Biosensores“Instrumentos analíticos que
transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación”
Detector biológico Transductor
Aparato medidor
Membrana olfatoria
Célula nerviosa
muestra
Cerebro
La nariz como biosensor
Analito (sustrato)
Elemento biológico de detección
Transductor
Procesador de la señal
Señal
Biosensores
Elemento detector que responde al sustrato que se está midiendo es biológico en su naturaleza
Capa delgada de material biológico activo en contacto con transductor eléctrico
Transductor convierte cambio observado (físico/químico) en señal cuantificable
Señal electrónica con magnitud proporcional a concentración de un compuesto específico
Especificidad y sensibilidad de sistemas biológicos con poder informático de microprocesador
Nature, 1967
Ann NY Acad Sci, 1962
etanol
azucares
urea
creatina
ácido láctico
ácido glutámicofosfato
colesterol
penicilinas
paracetamol
aspirina
TNT
aminoácidos
El analito o sustratocualquier sustancia consumida o producida en un proceso biológico
El componente biológico
Interacción con el sustrato altamente específica
Evitando interferencias de otras sustancias
Catalización de la reacción (más común)Unión selectiva al sustrato
Otros componentes que contienen enzimas como:
Microorganismos (levaduras y bacterias)Material tisular (plátano o hígado)
AnticuerposÁcidos nucleicos
El componente biológico
VENTAJAS
Alta especificidadDiscriminación
Detección en mezclas complejas EstructuraConcentraciones
Sin tratamiento previo
Métodos de inmovilización
Componente biológico siempre en contacto íntimo con el transductor
Unión covalente o no covalenteMembrana delgada recubriendo superficie
de detecciónDistancia entre lugar de reacción y lugar
donde ocurre la transducción eléctrica
Adsorción a la superficie (más simple)Microencapsulación (membranas)Atrapamiento (matriz de gel, pasta o
polímero)Unión covalente (enlaces químicos entre
componente biológico y transductor)Entrecruzamiento (agente bifuncional)
Factores de rendimiento
SelectividadCaracterística más importanteDiscriminación entre sustratosFunción del componente biológico
SensibilidadNormalmente rango sub-milimolar
(10-3 M)Casos especiales fentomoles (10-15
M)
PrecisiónAlrededor de ± 5 %
Factores de rendimiento
Naturaleza de la soluciónpHTemperaturaFuerza iónica
TiempoTiempo de respuesta más largo que
sensores químicos (30 seg)Tiempo de recuperación (pocos
minutos)Vida útil por inestabilidad del
material biológico (días a meses)
BIOSENSORES• Utilizan la especificidad de los procesos biológicos:
– Enzimas x Sustratos– Anticuerpos x Antígenos– Lectinas x Carbohidratos– Complementariedad de ácidos nucleicos.
• Ventajas:– Reutilización– Menor manipulación– Menor tiempo de ensayo– Repetitividad
• Tipos y usos mas comercializados:1. Tiras colorimétricas2. Electroquímicos:
• Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol, Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos,
Colesterol• Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol
3. Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.
Propiedades de un buen Biosensor
BIOSENSORES1. Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas.2. Consultas y Urgencias Hospitalarias:
– Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales– Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento– Menor riesgo de deterioro de la muestra
3. Diagnóstico Doméstico:• Ensayos de Embarazos• Control de Glucosa en diabéticos
4. Aplicaciones in vivo:– Páncreas artificial– Corrección de niveles de metabolitos– Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad
5. Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales:– Alimentación– Cosmética– Control de Fermentaciones – Controles de Calidad– Detección de Explosivos– Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas– Control de polución.
