentración intermedia (45 g.L-1), las
plantas presentaron similares contenidos de clorofila y carotenoides que los retoños de
árboles cultivados en campo. Además, las plantas mostraron eficacia en el transporte
de electrones del fotosistema II y una buena respuesta de la fijación de CO2 y al
aumento de la intensidad luminosa.
Por todo lo anterior, las plantas cultivadas con concentraciones intermedias de
sacarosa (45 g.L-1) presentaron la mayor supervivencia, actividad fotosintética y un
crecimiento más rápido en condiciones ex vitro, con el mejor rendimiento en campo
entre todos los tratamientos.
4.3 Fase de enraizamiento
4.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB
Las plantas obtenidas con 30 y 60 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo al
enraizamiento, presentaron características morfológicas similares a las descritas para
estos mismos tratamientos en el acápite 4.2.5.
Las plantas obtenidas con 60 g.L-1 presentaron mayor porcentaje de materia seca
(Figura 16) y mayor desarrollo en longitud, 6,12 cm por 5,23 cm las plantas obtenidas
con 30 g.L-1.
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Tesis de Maestría 54
18,95 a
11,60b
0
5
10
15
20
25
30 60
Concentraciones de sacarosa (g.L-1)
Mat
eria
sec
a (%
)
Barras con letras distintas difieren significativamente para p<0,05 según un análisis de varianza simple. (n=30)
Figura 16. Porcentaje de materia seca obtenido en plantas de P. caribaea var. caribaea con diferentes concentraciones de sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento.
Después de 30 días de cultivo en la fase de enraizamiento, no se logró en ninguno de
los tratamientos evaluados, la formación de raíces in vitro. El género Pinus ha sido
reconocido como recalcitrante con relación a la formación de raíces in vitro y varios
autores han descrito que el porcentaje de plantas in vitro que forman raíces es bajo
(Stojicic y Budimir, 2004).
Tampoco se observaron diferencias estadísticas en la longitud de las plantas al
subcultivar las plantas obtenidas con 30 g.L-1 de sacarosa, a un medio de cultivo de
enraizamiento con diferentes concentraciones de AIB. Sin embargo, esta variable
(longitud de la planta) si presentó diferencias al combinar plantas que fueron obtenidas
con 60 g.L-1 de sacarosa, con diferentes concentraciones de AIB (Figura 17).
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Tesis de Maestría 55
6,04b
6,21b
6,79a
7,49a
0
5
10
0 4,9 9,8 14,7
Concentraciones de AIB (uM)
Long
itud
de la
pl
anta
(cm
)
Barras con letras distintas difieren significativamente para p<0,05 según la prueba C de Dunnett.
Figura 17. Longitud promedio de plantas de P. caribaea var. caribaea obtenidas después de 30 días de cultivo en la fase de enraizamiento con diferentes concentraciones de AIB.
Varios han sido los estudios encaminados a comprender mejor la respuesta de
diferentes especies coníferas para formar raíces in vitro. La adición de auxinas, por lo
general, en forma de AIB o ANA, ha sido una práctica general para inducir la formación
de raíces in vitro en coníferas (Niemi et al., 2002; Zhang et al., 2006; Kalia et al., 2007).
Sin embargo, el éxito final de esta fase del proceso de propagación in vitro, no solo
depende de la adición al medio de cultivo de determinadas concentraciones de auxinas.
Por ejemplo, es importante tener en cuenta el efecto que pueden ejercer las altas
concentraciones de citoquininas (0,5-10 mg.L-1) empleadas durante la fase de
multiplicación, pues pueden inhibir o retrazar la formación de raíces y limitar los efectos
estimuladores de las auxinas en esta fase del proceso (Ben-Jaacov et al., 1991).
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 56
En ocasiones, antes de colocar las plantas a un medio de cultivo de enraizamiento, ha
sido necesario realizar más de un subcultivo en medio de cultivo libre de citoquininas,
hasta que las concentraciones endógenas de este regulador del crecimiento, se han
reducido lo suficiente en el tejido de la planta (van Staden et al., 2008).
4.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos
Al estudiar la posible influencia de diferentes concentraciones de nutrientes inorgánicos
en la fase de enraizamiento, se observó que después de 30 días de cultivo tampoco se
logró la formación de raíces in vitro. Sin embargo, en la figura 18A se puede observar
que las plantas que se obtuvieron con 60 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo a la
fase de enraizamiento presentaron una mayor deposición de lignina teniendo en cuenta
la intensidad de la coloración rojo/rosado en la zona de los haces vasculares, según fue
descrito por Gahan (1984).
No obstante, al realizar un análisis por separado, se pudo observar que
independientemente del origen del material vegetal (concentración de sacarosa en el
subcultivo previo), la concentración de nutrientes inorgánicos en el medio de cultivo de
enraizamiento también influyó en la acumulación de lignina en las paredes celulares de
los segmentos de tallos de 1,0 cm de longitud cortados de las bases de las plantas de
P. caribaea var. caribaea (Figura 19).
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Tesis de Maestría 57
Leyenda: A) Secciones de tallos de plantas obtenidas con 60 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento.
B) Secciones de tallos de plantas obtenidas con 30 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento. Figura 18. Deposiciones de lignina en las paredes celulares de tallos de plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea obtenidas después de 30 días de cultivo con diferentes concentraciones de nutrientes inorgánicos en la fase de enraizamiento.
