7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
1/117
EVALUACIN Y SIMULACIN DE LA PRODUCCIN DE CIDO
LCTICO CON Lactobacillus caseiATCC 7469
DIEGO ANDRS SUREZ ZULUAGA
DEPARTAMENTO DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA DE INGENIERA
UNIVERSIDAD EAFIT
MEDELLN
2007
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
2/117
EVALUACIN Y SIMULACIN DE LA PRODUCCIN DE CIDO
LCTICO CON Lactobacillus caseiATCC 7469
DIEGO ANDRS SUREZ ZULUAGA
Proyecto de grado para optar al ttulo de
Ingeniero de Procesos
ASESOR
MRes. VALESKA VILLEGAS ESCOBAR
DEPARTAMENTO DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA DE INGENIERA
UNIVERSIDAD EAFIT
MEDELLN2007
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
3/117
Nota de aceptacin
_________________________________
_________________________________
_________________________________
_________________________________
Jurado
_________________________________
Jurado
_________________________________
Jurado
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
4/117
A mis padres
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
5/117
AGRADECIMIENTOS
Se le expresa agradecimiento por su colaboracin a:
MRes. Valeska Villegas E. por su asesora.
MSc. Catalina Giraldo. Por su colaboracin en varios temas.
MSc. Luz Deisy Marn. Por su ayuda con las cromatografas.
Personal del laboratorio de Ingeniera de Procesos: Edgar Arbelaez y
Sigifredo Crdenas
Maria Adelaida Chica. Al trabajar conmigo en la simulacin en HYSYS.
Esteban Jaramillo F. por sus consejos para las otras simulaciones.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
6/117
VI
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS .IX
LISTA DE FIGURAS X
LISTA DE ECUACIONES.XII
RESUMEN.........XIII
INTRODUCCIN15
OBJETIVOS.17
Objetivo general. ......................................................................................17
Objetivos especficos. ..............................................................................17
1 MARCO TEORICO.18
1.1 EL CIDO LCTICO..................................................................18
1.2 USOS DEL CIDO LCTICO....................................................21
1.3 LOS MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACIDO
LCTICO..................................................................................................24
1.4 FERMENTACIONES. ................................................................28
1.4.1 Parmetros de relevancia en la produccin de cido
lctico....29
1.4.2 Consideraciones del proceso33
1.5 LOS PROCESOS DE SEPARACIN. .......................................33
1.5.1 Extraccin reactiva.35
1.5.2 Adsorcin.35
1.5.3 Electrodilisis..35
1.5.4 Esterificacin y destilacin reactiva.36
1.5.5 Proceso de separacin del cido lctico36
1.6 EL MERCADO DEL CIDO LCTICO ......................................37
1.6.1 Precios y costos..37
1.6.2 Produccin y cuantificacin de la oferta existente38
1.6.3 Crecimiento esperado y factores que inciden38
1.6.4 Proyeccin de la demanda39
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
7/117
VII
1.7 SIMULACIN DE PROCESOS BIOTECNOLOGICOS .............40
1.7.1 Modelo de simulacin.41
2 MATERIALES Y MTODOS.44
2.1 LOCALIZACIN.........................................................................44
2.2 MEDIO DE CULTIVO.................................................................44
2.3 MICROORGANISMO UTILIZADO.............................................44
2.4 MTODOS ANALTICOS .......................................................... 47
2.4.1 MEDICIN DE BIOMASA.47
2.4.2 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA..48
2.4.3 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE CIDO LCTICO
...48
2.5 FERMENTACIONES .................................................................49
2.5.1 Evaluacin de la concentracin de carbonato de calcio..49
2.5.2 Sistema batch en biorreactor50
2.5.3 Sistema Fed-batch..51
2.6 SIMULACIN.............................................................................53
2.7 ANLISIS ESTADSTICO.......................................................... 54
3 RESULTADOS Y DISCUSIN.55
3.1 VARIACIN DE LA CONCENTRACIN DE CARBONATO DE
CALCIO ...55
3.2 PROCESO FERMENTATIVO EN MODO BATCH EN
BIORREACTOR.......................................................................................59
3.3 FERMENTACIONES FED-BATCH............................................63
3.3.1 Fed-batch 1..63
3.3.2 Fed-batch 2..65
3.3.3 Fed-batch 3..67
3.4 SIMULACIN.............................................................................72
3.4.1 Simulacin del biorreactor en modo batch.72
3.4.2 Simulacin en Superpro Designer76
3.4.3 Simulacin en HYSYS79
4 CONCLUSIONES...87
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
8/117
VIII
5 RECOMENDACIONES..90
6 BIBLIOGRAFIA91
ANEXO 1. ...98
ANEXO 2101
ANEXO 4105
ANEXO 5110
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
9/117
IX
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades del cido lctico ..18
Tabla 2. Estadsticas de las Importaciones de Colombia por Pases para el
cido lctico.40
Tabla 3. Composicin del medio de cultivo MRS..45
Tabla 4. Parmetros productivos bajo diferentes concentraciones de
carbonato de calcio58
Tabla 5. Parmetros productivos de cido lctico en un biorreactor en
modo batch..60
Tabla 6. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 1..65
Tabla 7. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 2..66
Tabla 8. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 3.68
Tabla 9. Resultados obtenidos con las diferentes configuraciones
evaluadas.69
Tabla 10. Parmetros cinticos obtenidos en Polymath
6.0..73
Tabla 11. Tabla de corrientes.. 78
Tabla 12. Tabla de corrientes.. 82
Tabla 13. Tabla de Equipos y Utilities 83
Tabla 14. Grados de libertad utilizados en los equipos.. 85
Tabla 15. Matriz de indicadores de proceso. 86
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
10/117
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estreoformas del cido lctico. ...............................................19
Figura 2. Mtodos de produccin de cido lctico. .................................. 20
Figura 3. Diagrama de los usos comerciales y aplicaciones del cido
lctico. ......................................................................................................21
Figura 4. lbum filogentico de bacterias cido lcticas (LAB) y bacterias
relacionadas.............................................................................................25
Figura 5. Rutas metablicas en LAB para obtener cido lctico..............27
Figura 6. Proceso de separacin del cido lctico...................................37
Figura 7. Lactobacillus casei ATCC 7469 ............................................... 45
Figura 8. Lifilo.........................................................................................46
Figura 9. Sistema de perlas Cryobank. ....................................................47
Figura 10.Agitador lineal con control de temperatura...............................50
Figura 11. Biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 ...............................51
Figura 12. Cintica de las fermentaciones variando la concentracin de
carbonato de calcio 56
Figura 13. Cintica de Fermentacin en biorreactor en modo batch........60
Figura 14. Cintica de la fermentacin fed-batch 1..................................64
Figura 15. Cintica de la fermentacin fed-batch 2..................................66
Figura 16. Cintica de la fermentacin fed-batch 3..................................68
Figura 17. Resultados obtenidos con las diferentes configuraciones
evaluadas.................................................................................................71
Figura 18. Comparacin de los valores experimentales y simulados para
la cintica de la biomasa..........................................................................75
Figura 19. Comparacin de los valores experimentales y simulados para
la cintica de sustrato...............................................................................75
Figura 20. Comparacin de los valores experimentales y simulados para
la cintica de produccin de cido lctico. ............................................... 76
Figura 21. Velocidad Especifica de Crecimiento vs. Concentracin de
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
11/117
XI
Sustrato.................................................................................................... 77
Figura 22. Diagrama de flujo de la fermentacin......................................78
Figura 23. Comparacin de los valores experimentales y simulados para
la cintica de produccin de cido lctico ................................................ 79
Figura 24. Diagrama de flujo del proceso.................................................84
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
12/117
XII
LISTA DE ECUACIONES
Ecuacin 1.Modo diferencial del modelo de crecimiento logstico... 40
Ecuacin 2. Forma integrada de la ecuacin de crecimiento logstico. 41
Ecuacin 1. Modo diferencial de la ecuacin de Luedeking-Piret..41
Ecuacin 4. Ecuacin de consumo de glucosa.... 41
Ecuacin 5.Concentracin (g/L) de biomasa 48
Ecuacin 6. Rendimiento observado de sustrato en producto (g/g). 52
Ecuacin 7. Productividad volumtrica (g/L.h).. 53
Ecuacin 8. Rendimiento observado de sustrato en biomasa (g/g)...53
Ecuacin 9. Ecuacin de Monod..77
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
13/117
XIII
RESUMEN
El cido lctico y sus derivados han sido ampliamente usados en el rea
alimenticia, farmacutica y en aplicaciones industriales. Este puede sufrir
una gran cantidad de conversiones qumicas hacia compuestos
potencialmente tiles como el xido de propileno, el propilenglicol, el
cido acrlico, 2,3 pentanodionas, los steres de lactato y el cido
polilctico (polmero biodegradable que podra ser un buen sustituto para
plsticos sintticos derivados del petrleo). Debido a la gran cantidad de
oportunidades que existen en el mercado para este compuesto, la
produccin del cido lctico se evalu por medio de procesos de
biotransformacin con Lactobacillus casei ATCC 7469 bajo diferentes
concentraciones de carbonato de calcio como agente regulador del pH,
as como el modo de operacin batch y fed-batch por pulsos en un
biorreactor de 3 L. Adicionalmente, se ajust la cintica de crecimiento de
biomasa a la ecuacin logstica, la cintica de produccin de cido lctico
a la ecuacin de LuedekingPiret, y la cintica de consumo de sustrato a
la propuesta por Islam et al. (2003). Se encontr que la concentracin de
carbonato de calcio no tuvo efecto significativo sobre la produccin de
cido lctico (P>0.05), y que no haban diferencias significativas entre el
modo batch y fed-batch. Contrario a lo reportado por Guoqiang et al.
(1991) no hubo mejora de los parmetros productivos (productividad de
acido lctico, rendimiento observado de sustrato en producto, y
concentracin de acido lctico) con el cambio en el modo de operacin de
batch a fed-batch, pero la cantidad en gramos producidos en el proceso
fed-batch fue significativamente superior (P
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
14/117
XIV
Adicionalmente, se realiz una simulacin de la fermentacin en modo
batch, con los modelos que se ajustaron al proceso.
