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EXTRACCIN,
CUANTIFICACIN EIDENTIFICACIN DEPROTENAS
GENTICA MOLECULAR 2016 UNIVERSIDAD DE MORN
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Ciencia dedicada al estudio de la expresin de las
protenas y de sus cambios en dependencia del
contexto biolgico
Proteoma:
conjunto de protenas expresadas por un organismo (o
por una parte de l, por ejemplo un tipo de tejido) en
un momento dado. 2
PROTEMICA
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Aplicaciones:
1. Caracterizacin del proteoma de un organismo (identificacin delmayor nmero de protenas expresadas por un organismo en una
condicin biolgica particular).
2. Protemica comparativa (evaluar los cambios en la expresin deprotenas de un organismo sometido a dos o varias condicionesbiolgicas diferentes).
3. Interaccin de protenas entre s y con otras molculas (aislamiento decomplejos de protenas y posterior identificacin de las protenascomponentes; establecimiento de mapas de interaccin yesclarecimiento del mecanismo de determinadas funciones biolgicas
)
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PROTEMICA
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Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula,constituyendo ms del 50% del peso seco de la clula.
Una clula de un organismo superior contiene en un instante de tiempo
millones de molculas de protenas, correspondientes a unas 5000especies diferentes de ARNm en promedio.
4000 de ellas existen en un nmero muy bajo de copias (una o dosmolculas por clula) y dan lugar a protenas poco abundantes o muyescasas.
Se estima que una secuencia de aminocidos puede dar lugar a unas 20variantes moleculares o especies, con lo cual 5000 ARNm diferentesseran responsables por unas 100000 especies moleculares diversas a nivelde protenas.
PROTEMICA
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PROTEMICA
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Luego de ser sintetizadas por la clula, las protenas pueden tener distinta
solubilidad en el medio:
- una protena rica en aminocidos polares es en general ms soluble que
una rica en aminocidos hidrofbicos;
- las protenas fibrosas (alfa-queratina, colgeno) son en general menos
solubles que las globulares;
- los principales factores del entorno de la protena que pueden afectar su
solubilidad son la temperatura, la constante dielctrica del medio y el pH
del mismo y la fuerza inica.
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CUERPOS DE INCLUSIN
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Agregacin proteica: fenmeno que aparece frente a una situacin deestrs celular, tal como el que se da cuando las clulas son forzadas a
producir una protena fornea en concentraciones elevadas (conpromotores fuertes).
Debido a que los chaperones celulares que se encargan de ayudar a lasprotenas a adoptar su forma nativa se encuentran en cantidad limitanterespecto de la cantidad de protena sintetizada, las protenas que se vanproduciendo se pliegan en forma incompleta y se acumulan en forma de
agregados insolubles denominados cuerpos de inclusin.
Los mismos han sido descriptos como agregados proteicos densos,refrctiles, resistentes a algunos detergentes, cilndricos y de medida
variable, y que contienen protena activa y funcional.
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EXTRACCIN DE PROTENAS
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La extraccin de protenas comienza siempre con una ruptura celular o lisis:
rganos u otros tejidos animales: es necesario disgregarlos antes de
proceder a la lisis celular, ya que las clulas se encuentran rodeadas de
tejido conectivo. En general se utilizan enzimas como la colagenasa y/o
una ruptura mecnica grosera con morteros, homogeneizadores elctricos,
tijeras o tamices metlicos.
Cultivo celular: la extraccin puede realizarse adicionando un detergente,
realizando un shock osmtico o por sonicacin.
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EXTRACCIN DE PROTENAS
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a) Mtodos fsico-mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin
a alta presin o extrusin por presin;
b) Mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin-
descongelacin, sonicacin o secado;
c) Mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes,
cidos o sustancias caotrpicas.
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EXTRACCIN DE PROTENAS
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Destruccin fsica mcanica: homogeneizacin: hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan
casi totalmente. moler en un mortero con arena. molino con perlas de vidrio.
prensa de French, que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un pequeoorificio.
Destruccin fsica no mcanica: sonicacin: someter las clulas a vibraciones de ultrasonido. congelacin-descongelacin: la rotura se produce al someter las clulas a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) ypasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).
lisis celular: para clulas sin pared celular como las de tejidos animales (para clulasvegetales o bacterias no es suficiente) se suspenden las clulas en una solucinhipotnica y debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula,causando su hinchamiento y rotura.
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Durante el proceso de rotura, se
utilizan buffers de extraccin para
solubilizar las protenas, quepueden ser disoluciones acuosas
de buffers especficos para
protenas solubles o bien que
adems contengan detergentes si
se pretende purificar protenasasociadas a membranas.
