Revision
Reacdon en cadena de la polimerasa
J.M. Gonzalez Buitrago
Resumen
La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es una tecnica poderosa de amplijicacion de cartos fragmentos especf·ficos de A DN que ha represemado /lIIa remlucion en eI campo de la Biologia Molecular y en 1m futllro cercano en loslaboratoriQS clfnicQS. EI prQceso de la peR esto basado enla repe/icion ciclica de tres reacciones simples (desnalllrali·zacion, fijado y extension) que se dijerenciall solo enla temperatllra de reaccioll. Cada cicio produce la duplicacion delas mQ!eculas de A ON. EI procedimienro puede realizarseell/III /inico tuba y es focilmente automatizable. Su apficacion en los laborarorios cllnicos para la deteccio/l de enfermedades monogenicas, infecciosas y neoplosicas es )'a unorealidad. En lin flllllro no mllY lejano padro aplicarse muyprobablemente af diagllostico de enfermedades mllltigenicos mas com/Illes, como las enfermedades coronarias, fa hipertensian esencial, 10 diabetes mellitlls y los enfermedadestiroideas.
Introducci6n
EI acido desoxirribonucleico (ADN) es la molecula responsable de la herencia, eSlO es. del almacenamiento y transmisi6n de la infonnaci6n de las celulas y algunos virus. EI ADNes una mo[ecu[a de gran tamafto y composicion poco variable, por 10 que cuando comellzo a eSludiarse en [os aftos 50y 60, se encontraron grandes dificultades. En los aftos 70varios hechos fundamentales cambiaron el panorama de losestudios de la biologia molecular del ADN; los mas importantes fueron e[ descubrimiento de las enzimas de reslriccion, la pUCSla a punlO de tccnicas de sccucnciacion nipiday la tecno!ogia del ADN recombinante.
En 1984 un grupo de cientificos de la empresa Cetus desarroll6 un procedimiento para oblener una cantidad elevada de copias de fragmentos de ADN que denominaron reaccion en cadena de la po[imerasa (PCR) y que ha supuestouna revo[uci6n en los estudios del ADN (1,2). Con esta tecnica [a obtenci6n del mimero elevado de copias del fragmenlode ADN se consigue en horas, frente a los dias, semanas 0incluso meses necesarios con las tccnicas de clonaciOn. PoreSla tecnica Kary B. Mullis, su descubridor, ha recibido elpremio Nobel de Quimica de 1993. En un articulo de 1990,Mullis narraba como concibi6 csta tccnica (3).
Desde su introduccion hasta nuestros dias se han publicado un gran numero de revisiones sobre la tccnica (4-13),yel nllmero de lrabajos publicados en los que se ha empleadoes enorme. Tambicn han aparecido vados libros dedicados
Servieio de Bioquimiea.Hospilal Uni,'ersilario de Salamanca.OeparlamcnlO de Bioquimiea y E1iologia Mole<:uIJr.Uni,'ersidad de Salamanca.Recibido: 16·2_94.Aceplado: 16·S·94.
170 Quimica Clinica 1994; 13 (4)
QUIMICA CLiNICA 1994; 13 (4): 170-177
Summar~'
Polymerase cllain reaction (PCR) is a powerful amplification technique of specific short DNA fragments which hasrepresemed a rellolmion in rhe field of IWolecular /Jiologyand in the near future in clillicallaborarories. PCR is basedon the cyclic repetition of three simple reactiolls (denamration, annealing and extension) whicll differ only in reactiontemperature. Each cycle results in a doubling of DNA molecules. The procedure can be carried our ill a single tubeand is easily automated. peR applications in the clinical faboratories for monogenic, infectious and neoplasic diseases is nowadays a realitJ~ In a not too distaflf future PCRwill probably be applied to the diagnosis of mosr comrmm
multigenic diseases, such as coronary diseases, essemialhypertension, diaberes mellitus and thyroid disorders.
exclusivamcnlC a [a PCR (14-18), asi como una revisla, peRMethods and Applications.
