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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE APATZINGÁN.
INGENIERÍA BIOQUÍMICA.
TRABAJO No. 4:
“UNIDAD IV: BIOSEPARACIONES”.
OPERACIONES UNITARIAS I.
PROFESOR.I.Q. JULIO CÉSAR PAZ RAMÍREZ.
PRESENTA: No. de Control:
MORÁN AGUILAR XIOMARA. 13020109
6° SEMESTRE.
Apatzingán, Michoacán. Fecha: 31/May/2016
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INTRODUCCIÓN.
La comercialización de nuevos productos obtenidos a través del empleo de la
“biotecnología” requiere un coordinado acople de operaciones unitarias a fin de
desarrollar un proceso eficiente. El objetivo general de este proceso es convertir
materia prima relativamente de bajo costo en productos de mayor valor comercial.
En este sentido la biotecnología se puede definir como “la colección de procesos
industriales que involucran el uso de sistemas biológicos”. El punto central de este
proceso es el biorreactor. En esta unidad de operación se utilizan catalizadores
biológicos (microorganismos, células vegetales o animales, enzimas, virus, etc.)
para la producción de sustancias, alimentos, agentes terapéuticos, etc. de interés.No obstante, el biorreactor no existe aislado, sino que la eficiencia y éxito de la
operación depende de un adecuado “upstream processing” (procesado previo) que
incluye desde el diseño del medio de cultivo hasta la esterilización del mismo. Por
otro lado, la recuperación del producto final requiere una serie de operaciones
referidas colectivamente como “downstream processing” (SP). Estas operaciones
comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo, una vez finalizado, para
la obtención del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas
(Universidad Nacional de Quilmes, 2005).
Los productos que resultan de los proceso biotecnológicos pueden ser muy
variados. La variedad estará dada por:
a).- La naturaleza química del mismo: sustancias simples (alcoholes, ácidos
orgánicos); proteínas, sustancias con actividad terapéutica (antibióticos,
hormonas) etc. (Universidad Nacional de Quilmes, 2005).
b).- El volumen de producción y la concentración del producto en el caldo de
fermentación: los llamados “commodities” (etanol, ácido cítrico, etc.) se obtienen
de a cientos o miles de ton/año y en altas concentraciones en la fermentación.
Mientras que los agentes terapéuticos de última generación (hormonas, factores
de coagulación, etc.) se producen sólo algunos kg/año y su concentración en la
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producción es baja. Esto determina la escala de producción (Universidad Nacional
de Quilmes, 2005).
c).- Los requerimientos de pureza del producto final. Las moléculas a ser
utilizadas en salud humana requerirán una pureza final muy diferente a lasenzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar o de un acidulante para alimentos
(Universidad Nacional de Quilmes, 2005).
d).- Dejar el proceso más complejo (y por lo general más caro) para el final. Se
usan estos métodos cuando tenemos la sustancia a purificar concentrada y pre-
purificada (Universidad Nacional de Quilmes, 2005).
Biofiltros. También denominados filtros biológicos son dispositivos que eliminan una
amplia gama de compuestos contaminantes desde una corriente de fluido (aire o
agua) mediante un proceso biológico (Naranjo, 2012).
Funcionamiento general:
El aire es aspirado cerca del foco de emanación y habitualmente guiado a una
cámara de acondicionamiento. Aquí es saturado de humedad y luego guiado a un
lecho de biomasa fijada. Las sustancias contaminantes se absorben a la
biopelícula de biomasa formada sobre el relleno y aquí posteriormente son
digeridos por microorganismos. En el proceso de digestión y metabolización son
transformados en compuestos que ya no huelen (Naranjo, 2012):
Los compuestos orgánicos son degradados.
Así la superficie del relleno es siempre regenerada y no se satura. En principio
se trata de una oxidación de los contaminantes a baja temperatura y los
microorganismos pueden entenderse como catalizadores de esta reacción.
Los compuestos no volátiles (como los ácidos formados) son arrastrados por el
agua de lluvia o el agua de regadío aplicado sobre la biomasa.
