I
ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN Raphanus sativus Y
CULTIVO IN VITRO DE LA HIERBA DEL SAPO
II
DEDICATORIAS
A mis padres Mayra y Juan por brindarme la confianza y el apoyo para continuar
con mi meta trazada, por estar siempre a mi lado, por las palabras de aliento en los
momentos más adversos y por ser los mejores padres.
A mi tío José Manuel por todo el apoyo que me ha brindado y saber darme consejos
cuando los he necesitado para poder continuar con mi meta, muchas gracias.
III
AGRADECIMIENTOS
Dr. en C. Hebert Jair Barrales Cureño le gradezco el apoyo incondicional, la
paciencia que me brindó, la enseñanza y sobre todo por el haberme aceptado como
su alumna para la realización de éste trabajo.
A la Universidad Politécnica del Valle de Toluca, mi casa de estudios por permitirme
llevar a cabo en las instalaciones la realización del presente proyecto.
A mi asesor el Dr. Salvador Chávez Salinas por la orientación para llevar a cabo
éste proyecto.
IV
ÍNDICE
ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN RAPHANUS SATIVUS Y CULTIVO IN
VITRO DE LA HIERBA DEL SAPO I
DEDICATORIAS II
AGRADECIMIENTOS III
ÍNDICE IV
RESUMEN 1
OBJETIVOS 4
CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ 5
PROBLEMAS RESUELTOS 7
ALCANCES Y LIMITACIONES 8
DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS 25
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 33
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34
1
RESUMEN
Dávila Becerril Jenny
ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN Raphanus sativus Y
CULTIVO in vitro DE LA HIERBA DEL SAPO
(Bajo la dirección del Dr. en C. Hebert Jair Barrales Cureño y el Dr. en C. Salvador
Chávez Salinas).
En el presente proyecto se llevó a cabo la extracción de alcaloides e isotiocianatos
del fruto de Raphanus sativus con solventes orgánicos (etanol, metanol y
cloroformo), los cuales se sometieron a vaporización. Los isotiocianatos son
compuestos que exhiben sus propiedades anticarcinogénicas. Los mecánicos de
efectos citotóxicos y citostáticos incluyen la inducción de apoptosis, inhibición de la
progresión del ciclo celular e inhibición de la anglogénesis y se encuentran entre los
agentes quimiopreventivos más efectivos conocidos. Los alcaloides incluyen
alrededor de 12000 compuestos, algunos de estos compuestos se emplean para el
tratamiento de la leucemia, como agentes antihipertensivos contra las arritmias
cardiacas y el mejoramiento de la circulación cerebral.
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INTRODUCCIÓN
El rábano (Raphanus sativus) es un vegetal crucífero al cual se le han atribuido un
gran número de propiedades terapéuticas y farmacológicas a través del uso de la
medicina herbolaria tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades en el
ser humano. La planta de R. sativus ha sido utilizado en la medicina tradicional para
el tratamiento de enfermedades del hígado, cálculos renales, cálculos vesiculares y
enfermedades respiratorias. La actividad antibiótica de sus extractos valida su
eficacia contra enfermedades microbianas.
Sus extractos se han usado contra enfermedades gastrointestinales, tratamientos
preventivos contra el colesterol y para bajar los niveles de lípidos en el organismo.
Se ha encontrado un efecto inhibitorio significativo con un extracto de hexano de R.
Sativus en líneas celulares de cáncer humano. (Sutan Beevi 2010).
Tomando en cuenta la alta presencia de sustancias bioactivas en R. sativus se llevó
a cabo la extracción de isotiocianatos y alcaloides a partir de éste fruto, por medio
de solventes orgánicos (metanol. etanol y cloroformo) mediante procesos
fitoquímicos.
La importancia de los isotiocianatos deriva en que son compuestos que exhiben sus
propiedades anticarcinogénica, induciendo la apoptosis de las células cancerígena,
así como en la inhibicion de la progresión del ciclo celular e inhibición de la
anglogénesis, Los alcaloides son uno de los grupos más diversos de metabolitos
secundarios, han sido aislados tradicionalmente de las plantas, de las cuales
alrededor del 20% los contienen. Una gran cantidad de alcaloides se han empleado
en la medicina y muchos de ellos son prominentes fármacos actualmente.
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JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO
Los compuestos extraídos fueron los isotiocianatos y alcaloides, a los cuales se les
atribuyen diversas actividades biológicas como antibióticas, antifúngicas,
hipotensivas, y antitumorales, principalmente.
El análisis y caracterización de estos compuestos permite ampliar la posibilidad de
desarrollar fármacos contra diversas enfermedades, así como sustentar de manera
científica las propiedades de los extractos usados en la medicina tradicional.
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OBJETIVOS
Objetivo General:
Analizar cualitativamente el contenido de alcaloides e isotiocianatos en Raphanus
sativus.
Objetivo específico:
Realizar un método fitoquímico respecto a la extracción de alcaloides e
isotiocianatos de los extractos de Raphanus sativus.