Fundamento de la tecnica
La reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcenica para amp[ificar in lIitro fragmemos COrlOS (menos de 1000bases) de acidos nucleicos presentes en [as muestras en cantidades muy pequei'tas. Su fUlldamento es la repeticioll ciclica de tres reacciones simples que varian s610 en [a temperalura de incubaci6n. EI metodo uti[iza una ADN polimerasa,cantidades clcvadas de los cualTO desoxinuele6sidos lrifosfalO, y dos oligonucle6tidos cebadores de hebra sencilia comp[ementarios de secuencias conocidas del ADN que se quiereamp[ificar, para sintetizar un fagmemo especifieo de ADN,a partir de una secueneia mo[de de una sola hebra.
En la tecnica original se ulilizaba cl fragmento Klenowde [a ADN polimerasa de E. coli. ESla enzima se inactivaa [as temperaluras elcvadas que se requieren para la desnaturalizaci6n del ADN por 10 que debia aftadirse lras el pasode desnaturalizaci6n en cada ciclo. Posteriormeme, se introdujo [a ADN po[imerasa resiSlcnle al calor (termoeSlablc)de TlJermus oquoriCIIs (Taq), 10 que evila la necesidad de reintroducir la enzima en cada ciclo y proporciona adem as unamayor fide[idad del proceso ya que [a polimerasa Taq es masespecifica (19,20).
La figura I muestra de forma esquemalica eI proceso dereaccion en cadena de la polimerasa. EI primer paso cs [ndesnaturalizaci6n por calentamiemo a temperatura dcvadadel ADN nativo de doblc hebra, [0 que proporciona hebrassencillas. En cl segundo paso, que se realiza a lemperaturainferior, los dos oligonuclc6tidos ccbadores se fijan a sus
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den inlerferir se inactivan durante el paso inicial de desnaturalizacion.
Cada uno de los dos cebadores, asi como los cuatro desoxirribonucle6sidos trifosfato, deben encontrarse inicialmenteen cantidades elevadas con relacion a la cantidad de ADdiana 0 sustrato, ya que los cebadores son necesarios paracomenzar cada hebra de ADN y los desoxirribonucleosidostrifosfato para [a sintesis decada una de las hebras de ADN.
EI procedimiento requiere tambien conocer suficientemente la secuencia del ADN diana, al menos la dellugar de 11jacion de los cebadores, para poder sintetizar los cebadorescomplementarios adecuados.
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lll." 1. f>roceso de Ia reacciOn ftI cadnIa ck Ia polimna5a.
secuendas complementarias en las hebras opuestas del ADNdiana. Los oligonucleotidos cebadores se eligen de formaque Iimiten el material genetieo que quiere amplificarse. Losdos cebadores no deben acoplarse uno a otro y sus lugaresde fijadon en el ADN que quiere amplificarse deben encontrarse 10 suficientemente alejados uno del otro, de forma quesea posible la sintesis de produetos nuevos. La especificidaddel metodo deriva de la precision, aim con cebadores cortos, de esta reaccion de fijacion ADN: ADN. La especificidad de [a hibridacion puede controlarse mediante ajustes de[a temperalura, de forma que sea posible [a amplificadonde secuencias nanqueadas por regiones similares, aunqueno identicas, en complemenlariedad con los cebadores.
EI tercer paso es la sintesis de una segunda hebra complementaria de nuevo ADN, que se produce al extendersecada cebador utilizando la ADN polimerasa Taq, en presencia de un exceso de desoxirribonucle6sidos lrifosfato, copiando la secuencia de ADN molde adyacente. Por cada cebador se sintetiza una nueva hebra. Las hebras de ADNsintelizadas de nuevo son elias mismas moldes de los cebadares, por 10 que los ciclos repetidos de desnaturalizacion,fijacion del cebador y extension resuilan en la acumulacionexponencial del ADN.
Un ejemplo de las condiciones de un proceso de PCR son:
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Sistemas automalicos para la peR. Cicladoresh:irmicos
Las tres reacciones del proceso de PCR tienen lugar en elmismo tubo y todos sus componentes (polimerasa, cebadores y desoxirribonucle6sidos trifosfato) son termoestables,por 10 que la tecnica es facilmente automatizable. La reaccion en cadena de la polimerasa se ha aUlomatizado utilizando el denominado amplificador de ADN 0 ciclador termico (Thermal cycler) introducido en el mercado a finalesde 1987. De esta manera pueden tratarse simultaneamenteun gran numero de especimenes. amplificandose las secuencias de ADN un millon de veces en 2 horas.