En algunos casos, debido a la presencia de ácidos el pH de los lixiviados puede
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bajar a 1 o 2. Aun así, lo normal es que el relleno orgánico tenga una alcalinidad
suficiente como para neutralizar el pH de los lixiviados (Naranjo, 2012).
4.1.- FILTRACIÓN POR MEMBRANAS.
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La membrana filtra fundamentalmente en la superficie de la misma.
Partículas mayores que la porosidad nominal permanecen sobre el
filtro, mientras que las partículas más pequeñas pasan el filtro, a no ser que otras
interacciones en el filtro retengan éstas en la matrizde la misma. La filtración es claramente más lenta que con filtros de profundidad
(Naranjo, 2012).
La ultrafiltración consiste en la separación por una membrana en donde se
aplica una alta presión (Naranjo, 2012).
Se realiza para separar partículas de 0.01 a 0.1 micrómetros.
Realiza una remoción del 90%. Presenta una reducción de costos (Naranjo, 2012).
Parámetros para la ultrafiltración.
Separación en donde se remueven las partículas coloidales y dispersas de
un líquido al hacerlo atravesar por una membrana aplicando alta presión. Permite
separar moléculas de alto peso molecular , como agua, sales, aminoácidos,
proteínas, etc. (Naranjo, 2012).
Remueve partículas de 0,001-0,1 micrómetros.
Remueve más del 90% de los contaminantes.
Reduce costo de disposición y/o reciclado hasta el 10%.
Requiere poca energía (Naranjo, 2012).
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Tabla No. 1.- Separación por membranas.
Fuente: (Mireia, 2009).
4.1.1.- CARACTERIZACIÓN DE MEMBRANAS.
Las membranas son derivados de la celulosa (acetatos y nitratos). Las
fibras sintéticas son de poliamidas, polisulfonas, etc. y sus matrices poliméricas
densas están compuestas por una mezcla de polímeros, quitosano, entre otros
(Mireia, 2009).
Los polímeros termoplásticos están constituidos por polipropileno, difluoruro
de polivinilideno, politetrafluoruro de etileno, etc. (Mireia, 2009).
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Figura No. 1.-
Membrana de acetato de
celulosa (Mireia, 2009).
Figura No. 2.-
Membrana de poliamida
(Mireia, 2009).
Figura No. 3.- Membrana
de politetrafluoroetileno
(Mireia, 2009).
Figura No. 4.- Membrana
de polietersulfona (Mireia,
2009).
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Tabla No. 2.- Características de las membranas.
Fuente: (Mireia, 2009).
4.1.2.- DISEÑO DE MEMBRANAS.
Tabla No. 3.- Parámetros de diseño.
Fuente: (Mireia, 2009).
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El diseño se basa en laminar el caudal punta de 13,680 m3/d en el
homogeneizador y tratar el caudal máximo de 8,550 m3/d. El caudal será
bombeado desde el homogeneizador al bioreactor y de éste mediante bombas
enviar el caudal necesario hasta los tanques de membranas para el tratamiento de
filtrado y el caudal necesario para mantener la concentración de sólidos óptima
dentro de los tanques y recircular el fango activo hasta el recinto biológico previo
al sistema de membranas de ultrafiltración (UPC, 2007).
Una vez alcanzado el máximo nivel de concentración de sólidos en el
reactor será necesaria la purga de fangos hasta el espesador de fangos, dispuesto
en planta depuradora (UPC, 2007).
Tabla No. 4.- Parámetros físicos.
Fuente: (UPC, 2007).
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Tabla No. 5.- Diseño Preliminar. Valores.
Fuente: (UPC, 2007).
El diseño se basa en la utilización del bioreactor existente, después demodificar la infraestructura, para las zonas aerobias y las anóxicas. Construyendo
nuevos tanques de acero prefabricado alineados para membranas en el espacio
entre el bioreactor y el decantador secundario (UPC, 2007).
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Tabla No. 6.- Características carretes de membranas.
Fuente: (UPC, 2007).
El diseño se basa en poner un tren fuera de servicio para la limpieza u otros
servicios de mantenimiento durante el caudal medio diario, durante el caudal
máximo diario un tren puede ser puesto fuera de servicio durante un período de
tiempo < 24 horas al día (UPC, 2007).
