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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
“ESTUDIOS PRECLÍNICOS FARMACOLÓGICOS DE EXTRACTOS DE
Anthurium schelechtendalii Kunth (RAÍZ DE PIEDRA) EN LA REMISIÓN O
PREVENCIÓN DEL DAÑO RENAL INDUCIDO POR ADENINA EN
MODELOS MURINOS”
DIRECTOR
DR. OCTAVIO CARVAJAL ZARRABAL
ASESOR EXTERNO
M. en C. DULCE MARÍA BARRADAS DERMITZ
PRESENTA
Q.C. SAYRA QUERO HERRERA,
Estudiante de la Maestría en Medicina Forense.
VERACRUZ, VER.
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
REGIÓN VERACRUZ
INSTITUTO DE MEDICINA FORENSE
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CONTENIDO
Pág.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABLAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1.-INTRODUCCIÓN …………………………………………………………………1
2.-PLATEAMIENTO DEL PROBLEMA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …9
3.-JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....10
4.-OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ….11
5.- HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …...12
6.- METODOLOGIA……………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……….13
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... …...24
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1.-INTRODUCCIÓN
1.1. Enfermedad renal crónica
La Enfermedad Renal Crónica (ERC), en la SSA 2009, se definió como la
“disminución de la función renal expresada por una tasa de filtración glomerular
(TFG) < 60 ml/min/1.73m2 o presencia del daño renal (alteraciones histológicas,
albuminuria-proteinuria, alteraciones del sedimento urinario o alteraciones en
pruebas de imagen) de forma persistente, durante al menos tres meses”
(Cortes et al., 2009)
Esta definición de ERC es consecuente con la adoptada a nivel internacional
por la organización “Mejorando los resultados globales de la ERC” o Kidney
Disease Improving Global Outcomes (KDIGO), 2004, la cual está basada “en
la reducción de la filtración glomerular en combinación con signos de daño
renal”. Específicamente indica como ERC: “daño renal o una tasa (velocidad)
de filtración glomerular < 60 ml/min/1.73m2 por 3 meses o más”. En cuanto al
daño renal especifican que puede ser determinado por la presencia de
albuminuria a través de la relación o cociente albumina/creatinina a 30 mg/g
en dos de tres muestras de orina (Levey, et al., 2005).
La ERC es una patología de alta incidencia, prevalencia y mortalidad en
México y en el mundo. El número de nuevos casos por millón de habitantes por
año (incidencia) es de 200, en la mayoría de los países, mientras que en
países como los E.U.A., Taiwán y algunas regiones de México, alcanza 400
casos o más, por millón de habitantes, por año (Levey y Coresh, 2012).
En el estudio publicado por Franco-Marina, et al., 2011, a partir del registro de
tasas de mortalidad en México por ERC terminal (ERCT) entre 1990-2005, se
desarrolló la proyección para el período 2005-2025. En todos los 5 grupos en
los que se dividieron los estados de la República Mexicana, conforme al grado
de marginación (muy alta; alta; media; baja; muy baja) se proyectó un
constante incremento en la tasa de mortalidad por ERCT, los dos primeros
grupos (marginación muy alta y alta) alcanzaron la tasa más alta para el año
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2025) que es de 983 casos y 745 casos por millón de habitantes,
respectivamente. En cuanto a las tasas de incidencia y prevalencia se estima
que incrementarán del 2005 al 2025 también en estos dos grupos, de 433 y
402 a 1012 y 773 casos por millón de habitantes; y de 1209 y 1242 a 83 % y
56.6 %, respectivamente.