En los cicladores termieos eI calentamiento se realiza normalmente por lransferencia desde un bloque metalico. Qtrossistemas utilizan un f1uido como agua 0 aire. EI enfriamientopuede realizarse por circulacion de Iiquido por el bloque metalico, ya sea procedente de una fuente externa 0 integrada.Alternativamente, pueden utilizarse semiconduclores 0 f1uidos como agua 0 aire para disminuir [a temperatura del especimen.
EI proceso de PCR puede realizarse en tubos de microcentrifuga, placas de microtitulaci6n 0 tubos capilares. Lostubos de microcentrifuga tienen la ventaja de su empleo directo, una vez producido el proceso de PCR, en los pasosque requieren centrifugacion. Los tubos de microcentrifuga de pared delgada que permilen un equilibrado mas rapido de la temperatura tienen el inconveniente de ser masfragiles y pueden estriarse en la centrifugaci6n con el consiguiente riesgo de contaminaci6n.
Actualmente, se esla extendiendo el uso de la placa de microtitulacion, lanto la c1asica de 96 pocillos, como las detiras que permilen mayor f1exibilidad de uso, dependiendodel numero de especimenes. En ambos casos, las placas de·ben cubrirse durante la reaccion de PCR. Si se produce condensaci6n deben agitarse antes de quitar las tapas.
Recientemente, se ha introducido el tubo capilar que utiliza volumenes de especimen y reactivos menores, 10 que reduce los costos y permite reacciones mucho mas rapidas.Para los IUbos capilares se necesitan equipos especiales desellado y cicladores terminos diferentes.
Asi, pues, un proceso de PCR puede completarse en unos90 minutos.
EI proceso de PCR no requiere la purificacion del ADNque va a amplil1carse. Las proleinas contaminantes que pue-
Desnaturalizacion inicial25 cidos de:DesnaturalizacionFijadoExtensionExtensi6n final
94 "c I 5 minutos
94 "CI I minuto60 "CI I minuto70 "c I I minuto70 °CI 10 minutos
Cantidad de amplificaci6n
La amplificacion del proceso de PCR viene dada par [a formula N = n(l +E)", donde N es la cantidad de producto final, n la cantidad inicial de fragmentos de ADN diana quevan a amplificarse, E es la eficacia media y c el mimero decidos. La figura 2 muestra la amplification geometrieadel proceso de PCR. La visualization de una banda en ungel de agarosa tei\ido con bromuro de etidio requiere alrededor de 1012 pares de bases (pb). As!, en condiciones op-
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Especificidad del proceso de peR
r'l_n 1. AmplirlCari6n ccomnriot;a dd procno <k rQC'l;i6n "' o;adm.J. lit bpolimntill.
timas. con una eficacia del 1000;" una (mica moltcula de100 nucle6lidos produce una banda adecuada lras 3S dclos.
Una eficacia del 1001t,'0 producira tras 20 ciclosN=(I + lro= 1048576 moleculas. mientras que con un 801t,'0de eficacia solo se producinin N=(I +0.8)31= 127482 moleculas tras el mismo mimero de delos, esto es solo el 12070de rendimiento. De esta manera, diferendas de eficacia pequeftas conducen a una gran diferencia del rendimiento final.
La especificidad del proceso de PCR se consigue eligiendooligonucle6tidos cebadores que nanqueen la secuenda deADN diana con la longilud suficiente, de forma que su seeuencia sea virtualmenle unica en el genoma. Parte de losproduCIOS de amplificacion no espedfioos pueden eliminarseen las condiciones denominadas de cccomienzo calienle» (hotstart) (21). Para ello se manliene el es¢cimen a una temperatura mayor que la temperalura de fijado calculada parael cebador especifico antes de comenzar la reacd6n. La lecnica de cccomienzo caliente» no 5610 mejora la especificidad. sino que tambien minimiza la formacion de los denominados ccdimeros de los cebadores» (primer·dimcr), unproducto de la PCR de doble cadena formado por los doscebadorcs y sus sccuencias complcmentarias.
DtTa forma dc limilar la amplificacion al fragmenlo deADN deseado puede conseguirsc ulilizando una lecnicade cebadores anidados (nesled primers) con dos ciclos diferentes del proccso de PCR (22). Tras la amplificaci6n conun conjunto de cebadores, se toma una pequefta parte aHcuota y se amplifica en un nuevo cicio con dos cebadoresnuevos internos a los utilizados en el primer cicio 0 con un
Paramelros que afectan el proceso de peR
Los principales parametros del proceso de PCR que condicionan su funcionamienlo son las condiciones del procesode cidado; tiempo y temperatura de cada segmento, y la concentraci6n de ADN polimerasa. la concentracion de los ce·badores, la concentraci6n de Mg:' y la concenlracion delos desoxirribonucleosidos trifosfato.