Palabras clave:Fermentacin cido lctica, Lactobacillus casei,modelos
cinticos, fed-batch, simulacin.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
15/117
15
INTRODUCCIN
El mercado del cido lctico parece estar en crecimiento, con precios
estables y a la espera de una demanda en aumento. Aunque el mercado
de cido lctico en alimentos y bebidas se est expandiendo, se espera
que otras aplicaciones industriales crezcan rpidamente, por ejemplo que
la demanda de polmeros y solventes ambientalmente amigables a partir
de cido lctico se incremente sustancialmente en los prximos aos
(Jarvis, 2001).
Actualmente, a nivel mundial, algunos observadores aseguran que la
produccin de esta compuesto tiene un incremento de 12-15% anual
(Joglekar et al., 2006), y se tiene proyectado un aumento de la demanda
de un 45.5% anual para el uso en polmeros biodegradables (Jarvis,
2001).
Ante la demanda en aumento y ya que en Colombia no existen hasta
ahora empresas que lo produzca, con este trabajo se pretende iniciar
una investigacin alrededor del tema que genere conocimiento para el
sector productivo. Para esto se comenz a estudiar la produccin de
cido lctico por medio de la fermentacin bacteriana, aunque tambin
puede serlo a travs de la hidrlisis del lactonitrilo (Hagerdal yHofvendahl, 2000).
Debido a las razones anteriormente mencionadas, se estudiaron algunas
de las variables del proceso de produccin del cido lctico. Inicialmente
se evalu la concentracin de carbonato de calcio, el cual reacciona con
el acido lctico producido por la bacteria para evitar una cada del pH y
por consiguiente evitar la inhibicin del lactobacilo. Posteriormente, se
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
16/117
16
estudi el modo de fermentacin, realizando una comparacin entre el
modo batch y el modo fed-batch con alimentacin de sustrato por pulsos.
Para la realizacin de esta investigacin se utiliz una cepa certificada, el
Lactobacillus casei ATCC 7469, el cual ha tenido un buen
comportamiento en la fermentacin para produccin de cido lctico en
estudios anteriores (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
17/117
17
OBJETIVOS.
Objetivo general.
Evaluar y simular la produccin de cido lctico con Lactobacillus casei
ATCC 7469, en sistemas de cultivo batch y fed-batch a nivel de
laboratorio por medio de la cuantificacin de los parmetros cinticos y de
la utilizacin de un software de simulacin.
Objetivos especficos.
Evaluar la cintica de crecimiento, consumo de sustrato y
formacin de cido lctico con Lactobacillus casei ATCC 7469 por
mtodos gravimtricos en un sistema de fermentacin batch
variando las concentraciones de carbonato de calcio, para
determinar las mejores condiciones de fermentacin.
Evaluar la cintica de formacin de biomasa, de consumo de
sustrato y formacin de cido lctico con Lactobacillus casei ATCC
746 por mtodos gravimtricos en un sistema de alimentacin fed-
batch por pulsos variando el flujo de alimentacin, para determinar
las mejores condiciones de fermentacin.
Simular la fermentacin de cido lctico en modo batch por medio
de la utilizacin de un software comercial.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
18/117
18
1 MARCO TERICO
1.1 EL CIDO LCTICO
El cido lctico se ha usado como preservativo natural en productos
alimenticios desde hace mucho tiempo. Actualmente, es usado en una
amplia variedad de aplicaciones industriales especializadas (Reddy et al.,
2007).
La Tabla 1 muestra algunas de las propiedades del cido lctico.
Tabla 1.Propiedades del cido lctico (Merck S.A., 2006).
PROPIEDAD CONCENTRACINTEMPERATURA
/ PRESINVALOR /
CUALIDAD UNIDADESEstado fsico aceitosoColor incoloroOlor inodoroValor pH a 10 g/L H2O (20C) 2.8ViscosidadDinmica (20C) 20-40 mPa*sPunto de Fusin 18 CPunto de ebullicin (20 hPa) 122 CTemperatura deignicin no combustiblePunto de
inflamacin no inflamablePresin de vapor (25C) 0.1 hPaDensidad (20C) 1.21 g/cm3Solubilidad enagua (20C)
Fcilmentesoluble
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
19/117
19
El cido lctico (cido 2-hidroxipropanoico), es un compuesto incoloro de
frmula CH3CHOHCOOH. Es una de las molculas pticamente activas
ms pequeas de la naturaleza y se encuentra bajo dos formas: la
dextrgira D(-) y levgira L(+), frecuentemente denominadas cido D-
lctico y cido L-lctico (Figura 1). Es producido por animales, plantas y
microorganismos en la naturaleza. Tambin puede ser derivado a partir de
intermedios con un origen en materiales renovables (por ejemplo
acetaldehdo, etanol) o a partir de qumicos derivados del carbn
(acetileno) o aceites (etileno) (Sodergard y Stolt, 2002).
Figura 1.Estreoformas del cido lctico (Sodergard y Stolt, 2002).
Ya que niveles elevados del ismero D (-) son peligrosos para los
humanos, el ismero L(+) es preferido (Akerberg et al., 1998).
Aproximadamente el 90% del total del cido lctico es producido a travs
de fermentacin bacteriana y el resto sintticamente por la hidrlisis de
lactonitrilo (Gokhale et al., 2006) (Figura 2). Esta ltima siempre resulta en
su mezcla racmica, lo cual es su mayor desventaja; mientras que la
produccin fermentativa puede originar ya sea uno de los ismeros, o la
mezcla racmica, dependiendo en el microorganismo, sustrato y
condiciones de cultivo usadas. La produccin fermentativa ofrece las
ventajas de utilizacin de carbohidratos renovables y de la produccin del
cido L o D pticamente puro. Las propiedades fsicas de uno de los
principales derivados del cido lctico, el cido polilctico, dependen de
la composicin isomrica del monmero (Akerberg et al., 1998).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
20/117
20
Figura 2.Mtodos de produccin de cido lctico. (a) Sntesis qumica,
(b) fermentacin microbiana. (SSF) Sacarificacin y fermentacin
simultnea. (Wee et al., 2006.)
Solo MezclaRacmica
RecursosPetroqumicos
Acetaldehdo(CH3CHO)
Lactnitrilo
A) SntesisQumica
B) Fermentacincon
microorganismos
Adicin de HCN ycatalizador
Hidrlisis con H2SO4 Recuperacin ypurificacin
CaldoFermentado
Fermentacin conmicroorganismos
Carbohidratosfermentables
FuentesRenovables
Deseable debido
a:
1) Asuntosambientales
recientes
2) Cantidad limitada derecursos petroqumicos
cido Lctico L(+) D(-) pticamente
Puro
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
21/117
21
Para que el cido lctico sea usado en nuevas aplicaciones y mercados
emergentes, es esencial un proceso de manufactura econmico, eficiente
y ambientalmente seguro, capaz de optimizar los altos costos de
separacin y purificacin (Bolaos et al., 2000).
1.2 USOS DEL CIDO LCTICO.
En la figura 3 se muestra una visin general de sus posibles usos:
Figura 3. Diagrama de los usos comerciales y aplicaciones del cido
lctico (Wee et al., 2006).
El cido lctico ha recibido bastante atencin como qumico debido a su
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
22/117
22
gran cantidad de usos potenciales. Existen cuatro grandes reas en las
que es usado actualmente: alimenticia, cosmtica, farmacutica y en
aplicaciones qumicas. Las aplicaciones potenciales estn ilustradas en la
Figura 3. Es clasificado como GRAS (Generalmente Reconocido Como
Seguro) para su uso como aditivo alimenticio, por lo cual es ampliamente
usado en casi todos los segmentos de la industria alimenticia, debido a su
gran cantidad de funciones, como saborizante, regulador del pH,
mejorador de la calidad microbiana y fortificante mineral.
Este es un compuesto que tambin es usado comercialmente en las
industrias de las aves de corral y de las carnes, ya que aumenta sutiempo de almacenamiento y sabor y controla patgenos. Debido a su
sabor cido, tambin es usado como acidulante en ensaladas, productos
de panadera, bebidas, en confitera no solo como saborizante sino
tambin como controlador del pH durante el proceso. Las ventajas de usar
este compuesto en la industria incluyen su bajo costo, fcil manejo y la
capacidad de producir dulces incoloros (Wee et al.,2006).
Este es un cido que agrega ingredientes naturales para aplicaciones
cosmticas. Aunque inicialmente fue usado como humectante y regulador
del pH, posee mltiples propiedades, entre ellas la actividad
antimicrobiana y rejuvenecedor e hidratante de la piel. El efecto
humectante est directamente relacionado con la capacidad de retencin
de agua del lactato y el rejuvenecimiento de la piel es producido por la
supresin de la formacin de tironasa. Ya que son ingredientes naturalesdel cuerpo humano, tanto el cido como sus sales tienen perfecta acogida
en las nuevas tendencias hacia formulaciones naturales y seguras y con
efectos que los hacen muy atractivos como ingredientes activos en los
cosmticos (Wee et al., 2006)
Tambin es usado en la industria farmacutica como electrolito en
soluciones intravenosas que sirven para aumentar los fluidos del cuerpo.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
23/117
23
Adems, se emplea en una amplia variedad de productos minerales,
como tabletas, prtesis, suturas quirrgicas y sistemas controlados de
entrega de droga (Wee et al., 2006).
El cido lctico y sus sales son usados en varios tipos de productos y
procesos qumicos, por ejemplo: como agente de desincrustacin,
regulador del pH, neutralizador, intermedio quiral, solvente, agente de
limpieza, agente de liberacin de acidez, agente antimicrobiano y agente
humectante. Tambin tiene un uso emergente como solvente seguro, el
cual es una alternativa en muchas aplicaciones de limpieza fina en la
industria metalmecnica. Debido a la alta capacidad de solvencia y a lasolubilidad de cido lctico, es un excelente removedor de polmeros y
resinas. Est disponible con una pureza isomrica mayor al 98%, y sirve
como materia prima en la produccin de herbicidas o productos
farmacuticos. Debido a que presenta mejores propiedades de
desincrustacin que los productos orgnicos tradicionales, es usado en
muchos productos de este tipo, tales como, limpiadores de baos,
cafeteras y sanitarios. El etil lactato es usado en preparaciones antiacn,ya que combina excelente solvencia contra aceites y manchas
polimricas, con el hecho de no tener impactos ambientales ni efectos
toxicolgicos (Wee et al., 2006).