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Figura No. 5.- Membranas enrolladas en espiral (Mireia, 2009).
Figura No. 6.- Fibras huecas (Mireia, 2009).
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4.1.3.- SELECCIÓN DE MEMBRANAS.
Cuando los ingenieros de proceso necesitan separar, clarificar o fraccionar
corrientes de proceso, y cuando exigen un rendimiento confiable y repetible, lossistemas de filtración por membranas se están convirtiendo, cada vez con más
frecuencia, en su primera elección (Pearson, 2016).
En su nivel más básico, la filtración por membranas implica separar un
único flujo en dos corrientes, una más concentrada que la otra, utilizando presión
para que los materiales atraviesen, en forma selectiva, una barrera física
semipermeable: una membrana. Luego, las corrientes separadas pueden pasar
por un procesamiento adicional o, en el caso de una corriente de desechos, ser
desviadas a una salida adecuada (Pearson, 2016).
Con la capacidad de separar partículas de las especies disueltas y separar
las especies disueltas en sí, un sistema de membranas puede utilizarse para
producir un producto final más concentrado o purificado. Con la selección correcta
de las membranas, el proceso de filtración puede aislar especies disueltas de
tamaños específicos mientras que permite que otros componentes disueltos
traspasen la membrana (Pearson, 2016).
Uno de los factores de decisión principales utilizados para elegir la
membrana adecuada es la naturaleza del líquido de los procesos. Conocer el
contenido de los sólidos disueltos, el peso molecular de las especies disueltas y la
naturaleza y la carga de cualquier material en suspensión orientará a los
ingenieros hacia la selección y la geometría correctas de las membranas. El pH y
la temperatura de la corriente de proceso entrante también son factoresimportantes al momento de tomar la decisión final (Pearson, 2016).
Criterios de selección.
1.- Volumen de líquido a filtrar: laboratorio o industrial.
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Figura No. 7.- Proceso de
microfiltración (Valencia, 2012).
2.- Fuerza impulsora: gravedad, presión, vacío, fuerzo centrifuga.
3.- Grado de separación: tamaño de poro.
4. Producto que se selecciona: filtrado o torta.
5.- Resistencia térmica: el filtro debe esterilizarse.
6. El filtro debe ser compatible con el fluido: Tablas de compatibilidad entre
filtros y disolventes.
7.- Régimen de trabajo: continuo o discontinuo (Fernández, 2008).
4.1.4.- MICROFILTRACIÓN.
La filtración mediante membranas sigue el principio de la separación de
partículas basada en el tamaño de los poros y en su distribución. Las membranas
de microfiltración tienen tamaños de poro que varían de 0.075 micrones a 3
micrones. La microfiltración es un proceso de filtrado donde se opera con
membranas semi-permeables de baja presión. El objetivo de este proceso es la
eliminación de sólidos en suspensión pero no retiene el paso de sales disueltas y
macromoléculas. La microfiltración no altera las propiedades químicas de la
solución (Valencia, 2012).
Las membranas empleadas en este proceso son de estructura simétrica y
microporosa con tamaño de poro entre 0.1
µm a 10 µm. La diferencia de presión varía
entre 0.1 y 2 atm. Esta operación unitaria
es utilizada para la remoción de partículas,
bacterias, coloides y las macromóleculas
orgánicas de una solución acuosa en lasplantas de tratamiento de aguas (Valencia,
2012).
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En la microfiltración se alcanzan grandes velocidades de fluido en flujo
cruzado a través de la superficie del filtro mientras que la velocidad perpendicular
a la superficie es relativamente pequeña. De esta manera se evita la formación de
la torta filtrante y los problemas debido a la elevada resistencia de la torta. Este
tipo de filtración es una alternativa debido que las levaduras y bacterias son
mucho más difíciles de tratar por su pequeño tamaño. Por ejemplo Los micelios
fúngicos se pueden filtrar relativamente bien por un proceso de filtración debido a
que la torta filtrante micelial tiene una porosidad superficial grande (Doran, 1998,
citado por Valencia, 2012).