PRENSA
FRENCH
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FRACCIONAMIENTO DEL
EXTRACTO CRUDO
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Centrifugacin diferencial para obtener fracciones subcelulares o para
aislar organelas especficas
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FRACCIONAMIENTO DEL
EXTRACTO CRUDO
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MTODOSCROMATOGRFICOS PARASEPARACIN DE PROTENAS
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Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga,
tamao o afinidad de las diferentes protenas.
Filtracin o exclusin molecular
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa hidrofbica Cromatografa de afinidad
FPLC (cromatografa lquida de separacin rpida de protenas)
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FILTRACIN EN GEL O
CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN
MOLECULAR
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CROMATOGRAFA DEINTERCAMBIO INICO
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MTODOS DE CUANTIFICACIN
DE PROTENAS
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Absorcin a 280 nm: es proporcional a la concentracin de la protena.
Ensayos colorimtricos: el cambio de color en la solucin es cuantificado
mediante absorbancia. Son ms sensibles que la cuantificacin directa a
280 nm, pero involucran la adicin de una sustancia qumica que es
capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacdicos.
Anlisis de resultados: se interpolan las mediciones a una curva de
calibracin construida con una protena estndar de concentracin
conocida como la albmina srica bovina (BSA).
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MTODOS DE CUANTIFICACIN
DE PROTENAS
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MTODOS DE CUANTIFICACIN
DE PROTENAS
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Ensayo de Bradford (595nm)
Es uno de los ms sensibles, rpido y muy sencillo y adems no presenta
interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el -mercaptoetanol,que s interfieren con los ensayos de Lowry y BCA.
Desventaja: altamente sensible a detergentes y lpidos.
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MTODOS
ELECTROFORTICOS
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PAGE nativa
SDS-PAGE
SDS-PAGE +condiciones reductoras
Isoelectroenfoque
Electroforesis
bidimensional
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MTODOS
ELECTROFORTICOS
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Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de lasprotenas es un campo elctrico, y el gel acta como filtro
molecular, ralentizando la migracin de las protenas en funcin de
su relacin carga/masa.
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PAGE NATIVA VS. SDS-PAGE
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Electroforesis en condiciones nativas: las protenas se separan en funcin
de su carga/masa.
En condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia
de un detergente aninico, el SDS (dodecilsulfato sdico), que se une a
todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de
micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS
enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que stas seseparan solo en funcin de su masa e independientemente de su carga.
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SDS-PAGE
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Dodecilsulfato sdico: desnaturaliza a las protenas y se une a ellas en una
proporcin masa/masa constante (1.4 g SDS/g de protena).
Como resultado, las molculas de protena quedan completamente desplegadas y
recubiertas de una carga negativa uniforme, y por ello su movilidad electrofortica
es inversamente proporcional a su nmero de aminocidos.
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SDS-PAGE + CONDICIONES
REDUCTORAS
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Agentes reductores
Compuestos qumicos capaces de reducir los enlaces disulfuro de las
protenas (-S-S-) a grupos sulfhidrilo (-SH). Permiten desplegar completamente una protena y separar las
subunidades de una protena multimrica; ambos efectos son necesarios
para que la movilidad de la protena en una electroforesis SDS-PAGE sea
acorde con su masa molecular. Los ms habituales son el beta-
mercaptoetanol, el ditiotreitol (DTT) y la urea.
El SDS desnaturaliza a las protenas en sus estructuras 2ria. y 3ria.,mientras que los agentes reductores lo hacen en la 3ria. y la 4ria.
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ESTRUCTURAS DE LAS
PROTENAS
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http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1//commons.wikimedia.org/wiki/File:Estructura_prote%C3%ADnas.pnghttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1//commons.wikimedia.org/wiki/File:Estructura_prote%C3%ADnas.png7/26/2019 Protenas - Parte 2.pdf
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La electroforesis con SDS en condiciones reductoras -adems de permitircalcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas- nos indica las
distintas subunidades que posee la protena
PAGE NATIVA VS. SDS-PAGE +CONDICIONES REDUCTORAS
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Es un proceso de separacin e identificacin de protenas en dosdimensiones, orientando los frentes de corrida en ngulo recto uno de
otro
1) Las molculas primero son separadas por su carga o punto isoelctrico (pI)
por la tcnica de enfoque isoelctrico o IEF (Isoelectric Focusing).
2) Posteriormente, las protenas son separadas de acuerdo a su tamao o pesomolecular por electroforesis en SDS-PAGE.
Electroforesis en una dimensin: se puede resolver cerca de 50 bandas.Electroforesis de dos dimensiones: permite resolver 2500 manchas de
polipptidos.