Por su parte, Méndez-Duran, et al., 2010, afirman que la ERC “se considera
una enfermedad catastrófica debido al número creciente de casos, por los altos
costos de inversión, recursos de infraestructura limitados y detección
tardía”.Con su estudio pudieron concluir que en México las causas de la ERC,
en 31,270 pacientes de 127 hospitales, fueron diabetes mellitus (48.5%),
hipertensión arterial (19%), glomerulopatías crónicas (12.7%) y otras causas
(19.8%).Estos resultados son semejantes a los reportados en otros estudios
que identifican a la diabetes y a la hipertensión como principales causales de la
ERC (Haroun, et al., 2003 y Perneger, et al., 1994, citados en Zhang y
Rothenbacher, 2008). Este tipo de causas de ERC se les ha denominado
también como tradicionales, mientras que en Reunión Del Sector Salud De
Centroamerica y Republica Dominicana en el 2013 hacen mención a los
factores tóxico-ambientales (metales pesados, agroquímicos, medicamentos
antiinflamatorios no-esteroideos, antibióticos) integran el grupo de los no-
tradicionales a nivel mundial y generalmente están asociados al grupo de “otras
causas”. (Peraza et al., 2013)
En el 52o Consejo Directivo de la Organización Panamericana de la Salud-
OPS, realizado en Septiembre-Octubre del 2013, se manifestó que en las dos
últimas décadas los pacientes en Centroamérica, diagnosticados con ERC han
aumentado y que es “un grave problema de salud pública”. De igual forma se
expresó que la población más afectada son hombres agricultores menores de
60 años, y que la etiología en este caso no es la común de ERC, esto es,
diabetes e hipertensión. Se ha vinculado a “factores tóxico-ambientales
(probablemente agroquímicos) y ocupacionales (inadecuada higiene laboral en
condiciones de altas temperaturas e insuficiente ingestión de agua) y también
hábitos nocivos como la ingesta de medicamentos nefrotóxicos, especialmente
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de antiinflamatorios no esteroideos” La prevalencia de sustitución de la función
renal aumento aproximadamente en un 300%, pasando de 162 pacientes por
millón de personas, en 1991, a 473 pacientes por millón de personas en el
2006 (OPS, 2013).
Por su parte, el Ministerio de Salud de El Salvador, 2013, indica que este
fenómeno se presenta además de Centroamérica en el sur de México, lo que
resulta congruente con la proyección realizada por Franco-Marina, et al., donde
los estados del sur y sureste mexicano, se encuentran entre los grupos de
marginación muy alta y alta y a su vez de mayor mortalidad, incidencia y
prevalencia de la ERC.
1.2. Herbolaria e IRC.
Debido a la importancia del problema de salud pública de la ERC en México y a
nivel mundial, en la actualidad existe un interés en alternativas de prevención
y terapéuticas para este padecimiento, originadas en la medicina tradicional,
cuyos efectos adversos sean mínimos. El tratamiento actual para la ERC se
limita a esteroides, citotóxicos y tratamiento sustitutivo dependiendo del
estadio de la enfermedad (Javaid et al., 2005). La Medicina alternativa y
especificamente la herbolaria ha utilizado plantas para los padecimientos
renales y sus mecanismos de acción han sido estudiados.
Tal es el caso del Astragalus membranaceus, que es una planta usada en la
medicina china tradicional, cuyo beneficio es la prevención y remisión de la
glomerulonefritis por IgA, que es una enfermedad del glomérulo renal que se
caracteriza por el depósito difuso de inmunoglobulina A a nivel mesangial. Los
principios activos de esta planta son Flavonoides , saponinas , polisacáridos
(inmunoestimulantes responsables de su actividad). (Xu, D. et al.,2008). Un
estudio mostró que esta planta interviene en la protección mitocondrial del
túbulo proximal, al eliminar las formas reactivas de oxígeno, de tal manera que
confiere un efecto antioxidante (Li, X. et al., 2012).
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De igual manera la Acacia Senegal (Goma Arábica), es un polisacárido natural
que posee un alto contenido de fibra soluble y aumenta la excreción de
nitrógeno fecal. La Acacia es de uso común en el medio Oriente en pacientes
con enfermedad renal crónica (Bliss DZ,.et al.,1996). Los efectos renales y
extrarrenales de la goma arábiga se han analizado en modelos murinos. (Nasir
O., 2013).