En general, a mayor temperatura de fijacion del cebadormayor cs la cspecificidad. Por otro lado. la temperatura dedesnaturalizacion debe ser 10 suficientcmente elevada paradesnaturalizar el molde sin comprometcr la polimerasa.
No debe aftadirse demasiada enzima ya que puede producirse la amplificacion de productos no deseados.
Los cebadores optimos para la reacci6n en cadena de lapolimerasa dependen de la aplicaci6n especifica y se delerminan empiricamente. En cualquier caso, al selcccionar loscebadores han de tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
I. Debe aftadirse una concentraci6n adccuada de cebador. ya que una cantidad excesiva de cebador produce laamplificaci6n de productos no deseados. Las concentraciones adecuadas de la mayoria de los cebadores se encuentran comprendidas entre 10 y 20 "molll.
2. Los eebadores deben ser especificos de las secueneiasa amplificar. La especificidad de las secuencias cebadorasse comprueba de acuerdo con su homologia con secuenciasconocidas.
3. Si es posible, los cebadores deben ser complementariosde regiones libres de posibles estrUCluras sccundarias.
4. EI contenido de guanina·citosina de las secuencias cebadoras debe ser alrededor del 500;0. ya que las secuenciascebadoras con un bajo contenido de guanina-citosina requieren una lemperatura menor de fijado, 10 que puedeaumentar la amplificaci6n no especifica. Los cebadores ricos en guanina-citosina son mas resistentes a la desnaturaIizacion.
Los 0ligonucle6tidos cebadores se sintetizan mediante sintelizadores automaticos y no necesitan purificarse. tan s610desprolegerse, evaporarse a sequedad y rehidratarse en agua.Uno 0 los dos cebadores pueden marcarse en un extremacon un compuesto radiactivo, nuoreseente 0 con biotina. 10que hace que el produclo de la PCR final quede marcado.Dtra posibilidad es marcar el produclo de la PCR incluYendo en la mezcla de rcacci6n los marcadores adecuados.
Se denomina efeclo «plateau}) a la atenuacion de la velocidad de acumulacion exponential del produCfo Que se observa en los ultimos cidos del proceso de PCR con la acumulaci6n de una concenlraci6n de produclo de alrededorde 10-1 moll L. De forma caracteristica. el proceso de laPCR primero es exponencial, luego enlra en una fase cuasi·lineal y finalmente alcanza el c(plateau)).
Se han scftalado varios factores como responsables de esleccplateaUl}: inactivacion termica de la polimerasa Taq, concentradon Iimitante de la polimerasa Taq, reduccion de laeficacia de la desnaturalizaci6n en cada cicio. ineficacia enla fijaci6n del cebador por cicio y deslrucci6n del productodebido a la actividad 5'- - -3' cxonucleasa de la polimerasaTaq. EI (cplateaUl) es inevitable y. por lanto, una limitaciondel proceso de PCR.
nuevo cebador interno y otro de los cebadores originales.De esta forma, si se generan productos no especificos quecontengan secuencias del cebador de la primera rcaccion nose amplificaran en la segunda reacci6n, ya que no contie·nen secuencias correspondientes al segundo conjunto de cebadores especificos.
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163264
128256lI2
1.0242.0484.0968.192
16.38432.76865.536
131.012262.144524.288
1.048.5762.097.1524.194.3048.388.608
16.777.21633.554.43267.108.864
134.211.128268.435.456536.870.912
1.073.741.824
Cantidad relaliva
1234l6189
1011121314II1611181920212223242l2621282930
Ciclo
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Amplifil..'acion multiplex
Sedenomina asi al metodo Que se uliliza para amplilicar masde un fragmento simuilimeamente durante un proceso dePCR (23). Los cebadores deben elegirse de forma que no hibriden unos con otros y que generen fragmcntos de tamaftosdiferentes para que puedan separarse adecuadamente porelectroforesis en gel. Al aumentar el ntimero de fragmentosque se amplifican simullaneamente es necesario aumentarel tiempo de extension que puede Ilegar hasla varios minutosporcido. La amplilicacion multiplex se uliliza para la delec·don de delecciones en puntos dislintos de un mismo gen (24).