TIPOS DE BIOSENSORES1. BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS
– Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox
– Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones
– Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones
2. BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS
3. BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS
4. BIOSENSORES ÓPTICOS
– De onda envanescente
– Resonancia de plasma superficial
5. BIOSENSORES CELULARES
6. INMUNOSENSORES
UNIDADES FUNCIONALESDE UN BIOSENSOR
Electrodo dereferencia
4.328
S
P
Transductor AmplificadorReactor
Electrodo dereferencia
4.328
S
P
Transductor AmplificadorReactor
Material biológico + Analito Analito unido
(Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito)
(Constante de semisaturación) + (Concentración del analito)
Respuesta electrónica =
Respuesta biológica
Respuesta Electrónica
Cinéticas de reacción en biosensores
Biosensores Electroquímicos Amperométricos
electrodo de oxígeno
Biosensores Electroquímicos Amperométricos
electrodo de oxígenoReacciones redox catalizadas por
enzimas
Voltaje constante entre dos electrodos
Corriente debida a la reacción de los electrodos
Electrodo de Oxígeno
En este principio se basa el primer y más sencillo biosensor
Determinación de glucosa
Electrodo de oxígeno de Clark
Electrodo de Oxígeno
(A) Disco de resina epoxy(B) Cátodo de platino en el centro de un saliente. (C) Ánodo de plata en forma circular(D) Anillo de goma que sostiene un papel espaciador empapado en un electrolito y una membrana de polytetrafluoroethylene que separa los electrodos de la mezcla de reacción.
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
Glucosa + O2 -gluconolactona + H2O2
CH2OH
HH
H
H OH
OH
OH
O
OH
H
CH2OH
HH
H
H OH
OH
OH
O
O
H2O2
O2
GlucosaOxidasa
La glucosa se determina por la disminución de la concentración de oxígeno molecular disuelto cuando la glucosa oxidasa cataliza la reacción redox
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
Entre el cátodo central de platino y el ánodo circundante de plata se aplica un potencial de 0.6 voltios.
El circuito se cierra con solución saturada de KCl.
El oxígeno molecular disuelto se reduce en el cátodo de platino.
Se liberan electrones y se produce corriente eléctrica que se puede medir.
Cátodo (Pt)
Anodo (Ag)
Puente de KCl
O2 + 2H2O + 2e- H2O2 + 2OH-
2H2O2 + 2e- 2OH-
4Ag 4Ag+ + 4e-
4Ag+ + 4Cl- 4AgCl
4e-
- +
Electrodo de oxígeno
0,6-0,7v
Glucosa-oxidasaInvertasa
Ele
ctro
do
Glucosa
D-gluconolactonaH2O2
Sacarosa
FructosaGlucosa
O2
glucosa
sacarosa
tiempo
respuesta
fluj
o
DETERMINACIÓN DE SACAROSA
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de reacciones de degradación progresiva:
ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico
(HxR + Hx ) x 100
ATP + ADP + AMP + IMP + HxR + HxK =
La acumulación de inosina e hipoxantina respecto de los nucleótidos es un indicador del tiempo que hace que el pez murió y de sus condiciones de
conservación, por tanto, de su frescura.
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
BIOSENSOR: xantina-oxidasa y nucleósido-fosforilasa inmovilizadas sobre una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de oxígeno
HxR + P Hx + Ribosa P
Hx + O2 Xantina + H2O2
Xantina + O2 Acido úrico + H2O2
nucleósidofosforilasa
Xantinaoxidasa
Xantinaoxidasa
K < 20 El pescado puede ser comido crudo20 > K < 40 El pescado debe ser cocinadoK > 40 Pescado no apto para el consumo
Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa
DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO
ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico
(HxR + Hx ) x 100
ATP + ADP + AMP + IMP + HxR + HxK =
Ensayo simple para determinar de forma segura y fiable la frescura del pescado, que tiene gran importancia para la industria.La determinación de frescura en las inspecciones sería completamente subjetiva.
Biosensores Electroquímicos Amperométricos
Ventaja:Fáciles de fabricar.
Desventajas:Reacción dependiente de concentración de
oxígeno. Ambientes anaerobios.
Otros procesos redox. Oxidación/reducción de vitamina C. Interferencia.