Actualmente, es considerado la materia prima monomrica con mayor
potencial para conversiones qumicas, pues tiene dos grupos funcionales
reactivos, uno carboxlico y otro hidroxilo. Adicionalmente, este puedetener conversiones hacia qumicos potencialmente tiles, como el xido
de propileno (va hidrogenacin), cido propanoico (va reduccin), cido
acrlico (va deshidratacin), acetaldehdo (va descarboxilacin), 3-
pentanodiona (va condensacin), y dilctido (va auto esterificacin).
Tambin ha recibido mucha atencin como monmero para la produccin
de cido polilctico, el cual es un polmero biodegradable. El cido lctico
pticamente puro puede ser polimerizado en cido polilctico de alto peso
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
24/117
24
molecular a travs de una serie de conversiones de policondensacin,
despolimerizacin y polimerizacin de apertura de anillo. El polmero
resultante, tiene numerosos usos en una gran cantidad de aplicaciones,
como ropa protectora, empaque de alimentos, bolsas de basura,
contenedores rgidos, empaques flexibles y bandejas de vida corta (Wee
et al., 2006).
Diferentes reportes en los que se evalan las propiedades de los
polmeros del cido lctico han demostrado sin duda alguna que tienen
potencial para muchas aplicaciones diferentes, debido a la posibilidad de
modificar las propiedades dentro de un rango amplio. Estos, en adicin asu probada degradabilidad en sistemas biolgicos y su verificada
biocompatibilidad, hacen de estos polmeros muy promisorios
especialmente en aplicaciones mdicas (Sodergard y Stolt, 2002).
Se ha reportado que la estructura de estos polmeros tiene elevada
estabilidad en sus propiedades mecnicas y termo fsicas, lo que los hace
aptos para ser usados en aplicaciones mdicas en donde estaspropiedades son muy importantes (Sodergard et al., 2002).
1.3 LOS MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACIDO
LCTICO.
Las bacterias cido lcticas (LAB) son ampliamente usadas enfermentaciones industriales de alimentos y estn recibiendo gran atencin
por su uso como fbricas celulares para la produccin de compuestos
industriales y farmacuticos. La conversin glicoltica de azcares a cido
lctico es la ruta metablica ms importante en estas bacterias.
Las LAB son microorganismos de crecimiento rpido con pequeos
genomas, metabolismo simple y relevancia industrial. Estas son un grupo
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
25/117
25
de bacterias Gram-positivas relacionadas filogenticamente, que incluye
Lactococcus y Lactobacillus sp. (Figura 4). Adems, son consideradas
fbricas celulares programadas que producen cido lctico a partir de
azcares y son usadas en varias aplicaciones industriales (Vos y
Hugenholtz, 2004).
Figura 4. lbum filogentico de bacterias cido lcticas (LAB) y bacterias
relacionadas (Vos y Hugenholtz 2004).
Las LAB consisten en los gneros: Carnobacterium, Enterococcus(Ent),
Lactobacillus (Lb), Lactococcus (Lc), Leuconostoc (Leu), Oenococcus,
Pediococcus (Ped), Streptococcus(Str), Tetragenococcus, Vagococcus, y
Weissella.(Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
Son microorganismos de tipo coc, con la excepcin de los Lactobacillus
y Carnobacteriaque son bastones (rods), incapaces de sintetizar ATP por
respiracin, y que tienen el cido lctico como el mayor producto final a
partir de la conservacin de energa en la fermentacin de azcares. La
mayor parte de LAB son anaerobios facultativos, catalasa negativos, y no
formadores de esporas. Tienen alta tolerancia a los cidos y sobreviven a
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
26/117
26
pH de 5 y menores. Su tolerancia cida les da ventaja sobre otras
bacterias. Su temperatura de crecimiento ptima vara entre 20 y 45 C.
La mayor parte de ellas son consideradas GRAS, pero algunas de las
cepas como Streptococci son patognicas. Todos los gneros LAB
pertenecen a la subdivisin Clostridium (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
Estos microorganismos tienen requerimientos nutricionales complejos,
debido a su limitada habilidad para sintetizar vitaminas B y aminocidos.
Por lo que existen ambientes naturales ricos en nutrientes como plantas,
leche y dentro de cuerpos de humanos y animales. Los LAB han sido
usadas por los humanos para la fermentacin de comidas y productosalimenticios desde la antigedad y su mayor aplicacin actual es todava
en la industria de alimentos, por ejemplo en la produccin de productos
lcteos, carne y vinos. Las aplicaciones tcnicas actuales de las LAB
incluyen la produccin de dextrano a partir de sucrosa por Leuconostoc
mesenteroides, la produccin de lisina a partir de Lactococcus lactis ssp.
lactis y la produccin de cido lctico para diferentes aplicaciones.
Tambin se ha sugerido que las LAB podran ser usadas como vectorespara medicina oral.
Las LAB fermentan azcares a travs de diferentes rutas metablicas
resultando en fermentaciones homo, hetero y cida mezclada (Figura 5)
(Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
En la homofermentacin se obtiene cido lctico como el producto finaldel metabolismo de la glucosa, usando la ruta metablica Embed-
Meyerhof-Parnas (Figura 5A). En la fermentacin se forman cantidades
equimolares de cido lctico, dixido de carbono y etanol o acetato, a
partir de la glucosa a travs de la ruta metablica de la fosfoquetolasa
(Figura 5B). La relacin de etanol y acetato depende en el potencial redox
del sistema. Esta ruta es usada por heterofermentadores facultativos
como Lactobacillus casei, para la fermentacin de pentosas, y la
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
27/117
27
fermentacin de hexosas y pentosas por homofermentadores obligados
como Leuconostoc. Todas las LAB excepto Lactobacillitipo I (por ejemplo
Lactobacillus delbrueckii) son capaces de fermentar pentosas, por lo que
son heterofermentadores facultativos. (Hagerdal y Hofvendahl, 2000)
Figura 5.Rutas metablicas en LAB para obtener cido lctico (Hagerdal
y Hofvendahl, 2000).
Homofermentacin (A), heterofermentacin (B), y fermentacin cida
mezclada (C), P = fosfato, BP = bifosfato, LDH = lactato deshidrogenasa,
PFL = liasa piruvato formato, y PDH = piruvato deshidrogenasa
Los cidos mezclados son formados por homofermentadores como
Lactococcidurante la limitacin de la glucosa y durante el crecimiento en
otros azcares, por ejemplo el Lactococcus lactis cuando crece en
maltosa o lactosa o a pH elevados y bajas temperaturas produce, adems
del cido lctico, etanol, acetato y formato. Durante estas condiciones la
ruta metablica homofermentativa es usada, pero la diferencia est en el
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
28/117
28
metabolismo del piruvato, que en adicin al cido lctico tambin es
metabolizado en acetil-CoA por la piruvato formato liasa (PFL) (Figura
5C). En la presencia de oxgeno la PFL es inactivada y se activa una ruta
alternativa del metabolismo del piruvato va piruvato deshidrogenasa
(PDH), resultando en la produccin de dixido de carbono, acetil-CoA y
NADH (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
El grupo de los lactobacilos homofermentativos est integrado por
Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus lactis y
Lactobacillus acidophilus (Snchez y Ramrez, 2004).
1.4 FERMENTACIONES.
Se han patentado numerosos procesos de produccin fermentativa de
cido lctico. Ellos incluyen la fermentacin de desecho de almidn
industrial, por ejemplo de papa, con una mezcla de cinco cepas de
Lactobacillus. Tambin se ha reportado el uso de permeado de suero enun proceso continuo con recirculacin celular y electrodilisis (Bailey et
al., 1998)de material lignocelulcico y una cepa de Lactobacillus capaz
de fermentar xilosa. Varias patentes describen la produccin de cido
lctico pticamente puro, ya sea L(+) (Veringa, 1994), o D(-) (Severson y
Barrett, 1995). En una patente se describe el desarrollo de una cepa de
Lactobacillus delbrueckii tolerante al cido lctico (Robison, 1988),
tambin han sido patentados mtodos de purificacin a partir del caldo defermentacin con electrodilisis (Miura y Kumagai, 1995), separacin por
membranas (Russo y Kim, 1996) y esterificacin (Kumagai et al., 1994).
Muchos parmetros influencian la eficiencia de los procesos de
fermentacin. Debido a la tolerancia al oxgeno de las LAB la mayor parte
de las fermentaciones son llevadas a cabo sin control de oxgeno. En todo
caso se prefiere condiciones anaerobias a condiciones aerobias o
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
29/117
29
microaeroflicas (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
La efectividad de un proceso puede ser medida como la concentracin del
cido lctico producida, como el rendimiento de cido lctico basado en el
sustrato y como la productividad.
1.4.1 Parmetros de relevancia en la producc in de cido lctico.
1.4.1.1 pH: El pH de la fermentacin puede fijarse al comienzo y
permitirse disminuir debido a la produccin del cido, o puede sercontrolado por titulacin, extraccin, absorcin o electrodilisis del cido
lctico. Su efecto ha sido estudiado bajo diferentes valores. En todos los
casos, la titulacin a un pH constante ha resultado en concentraciones
iguales o mayores, en comparacin con los casos donde no hay control
de este (Hagerdal y Hofvendahl, 2000). La remocin del cido por
electrodilisis y extraccin, incluyendo sistemas de dos fases acuosos, ha
sido usado satisfactoriamente en varios sistemas, mientras en otros latitulacin ha dado los mismos o mejores resultados (Ye et al., 1996). El pH
ptimo para la produccin de cido lctico vara entre 5.0 y 7.0. Un pH
menor a 5.7 ha sido ptimo para las cepas de Lactobacillus, las cuales
son conocidas por tolerar menores valores de pH que las Lactococci
(Kashket, 1987).