Se valoró el efecto nefroprotector de Goma Arábica sobre el estrés oxidativo y
la inflamación en un modelo de daño renal inducido por adenina, similar a la
patología dada en la Enfermedad renal crónica no glomerular (Ali. et al., 2013).
En base a los antecedentes planteados y a la evidente necesidad de conocer la
eficiencia en la remisión o prevención de la ERC de compuestos bioactivos
presentes en plantas que por conocimiento etnobotánico se sabe son aplicadas
en la medicina tradicional para problemas renales, 4 instituciones de educación
superior e investigación: Universidad Veracruzana (UV), Instituto de Ecología,
A.C. (INECOL), Instituto Tecnológico de Veracruz (ITV) y Universidad Nacional
Autónoma de México (UNAM) han iniciado conjuntamente el Programa de
Investigación Institucional y Multidisciplinario sobre ERC.
1 .3. Anthurium schelechtendalii Kunth
Una de las plantas sujetas a estudio es Anthurium schelechtendalii Kunth (raíz
de piedra) miembro de la familia Araceae. Esta familia es principalmente
tropical con una mayor diversidad de especies en Asia y América tropical
(Croat, 1998). En México se han registrado 121 especies y 18 géneros; los
géneros Philodendron y Monstera son los más numerosos (Espejo y López–
Ferrari, 1993). La mayoría de las especies se concentran en las zonas
tropicales de los estados de Chiapas, Oaxaca, Yucatán y Veracruz, aunque
existen algunos elementos de zonas templadas; por ejemplo,
Arisaema (Bunting, 1965).
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No existen hasta ahora estudios fitoquímicos específicos en insuficiencia renal
de Anthurium, schelechtendalii, sin embargo existe un reporte de la actividad
antiproliferativa de los extractos de raíz y hojas (Stark, et al., 2009). Por otra
parte, en las hojas de Anthurium versicolor, se han encontrado antioxidantes y
compuestos fenólicos tipo flavonoide en forma de glucósidos (Aquino et al.,
2001).
1.4 Modelo murino de ERC.
Este trabajo de tesis contempla el estudio sobre la capacidad de extractos
obtenidos de la raíz de A. schelechtendalii para remitir o prevenir el daño renal
inducido por adenina en modelos murinos.
Es bien sabido que la mayor parte de nuestra comprensión fundamental de la
bioquímica humana, fisiología, endocrinología y farmacología procede de los
estudios originados de los mecanismos en modelos animales (Larsen, M.Ø.,
2001 citado en Hau, J., 2003) .
En enfermedad renal, las terapias experimentales estudiadas se han aplicado
principalmente en diversas cepas de ratas, pero también se han empleado en
mandriles, perros, gatos, conejos, y ratones. No se han encontrado las mismas
respuestas fisiológicas en todos los animales de experimentación, por lo que
se ha optado por los modelos con mas facilidad de manejo.La enfermedad
renal en los modelos murinos ha sido estudiada en casos de enfermedad
quística (Schieren G.,1996) y la nefritis lúpica (Rees AJ.,1997) .Incluso se han
observado diferencias en el grado de expresión de una enfermedad renal entre
cepas de ratones (He C,.1996).
La etapa funcional y morfológica final de riñón humano y su equivalente a nivel
experimental, el riñón en la rata, exhibe enfermedad túbulo-intersticial
generalizada. La modificación en la dieta baja en proteínas y grasas tanto en
en el metabolismo como en la histología ha sido estudiada por largo tiempo
(Banković-Calić N.,2002).
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El modelo de daño renal inducido por adenina implementada en el alimento
que se utilizará en este trabajo ha sido probado en ratas y ratones y ha
mostrado que los ratones son más sensibles a la adenina (Ali, et al., 2013). En
las ratas parece ser que la disfuncion renal inducida por adenina es reversible,
por lo que estos animales son particularmente útiles para el estudio del efecto
(okada, et al.,1999).
