Tema 7: Reacciones enzimáticas multisustrato.
Nomenclatura y clasificación de mecanismos de reacción. Derivación de
la ecuación de velocidad para reacciones bisustrato.
1. Introducción. En la cinética enzimática estudiada hasta ahora hemos considerado la reacción S↔P en la que
se ha considerado solamente sustrato y un producto de la reacción, excepto la reacción
catalizada por las proteasas. Sin embargo en el conjunto de las reacciones enzimáticas este es
más bien un caso excepcional, restringido a las reacciones de isomerización. Las reacciones
más generalizadas suponen la presencia de dos o más sustratos que reaccionan para dar dos o
más productos de reacción.
En el caso de las oxidorreductasas catalizan reacciones bisustrato aunque algunas veces
podemos ver que hay tres sustratos y tres productos, por lo que en este caso sería trisustrato.
Esto ocurre porque también intervienen en la reacción los protones, solo que este sustrato se
suele despreciar porque se suele trabajar en un ambiente tampón, en el que H+ se mantiene
constante.
Otras enzimas como las transferasas e hidrolasas también son bisustrato, en éstas últimas uno
de ellos es el agua. Las liasas son de orden superior a dos pues en ella intervienen más de dos
sustratos. Por último, el grupo de las ligasas catalizan reacciones multisustrato.
Para estudiar más a fondo todas estas reacciones multisustrato se establecen distintos tipos
atendiendo al orden en el que entren estos al centro activo y a la existencia o no de formas
modificados del enzima.
El estudio cinético de este tipo de reacciones se lleva a cabo partiendo de una familia de
rectas, cada una de ellas con uno de los sustratos actuando como variable independiente y el
otro como constante. Para simplificar este estudio en las reacciones bisustrato se puede llevar
a cabo una aproximación al modelo de las reacciones monosustrato en algunos casos como
por ejemplo en las reacciones catalizadas por las hidrolasas. Esta aproximación se lleva a cabo
haciendo que uno de los sustratos este a concentración variable y otro de ellos a
concentración saturante y fija y que por tanto todo el enzima este unido a ese sustrato. De
este modo se harían dos estudios uno con concentración saturante de A y otro con
concentración saturante de B.
Esta ecuación es similar a la de Michaelis-Menten pues estamos trabajando con enzimas
michaelianos.
2. Clasificación y nomenclatura de reacciones multisustrato.
Hay un sistema de nomenclatura validado por el SEBBM que determina lo siguiente para las
especies que participan en las reacciones multisustrato. Estas reacciones se clasifican
atendiendo al número de sustratos y productos.
Se utilizan los siguientes símbolos:
Para la nomneclatura general de las reacciones en sí e indicar cuantos sustratos y productos
participan en ellas se utilizan los prefijos latinos:
Un ejemplo de Ter Ter serían las reacciones catalizadas pro las ligasas sintetasas en las que
dos compuestos se unen a expensas de la hidrólisis de ATP u otros nucleótidos trifosfato.
Para las reacciones bisustrato a lo largo de la historia se han propuesto varios sistemas de
representación de los mecanismos de estas reacciones pero el que más éxito ha tenido ha sido
el mecanismo de Cleland. Este mecanismo hace alusión al orden en el que entran los sustratos
y en el que salen los productos y a las formas enzimáticas que se forman durante el curso de la
reacción.
De acuerdo con la simbología de Cleland, la reacción se simboliza por una línea horizontal en la
que se representan mediantes flechas verticales la entrada de sustratos y salida de productos.
3. Mecanismos generales: Tipos de reacciones multisustrato.
Atendiendo a la entrada de sustratos y a la salida de productos, a la formación o no del
complejo ternario EAB y a la aparición de especies modificadas del enzima podemos
determinar los siguientes tipos de reacciones multisustrato:
Modelo secuencial o de desplazamiento simple: Se forma el complejo ternario EAB,
este a su vez puede ser:
Ordenado: La entrada de los sustratos y luego la salida de los productos se
realiza en un orden determinado. De forma que el segundo sustrato solo se
unirá al enzima si el primero está presente en el centro activo.
Al azar: Ambos sustratos pueden incorporarse al enzima independientemente
sin seguir un orden establecido, es decir, el mecanismo de la reacción no
distingue si se forma [EAB] o [EBA].
El modelo al azar sería muy similar al ordenado y solo se diferencian en el tipo de
inhibición que ejercen los productos sobre las reacciones de los sustratos.