Sustitución del oxígeno por otras sustancias.
sustrato+
enzima (oxidada)
producto+
enzima (reducida)
reacción enzimática
enzima (reducida)+
mediador (oxidado)
enzima (oxidada)+
mediador (reducido)
reacción enzimática
mediador (reducido)mediador (oxidado)
+e-
reacción electrodo
La reacción mediada por el biosensor está compuesta por
tres procesos redox
Mecanismos redox para diferentes configuraciones de biosensores amperométricos
Oxidasas más especfíicas para el reactivo a oxidar
Rápidas velocidades de transferencia de electrones
Capacidad para ser regenerados fácilmente
Retenibles en membrana biocatalítica
No reaccionar con otras moléculas, incluyendo oxígeno molecular
Mediadores redox en
biosensores amperométrico
s
Mediadores redox en
biosensores amperométrico
s
Tetracianoquinodimetano aceptor parcial de electrones
Ferroceno, tetratiofulvaleno y N-metil fenazinio donantes parciales de electrones
Hidroquinona y ferrocianuro mediadores solubles
Biosensor que detecta concentración de glucosa en sangre.
Construido y vendido para el control de los enfermos diabéticos.
Área de detección dispositivo con electrodo de un solo uso
Deposición sobre una tira de plástico. Consta de electrodo de referencia Ag/AgCl y electrodo de carbono con glucosa oxidasa y mediador de ferroceno
Ambos electrodos cubiertos con tejido hidrofílico. Paso de moléculas de diferente tamaño, difusión homogenea, evita evaporación desigual
Duración 6 meses
Detección 2-25 mM en una gota de sangre
Resultado en 30 segundos
Miniaturización
Posible por la capacidad del pirrol para polimerizar mediante oxidaciones electroquímicas en condiciones suficientemente suaves como para atrapar enzimas y mediadores sin desnaturalizarlos
Microelectrodo glucosa/lactatoSe puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de microfabricación de microprocesadores, e incluso disponiendo varios sensores en los mismos
Biosensores Electroquímicos
PotenciométricosDeterminan cambios en la
concentración de iones concretos
Biosensores Electroquímicos
PotenciométricosUsan electrodos selectivos para
ciertos iones
Electrodos ion-selectivos. pHmetro
Baratos
Determinación de varios analitos
Mayor velocidad
Muy poca muestra
Necesidad de compensación de la temperatura
Biosensores Potenciométricos
Biosensor Potenciométrico
Detectan cambios en conductividad eléctrica causados por alteraciones
en la concentración de iones
Biosensores Electroquímicos
Conductimétricos
Biosensores Electroquímicos
Conductimétricos
En muchos procesos biológicos se producen cambios en concentraciones iónicas
Estos cambios pueden ser usados por biosensores que detecten cambios en la conductividad eléctrica
Sensor de Urea
NH2CONH2 +3H2O
2HN 4 + + HCO3- + OH-
Ureasa
Ureasa inmovilizada
Cirugía renal y diálisis
Reacción provoca gran cambio en concentración iónica
Sensor de Urea
Un campo alternante entre dos electrodos permite la determinación de los cambios en conductividad, evitando procesos electroquímicos no deseados
Electrodos dispuestos para ocupar mínimo espacio
0.1 y 10 mM de urea
Sensor de Urea
NH2CONH2 +3H2O
2HN 4 + + HCO3- + OH-
Ureasa
Otros ejemplos:amidasas,decarboxilasas,esterasas,fosfatasas ynucleasas.