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2.-PLATEAMIENTO DEL PROBLEMA
La insuficiencia renal es un problema de salud en México y especialmente en el
estado de Veracruz, que ocupa desde el 2013 el primer lugar en casos nuevos
con ERC con 600 casos al año por cada millón de habitantes. El modelo murino
de insuficiencia renal creado por la administración de adenina ha sido validado
en diferentes estudios. En este trabajo se plantea estudiar el efecto de remisión
y nefroproteccion para insuficiencia renal.
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3.- JUSTIFICACIÓN.
Desde los inicios de la humanidad el hombre ha tenido como aliadas a las
plantas. Más del 90% de los medicamentos utilizados en el mundo no-
industrilizado son productos naturales y más del 60% de medicamentos usados
en la medicina occidental tienen su origen en plantas y microbios. Un ejemplo
claro es la familia Araceae, pues en México, desde la época prehispánica
diversas especies de esta familia eran utilizadas con fines medicinales,
alimenticios, mágico-religiosos y ornamentales (Mandujano et al., 2002).
Sin embargo, algunas de las plantas de esta familia carecen de estudios
químicos y de actividad biológica; entre ellas podemos citar a las especies del
género Anthurium.
Actualmente se conoce que los extractos de Stenocereus eruca y de
Dracontium loretense tienen efectos analgésicos y antinflamatorios (Imai et al.,
2006;Collantes et al.,2011). Tomando en cuenta lo anterior, en este proyecto se
propone determinar la actividad antiinflamatoria, efecto regenerativo y citotóxico
de extractos orgánicos y metabolitos secundarios de raíz Anthurium
schelechtendalii kunth aplicados a nivel renal.
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4.-OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar la capacidad de raíz de piedra de Anthurium
schelechtendalii kunth en la remisión o prevención del daño renal
por adenina.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Establecer la Concentración Letal 50 (LC 50) de los extractos de Anthurium schlechtendalli Kunth en Artemia salina sp.
• Definir las alteraciones bioquímicas e histopatológicas en los riñones inducidas por adenina, en los animales de estudio.
• Determinar la capacidad de remisión de ERC de los extractos de la raíz de Anthurium schelechtendalii Kunth frente al daño renal inducido por adenina.
Determinar la capacidad nefroprotectora de extractos de la raíz de
Anthurium schelechtendalii Kunth frente a la administración de adenina.
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5.- HIPOTESIS
H1 Si existen compuestos bioactivos provenientes de la raíz de Anthurium
schelechtendalii Kunth (Raíz de piedra) en los extractos en estudio, que
muestren capacidad de remisión o prevención del daño renal inducido por
adenina, se harán evidentes en los modelos murinos de experimentación a
través de las valoraciones y exámenes de parámetros bioquímicos e
histopatológicos.
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6. METODOLOGIA
6.1. Tipo de estudio.
Estudio comparativo y experimental en animales, en el cual se evaluará el
efecto nefroprotector y efecto de remisión de Anthurium schelechtendalii
Kunth en un modelo de daño renal inducido por adenina.
Basados en los estudios de Yokozawa, et al., 1986 y Okada, et al., 1999,
respectivamente. Se inducirá un daño renal a los murinos con una dosis de
adenina de 0.75 % administrando en conjunto con la dieta comercial y los
extractos de Anthurium schelechtendalii Kunth elegidos de acuerdo a la
toxicidad para verificar el grado de nefroprotección. Por otro lado, en otro
grupo se administrará la adenina a la misma concentración y ya corroborado el
daño con los marcadores renales se procederá a administrar los extractos de
Anthurium schelechtendalii Kunth.
