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Expresso e Purificao de umaProtena Recombinante
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Glutationa
Tripptido linear.
Constituido por 3 aminocidos: Gl
icina; cido glutmico; Cistena.
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Glutationa
Existe na maioria das clulas, mas emmaior quantidade no fgado.
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Glutationa
Metabolizao do H2O2 como co-factorda glutationa peroxidase;
Desactivao de radicais;
Metabolizao de xenobiticos como co-factor da glutationa-S-transferase.
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Glutationa-S-transferase
Protena de 26 kDa.
Quando expressa em E.coli apresentaactividade enzimtica.
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Glutationa-S-transferase Protenas de fuso com a GST apresentam
tambm actividade enzimtica da GST.
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Protena de Fuso
Protena em que, durante a traduo, -lheadicionado o gene de interesse.
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Protena de Fuso So produzidas em quantidades
apreciveis pela E. coli
Facilmente purificadas por cromatografiade afinidade com Glutationa-Sepharose.
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Cromatografia Tcnica de separao dos componentes de uma mistura eque recorre a caractersticas fsicas e qumicas como:
Tamanho (massa molecular);
Carga;
Polaridade (hidrofobicidade);
Afinidade qumica (especificidade)
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Cromatografia por afinidade Caracteristicas comuns a todas
as tecnicas de cromatografia:
A mistura divide-se numafase estacionria (matriz) euma fase mvel (eluente)
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Caracteristicas especificas para a
cromatografia por afinidade: Os componentes da fase mvel
que se pretendem obter soretidos na fase estacionria
devido sua afinidade comesta.
Para remover a proteina que sel
igou matriz necessriousar outra substncia quetenha maior afinidade para amatriz e que substitua aproteina
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Cromatografia por afinidade
Matriz resina GlutationaSepharose
El
uente contm as proteinas defuso pretendidas
Neste caso especfico:
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Vector pGEX
Tem na sua composio um promotor tac
Capaz de produzir nveis elevados de expresso daprotena de fuso
Um vector uma entidade de transporte de materialgentico entre genomas diferentes
O pGEX um plasmdeo, ou seja, um crculo de DNA queapresenta a funo de vector nesta situao
Indutvel com IPTG;
um promotor forte;
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DN
A codificante de vrias protenas tem sido cl
onadoatravs do vector pGEX
Clulas E. Coli foram transformadas com este plasmdeorecombinante
Usado na expresso de uma protena de fuso comGST
Vector pGEX
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Mapa do vector pGEX
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Protocolo
1. Induo da expresso da protena de fuso com a GST;
2. Purificao da Protena de fuso com a GST;
2.1. Preparao do extracto de E. coli;
2.2. Purificao da Protena de fuso;
3. Quantificao da protena recombinante purificada.
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