Contaminacion
La gran sensibilidad del proceso de PCR 10 haec muy vulnerable a la contaminacion por cantidades minimas arrastradas de experimcntos anteriores. Cuando se realizan proccsos de PCR deben extremarse las precauciones para hacermInima In formaci on de aerosoles y otras posibilidadcs decontaminacion. Deben encontrarse sepamdas fisicamcnte lasareas dellaboratorio donde se realicen las reacciones PCRy aquellas en las que se analicen los productos de la PCR.Debe tenerse un gran cuidado con las pipetas, las puntas depipeta, los reactivos, etc.
Se han desarrollado varios protocolos para eliminar lassecuencias de ADN contaminantes arrastradas de reaccio·nes previas. La irradiacion ultraviolela del contenido de loslubos de reaccion dai'la las secuencias contaminanles antesde a"adir el ADN molde y la polimerasa (25). Dlra cSlralegia uliliza desoxiuridin trifosfato (dUTP) en lugar de desoxitimidin trifosfato (dTTP) para el proceso de PCR (26). Losproductos de la PCR son, por tanto, susceplibles de degradadon por la cnzima uracHo N-glicosilasa, que deslruiracualquier producto de la PCR arrastrado pero que nodegradara el ADN molde genomico deseado. Tras la inactivaci6n por calor de la N-glicosilasa se realiza el proceso dePCR con dUTP.
Dcleccion y amilisis de los produclos de la PCR
EI metodo mas empleado para el amilisis de los productosdel proceso de PCR es la electroforesis en gel. Se utilizangeles de agarosa 0 poliacrilamida, dependiendo del lamanode las secuencias de ADN amplificadas. Los produclos deamplificaci6n separados en el gel, pueden visualizarse directamenle con colorantes nuorescentes como el bromurodc etidio.
La dCleccion de los produclos de la PCR se ha automatizado mediante un sistema de eleclroforesis con un laser dedeteccion. EI espeeimen a analizar y un marcador de tamano se cargan en el gel y se separan por electroforesis. TaniOcI gel como la solucion amorliguadora deben comener bromum de elidio. EI programa analiza cada carri! y asigna unpcso molecular a cada uno de los picos desconocidos dcaCllcrdo con la curva de calibracion generada a partir dclpeso molecular del marcador de lamano. Thmbicn puede ulilizarse un cebador marcado con un complleSIO fluorescente. Pueden uliJizarse diferemes compueslOS nuorescentes ydifcrentes marcadores de lamai\o para cl analisis de fragmenlOS dc diSlinlOS pesos moleculares.
La forma mas frecuemc de identificar los produclOs delproceso de PCR es mediante cl uso de sondas marcadas conlas que hibridar, bicn en fase s61ida 0 en fase liquida. Lassondas pueden marcarsc con iSOIOJ)OS radiaclivos 0 con mar-
cadores no radiactivos. EI isotopo mdiaclivo mas ulilizadopara el marcaje de las sondas es eillp. Para In rutina de loslaboratorios clinicos se prefieren los marcajes no radiactivos. Se han ulilizado sondas de oligonucleotidos marcadascon csteres de acridinio, peroxidasa, fosfatasa alcalina, digoxigenina, colorantes fluorescentes, quimioluminiscencia(27-29).
Los productos del proceso de PCR pueden secuenciarsepara su delecci6n. Se han descrito varios prOlocolos parala secuenciacion direcla de los produclos del proceso dePCR. Tras eliminar los desoxinucleotidos y los cebadoresque no se han utilizado, el produclO de doble cadena puedesectlenciarse por los mctodos habiluales. Pllede obtenerseproducto del proceso dc PCR de una tinica hebra medianteuna tecnica denominada reaccion en cadena de la polimerasa asimelrica en la Que sc uliliza una cantidad mucho menor de uno de los cebadores (30), digestion enzimatica sclectiva de una de las hebras 0 caplUm selectiva de una delas hebras marcando un oligonucleolido con biolina e inmovilizando el producto sobre lechos magnclicos rccllbierlOS de cSlreptavidina.