6.2. Recolección del material vegetal.
Para este estudio se empleará material vegetal previamente recolectado.La
recolección se llevó a cabo el 01 de septiembre de 2013 en la zona de
Tlacojalpan del estado de Veracruz. El muestreo fue a base de conveniencia de
la zona antes mencionada, con un peso total de 2-2.5 kg de planta total. Se
tomó exclusivamente la raíz de este ejemplar, se realizó un tratamiento previo
con agua destilada para eliminar todo tipo de residuo, en seguida se fraccionó
el material en trozos pequeños obteniendo un peso 1850 kg. De este total se
obtuvieron dos partes: la parte A correspondiente a muestra fresca la cual fue
congelada por una semana y la parte B representaba la muestra seca; el cual
se puso a secar a temperatura ambiente en el laboratorio por una semana.
6.3. Obtención de los extractos
6.3.1.- Extractos orgánicos.
El material vegetal recolectado (raíz) se lavará minuciosamente con agua, para
eliminar residuos e impurezas, y se fraccionará en dos partes. Una de ellas se
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secará a temperatura ambiente durante una semana dentro del laboratorio pero
donde le lleguen los rayos del sol y la otra se trabajará como material fresco
dentro de las 48 horas después de la recolección.
100 g del material fresco someterá a extracción con acetato de etilo utilizando
dos extractores Soxhlet (50 gr serán depositados en cada extractor). El extracto
se concentrará en un evaporador rotatorio marca BUGUL-ROTAVAPOR
modelo RE 120 acoplado a una bomba de vacio (aspiración de agua) marca
Cole palmar modelo 7049-50 y a un ciculador refrigerado marca FISONS
modelo HAAKE CH, fijado a una temperatura de 18°C . El extracto se
recolectará y secará con corriente de nitrógeno de alta pureza. (EOMF =
Extracto Orgánico del Material Fresco)
20 gramos del material seco se tratará de la misma forma descrita en el
párrafo anterior para obtener el extracto orgánico correspondiente: EOMS =
Extracto Orgánico de Material Seco.
6.3.2. Extractos Acuosos
6.3.2.1. Maceración
El material vegetal 400 gramos fresco se macerará durante 24 horas en agua,
en recipiente de vidrio ámbar, a temperatura ambiente y con movimientos
rotacionales cada hora, por espacio de 3 minutos cada vez.
Se filtrará el macerado. Primero, a través de coladera de plástico, y el filtrado
que se recolectó se someterá a filtración en embudo Buchner, papel Whatman
No.2, con bomba de aspiración al vacío (marca Cole palmar modelo 7049-50 ).
Se congelará el filtrado resultante por 24 hrs.,y se liofilizará en LABCONCO
FREEZE DRY SISTEM 4.obteniéndose el Extracto Acuoso de Material Fresco
Macerado EAMFM.
Al material vegetal seco se le realizará el mismo procedimiento anterior,
obtenièndose finalmente el Extracto Acuoso de Material Seco Macerado
EAMSM.
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6.3.2.2. Infusión
Otra parte de material 400 gramos se someterá a extracción por infusión. Se le
agregará a la materia prima 1000 ml con agua desionizada a temperatura de
ebullición, durante 1 minuto y 4 minutos en reposo (sin mayor calentamiento).
Y se procesará de la misma forma que el material acuoso por maceración.
De igual manera el material seco se someterá al mismo proceso de extracción
por infusión, después de obtenido, se procederá a seguir con los pasos de
filtración, congelado y liofilización que en el de maceración.
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6.4. Determinación de la CL50 de los extractos
Esta prueba se realizará con Artemia salina,la cual se expondrá a diferentes
concentraciones del extracto tanto acuoso como orgánico.
SE DETERMINARAN LA
CL50 CON LA ARTEMIA
SALINA.
SE REALIZA LA PRUEBA DE
TOXICIDAD AGUDA CON
DIF. CONCENTRACIONES
DICROMATO DE POTASIO.
ESTO TAMBIÉN SERVIRÁ
PARA CONTROL POSITIVO.