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CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ
El presente proyecto se llevó a cabo en el Laboratorio de Química de la Universidad
Politécnica del Valle de Toluca, ubicado en el municipio de Almoloya de Juárez en
el Estado de México.
Colecta de especies de Raphanus sativus
La colecta de las especies de Raphanus sativus se llevó a cabo en el municipio de
Jiquipilco, en el Estado de México en el estado maduro del fruto, las muestras se
extrajeron con palas, se lavaron, secaron, se identificaron con la fecha de colecta y
se almacenaron a 0° C para evitar alteraciones por microorganismos.(Kadder 993)
Preparación de los extractos
Se llevó a cabo la extracción clorofórmica, etanólica y metanólica de los alcaloides
e isotiocianatos de R. sativus mediante el siguiente proceso fitoquímico:
Extracción clorofórmica, etanólica y metanólica: Se utilizaron tres ejemplares de
rábano negro (Raphanus sativus L. var. niger).Se extrajo la corteza del fruto con
cortes semifinos. La corteza extraída se recolectó en un vaso de precipitados de
500 mL, previamente lavado y esterilizado. Se pesaron 30 matraces Erlenmeyer de
20 mL en una balanza analítica y se agregaron 2 g de corteza de R. sativus a cada
matraz. A 10 repeticiones se adicionaron 20 mL de cloroformo, a 10 se adicionaron
50 mL de etanol y a las 10 últimas repeticiones se adicionaron 20 mL de metanol,
los matraces se cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron.
Posteriormente, con un bisturí se realizaron cortes semifinos del fruto de R. sativus
6
en fragmentos de 0.5 cm y se colectaron en un vaso de precipitados de 50 mL,
posteriormente se pesaron 30 matraces Erlenmeyer de 20 mL y se agregaron 2 g
de las hojuelas del fruto. A 10 muestras adicionaron 20 mL de cloroformo, a 10 se
adicionaron 50 mL de etanol y a las 10 restantes se adicionaron 20 mL de metanol.
Finalmente se cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron.
Filtración y evaporación de extractos
Las muestras de R. sativus, que se obtuvieron mediante la extracción clorofórmica,
etanólica y metanólica, se filtraron por gravedad con un embudo cónico y papel filtro
para eliminar los sólidos. La suspensión de cada matraz se colectó en tubos de
ensayo de vidrio con tapa y se etiquetaron. Posteriormente, se tomaron 10 mL de
cada repetición de las muestras de fruto y de corteza de R. sativus con los distintos
solventes y se depositaron en matraces Erlenmeyer de 25 mL. Cada matraz se
colocó en una placa calefactora para evaporar totalmente el solvente. Finalmente
se adicionó 1 mL del solvente correspondiente a las muestras secas de fruto y de
corteza de R. sativus de cada matraz.
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PROBLEMAS RESUELTOS
Se obtuvieron los alcaloides y los isotiocianatos a partir de los tres distintos tipos de
extracciones.
Los resultados arrojaron que la extracción etanólica fue la más óptima debido a que
al momento de obtener los cristales se obtuvo mayor cantidad de los compuestos
alcaloidales e isotiocianatos.
También se obtuvo mayor presencia de vitamina C en el extracto etanólico de la
corteza de R. sativus debido a que hubo una mayor decoloración de la solución
indicadora en comparación con el extracto etanólico a partir del fruto de R. sativus.
A continuación se presentan los principales metabolitos secundarios presentes en
Raphanus sativus:
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ALCANCES Y LIMITACIONES
Obtención de alcaloides e isotiocianatos
Se obtuvieron los alcaloides y los isotiocianatos a partir del fruto de R. sativus
mediante de solventes orgánicos (cloroformo, metanol y etanol).
Los alcaloides son compuestos de carácter básico, su solubilidad varía en función
del pH, es decir según se encuentre en estado de base o de sal: En forma de base,
son solubles en solventes orgánicos no polares como éter etílico, cloroformo,
diclorometano, y acetato de etilo. En forma de sales son solubles en solventes
polares como agua, soluciones ácidas e hidroalcohólicas. (Arango 2008).
El fundamento de la extracción se basa en el carácter básico de los alcaloides y en
el hecho de su existencia en las plantas como sales ácidos orgánicos o como
combinaciones de otras sustancias.
Las técnicas de reconocimiento para los alcaloides son basadas en la capacidad
que tienen los alcaloides para combinarse con el yodo y metales pesados formando
precipitados.(Arango 2008).
En el presente proyecto se llevó a cabo la extracción con los tres solventes
orgánicos corroborando que son los más aptos para obtener los compuestos
alcaloidales y los isotiocianatos, obteniendo la mayor cantidad a partir de la
extracción etanólica. Respecto al cultivo in vitro de la hierba del sapo no se pudo
llevar a cabo, debido a que la especie no crecía en la temporada en la cual se llevó
a cabo la metodología de la experimentación.
