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TEMA 8.- TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA.
1.-Tecnología del DNA recombinante
2.- Herramientas básicas necesarias para el conocimiento y modificación del DNA
3.- Marcadores moleculares aplicados a la identificación genética
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE1973 - Berg, Boyer y Cohen – Primeros experimentos de DNA recombinantecon los que introducen Genes en E.coli
Unión artificial de DNA de distintos orígenes
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Utilizacion: Clonación de genes es decir obtener copias del mismo
PRIMER PASOPRIMER PASO: cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a utilizar con enzimas de restricciónGEN PLÁSMIDO
SEGUNDO PASO: LIGACISEGUNDO PASO: LIGACIÓÓN. N. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el vector y el fragmento de DNA
+ MOLÉCULA DE DNARECOMBINANTE
TERCER PASO: TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias
(otro tipo de vector)
Procariotas: transformación, conjugación
Eucariotas: Electroporacion microinyección, vectores virales, proyectiles de DNA
HERRAMIENTAS BHERRAMIENTAS BÁÁSICAS NECESARIAS PARA EL SICAS NECESARIAS PARA EL CONOCIMIENTO Y MODIFICACICONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓÓN DEL DNAN DEL DNA
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
VECTORES DE CLONACIÓN
GENOTECAS
IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS
PCR
MARCADORES MOLECULARES
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN…FINALES DE LOS 60
¿Cómo era posible que algunas bacterias resistiesen la invasión de ciertos virus?
El DNA del virus se introduce en la bacteria, donde se corta en pequeños fragmentos inactivándose
Demostraron que las bacterias sintetizaban endonucleasasque cortaban el ADN en una secuencia corta y específica
- Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural
- Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena
- Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8
- Reconocen secuencias palindrómicas y el corte es simetrico
Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilusinfluenzae
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
AAGCTTTTCGAA
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PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS:
EXTREMOS COHESIVOS
EXTREMOS ROMOS
ALGUNOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE LOS MILES (>3000) QUE SE HAN AISLADO..
Extremos romos
NOMENCLATURA: 1 letra del Genero, 2 letras de la especie, 1 letra de la cepa (Opcional) y 1 numero romano ( si existen mas de una)
ALU I – primera enzima de restricción de Arthrobacter Luteus
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VECTORES DE CLONACIÓN
Características generales:
- Replicación autónoma- Mapa de restricción conocido: un único punto de corte- Tengan marcadores selectivos:
- resistencia a antibióticos- cambios de color
- De fácil recuperación
TIPOS:- Plásmidos- Fago λ- Cósmidos- YACs- BACs
PLÁSMIDOS
-ADN doble y circular -Replicación autónoma; información no vital-Pueden conferir resistencia a antibioticos-Posibilidad de integración en cromosoma
principal bacteriano → EPISOMA-Tamaño variable: 1 a 500Kb
FAGO λ
DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb
infecta E. coli
extremos cohesivos (COS): extremos 5’ monocatenarios (12 nucleótidos de secuenciacomplemenaria)
EXTREMOS COSClonación de fragmentos de
hasta 25 kb
Clonación de fragmentos de
hasta 10 kb
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Clonación de fragmentos de hasta 300 kb
BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)
YACs (Yeast Artificial Chromosomes)
Clonación de fragmentos de hasta 1000 kb
Cósmidos
Vectores híbridos Fago λ + plásmidoClonación de fragmentos de
hasta 45 kb
CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS
- Clonación de todas las secuencias del genoma de una especie
- Presente al menos una copia de cada gen o fragmento de DNA
- Numero de clones necesarios depende de- Tamaño del inserto- Tamaño del genoma
Fórmula de Clarke y Carbon N= ln (1 - p)
ln (1 - f )
N= nº de clones necesariosP= probabilidad de tener el genoma completoF= tamaño medio del inserto/ tamaño genoma
Ejemplo -E.coli-Tamaño: 4.300 KbP= 0,95
1300 plásmidos300 cósmidos130 BACs12 YACs
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IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS
PARA PODER IDENTIFICAR, AISLAR Y TRABAJAR CON LAS SECUENCIAS CLONADAS…TODOS LOS MÉTODOS SE BASAN EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS
SONDA: Fragmento de DNA de secuencia conocida que hibridará por complementariedad
TRANSFERENCIA del ácido nucleico a una membrana o soporte físico (“blotting”)
+HIBRIDACIÓN CON UNA SONDA