1.4.1.2 Fuente de carbono: Diferentes sustratos han sido usados
para la produccin fermentativa de cido lctico con LAB. El producto
ms puro ha sido obtenido cuando un azcar puro es fermentado,
resultando en menores costos de purificacin; pero esto es
econmicamente desfavorable, porque los azcares puros son costosos y
el cido lctico es un producto econmico. En vez de ellos los productos
de desechos de la agricultura y la silvicultura son utilizados. Comparando
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
30/117
30
diferentes fuentes de carbono se observa que la glucosa arroja mayores
concentraciones de cido lctico y rendimientos que con otros azcares.
La xilosa, galactosa, arabinosa, lactosa, fructosa y celulosa hidrolizada
han sido menos efectivos (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
1.4.1.3 Fuente de Nitrgeno: La composicin del medio ha sido
investigada en muchos aspectos, incluyendo la adicin de varios
nutrientes en la forma de extracto de levadura, peptona o jarabe de maz.
Las concentraciones de la fuente de nitrgeno en el medio de cultivo se
encuentran, por lo general, entre 10 y 25 gr/L, mostrando que la adicinde nutrientes y concentraciones ms altas de estos, tienen un efecto
positivo en la produccin de cido lctico. Con solo extracto de levadura
se obtiene mayor produccin de cido lctico que con extracto de
levadura y peptona en bajas cantidades, pero lo opuesto ocurre cuando la
concentracin de extracto de levadura se mantiene constante y se
adiciona peptona (Amrane y Prigent, 1997).
1.4.1.4 Temperatura: El efecto de la temperatura en la produccin
de cido lctico ha sido estudiado en pocos reportes. La temperatura que
da mayores productividades es en algunos casos menor que la
temperatura que resulta en el mayor rendimiento y concentracin de cido
lctico, mientras que en otros la misma temperatura obtuvo los mismos
resultados en todas las categoras. Por ejemplo, para el Lactobacilluscaseiy Lactobacillus paracaseila temperatura ptima fue reportada entre
37 y 44C (Linko y Javanainen, 1996).
1.4.1.5 Densidad Celular: Las ms altas densidades celulares (48-
103 gr/L) han sido logradas con recirculacin, pero en fermentaciones sin
recirculacin se han alcanzado concentraciones entre 60 y 77 g/L de
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
31/117
31
clulas. La fermentacin de las LAB, por lo general est acompaada de
un incremento en la masa celular, lo que constituye un subproducto
indeseado si el objetivo del proceso es la produccin de cido lctico.
Pero, al obtener altas concentraciones de microorganismos, estos
pueden ser usados como las materias primas principales en la produccin
de probiticos (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
1.4.1.6 Ismeros del cido Lctico: La mayor parte de las LAB
producen solo un ismero, pero en algunos casos una pequea cantidad
del otro ismero es producida. Lactobacillus helveticus y Lactobacillus
plantarum producen una mezcla racmica cuya composicion vara. La
enzima lactato deshidrogenasa es estereoespecfica, produciendo cido
lctico D L; la(s) forma(s) de la enzima presente en la bacteria
determina cual ismero es producido. Para algunas aplicaciones, como la
sntesis de cido polilctico, se desea un producto pticamente puro o
una mezcla racmica de composicin constante. Para la produccin de
cido lctico L(+), en algunas LAB como Lactobacillus amylophilus,Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus rhamnosus no se produce el
ismero D(-) cuando el pH es variado, ni cuando se cambian las
concentraciones de los nutrientes. Por otro lado, Lactobacillus delbrueckii
spp. bulgaricus, solo produce cido lctico D(-) en cultivos batch y
continuo a partir de glucosa y lactosa y cuando se modifican las
concentraciones de los nutrientes. La composicin de la mezcla racmica
formada por Lactobacillus plantarum cambia con la aireacin y laconcentracin de NaCl. Comparando los modos batch y continuo, la
concentracin del ismero predominante fue mayor en el primero, ya sea
L(+) D(-). La concentracin del ismero deseado tambin ha variado
aumentando el pH y la concentracin de sustrato, pero disminuye con la
temperatura y cuando el pH no es controlado (Hagerdal y Hofvendahl,
2000).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
32/117
32
1.4.1.7 Modo de Fermentacin: El cido lctico, por lo general, se
produce en modo batch, pero existen numerosos ejemplos de cultivo
continuo as como fed-batch y fermentaciones repetidas batch
semicontinuas. Cuando se compara los modos de fermentacin batch y
continuo, el primero resulta en mayores concentraciones de cido lctico y
mejores rendimientos en la mayora de estudios. Esto es debido a que
todo el sustrato es usado en el modo batch. Por otro lado, el modo
continuo resulta en mayores productividades, probablemente por que se
trabaja a altas tasas de dilucin, en donde la ventaja sobre el modo batch
es pronunciada. En general los modos fed-batch, semicontinuo y modobatch repetido han obtenido rendimientos mayores que el modo batch
(Ishiaki y Vonktaveesuk, 1996).
Inmovilizacin y recirculacin de clulas: Las clulas de LAB
pueden ser recirculadas o inmovilizadas en soportes slidos en diferentes
modos para aumentar la densidad celular; pero esto no ha sido muy
exitoso en trminos de aumento del rendimiento del cido lctico yproductividad. Por otro lado la recirculacin de clulas ha dado mayores
concentraciones de cido lctico y rendimientos iguales o mayores
(Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
Fermentaciones fed-batch: El proceso batch consiste en realizar
una alimentacin inicial con todos los nutrientes necesarios para el
microorganismo dentro del reactor, para que este se reproduzca en formaexponencial hasta el momento en que se agote el sustrato,
posteriormente la fermentacin llega a fase estacionaria. En contraste, la
metodologa fed-batch consiste en suministrar los nutrientes al
microorganismo durante el proceso fermentativo sin la eliminacin del
medio agotado, esta corriente de alimentacin puede ser suministrada de
forma continua, con flujos variables o constantes, o de forma discontinua
en forma de pulsos (Soto, 2004).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
33/117
33
1.4.2 Consideraciones del proceso.
Las mejores condiciones de fermentacin no siempre son las ms
favorables para todo el proceso desde el punto de vista econmico,
porque el costo del sustrato y de los procesos de separacin son
proporcionalmente altos. El sustrato, por lo general, es un asunto de
disponibilidad geogrfica. Los desechos de agricultura y silvicultura,
debido a su bajo precio, son preferibles a azcares puros y costosos. Para
sustratos lignocelulsicos una cepa que fermente pentosas y hexosas
como Lactobacillus pentosus es requerida para maximizar el rendimiento.
El almidn puede ser hidrolizado y fermentado por algunas cepas deLactobacillus productoras de amilasas, como Lactobacillus amylovorus,
o, despus de ser hidrolizado a glucosa, ser fermentado. Una cepa
homofermentativa maximiza la productividad de cido lctico producido.
Independientemente de la fuente de carbono, la fermentacin batch ha
sido superior a la fermentacin continua en todos los aspectos, excepto
en la productividad volumtrica. En modo continuo o en repetidos batch,se incrementa el rendimiento aun ms. Si el sustrato es costoso el
rendimiento debe ser maximizado (como en operacin batch o
semicontinua), mientras que la productividad volumtrica debe ser
maximizada mediante operacin continua si los costos de inversin son
altos. Una alta productividad puede ser alcanzada reciclando las clulas,
resultando en alta masa celular sin reducir el rendimiento (Hagerdal y
Hofvendahl, 2000).
1.5 LOS PROCESOS DE SEPARACIN.
La sntesis qumica de cido lctico siempre lleva a la mezcla racmica
pticamente inactiva, mientras que la selectividad puede ser alcanzada
mediante fermentacin usando el microorganismo apropiado. De cualquier
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
34/117
34
manera, el proceso biolgico requiere el uso de un proceso de separacin
econmico y eficiente para recuperar cido lctico y aislarlo de varias
impurezas en el caldo de fermentacin.
Los carbohidratos son fermentados a cido L-lctico por varios
microorganismos, haciendo que el pH del caldo de fermentacin
disminuya afectando la productividad de los microorganismos. Se han
realizado investigaciones para desarrollar cepas que puedan producir
cido lctico a bajos pH, pero no son todava comercialmente viables. Se
tienen dos procesos convencionales para mantener el pH del fermentador
estable:
El caldo de fermentacin clarificado es concentrado al 32%, muy
por encima del punto de cristalizacin y acidificado con cido sulfrico
para obtener el cido lctico crudo (Joglekar et al., 2006).
El carbonato de calcio es adicionado al caldo para mantener una
concentracin de cido lctico baja para prevenir la inhibicin de labacteria. La solucin de lactato de calcio caliente es despus clarificada
mediante filtracin y lavada; subsecuentemente es cristalizada y
convertida a cido lctico agregando cido sulfrico, el cual se convierte
en grandes cantidades de sulfato de calcio como subproducto (Jackman
et al., 2004). Este sulfato de calcio es eliminado mediante filtracin. Una
mayor purificacin es alcanzada mediante tratamiento con carbn
activado, resinas de intercambio inico, extraccin con solventes oesterificacin, seguida por destilacin e hidrlisis (Ohkouchi y Inoue,
2006).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
35/117
35
1.5.1 Extraccin reactiva.
El cido lctico es poco extrable con solventes orgnicos comunes
debido a su naturaleza hidroflica, por lo que la extraccin reactiva ha sido
considerada para su recuperacin a partir de procesos convencionales.
La extraccin reactiva usa la reaccin entre el extractante y el material ha
ser extrado. El extractante en la fase orgnica reacciona con un material
en fase acuosa y el complejo que reacciona es solubilizado en la fase
orgnica. El cido lctico es recuperado de la capa orgnica mediante
una desorcin. El prerrequisito de una recuperacin econmica mediantedistribucin es un alto coeficiente de distribucin (Kd) (Joglekar et al.,
2006.).