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BASE TEORICO-PRÁCTICAS UTILIZADAS
Características botánicas de Rhapanus sativus
Esta planta pertenece a la familia de las crucíferas, la cual contiene varios vegetales
de importancia económica. Raphanus sativus L. var niger es procedente de Europa
y Asia. Crece en climas templados y a latitudes de entre 190 y 1240 m. La planta
mide entre 30 y 90 cm de alto y sus raíces son de gruesas y de distintos tamaños,
formas y colores. Los frutos son comestibles y presentan sabor picante y las raíces
del rábano tienen un característico color amarillo, que se genera durante el
almacenamiento.
Distribución geográfica
El origen de R. sativus no se conoce con exactitud, pero es usado el tratamiento
de varias enfermedades en varias regiones de Asia y África.
Figura 1. Origen geográfico de R. sativus.( O’Hare,T, 2010 )
10
Usos terapéuticos
La planta de R. sativus ha sido utilizado en la medicina tradicional desde hace
muchos años para el tratamiento de enfermedades del hígado, cálculos renales,
cálculos vesiculares y enfermedades respiratorias. La actividad antibiótica de sus
extractos valida su eficacia contra enfermedades microbianas.
Sus extractos también se han usado contra enfermedades gastrointestinales,
tratamientos preventivos contra el colesterol y para bajar los niveles de lípidos en el
organismo.
Diversos autores han encontrado lo siguiente: se ha encontrado un efecto inhibitorio
significativo con un extracto de hexano de R. Sativus en líneas celulares de cáncer
humano. SutanBeevi (2010). El extracto obtenido de R. sativus induce muerte
celular tanto en p53 competente y líneas de células deficientes de p53 mediante
inducción de la apoptosis. Los mecanismos moleculares de R. sativus que indujeron
apoptosis, pueden implicar las interacciones entre los genes de las familias Bcl2 y
regulación de genes anti apoptosis. El análisis del extracto de hexano reveló la
presencia de distintos isotiocianatos como 4-(metiltio)-3-butenilisotiociantato e
isotiocianato-4-pentenil. Sutan Beevi (2010).
El extracto etanólico de R. sativus es un inhibidor del crecimiento celular mediante
la modulación de genes relacionados con la apoptosis celular, de la expresión de
mRNA, así como de los genes ErbB(2) y ErbB(3) en el cáncer de mama. Jan
Muhammad (2012).
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El extracto etanólico de R. sativus disminuyó significativamente la proliferación
celular después de 48 h de incubación (P <0,05). La expresión de la proteína y
ARNm de ErbB y de ErbB se redujo significativamente de una manera dependiente
de la dosis. Jan Muhammad (2012).
Contacto alérgico
El isotiocianato de alilo, se identificó como una posible sustancia sensibilizante. En
algunos casos, puede producir dermatitis y contacto alérgico. Las hojas de esta
planta también contienen glucoparin que produce contacto alérgico.
El jugo crudo de los rábanos inhibió el crecimiento in vitro de Escherichia coli,
Pseudomonas pyocyaneus, Salmonella typhi y Bacillus subtilis. Esta planta común
puede ser una fuente importante de sustancias antimicrobianas. Los péptidos ricos
en cisteína (AFP1-Rs y Rs-AFP2) aislado de R. sativus mostraron gran actividad
antifúngica contra varias especies de hongos con concentración inhibitoria mínima
(CIM) de 30 – 60 μg/ml. Ambos Rs-AFPs están entre las más potentes proteínas
antifúngicas caracterizadas. Por otra parte, su actividad antibiótica muestra un alto
grado de especificidad para hongos filamentosos. La región activa de la proteína
antifúngica parece implicar β-líneas 2 y 3 en combinación con el lazo que conecta
esos filamentos. AFP1-RS y Rs-AFP2 son proteínas oligoméricas altamente básicas
compuestas por pequeñas (5-kDa) polipéptidos ricos en cisteína. Estas proteínas
se encuentran en la pared celular y ocurren predominante en las capas externa de
la célula recubren órganos diferentes semillas. Por otra parte, Rs-AFP preferencial
son liberadas durante la germinación de las semillas después de la interrupción de
12
la capa de semilla. Dos proteínas antifúngicas RAP-1 purificaron y RAP-2, aisladas
de semillas de R. sativus exhiben inhibición de actividades contra Candida albicans
y Saccharomyces cerevisiae. La proteína AFP1 aislada del rábano muestra
actividad antifúngica contra Fusarium culmorum.
El ácido cafeico muestra propiedades antifúngicas contra Helminthosporium
maydis. El ácido ferúlico es un antibacteriano activo contra Sytaphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Corynebacterium, difteria, Aspergillus niger y Candida albicans.
Estos ácidos muestran actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas
Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus y gram-negativos Escherichia coli y
Kliebsiella pneumoniae.
Los ácidos p-hidroxibenzoico (hidroxicinámico, p-hidroxibenzoico) muestran una
marcada actividad contra Bacterias Gram-positivas.
El rábano libera compuestos biocidos, principalmente isotiocianatos, producidos
durante la degradación enzimática de glucosinolatos presentes en la célula vegetal.
