Trabajo experimental
Callogénesis en zanahoria
Reguladores de crecimientoAF-5402
Arabela Vega AguilarNoviembre 2011
Introducción
George et al (2008) definen un cultivo de callos (o bien cultivo de tejidos) como el crecimiento y mantenimiento de masas de células enormemente desorganizadas que surgen del crecimiento descoordinado y desorganizado de pequeños órganos de la planta, piezas de tejido de la planta o células previamente cultivadas.
¿por qué zanahoria?
• Stewart y Reinert en 1958 descubrieron
embriogénesis somática a partir de tejido de
zanahoria.
• Establecida como sistema modelo.
• Fenómeno reportado en más de 300 especies.
• Demuestra totipotencia de plantas superiores.
Objetivo general
Estudiar el rol de dos diferentes auxinas en el establecimiento de cultivos de callos de
zanahoria (Daucus carota).
Materiales y métodos(dos protocolos distintos)
Laboratorio de Biotecnología del CIA
• Piezas de tejido de la raíz de zanahoria.
• Medio de cultivo sólido.
Murashige y Skoog (MS)
• 2 reguladores de crecimiento.
AIA y 2,4 D
Tejido vegetal: proceso de desinfección
1. Zanahorias de 20cm de longitud y 4cm de diámetro.
2. Lavar con agua y jabón en recipiente agitando.
3. Pelar eliminando 2mm de tejido.
4. Cortar rebanadas de 1 cm de grueso.
5. Sumergir en etanol al 70% por 30 seg.
6. Sumergir en NaClO al 10% por 10 min en agitación.
7. Inicio de trabajo en cámara de flujo laminar.
8. Lavar rebanadas 5 veces con agua destilada y estéril, agitando en Erlenmeyer por 30 seg.
Mc Donald et al (1995)
Regulador de crecimiento
AIA
Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 1000ppm.
2,4 D
Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 500ppm.
Protocolo 1•MS con 1,0 ppm de 2,4D o 1,0 ppm de AIA.
•25ml de medio por frasco.
•Cubos de tejido del cambium de 1cm.
• 1 cubo de tejido por frasco.
•10 repeticiones por tratamiento.
•Cada frasco fue pesado y etiquetado.
•Peso de explantes por diferencia.
Mc Donald et al (1995)
Protocolo 2•MS complementado con:1ppm de 2,4D, 2ppm de 2,4D,
1ppm de AIA y
2ppm de AIA •Capa uniforme y delgada de MS.
•Cortes región cambial, floema sec.
•4 cortes por placa.
•10 repeticiones por tratamiento.
•Cada placa fue pesada y etiquetada.
•Peso de explantes por diferencia.
•Placas con AIA en oscuridad. 4xPhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003)
Cultivo de callos (ambos protocolos)
• 16 horas de luz por 8 horas de oscuridad,
• 28 °C
• observaciones cada 3 días,
• descarte de frascos contaminados,
• tiempo de aparición de los callos y
• peso semanalmente
Protocolo 1
• Aparición de callos 21 días después.
• Muchos descartes por contaminación.
• Cambio de balanza, posible fuente de error.
• Disminución en peso en todos los explantes.
• Aparición de tejido nuevo y coloraciones verdes, café y moradas.
• Desarrollo de raíz.
Resultados y discusión
deshidratación
Contaminación
Inicios de raíz
AIA
2,4D
21 días de cultivoprotocolo 1
2,4 D AIA
29 días en AIA
Fotoprotección
29 días en 2,4D
62 días de cultivoen AIA
Estrés y antocianinas
Raíces en AIA
• Semana 1 ningún cambio.
• Explantes con mayor superficie expuesta.
• Mala gelificación del medio.
• Presencia de azúcar: mayor contaminación.
• No representativo para curva de crecimiento.
• Muerte de tejido por desinfección.
• 41 días de cultivo: presencia de callo
Resultados y discusiónProtocolo 2
7 días en 2,4D
Tejido muerto
Contaminación
41 días de cultivoContaminación Cambio de
pigmentación
Conclusiones y recomendaciones
• Reducir tiempo y concentraciones de desinfección.
• Definir tipo de callo (E o NE).
• Definir material de origen.
Jiménez y Bangerth (2001) sugieren hipocótilos
Narayan y Venkataraman (2000) sugieren plántulas
• Comparar tipos de corte para explante en iguales
condiciones.
• Escoger recipiente más adecuado.
• Evaluar concentraciones y efecto del RC.
• Oscuridad evita degradación de AIA.
• Mejorar procedimiento de pesaje.
• Peso seco.
• Mayor número de repeticiones.
Conclusiones y recomendaciones
Mi protocolo
• Utilizar hipocótilos como tejido de origen.
• Desinfección con etanol no más de 1min.
• Desinfección con NaClO al 3% máximo.
• Placas de Petri.
• 2,4 D a 1ppm y 2ppm, AIA a 1ppm y 2ppm
• Mejor manejo del medio de cultivo.
• 6 explantes muy pequeños por placa.
• Cuarto oscuro.
• Pesaje directo dentro de cámara.
• Observaciones y peso semanal.
• Expresar datos como % de ganancia de
peso por explante, no curva de
crecimiento.
Otro protocolopara zanahoria
Arroz CIBCM
GRACIAS
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