En ambos casos el complejo ternario EAB se forma antes de liberar los productos. Sin embargo
algunas veces no se forma este complejo en las reacciones bi-bi secuencial ordenado. Este
mecanismo se conoce con el nombre de Mecanismo de Theorell-Chance y para el no existe ni
el complejo EAB ni el EPQ porque este se encuentra durante muy poco tiempo por lo que en el
momento que entra el sustrato se libera seguidamente el producto. Un ejemplo de este tipo
sería la reacción catalizada por la alcohol deshidrogenasa.
Modelo ping-pong o de doble desplazamiento: En este caso la entrada del primer sustrato
modifica el enzima formando un enzima modificado antes de la salida de los productos de
la reacción. La entrada de un segundo sustrato completa la reacción recuperándose la
enzima libre, es decir, ocurre una alternancia de entrada y salida de los sustratos y
productos de la reacción.
Un ejemplo de modelo de ping pong sería la reacción catalizada por la alanina
transaminasa. Esta transaminasa tiene como “cofactor” el PLP o piridoxal fosfato que
aparece en la forma intermediaria o de transición del enzima.
Entre las reacciones más complejas podemos encontrar por ejemplo la reacción
multisustrato tri-tri o ter-ter ping pong (Uni-uni-uni-uni-uni-uni Ping-Pong o Heza-uni Ping
Pong) sería la catalizada por la succinato tioquinasa. (EC 6.2.1.4).
Para todos los enzimas está totalmente establecido que tipo de reacción multisustrato
lleva a cabo como se indica en las diapositivas vistas en clase.
4. Estudios cinéticos y parámetros de las reacciones
multisustrato.
Obtención de datos experimentales.
El estudio cinético y la determinación de los parámetros cinéticos de las enzimas que catalizan
este tipo de reacciones se realiza a través de parámetros experimentales pero los
experimentos son algo más complicados que para enzimas monosustrato.
El procedimiento experimental para las reacciones bisustrato es utilizar combinaciones de
tubos con los sustratos A y B, con concentración fija de uno de ellos en primer lugar y luego del
otro.
Las columnas corresponden con la variación
de v con [A] variable y [B] fija. En las filas se
representa la variación de v con [B] variable
y [A] fija.
Los valores experimentales de estas velocidades iniciales se ajustan a la función doblemente
inversa como se observa en la gráfica de las diapositivas.
Aproximación al estado estacionario. Velocidades iniciales e
unidireccionales. Desplazamiento simple.
En estas reacciones intervienen los siguientes parámetros cinéticos:
y : valores máximos de velocidad y
(ambas obtenidas cuando las
concentraciones de A y B son saturantes).
y
: constante de equilibrio de
disociación de EA y EQ.
( y )
,
, y
( , , y ):constantes de Michaelis para A, B, P, Q… con la
misma definición, concentración de sustrato necesaria para que se alcance la mitad de
la velocidad máxima (1/2 Vmax).
Como existen varias Km se indica de la siguiente manera:
KmB(A) = KmA en el equilibro para concentración saturante de B.
Las reacciones bisustrato siguen, al igual que las monosustrato, una misma ley de velocidad
inicial. En ellas se dan condiciones de estado estacionario lo que corresponde a una situación
de velocidad inicial y unidireccional siguiendo las siguientes ecuaciones, una de ellas para los
sustratos (v1) y otra ecuación para los productos (v2).
Si en la siguiente ecuación llevamos a cabo el procedimiento aplicado en las diapositivas y
tenemos en cuenta que tanto la concentración de A como la de B tienden al infinito, ésta se
simplificaría y quedaría de la siguiente forma, pareciéndose mucho a la ecuación de Michaelis-
Menten:
Lo mismo se haría para ,
y .
Aplicando la nomenclatura de Cleland para la denominación de los distintos parámetros
cinéticos, las ecuaciones de velocidad anteriores se escribirían:
Esta ecuación se obtendría con el método de King-Altman que se desarrollará en otra parte del
tema pero su representación gráfica sería la siguiente:
El valor de las constantes del cuadrado se puede despreciar para deducir la ecuación de
velocidad general ya que se establecen equilibrios rápidos entre E y EA por un lado y E y EB por
otro, por lo que se puede deducir que la constante de equilibrio de disociación del complejo
EAB sería la Kcat que determina toda la reacción pues es el paso más lento y limitante de esta.
Por tanto la ecuación de velocidad general quedaría como:
Pero la concentración de esta especie enzimática no la podemos determinar
experimentalmente por lo que lo de tenemos que dejar en función de otras especies
enzimáticas de las que si podamos determinar su concentración.
V=Kcat[EAB] = f ([Eo], [E], [A],etc)
Determinación de parámetros cinéticos.
Para obtención de los parámetros cinéticos se utiliza la ecuación de Lineweaver-Burk (Ecuación
de inversos).