La mayor actividad fungicida depende de la concentración de isotiocianatos.
Actividad antitumoral
Una fracción neutral de extracto acuoso de rábano muestra inhibición in vitro de la
proliferación de las células de papovavirus SV40. El diaminotolueno (2, 4-D)
muestra mayor actividad citotóxica contra células HeLa.
13
Actividad antiviral
La pelargonidina y el ácido cafeico son virucidas para varios virus envueltos. Los
lipopolisacáridos muestran actividad antiherpético.
Inhibidores del crecimiento
Ácido 2-tioxotiazolidina-4-carboxílicos, es un inhibidor del crecimiento aislado de
extracto acetónico a partir de plántulas expuestas a la luz. Las giberelinas se
identificarón en los extractos de las semillas maduras de rábano.
Hipotensor
La sinapina es un compuesto hipotensor constituyente de la semilla de R. sativus.
Inhibidor de la agregación plaquetaria
El 6-metil-sulfinilhexil-isotiocianato (MS-ITC) se aisló del rábano como un potencial
inhibidor in vitro de la agregación de plaquetas humanas. Es un potencial inductor
de GST (glutación S-transferasa). En el mecanismo de MS el CCI, la molécula de
isotiocianato de MS-ITC desempeña un papel importante para las actividades
antiagregante plaquetarios y anticancerígenos debido a su alta reactividad con
sulfidrilo (-SH) grupos de biomoleculas (GSH, cisteína, residuo en una cierta
proteína).
Fitoalexinas
La inoculación de raíces con la bacteria Pseudomonas cichorii indujo la formación
de varios compuestos antifúngicos incluyendo brassinin, metoxibrassinin,
spirobrassinin y 3-indolecarbaldehidos.
14
Principio picante
El trans-4-metiltio-3-butenil-isotiocianato es el compuesto responsable del principio
picante del rábano es extraído de la raíz. El compuesto cis-isomerida es un producto
generado a partir del principio picante del rábano. Este compuesto posee actividad
antimicrobiana contra hongos y bacterias con concentraciones que van desde 50 –
400 μg/ml.
Las acciones antifúngicas y antibacterianas se deben a las actividades bactericidas
y esporicidas.
Prevención de enfermedades cardiovasculares
El polvo del rábano disminuye los niveles de lípidos aumentando la excreción fecal
de lípidos totales, triglicéridos y colesterol total. Los flavonoides y la vitamina C en
rábano pueden inhibir la peroxidación lipídica e inhibir actividades XOD en los
tejidos animales.
Isotiocianatos y alcaloides
Los glucosilonatos son sustancias aromáticas que confieren un sabor picante a las
verduras, sólo cuando se cortan se liberan estos compuestos en estructuras de
isotiocianatos, tiocianatos e indoles, dependiendo de su precursor biosintético ya
sea metionina, fenilalanina, o triptófano.
En específico los isotiocianatos son compuestos que exhiben sus propiedades
anticarcinogénicas por sus habilidades de inducir genes citoprotectivos. Los
mecánicos de efectos citotóxicos y citostáticos de los ITC incluyen la inducción de
15
apoptosis, inhibición de la progresión del ciclo celular e inhibición de la
anglogénesis.
Los isotiocianatos están entre los agentes quimiopreventivos más efectivos
conocidos. Una amplia variedad de isotiocianatos previenen el cáncer de diferentes
tejidos incluyendo el de pulmón, glándula mamaria, esófago, hígado, intestino
delgado, colon y vesícula biliar, evidenciado en experimentos con ratas.
Los alcaloides son uno de los grupos de metabolitos secundarios más diversos
encontrados en los vegetales, son casi siempre incoloros, son normalmente sólidos
a temperatura, se pueden encontrar en distintas partes de la planta, ya sea hojas,
fruto, semillas y raíces.
Este grupo incluye alrededor de 12000 compuestos entre los cuales se encuentran
alcaloides indólicos que son los obtenidos a partir de triptófano. Entre los alcaloides
más importantes se tienen a los de tipo bsindólico como la vinblastina empleada en
el tratamiento de la leucemia, además de los alcaloides monoterpen-indólicos como
la almalicina y serpentina utilizados como agentes antihipertensivos contra las
arritmias cardiacas y el mejoramiento de la circulación cerebral.
Biosíntesis de alcaloides e isotiocianatos.
a) Biosíntesis de los isotiocianatos
Cuando se dañan o rompen las células vegetales, la enzima mirosinasa es liberada
y cataliza la hidrólisis de los glucosinolatos formando isotiocianatos. Los
isotiocianatos son responsables, en parte del sabor agudo de ciertos vegetales
crucíferos y de la familia Brassica.
16
Los isotiocianatos están entre los agentes quimiopreventivos más efectivos
conocidos. Una amplia variedad de isotiocianatos previenen el cáncer de diferentes
tejidos incluyendo el de pulmón, glándula mamaria, esófago, hígado, intestino
delgado, colon y vesícula biliar, evidenciado en experimentos con ratas.