Aulomatizacion total del proceso de peR
Se ha desarrollado un sislema tOlalmente aUlomatico parala amplificaci6n de la PCR (3/). Tanto la amplificacion comola deteccion de los productos de la PCR tiene lugar dcntrode un tinico recipiente denominado I,saquito», 10 que obviala necesidad de manejar los productos de la PCR en un ambienle abierto y minimiza la contaminaciOn.
EI proceso de deteccion es rapido, f:i.cilmeme aUlomatizable y utiliza un marcaje enzimatico. Se basa en eI uso decebadores del proccso de PCR marcados covalcntcmente conbiolina en el extreme 5' para proporcionar productos de laPCR biotinilados. Estos pueden evidenciarse por hibridacion bajo condiciones de reslriccion controladas con sondas de oligonucloolidos espedficas inmovilizadas sobre unasuperficie sOlida. Los produclos de la PCR caplurados reaecionan a cominuacion con un conjugado de eSlTeptavidinay peroxidasa para producir complejos PCR-producto inmovilizados sobre la superficie. Estos complejos catalizan laconversi6n de un precursor en un colorante, produciendo uncolor visible. Se usan pasos de lavado para scparar los maleriales unidos de forma no espedfica.
£1 conlenedor (<<saquilo).) conliene varios compartimientos en los que en cada uno de ellos se encuemran los reaclivos de deteccion necesarios (conjugado estreptavidinaperoxidasa, soluciones de lavado y solucion de suslralo).Ademas sc utiliza otro compartimiento para el proceso deamplificacion de la PCR. Las sondas de caplUra em!n inmovilizadas en una camara de detection separada dentro delcontenedor.
Tras introducir el espeeimen y los reactivos de la PCR enel compartimienlo adecuado, se realiza el ciclado termicoaplaslando el compartimiento entre dos calenladores. Lasparedes delgadas del compartimienlo, su forma abarquillada y su capacidad para adaplarse a los calcntadores paraun contaclo intimo permilen ciclos termicos mllY rapidos.Tras el proceso de amplifteacion, los conlenidos de los com·partimientos se expulsan por presion y sc lIevan a la camamde delcccion.
Aplicaciones clinicas de III PCR
Tres son los campos principales de aplicaci6n c1inica del pro-
Quimica Oinica 19!N; IJ (4) 173
ceso de PCR: el diagn6stico de las enfermcdades geneticas,el diagn6stico de las enfermedades infecciosas y las en fermcdades neoplasicas.
Diagn6stico de las enfermedades genelicasEn el diagnostico de las enfermedades gencticas pueden emplearse dos tipos de estrategias: la delecdon direcla de 1amutacion y la deteccion indirecta de los genes anormales porrastreo genetico. Los melodos para detectar variaciones desecuencia para el diagnostico de enfermedades hereditariastras amplificaci6n por la peR son:• Digestion con una endonucleasa de restricti6n del produc
to de la PCR seguido de electroforesis.• Hibridaci6n del produclO de la PCR con sondas de oligo
nucle6tidos especificas de alelo.• Elcctroforesis del producto de la PCR para detectar dele
ciones.• Secuenciacion del producto de la PCR.• Amilisis de polimorfismos.
La estrategia mas adccuada se discna de acuerdo con eltipo de alteracion y la frecuencia de las alteraciones. La pri.mera aplicacion clinica del proeeso de PCR se publico en1985 para e1 diagnostico de la anemia falciforme (I). En laaetualidad se conoeen alredcdor de 100 enfennedades en lasque se ha identificado la alteracion. La tabla I presentalas enfermedades monogcnicas mas comunes, para las quese ha utilizado la tecnica de la PCR (32-48).
Enfermedades infccciosasLa deteccion de agentes infecciosos a nivel de las secuenciasde ADN 0 ARN presenta muchas venlajas sobre los metodos c1asicos de cu!livo y los inmunologicos mas recientes. Enlos uhimos anos ha comenzado a extenderse el uso de t&-nicas de ADN y en un lugar muy destacado la reaccion en cadena de la polimerasa para el diagnosticode infecciones porvirus, baeterias. hongos y otros microorganismos patogenos.