El paso siguiente corresponde a la consideración de la [A] fijo o [B] fijo, quedando las
siguientes ecuaciones:
o
Si tomamos como ejemplo la primera ecuación en la que las distintas [B] sean fijas,
obtendremos una familia de rectas en la representación primaria, en la que representamos el
inverso de la velocidad frente al inverso de la [A]. Obtendremos la siguiente gráfica de la que
se pueden deducir el valor de la pendiente y del punto de intersección con el eje de abcisas.
A continuación se llevaran a cabo las distintas representaciones secundarias donde cada recta
tendrá un valor de la pendiente y del punto de intersección dependiendo de la concentración
de [B] fija. Estas representaciones nos permitirán obtener los diferentes parámetros cinéticos
(Km y Vmax).
Las representaciones secundarias corresponden a la representación de las rectas de los valores
de la pendiente y de intersección con el eje y de la
representación primaria.
Primero se mostrará la representación para la
ordenada en el origen.
Esta recta a su vez tiene una pendiente, un punto de
intersección con el eje y otro con el eje x. Del punto
de intersección con el eje y se puede obtener la
velocidad máxima y del punto de corte con el eje x la
Km.
Como el valor de y para el punto de corte con el eje x vale 0, se simplifica la ecuación
quedando de la siguiente manera:
El siguiente paso es la representación de la ecuación de la pendiente.
En este caso, como ya tenemos el valor de la Km(B) calculada a partir de la ecuación del punto
de intersección y la velocidad máxima, podemos hallar la Km(A). Con el valor de la pendiente
calculamos por último el valor de la Ks(A).
Otra forma de deducir el último parámetro (Ks(A)) sería mediante la representación primaria, a
través del punto de corte de las distintas rectas, como se puede apreciar en el gráfico que
aparece en la parte correspondiente a esta representación.
Aproximación al estado estacionario. Velocidades iniciales e
unidireccionales. Doble Desplazamiento.
El mecanismo de doble desplazamiento conocido como Ping-Pong obedece a una forma
simplificada de la ley general de velocidad inicial ya que carece del término independe de
concentraciones del denominador. Obteniéndose las siguientes ecuaciones:
Esto lo que permite es diferenciar gráficamente ambos mecanismos en base a sus
representaciones primarias, ya que dichos mecanismos se distinguen de los secuenciales
porque en dichas representaciones son haces de rectas paralelas. Esto se consigue gracias a la
aplicación de la ecuación de Lineweaver-burk como se ve en la siguiente gráfica.
Igual que en el mecanismo secuencial se obtienen dos ecuaciones, una de ellas para la
pendiente y otra para la intersección con el eje y que se utilizaran para obtener los parámetros
cinéticos en la representación secundaria.
Estas ecuaciones serían:
La representación secundaria sería una sola debido a lo citado anteriormente de que este
mecanismo sigue un modelo simplificado:
Del punto de intersección se obtiene el valor de la velocidad máxima que se utilizará tanto
para obtener la Km(B) en la ecuación de la pendiente de la representación secundaria como la
Km(A) en la ecuación de la pendiente de la representación primaria. El valor de Km(B) se puede
obtener tanto con el valor de la velocidad máxima como con el punto de corte con el eje x.
Todo este procedimiento tanto para el mecanismo secuencial como para el mecanismo Ping-
Pong, se ha llevado a cabo considerando la concentración de B fija por lo que habría que
repetir el mismo procedimiento considerando fija la concentración de A, obteniendo los
correspondientes parámetros cinéticos.
Inhibición por productos.
El tipo de inhibición de los productos P y Q sobre los sustratos A y B permite diferenciar si un
tipo de mecanismo secuencial es ordenado o al azar como se puede ver en la siguiente tabla:
Los mecanismos cinéticos, aunque a veces son tediosos por el número de datos a manejar,
pueden ayudarnos a comprender propiedades locales de los enzimas. Estas propiedades son
necesarias para entender la responsabilidad de la regulación en un enzima en una
determinada vía metabólica. En la siguiente tabla se resumen los mecanismos conocidos para
algunos enzimas.
Bibliografía:
NUÑEZ DE CASTRO I. Enzimología. Ediciones Pirámide, Madrid, 2001.
SEGEL I.H. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State
Enzyme Systems. Wiley-Interscience, New York, 1993.
JESÚS V. JORRÍN NOVO. Reacciones enzimáticas multisustrato. Nomenclatura y clasificación de
mecanismos de reacción. Derivación de la ecuación de velocidad para reacciones bisustrato.
Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola. Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular. Universidad de Córdoba.
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