Existen más de 100 glucosilonatos distintos que son precursores de isotiocianatos
que han sido aislados de plantas que se encuentran en vegetales crucíferos como
el brócoli, repollo, coliflor, nabo, rábano, berro, coles de bruselas y mostaza.
Cuando las verduras crudas son masticadas o maceradas se produce la hidrólisis
por la enzima mirosinasa.
El proceso de hidrólisis ocurre en los glucosilonatos cuando el tejido vegetal se
rompe como consecuencia de una daño mecánico, por lo que la enzima mirosinasa
se pone en contacto con el sustrato y libera moléculas de glucosa, de bisulfato y de
la correspondiente aglucona; posteriormente, esta última experimenta un
acomodamiento.
Los glucosilonatos son compuestos estables localizados en las vacuolas y están
separados de la enzima mirosinasa cuando la planta está intacta, sin embargo los
glucosilonatos se hidrolizan rápidamente cuando se mezcla la mirosinasa que
elimina el azúcar de los glucosilonatos dando como resultado isotiocianatos, nitrilos,
cianuros orgánicos y tiocianato iónico. (Figuras 2 y 3)
17
Figura 2. Esquema de la biosíntesis de glucosilonatos e hidrólisis que muestra la
ruta de biosíntesis que conduce a los isotiocianatos.(Loyola-Vargas, 2004)
Figura 3. Degradación de glucosilonatos mediante la enzima mirosinasa que
cataliza la formación de aglicona. (Loyola-Vargas, 2004)
18
b) Biosíntesis de los alcaloides
La mayoría de los alcaloides son heterocíclicos aunque algunos son compuestos
nitrogenados alifáticos (no cíclicos) como la mescalina o la colchicina.
A los valores normales de pH del citosol y de la vacuola (7,2 y 5-6, respectivamente),
el nitrógeno está protonado lo cual confiere el carácter básico o alcalino de estos
compuestos en solución.
Se sintetizan normalmente a partir de lisina, tirosina y triptófano, aunque algunos
como la nicotina y compuestos relacionados derivan de la ornitina.
Los aminoácidos son precursores de los alcaloides y sufren una serie de
transformaciones:
Formación de bases de Schiff (genera enlaces C=N)
Figura 4. Formación de base de Schiff. (Loyola-Vargas, 2004)
Condensación Mannich que genera enlaces C-C-N, es una condensación entre un
carbanión, un aldehído o cetona u una amina primaria o secundaria.
19
Figura 5. Mecanismo de una condensación de Mannich (Loyola-Vargas, 2004).
Oxidaciones
Reducciones
Condensación aldólica
Figura 6. Mecanismo de formación adólica. (Loyola-Vargas, 2004)
Descarboxilación y deshidratación
Metabolitos secundarios
Definición
Se define metabolismo al conjunto de reacciones químicas que realizan las células
de los seres vivos para sintetizar sustancias que requieren su organismo para su
funcionamiento correcto. Se trata principalmente de aminoácidos, nucleótidos,
azúcares y lípidos y son denominados metabolitos primarios.
En particular, las plantas que son organismos autótrofos poseen un metabolismo
secundario que les permite además de la producción, la acumulación de carbono y
de energía para la síntesis de sustancias que participan indirectamente en los
20
procesos de respiración, fotosintéticos y asimilación de nutrientes que son
denominados metabolitos secundarios.
Los metabolitos secundarios no se encuentran en todos los grupos de plantas, se
sintetizan en pequeñas cantidades, tienen funciones específicas como atrayentes,
de protección y de pigmentación.
Tipos de metabolitos secundarios
Las rutas principales de biosíntesis de metabolitos secundarios derivan del
metabolismo primario del carbono, muchos tienen importancia en la industria
cosmética, alimentaria y farmaceútica.
Las principales clasificaciones de los metabolitos secundarios son:
Terpenos: Se encuentran hormonas, pigmentos o aceites esenciales.
Compuestos fenólicos: Cumarinas, flavonoides, lignina y taninos.
Glicósidos: Saponinas, glicósidos cardiacos, glicósidos cianogénicos y
glucosilonatos.
Alcaloides
A continuación se presenta una breve descripción de cada una de las
clasificaciones antes mencionadas.
Terpenos
Constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios considerando que
son más de 40.000 moléculas diferentes. La ruta biosintética de estos compuestos
da lugar tanto a metabolitos primarios como secundarios de gran importancia para
21
el crecimiento y supervivencia de las plantas. Entre los metabolitos primarios se
encuentran hormonas (giberelinas, ácido abscísico y citoquininas), carotenoides,
clorofilas y plastoquinonas (fotosíntesis), ubiquinonas (respiración) y esteroles (de
gran importancia en las estructura de membranas). Son compuestos solubles en
agua y derivan de la unión de unidades de isopreno (5 átomos de C).
Los terpenos se clasifican por el número de unidades de isopreno (C5) que
contienen: Los monoterpenos con 10 C; los sesquiterpenos con 15 C, los diterpenos
con 20 C. Los triterpenos que tienen 30 C, los tetraterpenos que tienen 40 C y se
habla de politerpenos cuando contienen más de 8 unidades de isopreno.