OTROS TIPOS DE HIBRIDACIÓN PARA AISLAMIENTO DE SECUENCIAS
NORTHERN BLOTTING Similar a Southern blot pero para identificación de secuencias de RNA
SLOT/DOT BLOTTING. No se realiza electroforesis, simplemente se deposita y se transfiere a soporte sólido
HIBRIDACION IN SITU. Hibridación en preparaciones histológicas o células en cultivo
SOUTHERN BLOTTING Digestión del DNA con enzimas de restricción -Separación mediante electroforesis
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PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Técnica que nos permite amplificar o clonar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta
obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”
FOTOCOPIADORA MOLECULAR
HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA… existe otra forma de “clonación de DNA”
¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde
DNA Polimerasa
3’ 5’
dNTPs dTTPdATPdGTPdCTP
+ Mg ++
5’ 3’
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EXTENSION DEL CEBADOR
DNA Polimerasa
3’ 5’
DNA polimerasa
5’ 3’
Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar
REPETICIÓN “n” VECES DE UN CICLO CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS
DESNATURALIZACIÓN
HIBRIDACIÓN DE LOS CEBADORES
EXTENSIÓN
Ciclo
1
10
“n CICLOS”: ciclo 3
“n CICLOS”: ciclo 5
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Después de:- 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N.
La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo
anterior.
Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en rojo.
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MARCADORES MOLECULARES
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA
Test de paternidad
Autentificación de productos
TrazabilidadDiagnóstico de patologías
Patógenos
Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones.
•Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual.
• Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis.
•Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas.
¿CÓMO SE GENERA ESTA GRAN VARIACIÓN GENÉTICA?
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: Bases moleculares
Causar patologías Generar variabilidad
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• RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción
• Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases
• RAPDs : Random amplified polymorphic DNA
• SNPs: Single nucleotide polymorphisms
• …
Para su detección : amplificación por PCR
RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción
• Detectables por PCR
• Bialélicos
• Muy abundantes
• Ampliamente distribuidos por el genoma
• Codominancia
• Alta reproducibilidad
Origen: mutacionesdeleccionesinserccionesreordenaciones
CARACTERÍSTICAS
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CC TT CTAmpl.+
_
199 pb165 pb
34 pb
+
_
1 2 3 4 5 6 7 8
Ejemplo RFLP
Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb.
MICROSATÉLITES
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- Su polimorfismo radica en el número de repeticiones
- Altamente polimórficos ( nº medio de alelos 10)
- Se han encontrado en todas las especies conocidas
- Muy numerosos y bien distribuidos por el genoma
- Posibilidad de hacer multiplex : amplificar varios micros a la vez
MICROSATÉLITES - Características -
TGLA 122
TGLA 126
TGLA 227
TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10 SPS115
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RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA)
• Se utilizan primers diseñados al azar. • Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos)• No es necesario el conocimiento previo de la secuencia
Ventajas
El mayor inconveniente puede ser su baja reproducibilidad
SNPs (single nucleotide polymorphisms)
Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido.
A C CA AG
cerdo 1AA
cerdo 2TT
A C CT AG
cerdo 3AT
A C CA AG
A C CA AG
A C CT AG A C CT AG
C/C
C/T
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SNPs Características
• Variación muy frecuente (1 cada 1000bp)
• Dos posibles alternativas en cada individuo
• Herencia muy estable ( t. mutación 10-6)
• Fácil estandarización
• Posibilidad de automatización
MARCADORES GENÉTICOS APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN
Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, necesita reunir una serie de características:
• Que sea muy polimórfico, • Que esté distribuido por todo el genoma. • Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación• Que sea público .• Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva.• Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN.• Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios• Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes.• Que sea estable
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