LAS PRUEBAS SE REPETIRAN 30
VECES PARA CADA
CONCENTRACIÓN.DEPENDIENDO
DEL RESULTADO.SE AUMENTA O
DISMINUIRA LAS
CONCENTRACIONES.
SE REALIZARAN LOS ENSAYOS
CORRESPONDIENTES PARA
ESTABLECER EL TIEMPO DE
INCUBACIÓN, LA TEMPERATURA
Y EL TIEMPO EN QUE
ECLOSIONAN LAS LARVAS PARA
OPTIMIZAR TIEMPO
SE REALIZA UN ENSAYO
PARA ADQUIRIR DESTREZA
EN LA MANIPULACIÓN DE LAS
LARVAS .Y REALIZAR LOS LAS
PRUEBAS DE CONTROL.
EL CONTROL
NEGATIVO SERA AGUA
SUPLEMENTADA CON
LEVADURA DE
CERVEZA COMERCIAL.
SE PREPARARA DE CADA EXTRACTO UNA SOLUCION
PATRON ( c = 100 g/mL )
DETERMINAR LA
CONCENTRACION LETAL
MEDIA REALIZANDO
DILUCIONES DE 10,100 Y 1000
EN CADA POZO.
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6.5. Manejo de animales y toma de muestras.
Ratas Wistar machos (9-10 semanas con peso de 240 ±10 gr) estarán en una
habitación a una temperatura de 22 º C , con una humedad relativa del 60
%,con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (luces encendidas las 6:00),tendrán
libre acceso al agua y a una alimentación estricta compuesta de la dieta en
polvo que contiene 0.85% de fósforo, 1.12% de calcio, 0.35% de magnesio,
25.3% de proteína cruda y 2,5 UI / g vitamina D3 (Omán Flour Mills, Muscat,
Omán). Los procedimientos con animales y su cuidado se llevaran a cabo de
acuerdo con las leyes y políticas internacionales.
Durante el periodo de tratamiento ratas se pesaran semanalmente y serán
colocadas individualmente en jaulas metabólicas para recoger el orina de 24
hrs. Al final de experimento las ratas se anestesiaran con tratamiento
intraperitoneal y la sangre (3 ml aproximadamente) se tomará de la vena cava
anterior, y se colocará en tubos para colectar suero o plasma(opcional). La
sangre y la orina se centrifugaran a 900 g a 4 ºC durante 15 min. El suero o
plasma obtenido, junto con las muestras de orina, se almacenaran congeladas
a 2-8 ºC en espera de análisis. Los dos riñones serán extirpados envueltos
en papel de filtro y se pesaran. Un corte del riñón derecho se colocara en
formalina al 10% para el procesamiento histológico posterior. El resto de los
riñones se mantendrán congelados a 2 – 8 ºC a la espera de análisis
bioquímico.
Pasada una semana. El riñón izquierdo se homogeneizara en tampón Tris
enfriado con hielo (pH 7,4) para dar un 10% w / v homogeneizado. Este último
se centrifugara a 1500 g a 48C durante 15 min, y el sobrenadante obtenido
será utilizado para medir la actividad de la SOD.
6.6. Esquema de tratamiento.
Los animales (n= 36) se mantienen por una semana en las condiciones
referidas para su adaptación. Se dividen al azar en 6 grupos con 6 ratas en c/u.
El primer grupo o grupo control (gc) se le administra la misma dieta (alimento
comercial) hasta el final del estudio. Al segundo grupo o grupo de daño renal
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inducido (gdri) se le modifica la dieta anterior incorporándosele adenina (0.75%
p/p). La mezcla de adenina con el alimento comercial se realiza pulverizando
ambas. El tercer y cuarto grupo (ExtAx% y ExBy%) reciben la dieta comercial
mezclado con adenina y dos diferentes concentraciones del extracto
respectivamente en estudio. La mezcla de extracto con el alimento comercial
se realiza pulverizando ambos ingredientes. El quinto y sexto grupo (gdri +
ExtA% y gdri+ExtBy%) se les da la mezcla de dieta comercial con adenina
durante dos semanas para producir las alteraciones y después se le deja de
administrarla adenina y se deja con dieta más extracto, todo en forma de
polvo. El tiempo total de experimentación para el estudio en estos 6 grupos es
de 4 semanas.