Compuestos fenólicos
Las sustancias que sintetizan las plantas con un grupo fenol reciben el nombre de
compuestos fenólicos, polifenoles o fenilpropanoides. son un grupo muy diverso que
comprende desde moléculas sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros
complejos como los taninos y la lignina. En el grupo también se encuentran
pigmentos flavonoides Muchos de estos productos están implicados en las
interacciones planta-herbívoro.
Existen dos rutas básicas implicadas en la biosíntesis de compuestos fenólicos: la
ruta del ácido siquímico y la ruta del ácido malónico.
La ruta del ácido malónico es una fuente importante de fenoles en hongos y
bacterias, pero es poco empleada en plantas superiores. La ruta del ácido siquímico
es responsable de la biosíntesis de la mayoría de los compuestos fenólicos de
plantas.
22
Glicósidos
Su nombre hace referencia al enlace glicosídico que se forma cuando una molécula
de azúcar se condensa con otra que contiene un grupo hidroxilo. Existen tres grupos
de glicósidos de particular interés: saponinas, glicósidos cardiacos y glicósidos
cianogénicos. Una cuarta familia, los glucosinolatos, se incluyen en este grupo
debido a su estructura similar a los glicósidos.
Las saponinas se encuentran como glicósidos esteroideos, glicósidos esteroideos
alcaloides o bien glicósidos triterpenos y contienen una o más moléculas de azúcar
en su estructura.
Los glicósidos cardiacos o cardenólidos son semejantes a las saponinas
esteroideas, tienen propiedades detergentes, pero su estructura contiene una
lactona. Se encuentran de forma natural en forma de glicósidos o de agliconas.
Los glicósidos cianogénicos son compuestos nitrogenados, que no son tóxicos pero
se degradan cuando la planta es aplastada liberando sustancias volátiles tóxicas
como cianuro de hidrógeno (HCN).
Los glucosinolatos, se degradan y desprenden sustancias volátiles responsables
del aroma, el olor y el gusto de condimentos como la mostaza y de vegetales de la
familia Brassicaceae.
Alcaloides
Los alcaloides son una familia de más de 15.000 metabolitos secundarios que tienen
en común tres características: son solubles en agua, contienen al menos un átomo
23
de nitrógeno en la molécula, y exhiben actividad biológica. La mayoría son
heterocíclicos aunque algunos son compuestos nitrogenados alifáticos (no cíclicos)
como la mescalina o la colchicina. Se encuentran en el 20% aproximadamente de
las plantas vasculares, la mayoría dicotiledóneas herbáceas.
Cultivo in vitro
El cultivo in vitro es una técnica que comprende la micropropagación, el aislamiento
y el cultivo de embriones, la regeneración, a partir de callos o de suspensiones
celulares, el cultivo de protoplastos, anteras y microsporas. Ésta técnica se ha
utilizado en todo el mundo para la multiplicación de plantas a gran escala y es muy
factible debido a que da como resultado la producción de material de plantación de
gran calidad y libre de enfermedades. La clave del cultivo in vitro consiste en extraer
porciones de tejidos inmaduros (explantes), que siguen conservando su potencial
morfogenético (totipotencia) y cultivarlos en medios nutritivos suplementados con
mezcla de dos tipos de homornas vegetales, que son las auxinas, las cuales inducen
el crecimiento de raíces y las citocininas que induce la caulogénesis.
El fundamento del cultivo in vitro se basa en la totipotencia de las células vegetales,
que consiste en la habilidad de dividirse y producir todas las células diferenciadas
de un organismo.
Uno de los factores para obtener la respuesta morfológica deseada en un cultivo de
tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo, el cual está conformado por
macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes
24
(hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas
vegetales.
Hierba del sapo
La hierba del sapo pertenece a la familia de las umbelíferas; el género Eryngium
alberga alrededor de 230 especies, su uso en medicina tradicional en México data
desde tiempos prehispánicos. Ésta planta ha sido estudiada debido a la capacidad
de reducir los niveles de colesterol y triglicéridos.
Es una hierba sin tallo aparente, que alcanza aproximadamente los 50 cm de altura,
las hojas son basales dispuestas en forma de roseta, las flores son en forma de
cabezuelas de color azul, violeta o blanco.
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DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
Extracción clorofórmica
Se utilizaron dos ejemplares de rábano negro (Raphanus sativus L. var. niger) se
extrajo la corteza del fruto en cortes semifinos. La corteza extraída se recolectó en
un vaso de precipitados de 500 mL, previamiente lavado y esterilizado. Se pesaron
10 matraces Erlenmeyer de 20 mL en una balanza analítica y se agregaron 2 g de
corteza de R. sativus a cada matraz. A cada muestra se adicionaron 20 mL de
cloroformo, los matraces se cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron.