1.5.2 Adsorcin.
La recuperacin de cidos carboxlicos de caldos de fermentacinpresenta un problema de separacin desafiante debido a la compleja
naturaleza de estos. Mtodos de recuperacin que utilizan agentes de
separacin, como adsorbentes slidos que son selectivos para cidos
carboxlicos, son atractivos. Caractersticas importantes de los
extractantes y de los adsorbentes slidos son una alta capacidad, una alta
selectividad para el cido sin serlo para el agua ni el sustrato,
regenerabilidad y, dependiendo del proceso, configuracin ybiocompatibilidad con los microorganismos (Joglekar et al., 2006).
1.5.3 Electrodilisis.
La fermentacin con electrodilisis es promisoria porque puede remover
cido lctico continuamente y mantener el pH del medio. La mayor parte
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
36/117
36
de la literatura muestra la produccin de cido lctico a sales de lactato en
dos pasos: electrodilisis convencional y purificacin con electrodilisis
bipolar para la conversin de las sales de lactato en cido lctico con la
recuperacin del compuesto alcalino (Joglekar et al., 2006).
1.5.4 Esterificacin y destilacin reactiva.
La esterificacin es el nico proceso de separacin que separa el cido
lctico de otros cidos orgnicos. El cido lctico de alta pureza puede ser
preparado mediante la formacin de un ster al reaccionar el cido lcticocon alcohol. Posteriormente, la purificaron del ster se da por destilacin o
extraccin y luego se realiza su conversin en cido lctico.
La destilacin simultnea con esterificacin-hidrlisis es llamada
destilacin reactiva. El caldo fermentado con cido lctico necesita ser
pretratado para remover algunas impurezas antes de la destilacin
reactiva, para lo cual se usan camas de resinas que sirven comocatalizador y como relleno para la columna de destilacin (Joglekar et al.,
2006).
1.5.5 Proceso de separacin del cido lctico.
En la figura 6 se muestra el proceso de separacin de cido lcticocuando el pH de la fermentacin es controlado con carbonato de calcio.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
37/117
37
Figura 6. Proceso de separacin del cido lctico.
En la fermentacin se produce el cido lctico y ya que el pH de esta es
controlado con carbonato de calcio estos reaccionan para generar lactato
de calcio. Posteriormente, se realiza una filtracin con el fin de eliminar labiomasa y una evaporacin para separar el exceso de agua y as
disminuir el tamao de los equipos posteriores.
Despus de la evaporacin se realiza una esterificacin en donde el
lactato de calcio reacciona con cido sulfrico en presencia de metanol
para generar lactato de metilo y sulfato de calcio (el cual es un
subproducto).
El lactato de metilo generado junto con el agua que esta presente en el
proceso desde el comienzo van a una destilacin reactiva donde estos
dos compuestos reaccionan para regenerar y separar el metanol y el
cido lctico.
1.6 EL MERCADO DEL CIDO LCTICO
1.6.1 Precios y costos.
El cido lctico tiene un precio comercial que varia entre 1.38 US$/kg
(para 50% de pureza) y 1.54 US$/kg (para 88% de pureza) (Wee et al.,
2006). La produccin sinttica de este tiene un costo entre 1.30 y 1.40
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
38/117
38
US$/kg. (Zacchi y Akerberg, 2000); pero para ser competitivo el costo del
monmero debe ser menor a 0.8 US$/kg, (Datta et al., 1995). En todo
caso, todava hay varios tpicos que deben ser estudiados para producir
cido lctico por medios biotecnolgicos en el rango de costos sealado,
como el desarrollo de microorganismos de alto desempeo en la
produccin de cido lctico, la disminucin de los costos de las materias
primas y los procesos fermentativos. Los procesos biotecnolgicos para la
produccin de cido lctico a partir de materias primas de bajo costo
deben ser mejorados para hacerlos competitivos con los procesos
qumicos (Wee et al.,2006).
1.6.2 Produccin y cuanti ficacin de la oferta existente.
Se estima que la demanda actual del cido lctico en el mundo est entre
130,000 a 150,000 toneladas mtricas por ao (Wee et al., 2006). Este
compuesto posee un uso potencial como insumo para aplicaciones de
gran volumen, con ventas proyectadas que exceden los US $ 3 billonesanuales slo en Estados Unidos (72 millones de libras), (Wisconsin
Biorefining Development Initiative, 2006).
Para resumir cabe decir que el mercado mundial para sustitucin de
solventes sera de US$ 4.5 billones/ao, el de polmeros biodegradables
US$ 0.9 billones/ao y el de qumicos oxigenados US$ 5.4 billones/ao
(Bolaos et al., 2000.).
1.6.3 Crecimiento esperado y factores que inciden.
Actualmente, a nivel mundial, algunos observadores estiman que la
produccin de cido lctico tiene un incremento de 12-15% anual
(Joglekar et al., 2006) y se tiene proyectado un aumento de la demanda
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
39/117
39
de cido lctico de un 45.5% anual para el uso en polmeros
biodegradables (Jarvis, 2001).
Los productores de cido lctico estn esperando aumentar sus
ganancias con el potencial del producto como monmero del cido
polilctico. La industria espera que haya suficiente capacidad de cido
lctico para mantener la demanda de polmeros biodegradables y
solventes. El mercado por el cido polilctico crece, adems, con los
requerimientos de los consumidores de productos verdes; igual ocurre
con los solventes y agentes de limpieza biodegradables, en donde el
consumo de lactatos crece debido a su biodegradabilidad. El etil lactatoes el producto primario, y es usado como agente de limpieza en las
industrias de la microelectrnica, metalmecnica y de impresin (Jarvis,
2001).
1.6.4 Proyecc in de la demanda.
Actualmente, todo el cido lctico consumido en Colombia es de origen
extranjero, el cual se encuentra distribuido segn se muestra en la tabla 2.
Proyectando las tendencias mostradas hasta el 2010, se esperaran
volmenes de 297.3, 320.6, 343.9 y 367.2 Ton para los aos 2007, 2008,
2009 y 2010, respectivamente, considerando incrementos acordes con el
comportamiento de la tendencia en los ltimos aos.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
40/117
40
Tabla 2. Estadsticas de las Importaciones de Colombia por Pases para
el cido lctico (Comunidad Andina de Naciones, 2007).
Volumen en Toneladas2000 2001 2002 2003 2004
MUNDO 140 159 170 198 237
Alemania 1 0 0 0 4
Blgica 9 28 25 76 109
Brasil 114 115 107 104 135
China 13 5 27 1 20
Espaa 0 3 2 4 1
Estados
Unidos 0 0 4 0 5
Italia 0 0 0 0 4
Japn 0 0 0 0 1
Mxico 0 0 1 6 32
Pases
Bajos 3 7 5 7 74
Per 0 0 0 0 9
1.7 SIMULACIN DE PROCESOS BIOTECNOLOGICOS
En la actualidad, se han venido implementando la utilizacin deherramientas computacionales para realizar simulaciones de bioprocesos
con el fin de optimizarlos. Par esto se cuenta con herramientas tales como
Superpro designer, Excel, Matlab o ASPEN, en donde es posible la
manipulacin de distintos tipos de datos y utilizacin de ambientes
grficos que representan los comportamientos descritos por los modelos.
La simulacin puede ser usada como una importante herramienta para el
desarrollo de bioprocesos, jugando un importante rol para lograr undiseo ptimo de ellos, mientras acelera el desarrollo de los proceso para
la industria bioqumica.
Las ventajas de la simulacin para el desarrollo y escalamiento de
bioprocesos han sido conocidas por largo tiempo. Los simuladores de
procesos ofrecen la oportunidad de reducir el tiempo requerido para el
desarrollo de estos. Ellos permiten la comparacin de alternativas de
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
41/117
41
proceso para que un gran nmero de ideas puedan ser sintetizadas y
analizadas interactivamente en poco tiempo (Zhou et al.,1997).
1.7.1 Modelo de simulacin.
Un modelo es aquel que describe las relaciones entre las principales
variables de estado y explica cuantitativamente el comportamiento de un
sistema. El modelo puede proveer sugerencias para el anlisis, diseo y
operacin de un fermentador. Los modelos de fermentacin normalmente
son divididos en dos clases: en modelos estructurados en donde las rutasmetablicas intracelulares son consideradas y modelos no estructurados,
en donde la biomasa es descrita por una variable. Los modelos
estructurados parecen ser complicados para el uso regular, mientras que
los modelos no estructurados son mucho ms fciles de usar y han
demostrado que tienen la capacidad de describir adecuadamente muchas
fermentaciones (Liu et al.,2003).
A continuacin se muestran algunos modelos que describen las cinticas
de crecimiento microbiano, produccin de cido lctico y consumo de
glucosa (Islam et al., 2003; Liu et al., 2003 ):
1.7.1.1 Crecimiento microbiano (X): Los modelos no estructurados
ms ampliamente usados para describir el crecimiento celular son elmodelo cintico de Monod, la ecuacin logstica y el modelo de Haldane.
La ecuacin logstica es un modelo independiente del sustrato que puede
describir la inhibicin de crecimiento de la biomasa que se presenta en
muchas fermentaciones batch. El modelo logstico se describe en la
ecuacin 1.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
42/117
42
Ecuacin 1. Modo diferencial del modelo de crecimiento logstico (Liu et
al., 2003).
= Xm
X
Xdt
dXm
1*
La forma integrada de la Ecuacin1 usando X=Xo (t=0) (ecuacin 2) da
una variacin de X como funcin de t, el cual puede representar tanto la
fase exponencial como la fase estacionaria.
Ecuacin 2. Forma integrada de la ecuacin de crecimiento logstico (Liu
et al., 2003).
tm
tm
eXoXoXm
eXmXoX
*
*
*
**
+=
Donde Xmrepresenta la concentracin de biomasa (g/L) mxima obtenida
durante la fermentacin, X0la concentracin inicial de biomasa (g/L), y
mla velocidad especfica mxima de crecimiento (h-1).
1.7.1.2 Formacin de producto (P): La cintica de la formacin de
cido lctico se bas en las ecuaciones de Luedeking-Piret. Este modelo
fue originalmente desarrollado para la formacin de cido lctico por
Lactobacillus delbrucckii (Gong y Lun, 1996). De acuerdo con este
modelo, la velocidad de formacin de producto depende de la
concentracin de biomasa y de la velocidad de crecimiento dX/dt, demanera linear (ecuacin 3).