6.7. Histología renal
Los riñones se fijarán en 10% formalina, deshidratados en concentraciones
crecientes de etanol, serán aclaradas con xileno y embebidos en parafina.
Cinco secciones micrométricas serán preparadas a partir de bloques de
parafina y se tiñeran con hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson
utilizando procedimientos estándar.
La evaluación microscópica de las secciones de riñón se llevarán a cabo
asignando una puntuación, que evalúa el área de necrosis de los túbulos
proximales en una escala arbitraria de 0-4 (0, sin necrosis; 1, Área de necrosis
hasta un 25 %de los tubulos ; 2, área necrótica de hasta un 50% de los
tubulos; 3, Necrosis que afecta el 75% de los túbulos 4, Necrosis del 76 al
100% de los túbulos
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6.8. Esquema de determinaciones
ORINA SUERO o PLASMA HOMOGENEIZADO
RENAL
Creatinina
Urea
Acido urico
Proteínas en
orina.
Lactato
Deshidrogenasa
LDH
Capacidad
Antioxidante
GSH Glutatión
SOD Super
Óxido
Dismutasa
CRP Proteína C
Reactiva
TNF-alfa
IL-10
*CHECAR LA PRESION DE LOS MURINOS
6.8.1. Determinaciones analíticas
Las concentraciones de creatinina y urea en plasma o suero serán medidas
por método enzimático. El ácido úrico por método uricasa-PAP. En las
determinaciones de Lactato deshidrogenasa usara el método UV(Fosfatos-
Piruvatos-NADH) .Para las proteínas en orina el método de rojo de pirogalol.
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Realizando las mediciones en espectrofotómetro utilizando kits comerciales
(Randox).
Actividad antioxidante total (TOA) se medirá en suero utilizando un kit de
Oxford Investigación Biomédica (Oxford, MI, EE.UU.).
En homogeneizados de la corteza, la concentración renal de glutatión (GSH)
por método UV y superóxido dismutasa (SOD) método UV cinético con un kit
de Randox, medidos espectrofotométricamente.
Para pruebas de PCR con un inmunoensayo enzimático desarrollado para la
detección y cuantificación de la CRP en suero u otras muestras de fluido
biológico. kit ELISA de Genway Biotech., Inc.
TNF-alfa basado en el método Elisa en sandwich fase sólida con un
anticuerpo monoclonal específico para TNF-α. El processo incluye la
incubación de la muestra a la que se le añade trás el lavado, la enzima
streptavidin-HRP, volviéndose a incubar y lavar. La intensidad de la reacción
coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adición del
sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la
concentración de TNF-α presente en las muestras analizadas. La reacción se
termina mediante la adición de ácido (H2SO4) y la absorbancia se mide a 450
nm. kit ELISA de R & D Systems Europe Ltd.
IL-10.- El kit está basado en un método ELISA en sandwich en fase sólida con
un anticuerpo monoclonal específico para la interleucina10. El proceso incluye
una incubación de la muestra a la que se añade tras el lavado, la enzima
streptavidin-peroxidasa, volviéndose a incubar y lavar. La intensidad de la
reacción coloreada que se produce finalmente tras la correspondiente adición
del sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a
la concentración de IL-10 presente en las muestras analizadas. Despues se
lee la absorbancia em espectrofotômetro.El kit ELISA de R & D Systems
Europe Ltd.