Posteriormente, con un bisturí se realizaron cortes semifinos del fruto de R. sativus
en fragmentos de 0.5 cm y se colectaron en un vaso de precipitados de 50 mL,
posteriormente se pesaron 10 matraces Erlenmeyer de 20 mL y se agregaron 2 g
de las hojuelas del fruto. A las muestras se les añadió 20 mL de cloroformo, se
cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron (Figura 7).
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Figura 7. Método de extracción clorofórmica a partir de la corteza y fruto de R. sativus. a) Ejemplar de rábano negro (Raphanus sativus L. var niger); b) Extracción de la corteza de R. sativus; c) Corteza de R. sativus en vaso de precipitados; d): Fruto de R. sativus sin epidermis; e) Hojuelas de fruto de R. sativus depositadas en un vaso de precipitados de 50 mL; f) Matraz con 2 g de corteza de R. sativus; g) Muestras de corteza de R. sativus colocada en un matraz con 20 mL de cloroformo; h) Matraz con 2 g de muestra de fruto de R. sativus; i) Muestras de fruto R. sativus en un matraz con 20 mL de cloroformo.
Extracción etanólica
Se extrajo la corteza de R. sativus de un segundo ejemplar con un bisturí. La
corteza extraída se colectó en un vaso de precipitados de 500 mL, previamente
lavado y esterilizado. Posteriormente se pesó un matraz de recuperación de 50 mL
y se agregaron 2 g de corteza. A cada muestra se adicionaron 50 mL de etanol, con
10 repeticiones.
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Se realizaron cortes semifinos del fruto der R. sativus con un bisturí, los cortes se
colectaron en un vaso de precipitados de 50 mL. Se pesaron 10 matraces de
recuperación de 50 mL y se agregaron 2 g de fruto de R. sativus. Finalmente, a cada
matraz se le adicionaron 50 mL de etanol.
Figura 8. Método de extracción etanólica de la corteza y fruto de R. sativus a)
Corteza de R. sativus en matraz de recuperación con 50 mL de etanol; b) Muestras
de fruto de R. sativus en matraz con 50 mL de etanol
Extracción metanólica
Se utilizaron dos ejemplares de R. sativus para extraer la corteza con un bisturí en
cortes semifinos de 0.5 cm. La corteza extraída se colectó en un vaso de
precipitados de 500 mL, previamente lavado y esterilizado. Se pesaron 10 matraces
Erlenmeyer de 20 mL con una balanza analítica y se agregaron 2 g de corteza de
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Filtración, evaporación y concentración de compuestos
Las 40 muestras de R. sativus, que se obtuvieron mediante la extracción
clorofórmica y la extracción metanólica, se filtraron por gravedad con un embudo
cónico y papel filtro para eliminar los sólidos. La suspensión de cada matraz se
colectó en tubos de ensayo de vidrio con tapa y se etiquetaron.
Las 20 muestras de extracción etanólica se filtraron por gravedad con un embudo
cónico y papel filtro, para eliminar los sólidos del fruto y de la corteza de R. sativus,
la suspensión de cada muestra se colectó en matraces Erlenmeyer y se etiquetaron.
Posteriormente, se tomaron 10 mL de cada repetición de las muestras de fruto y de
corteza de R. sativus con los distintos solventes y se depositaron en matraces
Erlenmeyer de 25 mL. Cada matraz se colocó en una placa calefactora para
evaporar totalmente el solvente.
Finalmente se adicionó 1 mL del solvente correspondiente a las muestras secas de
fruto y de corteza de R. sativus de cada matraz.
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Figura 10. Concentración de extractos de R. sativus. a) Filtración por gravedad de
extracto de R. sativus en matraz Erlen meyer; b) Muestra con 10 mL de extracto de
R. sativus; c) Evaporación de los extractos en placa; d) Muestras en proceso de
ebullición; e) Muestras sin solvente.
Figura 11. Muestras evaporadas de etanol con 1 mL de solvente.
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Determinación de vitamina C en extractos etanólicos de Raphanus sativus.
Para la determinación de vitamina C en R. sativus se utilizó una solución indicadora
preparada en el laboratorio.
Se mezclaron 8 g de almidón de maíz con 5 mL de agua, se adicionaron 250 mL de
agua a la pasta, se hirvió durante 5 minutos en una placa.
Se adicionaron 75 mL de agua en un matraz, 10 gotas de la disolución preparada
con almidón de maíz y 15 gotas de tintura de yodo, lo que provocó un cambio de la
solución a un color azul. (Figura 12).
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Figura 12. Preparación de solución indicadora de presencia de vitamina C en extractos etanólicos. a) Solución de almidón de maíz con 250 mL de agua; b) solución de almidón de maíz en ebullición; c) solución de 75 mL de agua y 10 gotas de solución de almidón; d) Solución indicadora finalizada con 15 gotas de tintura de Yodo.
Determinación de vitamina C
Posteriormente se adicionaron 10 mL de la solución indicadora a un tubo de ensayo,
con 10 repeticiones para el extracto etanólico de corteza de R. sativus y 10
repeticiones para los extractos etanólicos de fruto de R. sativus. Se adicionaron 10
gotas de extracto etanólico de corteza y de fruto de R. sativus a cada uno de los
tubos y se agitó suavemente.