Ecuacin 3. Modo diferencial de la ecuacin de Luedeking-Piret (Liu et
al., 2003).
Xdt
dX
dt
dP* +=
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
43/117
43
Donde (g/g) y (g/g.h) representan la constantes de produccin de
cido lctico asociada y no asociada al crecimiento respectivamente.
1.7.1.3 Consumo de glucosa (S): Una fuente de consumo de
carbono como la glucosa es usada para formacin de biomasa, de
productos resultantes del metabolismo celular y para el mantenimiento de
las clulas. La Ecuacin 4 muestra como se relacionan:
Ecuacin 4. Ecuacin de consumo de glucosa (Islam et al., 2003).
( )1*00
++
+= t
xss
xs
m eY
mY
XSS
Donde S0 representa la concentracin inicial de sustrato (g/L), Yxs el
rendimiento real de sustrato en biomasa (g/g), ms el coeficiente de
mantenimiento (g/g.h) y es la velocidad especifica de crecimiento (h-1).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
44/117
44
2 MATERIALES Y MTODOS.
2.1 LOCALIZACIN.
Los anlisis y pruebas correspondientes a este trabajo, se realizaron en los
laboratorios de Biotecnologa y Anlisis Instrumental de la Universidad EAFIT, en la
ciudad de Medelln.
2.2 MEDIO DE CULTIVO.
El medio de cultivo usado fue el MRS, el cual es un medio creado por DeMan,
Rogosa y Sharpe (1960) para el enriquecimiento, cultivo y aislamiento de las
diferentes especies de Lactobacillus. Las concentraciones de los nutrientes en elmedio (Tabla 3) fueron las reportadas por Guoqiang et al. (1991), cambiando la
concentracin de glucosa. Las soluciones de sales y la glucosa fueron autoclavadas
por separado a 15 psi y 120C durante 20 minutos.
2.3 MICROORGANISMO UTILIZADO.
Se utiliz el microorganismo, Lactobacillus casei ATCC 7469 (Figura 7) obtenido
en laAmerican Type Culture Collection (ATCC).
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
45/117
45
Tabla 3. Composicin del medio de cultivo MRS (Guokiang et al., 1991).
Compuesto Composicin (g/L)Glucosa 100
Extracto de levadura 10K2HPO4 0.5KH2PO4 0.5
Citrato de sodio 1.0MgSO4.7H2O 0.005MnSO4.H2O 0.0031FeSO4.7H2O 0.002
Acido ascrbico 0.005Agar Agar 13.0
Figura 7. Lactobacillus caseiATCC 7469
Inicialmente el microorganismo se encontraba liofilizado por lo que fue activado de la
siguiente forma:
- Una asada del lifilo (Figura 8) se agreg a 20 mL de medio MRS lquido
(Tabla 3) y se ubic en un shaker a 37C y 90 rpm, durante dos das.
- El caldo de cultivo resultante fue el inculo para sembrar una caja petri, la
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
46/117
46
cual a su vez sirvi para almacenar la cepa en el sistema de perlas Criobank (
- Figura 9), para lo cual:o De una caja petri de cultivo fresco se retir toda la biomasa con un asa
estril y se disolvi en el medio que el sistema de perlas contiene.
o Se agit hasta incorporar completamente la muestra al medio
invirtiendo el vial. Esto permiti que las bacterias se adhirieran a las
perlas.
o Con una pipeta estril, se removi el medio de cultivo de Cryobank y
se almacenaron las perlas a 4C.
- Para generar las cepas de trabajo se tom una perla del vial con un asa
de siembra y se extendi sobre la superficie de una caja petri con agar MRS.
- Las cajas petri se incubaron a 37C durante dos das y posteriormente se
almacenaron a 4C.
Figura 8. Lifilo.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
47/117
47
Figura 9. Sistema de perlas Cryobank.
2.4 MTODOS ANALTICOS
Las muestras para realizar las curvas de crecimiento, generacin de producto y
consumo de sustrato fueron tomadas por duplicado a tiempos dados desde el tiempo
cero que corresponde a la inoculacin, hasta que termina cada fermentacin. Luego,las muestras fueron analizadas para determinar la concentracin celular por peso
seco, el consumo de sustrato por DNS (Miller, 1959) y la concentracin de cido
lctico por cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC.
Las fermentaciones, los anlisis y la toma de muestras fueron llevadas a cabo por
duplicado y los valores aqu presentados son el promedio de las mediciones con su
respectivo error estndar.
2.4.1 MEDICIN DE BIOMASA
La medicin de biomasa de L. caseise realiz por el mtodo de peso seco. Para ello
se tom de manera estril 1 mL de muestra, luego se centrifug a 14000 rpm a 4C,
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
48/117
48
durante 60 minutos para eliminar el sobrenadante. Al pellet resultante se le agreg 1
mL de cido clorhdrico 1 M para que el carbonato de calcio presente reaccionara yse centrifug a las mismas condiciones anteriores. Finalmente, el eppendorf fue
secado a 50C durante 24 h para luego ser pesado. El clculo de la concentracin de
biomasa en g/L se comput de acuerdo a la ecuacin 5:
Ecuacin 5. Concentracin (g/L) de biomasa
( )%100*
001,0
____
L
EppendorfInicialPesoEppendorfFinalPesoBiomasa
=
2.4.2 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA
La cintica de consumo de sustrato se determin por el mtodo de cido
Dinitrosaliclico (DNS) (Miller, 1959), que permite cuantificar la presencia de azcares
reductores (Anexo 1). Para llevar a cabo la cuantificacin se realiz una dilucin delsobrenadante obtenido despus de la centrifugacin de 1:165.7.
2.4.3 MEDICIN DE LA CONCENTRACIN DE CIDO LCTICO
La concentracin de cido lctico y del lactato de calcio presente en el cultivo debido
a la reaccin del cido con el carbonato de calcio, fue determinada por medio decromatografa lquida (HPLC). El equipo usado fue un HPLC Agilent Technologies
serie LC 1200 Series Quaternary a temperatura ambiente, en una columna C18, con
cido sulfrico 0.01 M como fase mvil y con un flujo de 0.7 mL/min, se us un
detector de absorcin ultravioleta a 210 nm, con un volumen de inyeccin de 10 l.
Como preparacin de las muestras se siguieron los protocolos encontrados en
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
49/117
49
Snchez y Ramrez (2004) y Wang et al. (2007).
A cada muestra primero se le elimin la biomasa por medio de la centrifugacin de 2
mL, a 14000 rpm, por 60 minutos, a 4C; despus, para desproteinizar la muestra se
tomaron 1.5 mL de esta y se le agreg 0.1 mL de H 3PO40.1 N, luego se centrifug
durante 60 minutos, a 12000 rpm, a 4C y se tom el sobrenadante.
Posteriormente, se calent el sobrenadante durante 10 minutos a 30C en bao
Mara para despolimerizar al cido y se filtr por acetato de celulosa con un dimetro
de puro de 0.3 m. En este punto las muestras estaban listas para ser llevadas al
cromatgrafo y realizar las mediciones.
Para cada muestra, se ley en el cromatograma el rea del pico correspondiente
tanto al cido como al lactato presente, los cuales aparecen a 6 y 3.1 minutos
respectivamente y se obtiene la concentracin a partir de las curvas de calibracin
(Anexo 2 y 3), teniendo en cuenta los factores de dilucin usados.
2.5 FERMENTACIONES
2.5.1 Evaluacin de la concentracin de carbonato de calcio .
Las fermentaciones fueron realizadas en el agitador lineal con control de temperatura
(Figura 10) a 37C y a una velocidad de 90 rpm. Estas fueron llevadas a cabo porduplicado en erlenmeyers de 500 mL con 300 mL de medio MRS. Los erlenmeyers
fueron cubiertos con algodn, aluminio y vinipel, para crear condiciones parcialmente
anaerobias.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
50/117
50
Figura 10.Agitador lineal con control de temperatura.
La inoculacin fue realizada con 3 asadas del microorganismo, provenientes de cajaspetri preparadas a partir del sistema de perlas Criobank.
Para la toma de muestras, los erlenmeyers fueron llevados a la cmara de flujo
laminar y all se les retir la cubierta y se tom de manera estril 1 mL de muestra
por duplicado. Los erlenmeyers fueron nuevamente tapados y llevados al agitador.
Las concentraciones de carbonato de calcio evaluadas fueron 15, 37.5 y 60 g/L.
2.5.2 Sistema batch en bior reactor.
Primero se realiz un preinculo a partir de tres asadas de las cajas petri en
erlenmeyers de 50 mL con 20 mL de medio de cultivo MRS. Despus de 2 das de
cultivo a 37C y 90 rpm en el agitador lineal con control de temperatura, el contenido
fue pasado, en condiciones estriles, a erlenmeyers de 500 mL con 180 mL de medio
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
51/117
51
de cultivo MRS. El proceso se llev a cabo a 37C, 90 rpm, por 48 horas para ser
usado despus como inculo con una OD de 1.9 0,5 en el biorreactor.
El equipo utilizado fue un biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 (Figura 11) con un
volumen total de 3 L, cuatro bafles y 2 agitadores de seis hojas planas tipo Rushton.
Figura 11. Biorreactor BIOENGINEERING CH 8636
2.5.3 Sistema Fed-batch.
En las fermentaciones batch se realiz el mismo procedimiento descrito para las
fermentaciones batch, en el cual fue preparado el preinculo y el inculo,
adicionalmente, se prepararon las soluciones para la alimentacin del biorreactor.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
52/117
52
La estrategia de alimentacin fed-batch se dividi en tres etapas: primero se oper el
biorreactor en modo batch con 2 L de medio de cultivo hasta finalizar la faseexponencial, posteriormente, comenz la alimentacin fed-batch hasta que fue
agregado 1 litro de solucin de glucosa y por ltimo se oper nuevamente el
biorreactor en modo batch durante las ltimas 24 horas del proceso
Los procesos fed-batch realizados fueron los siguientes:
Fed-batch 1: flujo 74 mL/h, concentracin de glucosa de 850 g/L.