Una parte de la contaminación viral es atrapada en este proceso ya que, a
pesar de que los virus son de menor tamaño que los poros de la membrana, éstos
pueden acoplarse a las bacterias y por tanto ser eliminados (Valencia, 2012).
La microfiltración puede ser aplicada a muchos tratamientos de agua
cuando se necesita retirar de un líquido las partículas de un diámetro superior a
0.1 mm (Valencia, 2012).
Figura No. 8.- Microfiltración y Ultrafiltración (Valencia, 2012).
La microfiltración es básicamente lo mismo solo que el tamaño del poro es
más pequeño (Valencia, 2012).
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Tipos de membranas.
Las membranas están hechas de materiales como cerámica, polímeros y
metales sinterizados. Mientras las cerámicas y los metales se usan generalmente
en aplicaciones industriales, las membranas poliméricas se están convirtiendo enuna herramienta común para el tratamiento de agua potable y aplicaciones
municipales (Valencia, 2012).
Membranas a presión.
Las primeras membranas comercialmente disponibles estaban diseñadas
como láminas planas enrolladas para formar membranas en espiral. Estas
membranas no podían tolerar sólidos y requerían altas presiones para operar. Elelevado costo operativo de estas membranas dio lugar a que fueran poco usadas
para la microfiltración en aplicaciones municipales. Las membranas enrolladas en
espiral generalmente se usan en la nanofiltración y ósmosis inversa, y por lo
general se usan en la desalinización de agua salobre y agua de mar para la
producción de agua potable (Valencia, 2012).
Las membranas de fibra hueca se desarrollaron en la última década como
un medio para abordar las necesidades de la microfiltración con bajos costos deconsumo energético. Ellas rápidamente se convirtieron en el estándar de la
industria y varias empresas empezaron a elaborar estas membranas de gran
superficie para aplicarlas al área de agua potable (Valencia, 2012).
Existen dos tipos de membranas de fibra hueca operadas a presión:
Membranas d e adentro hacia afuera , en las que el afluente ingresa al
interior del lumen de la membrana y el agua limpia se obtiene al pasar del interior
de la membrana al exterior (Valencia, 2012).
Membranas de afuera hacia adentro , en las que el afluente viene por
fuera de la membrana y el agua limpia se obtiene al pasar del exterior de la
membrana al interior (lumen). (Valencia, 2012).
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Figura No. 9.- Modalidades de filtración – Membranas de fibra hueca
(Valencia, 2012).
Todas las membranas de fibra hueca a presión están instaladas dentro de
recipientes presurizados que sirven para aplicar la presión necesaria para la
transferencia adecuada del fluido. La presión de operación típica de estas
membranas es de 15 a 30 psi (Valencia, 2012).
Membrana de fibra hueca operada al vacío – Membrana ZeeWeedä.
El proceso de tratamiento de agua potable basado en la membrana
ZeeWeedä es un proceso revolucionario que usa poca energía y consta de
módulos de microfiltración con membranas de fibra hueca de afuera hacia adentro
que se sumergen en el agua de alimentación. Este microfiltro tiene un tamaño de
poro nominal de 0.085 micrones y un tamaño de poro absoluto de 0.2 micrones, lo
cual asegura que no pasará al agua tratada ninguna partícula mayor a 0.2
micrones (Valencia, 2012).
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Las membranas operan bajo una succión pequeña creada dentro de las
fibras huecas por una bomba de filtración. El agua tratada pasa a través de la
membrana, entra a las fibras huecas y es bombeada para su distribución. Se
introduce un flujo de aire en el fondo del módulo de la membrana para crear una
turbulencia que frota y limpia el exterior de las fibras de la membrana y les permite
funcionar a una tasa de flujo alta. Este aire también oxida el hierro y otros
compuestos orgánicos, con lo que se obtiene agua de mejor calidad que la
suministrada por sólo microfiltración (Valencia, 2012).
Figura No. 10.- Concepto operativo de una membrana de afuera hacia
adentro sumergida sin casco (Valencia, 2012).
Aplicaciones. Esterilización por frío de bebidas y productos farmacéuticos.
Aclaración de zumos de frutas, vinos y cerveza.
Separación de bacterias del agua (tratamiento biológico de aguas
residuales).