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VALORES DE REFERENCIA
Creatinina 0.4 a 1.5 mg/dla
Urea 15 a 22 mg/dla
Proteinas en orina 30 mg/dla
Lactato Deshidrogenasa LDH Hasta 15 UI/la
Capacidad Antioxidante 0.52-7.0mg/lc
GSH Glutatión 6.76 – 7.66 mg/gc
SOD Súper Óxido Dismutasa 1.22 – 1.49U/gc
CRP Proteína C Reactiva <1 ng/mlc
TNF-alfa 29,6 y 57,6 pg/mlc
IL-10 17.06-24.66 pg/mlb
(Hernandez et al.,1990)a(Reyero et al.,2001)b (Ali et al.,2013)c
FLUJOGRAMA
SELECCIONAR EL
AREA DE COLECTA
DE LA PLANTA
EXTRACCIONES DE LA RAìZ DE
LA PLANTA EN MEDIO
ACUOSO (MACERACIÓN E
INFUSIÓN) Y
C
EXTRACCIONES DE LA RAìZ DE
LA PLANTA EN MEDIO
ACUOSO (MACERACIÓN E
INFUSIÓN) Y CON ACETATO DE
ETILO
ON ACETATO DE ETILO
PRUEBA PRECLÌNICA EN MODELO MURINO:
-ACLIMATIZACIÓN DE LOS ANIMALES.
- INDUCCION FALLO RENAL CON ADENINA Y
TRATAMIENTO DE LOS ANIMALES
LOS NIVELES DE CONCENTRACIÓN DE
EXTRACTOS A UTILIZAR EN LA PRUEBA
PRECLÍNICA CON MURINOS.
EXTRACCIONES DE LA RAìZ DE LA
PLANTA EN MEDIO ACUOSO
(MACERACIÓN E INFUSIÓN) Y CON
ACETATO DE ETILO
DETERMINAR CL50 CON BASE
A LA PRUEBA TOXICIDAD DE
ARTEMIA SALINA.
-OBTENCIÒN DE MUESTRAS
-PROCESAMIENTO DE
MUESTRAS Y
GENERACIÓN DE RESULTADOS.
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6.9. Análisis Estadísticos
Los marcadores bioquímicos y datos en cambios morfológicos se expresan
como la desviación estándar media ± (x ± SD). La significación estadística se
determinara con el análisis de los procedimientos de la varianza(ANOVA),
Seguida con la prueba de comparación múltiple de Tukey (P <0,05). Los datos
serán analizados utilizando el programa estadístico SPSS Versión 20, 2011.
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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Recolectar la raíz de la planta Preliminar
Obtención de los extractos acuosos y orgánicos
Liofilizarlos
Determinar la cantidad de material de raíz
necesario para realizar los futuros ensayos basados
en el total de rendimiento por extracto.
SEPTIEMBRE DE 2013-
ABRIL DE 2014
Determinar la Concentración letal media(CL 50) con
el ensayo de artemia salina
MAYO DE 2014-
AGOSTO DE 2014
Recolectar material necesario (raíz de la planta)
basados en los cálculos de rendimiento.
Obtención de los extractos
Liofilizarlos
Determinar la concentración letal con el ensayo e
artemia salina .
SEPTIEMBRE –
NOVIEMBRE DE 2014
1. Adquirir a los modelos murinos, verificar que
cumplen los criterios,
2. Periodo de aclimatación.
3. Proceder a administrar la adenina en su
alimentación para producir el daño renal
4. Realizar la determinación de orina, sangre y
biopsia histológica para corroborar el grado
de daño renal
5. Administrar a los murinos( con daño renal el
extracto de la raíz de piedra y monitorear si
existe la remisión
6. Corroborar la mejoría de la enfermedad
DICIEMBRE DE 2014-
FEBRERO DE 2014
24
tomando muestra histológica para comparar .
Organizar los datos MARZO 2015
Analizar los datos estadísticamente ABRIL 2015
Presentación de resultados y conclusiones MAYO 2015
25
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