La presencia de vitamina C en los extractos provocó la decoloración de la solución
indicadora. (Figura 13).
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Figura 13. Determinación de vitamina C en R. sativus. a) Solución indicadora en tubos de ensayo; b) adición de 10 gotas de extracto etanólico de R. sativus; c) muestras de extractos etanólicos de fruto de R. sativus con solución indicadora; d) Muestras de extractos etanólicos de corteza de R. sativus con solución indicadora.
PRODUCTOS DEL PROYECTO
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El diseño experimental empleado consistió en la extracción con de los alcaloides y
los isotiocianatos por medio de tres solventes orgánicos (cloroformo, metanol y
etanol), con 20 repeticiones (10 para la extracción del fruto y 10 para la extracción
de la corteza) para cada tipo de solvente.( Cuadro 1).
La extracción de alcaloides e isotiocianatos con cloroformo se presenta en la página
número 25, la extracción etanólica de alcaloides e isotiocianatos se presenta en la
página número 27, la extracción metanólica en la página número 28. La prueba de
presencia de vitamina C en los extractos etanólicos de Raphanus sativus se
presenta en la página 30.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Cuadro 1. Diseño experimental de extracción de isotiocianatos y alcaloides a partir de R. sativus
Tipo de extracción Composición
No. De repeticiones
Extracción clorofórmica 2 g de fruto
20 mL de cloroformo
10
2 g de corteza 10
Extracción metanólica
2 g de fruto
20 mL de metanol 10
2 g de corteza 10
Extracción etanólica 2 g de fruto
50 mL de etanol 10
2 g de corteza 10
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Se concluye que la extracción de los isotiocianatos y alcaloides a partir de R. sativus
se logró con éxito con los tres distintos solventes orgánicos. Además de que la
mayor concentración de vitamina C se identificó en la corteza por medio del extracto
etanólico.
Para futuros investigaciones se recomienda llevar a cabo un análisis cuantitativo de
la cantidad de compuestos alcaloidales e isotiocianatos con una mayor
concentración de solventes.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Sutan, Beevi. (2010) “Hexane Extract of Raphanus sativus L. Roots Inhibits Cell
Proliferation and Induces Apoptosis in Human Cancer Cells by Modulating Genes Related
to Apoptotic Pathway.”en Journal of Plant Foods Human Nutrition. [En línea]. Estados
35
Unidos de América, disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20652750
[Accesado 24 de Marzo de 2015]
2. Vangalapati, M. (2014). ” Experimental studies and Development of Modelling equation of
Quercetin from Raphanus Sativus using Soxhlet Extractor”, en International Journal of
Innovative Research in Science, Engineering and Technology. No. 3. Junio 2014, disponible
en:
http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CBwQF
jAA&url=http%3A%2F%2Fwww.ijirset.com%2Fupload%2F2014%2Fmay%2F28_Experiment
al.pdf&ei=EW5pVZSQN8TIsAXHxYGoAQ&usg=AFQjCNEAYL7lpmTr3a6_BieaVqZU1BuEOw&
bvm=bv.94455598,d.b2w [Accesado 27 de Marzo de 2015]
3. Abd-Elmoneim, M. (2013) “ Anticarcinogenic Effect of Raphanus sativus on 1,2
Dimethylhydrazine (DMH) Induced Colon Cancer in Rats.” , en The Egyptian Journal of
Hospital Medicine. No. 1, Abril 2013, disponible en:
https://doaj.org/article/30f2d0226d9249cbb14343c883146f87 [Accesado 27 de Marzo de
2015
4. O’Hare,T.(2010 ) “Anti-cancer Potential of Asian Brassicas Glucosinolates &
Chemoprevention” en O'Brien, Rural Industries Research and Development Corporation.
Disponible en http://www.sproutnet.com/Anti-Cancer-Potential-of-Brassicas [Accesado
29 de marzo de 2015]
5. Villavicencio M.A. (2008) “Citotoxicidad en células HeLa de extractos de tres especies de plantas medicinales de Hidalgo” en Revista de Polibotánica. 26 p 137-147. [Accesado 04 de Abril de 2015]
6. Loyola-Vargas, V. (2004) “Biosíntesis de los alcaloides indólicos. Una revisión crítica” en Revista de Centro de Investigación Científica de Yucatán.48 p 67-94 [Accesado 10 de Abril de 2015]
7. Bergoñón, S. (1994) “Aislamiento y caracterización química de alcaloides del tipo
Amaryllidaceae”, Universidad de Barcelona. 1994, Barcelona, España. [Accesado 12 de Abril de 2015]
8. Arranz N., Haza, A.I., García, A., Möller, L., Rafter, J. y P. Morales 2006. “Protective effects of isothiocyanates towards N-nitrosamines-induced DNA damage in the single-cell gel electrophoresis” en. Journal of Applied Toxicology, 26 p 446-473. [Accesado 14 de Abril de 2015]