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Tratamiento de efluentes.
Separación de emulsiones de agua y aceite.
Pre-tratamiento del agua para nanofiltración y ósmosis inversa.
Separación sólido-líquido para farmacias e industrias alimentarias
(Valencia, 2012).
Microfiltración en la industria alimenticia.
Microfiltración como protección de huevos y leche líquida. Usualmente para su
control se usa la pasteurización, proceso térmico que elimina los agentes
patógenos sensibles al calor pero algunos microorganismos resistentes a este
factor pueden sobrevivir. El consumidor puede evitar la infección si aplica una
adecuada cocción de los huevos antes de consumirlos, la microfiltración ofrece
una nueva posibilidad para compensar las posibles deficiencias de la
pasteurización (Valencia, 2012).
En la industria láctea, genera una reducción bacteriana significativa y al operar
a bajas temperaturas, posibilitan la obtención de productos con excelentes
características organolépticas y una calidad bacteriológica satisfactoria (Valencia,
2012).
4.1.5.- NANOFILTRACIÓN.
Es un proceso de filtración por membranas que se da por la aplicación de
presión; donde solutos de bajo peso molecular (1000 daltons) son retenidos,
mientras que algunas sales pueden pasar, total o parcialmente, a través de la
membrana con el filtrado (Abadiano, 2013).
El principio de la filtración se basa en la difusión de ciertas soluciones
iónicas (como sodio y cloruro), iones monovalentes, divalentes y multivalentes
(Abadiano, 2013).
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La presión operativa es más baja en la Nanofiltración que en la Ósmosis
Inversa (Abadiano, 2013).
Figura No. 11.- Tipo de filtración y su diámetro de partículas(Abadiano, 2013).
Las membranas orgánicas presentan una resistencia adecuada al pH entre
pH 2 y pH 11, en la mayoría de los casos; sin embargo, su resistencia a la
temperatura es por el momento inferior a los 100 ˚C, y estas membranas todavía
son demasiado sensibles a los solventes orgánicos y a algunas moléculas como
los surfactantes. Estos son los factores que limitan actualmente el desarrollo de la
nanofiltración en la industria química o la petroquímica (Abadiano, 2013).
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Tabla No.7.- Características de utilización de las principales
membranas de nanofiltración.
Fuente: (Abadiano, 2013).
Aplicaciones.
Industria Láctea: Reduce costos de transportación así como derecuperación de lactosa.
Eliminación de nitratos y sólidos de proteínas de suero.
Industria de Alimentos y Bebidas: Desalinización de gelatina para mejores
propiedades de batido y para mejorar la claridad de color.
Industria Farmacéutica: Incrementa el valor de los productos farmacéuticos
al obtenerlos más purificados.
Industria: Desalinización de tintes para un producto de valor más alto.
Reciclaje de aguas residuales en lavanderías.
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Agroindustria: La eliminación de pesticidas de las aguas subterráneas
(Abadiano, 2013).
4.1.6.- ÓSMOSIS INVERSA.
Ósmosis. El fenómeno de la Ósmosis está basado en la búsqueda del
equilibrio. Cuando se ponen en contacto dos fluidos con diferentes
concentraciones de sólidos disueltos se mezclarán hasta que la concentración sea
uniforme. Si estos fluidos están separados por una membrana permeable (la cual
permite el paso a su través de uno de los fluidos), el fluido que se moverá a través
de la membrana será el de menor concentración de tal forma que pasa al fluido de
mayor concentración (Binnie et. al . 2002).
Al cabo de un tiempo el contenido en agua será mayor en uno de los lados
de la membrana. La diferencia de altura entre ambos fluidos se conoce como
Presión Osmótica (Binnie et. al . 2002).
Ósmosis inversa. Si se utiliza una presión superior a la presión osmótica,
se produce el efecto contrario. Los fluidos se presionan a través de la membrana,mientras que los sólidos disueltos quedan atrás (Binnie et. al . 2002).