La tabla II muestra algunos de los agenles infecciosos paralos Que se utiliza la PCR para el diagnostico (49-90). En elcaso de bacterias es extremadamente util para aqueUas decrecimiento lento, las que requieren medios de cultivo complcjos y las peligrosas. El proceso de PCR se ha empleado
Tabla II. Algunos microorganismos en los que seha ulilizado la reaccion en cadena de la polimerasapara su detection
Virus
Virus de Epslein-Barr (49)Enlerovirus (50)Virus hepatitis A (5/)Virus hepatitis B (52)Virus hepatitis C (53)Parvovirus (54, 55)Virus del papiloma (56. 57)Virus herpes (58, 59)Citomegalovirus (60-63)Virus de inmunodeficiencia humana (HIV-l y HIV-2)
(64-72)Virus del linfoma de celulas T (73)
BacteriasBorrelia burgdorjeri (74)Legiollella pnellmop1li/ia (75)MycobaClcrias (76-78)Chlamidia trachomalis (79)Mcningococos (80)Mycoplasma (8/)Fra/lcisella IUlarellsis (82)
ProtozoosPneumocystis cari"ii (83)Toxoplasma gOlldli (84)Trypanosoma (85)Plasmodium (86)Leishmania (87)El1Iamwba Hyslolflica (88)
HongosCrYPuxoccllS (89)Histoplasma capslllolUm (90)
tambicn para diferenciar cepas patogenas de las no palogenas dentm de una misma especie (88, 9/).
La gran sensibilidad de la PCR permite deteclar infecciones antes de que se genere la respuesta inmune, cuando noes posib1e la detecci6n del anticuerpo. La sensibilidad de la
Tabla I. Algunas cnfcrrnedades monogenicas en las que se ha empleado In reaction en cadena de lapolimerasa para el diagnoslico
A Ulosomicas domillantes
Enfermcdad de HuntinglonRelinoblaslomaEnfermcdad de Von Willcbrand
Alllos6micas recesil'asFibrosis quisticaAnemia falciforme{3-talasemia/X-talasemiaFeni1cetonuriaDHieit de /X.amitripsinaEnfermedad de GaucherEnfermedad de Tay-Sachs
Ligadas 01 cromosol/la XDislrofia muscular de DuchenneHemofilia AHemofilia BCromosoma X fnigilEnfermcdad de Lesch-Nyhan
174 Quimica Clinica 199-1: IJ (4)
Localizacion cromos6mica
4p16.313q14.212ptcr-p12
7q31-32Ilpl5.5II p15.516p13.312q2214q31-31.2Iq21
Ilq23-24
Xp21Xq28Xq27Xq27Xq26
Referenda
(32)(33)(34)
(35)(1,36)
(36.37)(381(39)(39)(40,41)(42)(43)
(44)(45)(46)(47)(48)
peR pennite lambien deleclar un numero pequeno de microorganismos que pueden enconlrnrse presentes en las fases lemprnnas de la infeccion.
En 19BB Qut et aL (92) comunicaron la deleccion de ADNde virus de la inmunodeficiencia humana del tipo I (HIV-I)en celulas mononucleares de sangre periferica de 22 patientes con anticuerpos positivos frente al HIV-I utilizando lareaccion en cadena de la polimernsa y un metodo de delecdon iSOlopieo. Desde ese momenlO, el desarrollo y refi~
namiento de pruebas de PCR y sistemas de deleccion noiSOIopicos ha incrementado mueho la sensibilidad y especificidad de las pruebas PCR para e1 HIV-l haciendolasen la actualidad adecuadas para los laboratorios c1inicos (93).
Ademas de ulilizarse en la identification de microorganismos patogenos, los merodos genotipicos pueden ulilizarsepara deteclar faetores virulentos especifieos 0 genes que codifican produclos que permilen a las baclerias producir enfermedades al hombre (94).
Enfermcdadcs neoplasieasLa mayoria. si no lodos, los canceres surgen a partir de unaserie compleja de alterationes genelieas de una unica celula. Estas alteraciones genelicas pueden ser simples mUladones punlua!es, reordenamienlOS, de1eciones 0 amplificadones.
Los oncogenes son genes cuya expresion anormal 0 e1 producto genetico alterado conducen directamcnte a un fenotipo transformado (95,96). Los oncogenes se reconocieron ini+cialmente estudiando virus Iransformanles de diversosmamiferos y aves.