Biosensores Termométricos
“Sensores bioquímicos y TELISA”
La producción de calor es una propiedad general de muchas reacciones enzimáticasBase de los biosensores calorimétricos o
térmicos
Biosensor termométrico
Biosensor termométricoLos cambios ambientales no afectan a los cambios de temperatura detectados
Reacción confinada en dispositivos termoaislados (a) Precisa un aislamiento correcto
La corriente del analito pasa a través de un intercambiador de calor (b)
Biosensor termométricoLa reacción tiene lugar en un pequeño reactor (c)
La diferencia en temperatura del analito que entra y el producto que sale es determinada por los termistores interconectados (d)
Diferencia habitual de una fracción de grado centígrado
Diferencias de hasta 0.0001ºC
Reacciones usadas en biosensores termométricos
Biosensores Termométricos
Poco éxito comercial en comparación con otros biosensores
Ventajas:
Se puede acoplar fácilmente varias reacciones en un único reactor
Producir reacciones que actúan sobre los productos de la reacción principal
Coinmovilizando otras enzimas
Introduciendo más reactivos en la corriente a analizar
Biosensores Termométricos
Detector de Lactato
La sensibilidad a lactato se incrementa por coinmovilización de lactato deshidrogenasa con lactato oxidasa
Reciclaje de productos de la primera reacción del sustrato
lactato oxidasalactato + O2 -----------------------> piruvato + H2O
lactato deshidrogenasapiruvato + NADH + H+ --------------------------> lactato + NAD+
Biosensores Termométricos
Más ventajas:
Puede utilizarse células viables
Uso de células viables inmovilizadas en un reactor, no sólo para producir bioconversiones, sino para controlar la presencia de un sustrato metabolizable en la corriente a analizar
Análisis de la presencia de materiales tóxicos en una muestra, ya que afecta la tasa metabólica de las células inmovilizadas sobre un determinado sustrato
Biosensores Termométricos
Más ventajas:
Puede acoplarse a un inmunoensayo enzimático
ELISA termométrico o TELISA
Mezcla antígeno no marcado (analito) y antígeno marcado enzimáticamente en concentraciones conocidas junto con un reactor en el que se ha depositado una capa de inmunoadsorbente
Aumento en cantidad de antígeno no marcado desplaza al antígeno marcado de la unión a la capa del reactor por competición
La cantidad de antígeno marcado que queda en el reactor se puede determinar por adición a la corriente que pasa por él del sustrato de la enzima que marca el antígeno y midiendo la cantidad de calor en la reacción enzimática
Biosensores Piezoeléctricos
“Narices bioelectrónicas”
Biosensor de fibra óptica para lactato
•Detecta cambios en la en la concentración de oxígeno determinando la reducción de la fluorescencia de un fluorocromo (quenching)
Biosensor de célula óptica para albúmina sérica
•Detecta la absorción de luz a 630 nm que pasa a través de la célula detectora.
•Se evalúa el cambio de amarillo a azul verdoso del verde de bromocresol cuando se une a la albúmina sérica a pH 3.8
•Respuesta lineal a la albúmina en un intervalo de 5 a 35 mg/cm3
Biosensores Ópticos
1) Detección de Vapores:• Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de
alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y 2,6-diclorindofenol sólidos dispersados sobre placas de TLC (cromatografía en capa fina) de celulosa microcristalina transparente.
2) Tiras colorimétricas de un solo uso:• Los más utilizados: análisis de sangre y orina.• Control de la glucemia en diabéticos
- Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un cromógeno que cambia el color al ser oxidado
Cromógeno (2H) + H2O2----(peroxidasa)--->colorante + 2H2O
Biosensores Ópticos
3) Reacciones luminiscentes:• Utilización de luciferasa• Detecta la presencia de microorganismos en orina al
liberar ATP en su destrucción
Luciferina + ATP----(luciferasa)---> oxiluciferina + CO2 + AMP + ppi + luz
Biosensores Ópticos
Onda evanescente
• Se basa en un fenómeno conocido como reflexión interna total de fluorescencia, que consiste en la absorción y emisión de fotones.
Biosensores Ópticos
Onda evanescente• En este sensor una radiación que viaja a
través de una guía de ondas por reflexión interna total crea un campo electromagnético denominado campo evanescente, que puede penetrar una determinada distancia desde la superficie dependiendo del ángulo de incidencia en la interfase y la longitud de onda de la radiación de excitación.
Biosensores Ópticos
Onda evanescente• Cualquier interacción molecular que
se produzca en este campo (como la unión de un analito a un receptor inmovilizado en la superficie de la guía de ondas) produce cambios en las características de la luz que se propaga por la guía de ondas que pueden medirse y relacionarse con la concentración de analito.
Biosensores Ópticos
Onda evanescente
• Es necesario utilizar marcaje con moléculas con propiedades fluorescentes.
• Permite una detección directa, rápida y selectiva del analito.
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“Un haz de luz será reflejado en su totalidad cuando incida sobre una superficie transparente presente entre dos medios, cuando proceda del medio con mayor índice de refracción y cuando el ángulo de incidencia sea mayor que un valor critico”
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“En el punto donde se produce la reflexión, se induce un campo electromagnético que penetra en el medio que tiene menor índice de refracción”“Este campo es denominado onda evanescente y decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros”
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“La onda evanescente decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros” “La profundidad a la que penetra depende del índice de refracción, de la longitud de onda de la luz utilizada y puede ser controlada con el ángulo de incidencia.