Para poder purificar el agua necesitamos llevar a cabo el proceso contrario
al de la ósmosis convencional, es lo que se conoce como Ósmosis Inversa. Se
trata de un proceso con membranas. Para poder forzar el paso del agua que se
encuentra en la corriente de salmuera a la corriente de agua con baja
concentración de sal, es necesario presurizar el agua a un valor superior al de la
presión osmótica. Como consecuencia a este proceso, la salmuera se concentrarámás (Binnie et. al . 2002).
Por ejemplo, la presión de operación del agua de mar es de 60 bar
(Binnie et. al . 2002).
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Figura No. 12.- Diferencia de ósmosis y ósmosis inversa
(Imagen de la derecha). (Abadiano, 2013).
1.- El agua fluye de una columna con un bajo contenido de sólidos disueltos
a una columna con una elevada concentración de sólidos disueltos
2.- La presión osmótica es la aplicada para evitar que el agua siga fluyendo
a través de la membrana y de esta forma crear un equilibrio.
3.- Para poder alcanzar una presión superior a la presión osmótica, el agua
debe fluir en sentido contrario. El agua fluye de la columna con un alto contenido
en solidos disueltos a la columna con bajo contenido en sólidos disueltos
(Binnie et. al . 2002).
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Figura No. 13.- Ósmosis inversa (Mireia, 2009).
Calidad de las membranas.
1.- Alta retención de sales minerales y compuestos orgánicos: TASA DE
DEPURACIÓN.
2.- Alta permeabilidad al agua pura.
3.- Poco espesor.
Baja biodegradabilidad.
Elevada inercia química.
Margen de pH amplio.
Buena resistencia mecánica.
Buena estabilidad en el tiempo (Mireia, 2009).
CAUDAL.
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4.1.7.- ELECTRODIÁLISIS.
Procedimiento de separación con
membranas que tiene por objeto concentrar
o diluir disoluciones de electrolitos
mediante el uso de membranas de
intercambio iónico y la aplicación de un
potencial eléctrico (Mireia, 2009).
Figura No. 14.- Instalaciones de
Ósmosis Inversa (Mireia, 2009).
Figura No. 15.- Electrodiálisis
(Mireia, 2009).
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Resinas de intercambio iónico.
Sustancias insolubles en agua que tienen iones lábiles fácilmente
intercambiables por otros iones del mismo signo presentes en una
solución acuosa (Mireia, 2009).
Son cadenas poliméricas de elevado peso molecular unidas por
un enlace iónico a un contraión (Mireia, 2009).
Figura No. 16.- Resinas de intercambio iónico (Mireia, 2009).
Figura No. 17.-
Electrodiálisis (Mireia, 2009).
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Inconvenientes:
Bajo rendimiento: 40 –66% electrolitos.
No elimina moléculas no ionizadas ni coloides (Mireia, 2009).
Aplicaciones:
Producción de agua potable a partir de agua salobre de baja mineralización
(0.8 a 2 g/ℓ).
Desalinización de soluciones coloidales u orgánicas (desmineralización de
sueros). (Mireia, 2009).
4.2.- TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS.
ELECTROFORESIS.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo dela técnica que se use (Morales, 2008).
Figura No. 18.- Electroforesis (Morales, 2008).
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La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa
impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos
independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos
del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo
transversal en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador
interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o
reactivos en particular (Morales, 2008).
Fundamentos y Conceptos Básicos.
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha
desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia
junto con los procedimientos más tradicionales de electroforesis. Esta técnica
permite separar bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se
muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de
estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte (Morales,
2008).
Figura No. 18.- Esquema representativo de la electroforesis (Morales, 2008).
La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica
de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies
de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el
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efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de
desplazamiento) adecuado (Morales, 2008).
Figura No. 19.- Electroferograma (Morales, 2008).
En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en
sus extremos, fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150µm). El capilar oscila
entre 20 y 80 cm, y está lleno de una solución buffer. Un detector se encuentra
ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento catódico. La señal
obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que muestra el registro
de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el cátodo
serán detectadas (Morales, 2008).
Métodos de Detección.
En la detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través
del capilar en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco
(Morales, 2008).
Figura No. 20.- Detector (Morales, 2008).