Fed-batch 2, flujo 43mL/h, una concentracin de glucosa de 100 g/L.
Fed-batch 3 flujo 14 mL/h y concentracin de glucosa de 100 g/L.
Todos los procesos fed-batch operaron con una agitacin de 90 rpm, una
temperatura de 37 C y una concentracin inicial de CaCO3de 15 g/L.
2.5.3.1 Clcu lo de los parmetros productivos en las fermentaciones.
Rendimiento observado de sustrato en producto (Yps).
El clculo del rendimiento de sustrato en producto se define como los gramos de
cido lctico producidos sobre los gramos de glucosa consumida, por esto el clculo
de este parmetro est definido por la ecuacin 6:
Ecuacin 6. Rendimiento observado de sustrato en produc to (g/g).
ConsumidaaGludeGramos
oducidosLcticocidodeGramospsY
_cos__
Pr____ =
El rendimiento terico de sustrato en producto est definido como los gramos de
cido lctico producidos sobre los gramos de glucosa consumida para la produccin
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
53/117
53
de este cido, por lo tanto, ya que esta es solo una fraccin de la glucosa total
consumida, el rendimiento terico es mayor que el rendimiento observado.
Productividad Volumtrica (Q).
La productividad volumtrica est definida como los gramos de cido lctico
producidos por unidad de volumen, en un tiempo dado (ecuacin 7)
Ecuacin 7. Productividad volumtrica (gr/L.h).
VolumennFermentacideTiempo
oducidosLcticocidodeGramosQ
=
__
Pr____
Rendimiento observado de sustrato en biomasa (Yxs)
El rendimiento observado de sustrato en biomasa esta definido como los gramos de
biomasa obtenida sobre los gramos de glucosa consumida y se calcula con la
ecuacin 8:
Ecuacin 8. Rendim iento observado de sustrato en biomasa (g/g).
ConsumidaaGludeGramos
ObtenidaBiomasadeGramosY xs
_cos__
___ =
2.6 SIMULACIN.
Para la implementacin del modelo de simulacin, fueron escogidas las ecuaciones
que describen el proceso de fermentacin, propuestas por Liu, et al. (2003) para la
produccin de biomasa y de cido lctico e Islam et al. (2003) para el consumo de
sustrato. En ellas se presentan los modelos que representan a estos parmetros en
el tiempo; siendo estas las Ecuacin 2, 3 y 4. Ellas fueron usadas para simular los
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
54/117
54
resultados experimentales, mediante el uso de EXCEL, los valores de los parmetros
cinticos fueron encontrados con el software Polymath 6.0.
2.7 ANL ISIS ESTADSTICO
Se realizaron diferentes anlisis estadsticos segn la etapa del proceso en el
software Statgraphics 5.0. El primero fue llevado a cabo para las fermentaciones
realizadas en el agitador lineal, en donde se evaluaron diferentes concentraciones de
carbonato de calcio.
A estas fermentaciones se les realiz un anlisis de varianza ANOVA con un nivel de
confianza del 95%. Para ello se evaluaron las diferencias que existan entre las
diferentes concentraciones de carbonato y los diferentes parmetros productivos
(concentracin de cido lctico, Yps, Q).
Posteriormente se realiz un anlisis estadstico para comparar las diferenciasexistentes entre todas las fermentaciones realizadas en el biorreactor. Tambin
consisti en un anlisis de varianza ANOVA con un nivel de confianza del 95%.
Adems, se llev a cabo un anlisis de rangos mltiples para determinar que grupos
eran homogneos y as identificar cuales medias eran significativamente diferentes
de las otras.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
55/117
55
3 RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1 VARIACIN DE LA CONCENTRACIN DE CARBONATO DE CALCIO
El carbonato de calcio es un agente regulador de pH, el cual reacciona con el cido
lctico formando lactato de calcio. Por ello, es importante determinar la concentracinde este compuesto que permita altas productividades y buenos rendimientos. En este
estudio, se evaluaron diferentes concentraciones de este compuesto en un sistema
de fermentacin batch (15, 37.5 y 60 g/L)
Se observ un comportamiento muy similar en todas las concentraciones evaluadas,
en la Figura 12 se puede observar su comportamiento.
En la figura 12a se observa que durante el crecimiento de L. casei se hallaron
diferentes fases de crecimiento. La fase lag correspondi a un perodo de 8 horas,
donde el microorganismo se adapt a las condiciones fsico qumicas del proceso.
Posteriormente, ocurri la fase exponencial con una duracin de 54,5 h, en donde
aument considerablemente la concentracin del microorganismo, para luego entrar
en la etapa de fase estacionaria y muerte celular evidenciada por la disminucin en la
concentracin de biomasa de 2.68 a 2.49 g/L.
La disminucin en la concentracin de glucosa est relacionada con el aumento en la
concentracin de biomasa y la mayor velocidad en el consumo de este se da durante
la fase exponencial de crecimiento, llegando a un valor final de 47.7 gr/L de glucosa.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
56/117
56
Figura 12.Cintica de las fermentaciones variando la concentracin de carbonato de
calcio. a)15 g/L, b)37.5, c)60 g/L.Biomasa ( ) , Glucosa ( ) , cido lctico ( ).
a)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (h)
Concentracion
(g/L)(X)
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
140.0
Concentracion
(g/L)(S,P
)
b)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (h)
Co
ncentracion(g/L)(X)
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
Con
centracion
(g/L)(S,P
)
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
57/117
57
c)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (h)
Concentracin
(g/L)(X)
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
Concentracin
(g/L)(S,P
)
Finalmente, se puede ver cmo la produccin de cido lctico comenz al igual que
el crecimiento celular a las 8 horas y al finalizar el crecimiento exponencial se
alcanz el 95% (94.7 g/L) del cido total que se produjo en la fermentacin completa.
Al final de la fermentacin, se encontraron 99.3 g/L de cido lctico, habindose
generado aun una pequea fraccin de este (5%) durante la fase estacionaria. Por
ello, bajo las condiciones evaluadas, este metabolito est relacionado parcialmente
con el crecimiento celular, ya que se produjo principalmente en la fase exponencial,
pero tambin, aunque en menor proporcin, en la fase estacionaria tal como fue
reportado por Islam et a., (2003).
Para cada fermentacin se evaluaron los siguientes parmetros a las 80 horas:
concentracin final de cido lctico (AL), rendimiento observado de sustrato en
producto (Yps), productividad volumtrica de cido lctico (Q) y rendimiento
observado de sustrato en biomasa (Yxs) (Tabla 4). Los datos reportados son el
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
58/117
58
promedio de sus duplicados.
Las figuras 12b y 12c tienen el mismo comportamiento que la figura 12a, pero al
aumentar la concentracin de carbonato de calcio aument la fase lag de estas, esto
pudo ser debido a que el inculo de estas fue obtenido directamente de cajas petri y
en estas el medio de cultivo no contena carbonato de calcio. Por esto, para estas
fermentaciones el carbonato consisti en un agente nuevo en el medio y al aumentar
la concentracin de este tambin aument el tiempo de adaptacin de la bacteria al
medio de cultivo.
Tabla 4. Parmetros productivos bajo diferentes concentraciones de carbonato de
calcio.
Carbonato de calcioParmetro 15 g/L 37.5 g/L 60 g/L
AL (g/L) 99.1 94.9 92.4Yps(g/g) 2.38 1.70 1.72Q (g/L.h) 1.24 1.19 1.23
Yxs (g/g) 0.056 0.061 0.053
A estas fermentaciones se les realiz un anlisis de varianza ANOVA con un nivel de
confianza del 95%. Para ello se evaluaron las diferencias que existan entre las
concentraciones de carbonato y los parmetros productivos (concentracin de cido
lctico, Yps, Q). No se hallaron diferencias significativas entre estas variables
dependientes y la concentracin de CaCO3(P>0,05) (Anexo 5) concluyendo as que
la produccin de este cido no se ve afectada por la concentracin de esta sal bajolas condiciones evaluadas en este proyecto.
El carbonato de calcio es un agente inerte para la bacteria ya que esta no lo puede
consumir y a las concentraciones trabajadas tampoco es nocivo para ella. La nica
funcin de este compuesto en el medio de cultivo es reaccionar con el cido lctico
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
59/117
59
producido, posiblemente por esto es que su concentracin en el medio no afect de
manera significativa a los parmetros productivos.
Los resultados obtenidos son mejores a los de Vzquez et al. (2003) en donde con
una concentracin de 100 g/L de carbonato de calcio se obtuvo 58,9 g/L de cido
lctico con L.coryniformis en erlenmeyers de 250 mL y 100 mL de medio de cultivo.
Las concentraciones obtenidas tambin son ms altas que aquellas logradas por
Elibol et al. (2004) quienes estudian diferentes fuentes de carbono para la produccin
de cido lctico con Rhyzopus oryzae, logrando una concentracin mxima de 60 g/L
del cido en erlenmeyers de 250 mL con 50 mL de medio de cultivo y 50 g/L de
carbonato de calcio.
En Patel et al. (2007)trabajando con Lactobacillus sp. KCP01 se obtuvo un aumento
de 23,48 g/L a 45,59 g/L en la concentracin final de cido lctico al pasar de realizar
las fermentaciones sin control de pH, a llevarlas a cabo con 20 g/L de carbonato de
calcio. Esto evidencia que un control adecuado del pH puede aumentarsignificativamente la produccin de cido lctico.
Por esto, y para disminuir el gasto de reactivos, se decidi trabajar con la menor
concentracin de carbonato de calcio, correspondiente a 15 g/L de la misma manera
como lo realizaron Tan y Ding (2006).
3.2 PROCESO FERMENTATIVO EN MODO BATCH EN BIORREACTOR.
El proceso de fermentacin a nivel de agitador lineal se llev a un biorreactor de 3 L,
con el fin de evaluar la produccin de cido lctico a una escala mayor y
posteriormente, comparar el proceso batch con uno fed-batch. La cintica de
crecimiento de biomasa, consumo de sustrato y formacin de producto se describe
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
60/117
60
en la Figura 13.
