PRÁCTICO N° 3
Técnicas para la observación,
aislamiento y conservación de
microorganismos
Objetivos
Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el
laboratorio de microbiología.
Conocer las técnicas básicas para la realización de coloraciones simples y
dobles.
Ser capaz de explicar el fundamento de la coloración de Gram y mencionar sus
utilidades diagnósticas.
Conocer las técnicas de aislamiento de microorganismos para obtener cultivos
puros.
Adquirir habilidad para la observación de microorganismos.
Adquirir habilidad en el aislamiento de microorganismos en medio sólido.
Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar
una eficiente labor grupal.
Métodos de coloración y observación de microorganismos
Características del microscopio óptico
Aumento: objetivo x ocular
Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión)
Tipos de microscopios ópticos
Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia
Preparaciones húmedas
Tipos de preparaciones para observación en microscopio ópticos
Preparaciones fijadas
Métodos de coloración
Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo.
Tipos de colorantes
Catiónicos:
- azul de metileno
- cristal violeta
- safranina
Aniónicos:
- fucsina ácida
- rojo congo
Preparación y fijación de
un extendido por calor
Coloración
Observación
Tipos de coloración
Coloraciones simples
Secuencia de una coloración simple
Equipo de coloración Flamear un portaobjeto Esterilizar el ansa
Extender Fijar al calorExtraer una alícuota
Secuencia de una coloración simple (cont.)
Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar
Secar
Observar
Secuencia de una coloración simple (fijación con ácido)
Portaobjeto enterrado
Colorear con fucsina Fijación con ácido acéticoEsperar 5 minutos
Actividad: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el
portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético).
Coloración simple (Rossy-Cholodny)
Hongo
tabicado
Hongos
Bacterias
Actinomycetes
Partícula de
arena
Coloraciones Diferenciales (Gram)
1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto)
Todas las bacterias se tiñen de violeta
2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto)
3) Decolorar el extendido con alcohol acetona.
Se enjuaga con agua.
Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran
4) Teñir el extendido con fucsina (30 segundos).
Enjuagar con agua.
Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas
Gram + Gram -
Coloración diferencial (Gram)
Bacterias G-
Bacterias G+
Actividad: realizar una coloración diferencial
Métodos de aislamiento
Aislamiento en medio sólido:
Consiste en separar e inmovilizar
individuos en un medio solidificado.
Aislamiento biológico:
Consiste en inocular animales o
vegetales y aislarlas de la sangre,
tejidos, etc.
Cultivo puro: conjunto de microorganismos genéticamente iguales.
Aislamiento: procedimiento que permite separar un microorganismo
de una población mixta.
Obtención de cultivos puros
Aislamiento en medio sólido por estriado
Fundir el agar
Esterilizar el ansa
Colocar en caja de Petri
Trazar estrías sobre el agar
Dejar solidificar
Incubar
Cultivos puros en caja de PetriCrecimiento confluente
Colonias aisladas
Actividad: realizar aislamiento por agotamiento (estrías)
Conservación de cultivos puros
Formas de conservación de cultivos puros
Liofilización: desecación mas congelación
Congelación: -90° C recubierto con glicerol
Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5°C)
Síntesis del práctico N° 3
Técnicas
microbiológicasNormas de manejo
en microbiología
Asepsia
• Atmósfera
• Sup. de trabajo
• Manejo de material
y recipiente
Observación
Microscopio Óptico
Tipos de Coloración
• Simples
• Diferenciales
Conservación
• Liofilización
• Congelación
• Subcultivos seriados
Aislamiento
• Medio sólido (estrías)
• Biológico (vegetales o
animales)
Tipos de Colorantes
• Catiónicos
• Aniónicos
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