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La detección por fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente
láser muy intenso, asociado a menudo a un procedimiento de preformación de
derivados de los analitos portadores de un fluoróforo (Morales, 2008).
4.2.1.- CLASIFICACIÓN DE TÉCNICAS
ELECTROFORÉTICAS.
1.- Electrofo resis c api lar en zona o en dis olu ción l ibre (CZE).
Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar esrecorrido por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato
o citrato), básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo
electroosmótico crece con el pH del medio electroforético (Morales, 2008).
2.- Electr ofo resi s cap ilar elec tro cinética m icelar (MEKC).
En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un
compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. Estas
pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos
neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-hidrófoba. Se
puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a
migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiomeros (Morales, 2008).
3.- Electrofor esis c api lar en g el (CGE).
Esta es la transposición de la electroforesis en el gel de poliacrilamida o de
agarosa. El capilar está relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce
un efecto de filtración que ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los
fenómenos de convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se
pueden separar de este modo (Morales, 2008).
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4.- Isoelec tro enfoqu e capilar (CIEF).
Esta técnica, también conocida como electroforesis en soporte, consiste en
crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un
anfótero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que supunto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de
una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se desplazan las
especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este
procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02
unidades de pH (Morales, 2008).
Electrocromatografía Capilar. Este tipo de separación asocia la electromigración de los iones, propio de la
electroforesis, y los efectos de separación entre fases presentes en la
cromatografía. La técnica consiste en la utilización de un capilar relleno con una
fase estacionaria, cuyo papel es doble: actúa como material selectivo que debe,
por otro lado, participar en la migración del electrolito (Morales, 2008).
Figura No. 21.- Detector fluorimétrico (Morales, 2008).
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El factor de separación es muy elevado, pero existen un cierto número de
problemas que limitan su aplicación, como el efecto de los modificadores
orgánicos sobre el flujo electroosmótico y la dificultad de un control preciso del
volumen de muestra introducido en el capilar (Morales, 2008).
4.2.2.- DISEÑO Y SELECCIÓN DE TÉCNICAS
ELECTROFORÉTICAS.
Diseño.
Figura No. 22.- Métodos
electroforeticos zonales
(Krause, 1996).
Se aplican pequeñas cantidades de la
disolución de proteínas a un soporte sólido, que se
impregna con una solución tampón. Los soportes son
en general polímeros y forman un gel poroso que
restringe el movimiento de las moléculas a través de
medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de convección del solvente (Krause, 1996).
Como soporte han sido utilizados pape
(celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de
celulosa, entre otros. Este método tiene gran pode
resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de
proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud
del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación
(Krause, 1996).
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Figura No. 23.- Electroforesis en gel de
poliacrilamida (Krause, 1996).
Los geles de poliacrilamida se forman
por polimerización de la acrilamida por acción
de un agente entrecruzador, es químicamente
inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rápida y reproducible.
Forma, además, geles transparentes con
estabilidad mecánica, insolubles en agua,
relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo
prolongado. Además tiene la ventaja de que
variando la concentración de polímeros, se
puede modificar de manera controlada en el
tamaño del poro, lamentablemente cada vez
se emplea menos en diagnostico debido a su
neurotoxocidad (Krause, 1996).
Figura No. 24.- Electroforesis en gel de gradientes (Krause, 1996).
El uso de geles de poliacrilamida que
tienen un gradiente creciente de concentración
de archilamida + bisacrilamida, y en
consecuencia un gradiente decreciente en eltamaño del poro, pueden tener ventajas sobre
los geles de concentraciones uniformes de
acrilamida. En un gel en gradiente la proteína
migra hasta alcanzar una zona donde el
tamaño de poro impida cualquier avance. Una
vez se alcanza el límite del poro no se produce
una migración apreciable aunque no se detiene
completamente. Una de las ventajas de este
tipo de geles es que resuelve mejor las bandaspues las concentra en regiones más estrechas,
además de incrementar el rango de
pesos moleculares que se pueden resolver en
un mismo gel comparado con los de una
concentración fija. (Krause, 1996).
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Figura No. 25.- Electroforesis en gel
de agarosa (Krause, 1996).