Figura 13. Cintica de Fermentacin en biorreactor en modo batch.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h)
Concentracin(g/L)(X)
0
20
40
60
80
100
120
140
Concentracin(g/L)(S,P
)
Biomasa (X)
Glucosa (S)
cico Lctico (P)
Tabla 5. Parmetros productivos de cido lctico en un biorreactor en modo batch.
La fase de adaptacin de crecimiento encontrada a nivel de los agitadores orbtales,
desapareci en el biorreactor, probablemente debido a mejores condiciones de
fermentacin. Ellas pueden ser una mejor agitacin, un mejor control sobre la
AL (g/L) 122.6Yps(g/g) 2.71
Q (g/L.h) 2.4Yxs (g/g) 0.058
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
61/117
61
temperatura del proceso y la posibilidad de garantizar anaerobiosis desde el
comienzo de la fermentacin, lo cual no se poda garantizar en el montaje realizadoen el agitador. El efecto inmediato se evidencia por el aumento inmediato de la
concentracin de biomasa observado en la Figura 13. La fase exponencial se
extiende entonces desde el tiempo cero hasta las 27 horas, terminando esta fase
37.5 horas antes que en la fermentacin en frascos agitados (70 horas), debido a las
condiciones de fermentacin explicadas anteriormente.
La corta fase estacionaria y la acelerada muerte celular se deben a la acelerada tasa
de consumo de glucosa, alcanzando lmites inhibitorios muy rpidamente, ya que la
bacteria deja de consumir sustrato casi completamente desde las 27 horas.
La concentracin de glucosa disminuy desde 98.2 g/L hasta 52.7 g/L, valor
alcanzado a las 27 horas, momento en se que alcanz el final del crecimiento
exponencial de las clulas.
Finalmente, la concentracin de cido lctico que comenz en 30 g/L (producidos enlos inculos) aument hasta un valor de 118.9 g/L, producindose la mayor cantidad
de este metabolito (90.6%) durante las primeras 27 horas de la fermentacin en la
fase exponencial, de manera similar a lo que ocurri en el agitador lineal. La
proporcin de cido lctico producido durante la fase estacionaria y de muerte celular
se increment respecto al montaje anterior, aumentando de 5 a 9,4%. Este resultado
muestra una vez ms cmo el cido lctico, en las condiciones de proceso
evaluadas, se comport como un metabolito parcialmente relacionado con elcrecimiento celular. Esto se concluye ya que la fase de crecimiento exponencial
termin a las 27 horas, y es durante este tiempo que se dio la mayor produccin de
cido lctico; por lo cual en las prximas fermentaciones en modo fed-batch, la
alimentacin de sustrato comenz en este tiempo.
El rendimiento observado de sustrato en biomasa fue muy bajo (0.058 g/g)
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
62/117
62
comparado con el de sustrato en producto (2.71 g/g). Esto muestra cmo las
condiciones que se estn trabajando son las apropiadas para favorecer la produccinde cido lctico sobre el crecimiento de biomasa. Esto se debe a que los
rendimientos de sustrato en biomasa siempre son mucho menores en
fermentaciones anaerobias, ya que se favorece la produccin de otros metabolitos
sobre la biomasa (Hagerdal y Hofvendahl, 2000).
La concentracin final de cido lctico, el rendimiento observado de sustrato en
producto y la productividad volumtrica obtenidos en modo batch en el biorreactor,
fueron un 28.4%, 42.63% y 96.8% respectivamente, superiores a aquellas logradas
en el agitador, indicando que en el primero, se dan mejores condiciones tales como
la anaerobiosis y un mejor control en la agitacin y temperatura que favorecen la
produccin de cido lctico.
En los trabajos consultados en la siguiente comparacin de resultados los estudios
fueron realizados con Lactobacillus caseiATCC 7469:
La produccin de cido lctico obtenida en el modo batch (118.9 g/L) es mayor a la
obtenida por Schugerl et al. (1993), los cuales lograron una concentracin de cido
lctico de 26.8 g/L trabajando en un reactor de 3 L y una concentracin inicial de
glucosa de 30 g/L.
En el trabajo realizado por Guoqiang et al.(1991), lograron concentraciones de cido
lctico de 68 g/L en erlenmeyers de 100 mL y una concentracin inicial de glucosa de140 g/L.
En este estudio se present una mayor produccin de cido lctico a la encontrada
por Petrov et al. (2007), los cuales obtuvieron una concentracin de 10g/L de cido
lctico con clulas inmovilizadas y 30 g/L de lactosa.
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
63/117
63
La concentracin de cido lctico obtenida en este estudio es comparable con la
producida por Vaccari et al. (1993) los cuales con una concentracin inicial deglucosa de 119.6 g/L obtuvieron una produccin de cido lctico de 99.9 g/L en un
reactor de 3 L.
El rendimiento de 2.71 g/g es ms alto que los reportados en la literatura, como en
los estudios de Schugerl et al. (1993) los cuales encontraron un rendimiento de 0.93
g/g y en Guoqiang et al.(1991) que fue de 1.1 g/g.
Por otra parte la productividad volumtrica lograda (2,4 g/L.h) tiene un valor cercano
al reportado por Guoqiang et al.(1991) el cual fue de 2.6 g/L.h.
3.3 FERMENTACIONES FED-BATCH
3.3.1 Fed-batch 1
Un proceso fed-batch es usado para complementar los contenidos del reactor y
proveer control sobre la concentracin de sustrato. Idealmente, al comenzar con una
solucin diluida de sustrato y aadiendo nutrientes, se evaden altas velocidades de
crecimiento. Esto es de gran importancia para cultivos que demandan grandes
cantidades de oxgeno por sus altas tasas de crecimiento, al igual que para
fermentaciones que puedan sufrir inhibicin por sustrato y cambiar sus rutas
metablicas a algunas deseadas. Por lo anterior, si el reactor se opera en modobatch hasta obtener una alta concentracin celular y una baja concentracin de
sustrato, y posteriormente se comienza la adicin de sustrato, se espera que la
concentracin de ambas permanezcan aproximadamente constantes durante la
operacin fed batch.
Despus de tener los datos de las fermentaciones batch, se procedi a evaluar
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
64/117
64
diferentes estrategias fed-batch con el fin de mejorar el proceso para obtener
mayores productividades. La primera estrategia de evaluacin se realiz con un flujode 74 mL/h y una concentracin de glucosa de 850 g/L de acuerdo con lo reportado
por Tan y Ding (2006).
Figura 14. Cintica de la fermentacin fed-batch 1.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0
Tiempo (h)
Concentracin(g/L)(X)
0.0
50.0
100.0
150.0
200.0
250.0
300.0
Concentracin(g/L)(S,P
)
Biomasa (X)
Glucosa (S)
cido Lctico (P)
En la figura 14 se puede observar que la concentracin de biomasa aument durantetodo el tiempo, lo cual indica que el lactobacilo se adapt al cambio en las
condiciones de fermentacin provocado por la adicin de sustrato. Una vez comenz
la adicin de glucosa su concentracin aument desde 49.3 g/L hasta 283.9 g/L y la
fermentacin solo tuvo la capacidad de disminuirla despus de 13.5 horas de haber
finalizado el proceso de adicin de sustrato. Por ende, la cantidad de glucosa
Batch
Fed-batch
Batch
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
65/117
65
adicionada fue elevada, aunque no tanto para inhibir el crecimiento del
microorganismo.
Al comenzar el proceso fed-batch hubo un pequeo aumento en la concentracin de
cido lctico, sin embargo este se diluy y baj desde 107.8 g/L hasta 52.5 g/L.
Este comportamiento indica que el flujo trabajado fue mayor al requerido para poder
ver un efecto positivo en este modo de fermentacin.
Tabla 6. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 1.
Nota: estos resultados se refieren a toda la fermentacin
En Tan y Ding (2006) la cepa Lactobacillus casei LA-04-1 fue usada para realizar
procesos fed-batch. All todas las fermentaciones fed-batch fueron iniciadas como
cultivos batch con una concentracin inicial de glucosa de 90 g/L. Posteriormente
una solucin de glucosa de 850 g/L comenz a alimentar al fermentador a un flujo de
30 mL/h cuando la concentracin de glucosa en el biorreactor se encontraba entre 0-
5 g/L. En este estudio se alcanz una concentracin final de 152.5 g/L de cido
lctico y una productividad volumtrica de 1.82 g/L.h.
3.3.2 Fed-batch 2
Debido a los resultados obtenidos en el sistema anterior, se disminuy la
concentracin de glucosa en la solucin a 100 g/L y el flujo a 43 mL/h, obteniendo los
resultados reportados en la figura 15.
AL (g/L ) 82.7
Yps(g/g) 0.78
Q (g/L.h) 1.29
Yxs(g/g) 0.059
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
66/117
66
Figura 15. Cintica de la fermentacin fed-batch 2.
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)
Concentracin(g/L)(X)
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
Con
centracin(g/L)(S,P
)
Biomasa (X)
Glucosa (S)
cido Lct ico (P)
Tabla 7. Parmetros productivos en la fermentacin fed-batch 2.
AL (g/L ) 92.9Yps(g/g) 2.05Q (g/L.h) 1.27Yxs(g/g) 0.070
En la figura 15 se puede observar que a las 27 horas, justo en el momento que
comenz a ingresar la solucin de glucosa en el reactor, tanto la concentracin de
cido como de biomasa empezaron a diluirse, indicando que el flujo era todava
bastante alto para que el sistema pudiera asimilarlo de forma adecuada.
En una fermentacin en modo fed-batch se espera que la concentracin de glucosa
suba un poco en el momento que la adicin de sustrato comienza, pero debido a la
Batch Batch
Fed-batch
7/25/2019 Simulacon de La Produccion de Acido Lactico
67/117
67
alta cantidad de biomasa presente en el fermentador, la concentracin de glucosa
baja rpidamente.
En la fermentacin mostrada en la Figura 15 comenz a verse un poco este
comportamiento, ya que aunque la concentracin de glucosa aument en el
momento que comienza el proceso fed-batch, esta baja un poco antes de que se
acabe el proceso. Esto indica que a diferencia de la fermentacin anterior, en esta
configuracin del sistema, el microorganismo asimil la glucosa que ent
Top Related