Los oncogenes surgen de genes preexistenles que se encuemran presenles en cI genoma humano, los prOtooncogenes. Estos desempenan funciones esenciales en la fisiologiacclular normal y estan, a menu do, implicados en la regulacion del cretimienlO y proliferation celular. La mutacion delos prolooncogenes en oncogenes. generalmente, resulla enuna expresi6n aumentada del gen, la e:xpresion genica inadecuada 0 la expresi6n de un produclo genico anormal, yasea como resultado de una mutaci6n punlual 0 de dclecciones 0 inserciones mas e:xtensas.
Los genes Sllpresores de lurnores son genes responsablesde la regulation negaliva del crecimienlO de las celulas(97,98). Debido a que aCluan de forma opuesla a los oncogenes han rccibido lambien e1 nombre de anlioncogenes. Asimismo., debido a que han de perdersc ambos aldos para quese produzca la proliferati6n celular aberranle se Ics llamatambien frecuentemente oncogenes recesivos.
La expresion de oncogenes 0 la pcrdida de genes supresores de lurnores pod ria utilizarse para el raSlreo de pacientes, facilitar el diagn6slico precol.. establecer un pronosticoy valorar la respueSla a un tralamiento (99,100). Para ellopuede ser de gran utilidad la reacci6n en cadena de la poli+merasa.
Mas del90lJ. de los canceres pancrealicos lienen una mulation 0 amplificacion de uno de los genes de la familia ras(10/). En el caso de los canceres de colon. el 50'7, de lospacientes lienen anomaHas del gen ras (102). Se han deteclado cclulas potencialmenle metaslasicas en In sangre de patientes con tumores primarios como los melanomas (/03).
En las celulas eliminadas en la orina se han obscrvado mulaciones del gen que codifica la proleina p53, indicalivas dedesarrollo dc canccr de vcjiga (104). Asimismo, pueden delectarse carnbios prernalignos del traclO gaslroinleslinal analizando heces con la amplification de la reaccion en cadenade la polimerasa (105). Se han encontrado presentes en lasheces suficienles cclulas premalignas para pcrmilir el anali-
sis de mUlationes geneticas de los genes supresores de IUmores can esla lecnica.
Una de las aplicaciones aCluales mas inil de la PCR enoncologia c1inica es la detecti6n de reordenamientos 0 traslocaciones cromosomicos especificos encontrados en canceres hematologicos. Algunas leucernias y linfomas estanasociadas can traslocaciones cromos6micas no aleatorias.En la leucemia mieloide cr6nica el cromosoma Filadelfia resulta de una traslocaci6n redproca que implica a los cromosomas 9 y 22. La consecuencia de esta uaslocaci6n es elpositionamiento del proto-oncogen e-abl yuxlapucsto al genber. El gen fusionado ber/abl es transcripcionalmente activo y puede deteclarse facilmente por amplificacion PCR trasla transcripcion inversa del mARN (106).
De forma semejante la leucemia promielocitica aguda estaasociada con frecuencia con una Iraslocaci6n univariante,1(15; 17), Que tambicn produce la generacion de un produc10 genetico fusionado. Mediante una prueba de PCR puededeleclarse facilmente el transcrito fusionado, permiliendoel diagn6slico de esta enfermedad (107).
En muchos linfomas no hodgkinianos esta presente unatraslocati6n 1(14; (8). Los dos puntoS mas comunes de ruptura se producen en regiones Ian estrcchamenle agrupadasQue es posible la amplificaci6n por peR direcla a 10 largodel punlo de roturn (108).
Conclusion
Como conclusion, debe senalarse el enormc desarrollo experimentado en los pocos anos lranscurridos desde el descubrimiento del proceso de amplification in Vi/TO de secuencias de ADN conocido como reacci6n en cadena de lapolimerasa (PCR). Durante los proximos anos vamos a asislir a su entrada y difusi6n de forma masiva eulos laboratorios cHnicos, aplicado a la deleccion de enfermedades monogenicas, enfermedades infecciosas y enfermedadesneoplasicas. En un futuro no muy lejano padro aplicarscmuy probablemenle al diagn6slico de enfermedades multigenicas mas comunes como las enfermedades coronarias,la hiperlensi6n esencial, In diabeles mellitus, la epilepsia. laenfermedad liroidea y la demencia seni!.
Corrnpondend.;Or. J.M. Gonzalez Buitrago..Xo'if;;o de Bioquimita. HllISpilalUni'wsiuOo. 37007 Salamanca.
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