ELECTTROFORESISBIDIMENSIONAL
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ISOELECTROENFOQUE
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BIDIMENSIONAL
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BIDIMENSIONAL
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La electroforesis de protenas es discontinua y desnaturalizante
Es discontinua porque est conformada por dos geles de poliacrilamida(uno de empacamiento y otro de resolucin) que presentan diferenteconcentracin, composicin y pH.
Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por una fase deseparacin visible a trasluz.
Debido a que en estado lquido ambos geles pueden mezclarsefcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total
polimerizacin del primero para continuar con la polimerizacin del otro.
PREPARACIN DE GELES DEPOLIACRILAMIDA
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El gel de empacamiento, apilamiento o concentracin se localiza en laparte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarnlas muestras: posee baja concentracin de acrilamida (4%) en tampn
ligeramente cido (Tris/HCl 1M pH 6,8), de forma que ofrezca pocaresistencia a la mezcla de protenas sometidas a electroforesis; por esolo atraviesan con relativa rapidez.
El gel de resolucin o de separacin forma el cuerpo del gel por donde
migrarn y se separarn las protenas: debe tener mayor concentracinde acrilamida (10% o ms) y pH ms bsico (8,3-8,8) de manera queofrezca mayor resistencia en la corrida a los polipptidos.
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PREPARACIN DE GELES DEPOLIACRILAMIDA
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PREPARACIN DE GELES DEPOLIACRILAMIDA
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Dato importante: la metilbisacrilamida es uncompuesto qumico neurotxico, mientras que la
poliacrilamida no lo es
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SDS-PAGE
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La electroforesis termina cuandose haya producido la mximaseparacin de los componentes
de la muestra, pero sin sobrepasarlos lmites del gel.
Para evitar que se sobrepasenestos lmites, se utilizan molculascoloreadas con una movilidadelectrofortica superior a la decualquier componente de la
muestra (poseen elevada carga
respecto a su tamao).
Entre los ms utilizados seencuentran la dinitrofenil-lisina
(DNP-Lys) y el azul de bromofenol.
SDS-PAGE
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Marcadores moleculares: permiten determinar el pesomolecular de la cadena polipeptdica
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SDS-PAGE
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Cuba de electroforesis con 4 geles sembrados y listos para correr
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Electrodo
s
SDS-PAGE
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Comienzo de la corrida electrofortica
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Burbujeo
SDS-PAGE
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No se sabe a ciencia cierta cul es el mecanismo de adhesin a las protenas deeste colorante, pero se especula que se puede unir al grupo amino o bien quereconoce y se une a los siguientes aminocidos:
TINCIN CON COMASSIE BLUE
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Patrn del markerKaleidoscope prestainedstandards de BIO-RAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BSA(Seroalbmina bovina.
66,00 kDa)
Protena acuantificar:
Eg95 ( 37,40
kDa)
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TINCIN CON COMASSIE BLUE
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*Es la transferencia de las protenas a una membrana*
Finalizada la PAGE, se puede obtener informacin acerca de las protenas si stas setransfieren desde el gel a una membrana.
El proceso de transferencia se denomina blotting y fue originariamente descriptopor E. M. Southern para el ADN (Southern blot); posteriormente y continuando con lamisma terminologa, se describi para el caso del ARN y las protenas (Northern yWestern blot respectivamente).
Una vez en la membrana, las protenas estn accesibles a diferencia de en el gel-para interaccionar con otras molculas que permitan su identificacin; en la mayorade los casos, estas molculas son anticuerpos y el proceso se conoce comoimmunoblotting, pero tambin pueden ser lecitinas, cidos nucleicos, receptores ocualquier otro ligando.
WESTERN BLOT
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Membrana de nitrocelulosa:posee una buena
capacidad de unin deprotenas (250g/cm2), que
quedan unidas a lamembrana de forma no
covalente medianteinteracciones electrostticas
e hidrofbicas.
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WESTERN BLOT
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WESTERN BLOT
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Membrana transferida y teidareversiblemente con rojo ponceau
43MarkerEstndarMuestras
REVELADO
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REVELADO
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Mtodo indirecto de deteccin: el anticuerpo primario sin marcarreacciona con el antgeno. Luego, un anticuerpo secundario
marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.
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REVELADO
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Placas radiogrficas: confirman la identidad de la protena de inters
La presencia de bandas indica inequvocamente -por medio del pegado delanticuerpo especfico- que la protena sembrada es la de inters. Si el
anticuerpo 1rio. no se pega, el 2rio. tampoco y no hay revelado (es decir, nose impresiona la placa)
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REVELADO
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