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“La onda evanescente puede interaccionar a su vez con el medio, provocando un campo electromagnético que puede volver al medio con mayor índice de refracción, dando lugar a cambios en la luz que continúa a lo largo de la guía de ondas.”
Inmunosensor de onda evanescente
Especialmente indicados para inmunoensayos:
•No es necesario separar el resto de los componentes de una muestra clínica
•La onda solo penetra hasta el complejo antígeno anticuerpo
•Se excitan fluorocromos unidos a la superficie mediante la onda evanescente, y la luz emitida por ellos volverá a la fibra óptica
•La cantidad de muestra necesaria es mínima
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales
• Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de conducción de un metal.
• La resonancia de plasmones superficiales es un fenómeno óptico que ocurre cuando una luz polarizada se dirige desde una capa de mayor índice de refracción (un prisma) hacia una de menor índice de refracción, que en este caso es una capa metálica, de oro o de plata, que se sitúa entre el prisma y la muestra.
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales
• La luz que incide en la interfase entre el metal y el prisma provoca la excitación de un plasmón superficial para un determinado ángulo de incidencia de dicha luz, llamado ángulo de resonancia.
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales
• El ángulo de resonancia depende fuertemente del índice de refracción del medio colindante a la lámina metálica, por lo que las variaciones que se produzcan en el mismo van a ser detectadas como cambios del ángulo de resonancia y este cambio es proporcional a la concentración.
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales
• La unión de los analitos al elemento de reconocimiento supone un cambio de índice de refracción sobre la superficie del metal y, como consecuencia, un desplazamiento del ángulo de resonancia.
Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones
superficiales
• Esto permite realizar medidas directas en tiempo real, sin marcaje, así como el análisis de muestras complejas sin purificación previa.
Resonancia de plasma superficial
“Si la superficie del cristal está recubierta por una capa metálica (oro, plata, paladio) los electrones de su superficie pueden oscilar en resonancia con los fotones generando un onda de plasma superficial y amplificando el campo evanescente en la cara mas alejada del metal”
Resonancia de plasma superficial
“Si la capa de metal es lo suficientemente delgada como para permitir al campo evanescente penetrar hasta la superficie opuesta, el efecto será muy dependiente del medio adyacente al metal”
Resonancia de plasma superficial
“Este fenómeno sucede sólo cuando la luz incide con un ángulo específico, el cual depende de la frecuencia, el grosor de la capa metálica y el índice de refracción del medio que se encuentra inmediatamente sobre la superficie metálica”
Resonancia de plasma superficial
“La producción de esta resonancia de plasma superficial absorbe parte de la energía de la luz reduciendo la intensidad de la luz reflejada internamente”
Resonancia de plasma superficial
“Los cambios que suceden en el medio provocados por interacciones biológicas pueden ser apreciados detectando los cambios de intensidad de la luz reflejada o el ángulo de resonancia”
Cambio en la absorción por efecto de la resonancia de plasma superficial
“Detección de la gonadotropina coriónica humana (hCG) mediante un anticuerpo unido a la superficie del biosensor: La unión causa un cambio en el ángulo de resonancia”
Resonancia de plasma superficial
•Permiten detectar partes por millón•Un análisis típico requiere 50µl de muestra y tarda 5 a 10 minutos•Puede utilizarse con DNA y RNA.
Biosensores celulares
• Las células microbianas, como biocatalizadores, poseen ciertas ventajas sobre las enzimas purificadas cuando se usan en biosensores:
• Baratos
• Vida media más larga
• Menos sensibles a inhibición, al pH y a temperatura
• Capacidad autorregenerativa
Biosensores celulares
• Desventajas:
• Más lentos en respuesta
• Más lentos en velocidad de recuperación
• Menor selectividad
• Fácilmente disgregables
• Condiciones más suaves
Biosensores celulares
•Muy útiles cuando se requieren varios pasos o la presencia de coenzimas
•Células vivas o muertas
Biosensores celulares
Inmunosensores
Tipos de inmunosensores
Nanobiosensores en el Campo de la Medicina
Nanobiosensores en urgencias
Nanobiosensores en la consulta
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