Secciones de los tallos (a 1.0 cm de la base)
Secciones de los tallos (a 0.5 cm de la base)
Secciones de la base de los tallos
WV5 al 100% WV5 al 50% WV5 al 100% WV5 al 50%
A B
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Tesis de Maestría 58
47,95a
38,68b
0
10
20
30
40
50
60
WV5 al 50% WV5 al 100%
Res
iduo
s de
la p
ared
ce
lula
r (%
)
27,53a
13,58b
0
10
20
30
40
50
60
WV5 al 50% WV5 al 100%
Res
iduo
s de
la p
ared
ce
lula
r (%
)
Barras con letras distintas difieren significativamente
para p<0,05 según la prueba de Mann Whitney. (n=18) Figura 19. Porcentaje de residuos de la pared celular en plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea obtenidas con diferentes concentraciones de nutrientes inorgánicos. A) Plantas obtenidas en el subcultivo previo con 60 g.L-1 de sacarosa. B) Plantas obtenidas en el subcultivo previo con 30 g.L-1 de sacarosa.
A
B
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 59
En muchos sistemas de cultivo de tejidos, la formación de lignina, se ha estimulado por
un cambio en los reguladores del crecimiento (Pauwels et al. 2008), por elicitores
fúngicos (Lange et al. 1995), por estrés hídrico (Tsutsumi y Sakai 1993) y también, por
el empleo de diferentes concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo (Nose et al.
1995).
Autores como Thorpe et al. (2008) explicaron que con el empleo de elevadas
concentraciones de sacarosa (>6.0%) en el medio de cultivo se acumularon grandes
cantidades de lignina y como se conoce la presencia de mayor o menor contenido de
lignina en plantas cultivadas in vitro, ha sido un indicador del grado de diferenciación de
los tejidos vasculares y de la madurez de las plantas (Yamamoto, 1998).
Los mayores porcentajes de residuos de la pared celular (contenido de lignina)
determinados en los segmentos de los tallos de las plantas obtenidas con 60 g.L-1 de
sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento y colocadas en un medio de
cultivo de enraizamiento con 50% de reducción de los nutrientes inorgánicos WV5,
confirman la influencia de ambos factores en la diferenciación y madurez de los tejidos
vegetales, en particular de los elementos vasculares, zona en la cual se acumuló la
lignina.
A partir de los resultados obtenidos se confirmó que la concentración de sacarosa en el
medio de cultivo, es uno de los factores a tener en cuenta en el acondicionamiento de
las plantas para la fase final del proceso de propagación in vitro, porque favoreció en
las plantas el desarrollo de características morfológicas que le confirieron un mayor
grado de diferenciación y madurez fisiológica, con lo cual, están mejor preparadas para
lograr la formación de raíces in vitro.
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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 60
Los resultados obtenidos constituyen elementos fundamentales en la concepción de
nuevas estrategias de investigación con la finalidad de lograr en Pinus caribaea var.
caribaea, la formación de raíces in vitro.
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Conclusiones ________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 61
5. CONCLUSIONES
1. Se logró establecer in vitro brotes apicales a partir de plantas donantes
cultivadas en casa de cultivo y se definieron las características que debe
tener este tipo de brote.
2. El 6-BAP influyó en el desarrollo de las plantas in vitro en la fase de
multiplicación, con una concentración de 6,66 µM se lograron los mejores
resultados en cuanto al número y longitud de los brotes por plantas y el
coeficiente de multiplicación.
3. Se demostró que el agente gelificante y su concentración, fueron factores
que influyeron en el desarrollo y la respuesta in vitro de las plantas en la
fase de multiplicación. Con 4,0 g.L-1 de Gelrite se obtuvo el mayor
coeficiente de multiplicación.
4. Se observó que al incrementar la concentración de sacarosa en el último
subcultivo de la fase de multiplicación, se produjeron cambios en el
desarrollo morfológico de las plantas, los cuales, le confirieron mejores
características para ser subcultivadas a la fase de enraizamiento.
5. Se determinó que al reducir la concentración de nutrientes inorgánicos en la
fase de enraizamiento, aumentó la acumulación de lignina en los tallos, con
una mayor diferenciación celular de las plantas.
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Recomendaciones ________________________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 62
6. RECOMENDACIONES
1. Realizar estudios para la caracterización histológica de los diferentes tipos
de brotes obtenidos de las plantas donantes.
2. Determinar la influencia de concentraciones de sacarosa superiores a 60
g.L-1, en las características morfológicas de las plantas obtenidas en el
subcultivo previo a la fase de enraizamiento.
3. Realizar otros estudios que permitan mejorar las respuestas morfogenéticas
de las plantas P. caribaea var. caribaea en la fase de enraizamiento.
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Referencias Bibliográficas __________________________________________________________________________
Tesis de Maestría 63
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Agrawal, V, Prakash S, Gupta SC (2002) Effective protocol for in vitro shoot production through nodal explants of Simmondsia chinensis. Biol. Plant. 45: 449-453
2. Aitken-Christie, J, Singh A, Davies H (1986) Multiplication of meristematic tissue culture system for radiata pine. Biotechnology in Agriculture and Forestry. 1: 413-432
3. Alkhateeb, AA (2001) Influence of different carbon sources and concentrations on in vitro root formation of date palm (Phoenix dactylifera L.) cv Khanezi. Zagazig J. Agric. Res. 28: 597-608
4. Alkhateeb, AA (2008) Comparison effects of sucrose and date palm syrup on somatic embryogenesis of date palm (Phoenix dactylifera L.). American Journal of Biotechnology and Biochemistry. 4: 19-23
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