La agarosa es un polisacárido
(originalmente obtenido de algas, como el agar-
agar, pero de composición homogénea), cuyas
disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseenla propiedad de permanecer liquidas por encima
de 50 grados C y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel está constituido por una
matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de
medio líquido, que retarda el paso de las
moléculas, se usa usualmente para separarmoléculas grandes de alrededor 20.000
nucleótidos Krause, 1996 .
Figura No. 26.- Electroforesis capilar (Krause,1996).
La electroforesis capilar se basa
en los mismos principios de las técnicas
electroforéticas convencionales, pero
utiliza condiciones y tecnología distinta
que nos permiten obtener una serie de
ventajas al respecto, Esta separación de
péptidos realizada sobre un capilar de
silica fundida a potenciales elevados 20
a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire. (Krause, 1996).
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Figura No. 27.- Isoelectroenfoque
(Krause, 1996).
Se basa en el desplazamiento de las moléculas e
un gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como lo
aminoácidos, se separan en un medio en el que existe un
diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región de
ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos sestablece un gradiente de pH tal que las moléculas que s
han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro de
rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran e
regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estará
cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo
mientras aquellas que se encuentran en medios con p
más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carg
negativa y migraran hacia el ánodo. La migración le
conducirá a una región dónde el pH coincidirá con s
punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y s
detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas s
sitúan en estrechas bandas donde coincide su punt
isoeléctrico con el pH (Krause, 1996).
Figura No. 28.- esquema de una electroforesis
bidimensional
(Krause, 1996).
La electroforesis
bidimensional se basa en separarlas proteínas en una mezcla
según sus dos propiedades
moleculares, una en cada
dimensión. El procedimiento más
usado se basa en la separación
en una primera dimensión
mediante isoelectroenfoque y la
segunda dimensión según peso
molecular mediante electroforesis
en poliacrilamida. (Krause, 1996).
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La electroforesis permite separar bastante bien biomoléculas, donde la
cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa
molecular, difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración
en soporte (Cruz et al, 2016).
La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica
de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies
de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el
efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de
desplazamiento) adecuado (Cruz et al, 2016).
Tipos de módulos:
Fibras huecas-capilares: membrana de diámetro muy pequeño.
Tubular: se soportan mediante una vasija a presión.
Monolíticos: se convierte en un módulo mediante la conexión
de accesorios terminales y un medio de recolección de filtrado.
Espiral: la membrana de lámina puede adaptarse a un módulo
barato y compacto mediante enrollado espiralplaca y estructura: es el único modo comúnmente empleado en la ED (Cruz et al,
2016).
4.3.- CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA.
Es parte de los proceso de separación utilizada para separar moléculasdispersas en mezclas homogéneas (Cruz et al, 2016).
La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones,
desde el aislamiento de 1 µg. de muestra para identificación espectroscópica
hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La
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cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos aspectos,
desde la preparación de la papilla. Ésta debe hacerse con menos agua que de
ordinario. Una papilla más espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que
se precisa para una carga de mayor magnitud. El espesor óptimo oscila desde un
mínimo de 1 mm. hasta un máximo de 2 mm. (textoscientificos.com, 2007).
Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes, de
aproximadamente 20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de
mezcla utilizando unos 35 g. de adsorbente (textoscientificos.com, 2007).
La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o
tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una línea recta (existen en el
mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra
todavía queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la segunda,
intentando que ésta quede sobre la anterior, para así conseguir que el frente sea
lo más estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa
(textoscientificos.com, 2007).
Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografía. Se utiliza un
adsorbente con indicador fluorescente para ver en la lámpara ultravioleta dondehan quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas manchas se
marcan (textoscientificos.com, 2007).
Una vez localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase
estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de filtro u
otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un Erlenmeyer, y se
mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el compuesto se filtra varias
veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez separado se
elimina el disolvente (destilación), con lo cual se obtiene el componente separado
(textoscientificos.com, 2007).
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Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores
químicos sobre toda la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa
separando totalmente una pequeña franja de placa, sobre la cual se aplica el
revelador químico, y a partir de esta franja se marcan las franjas de compuestos
(textoscientificos.com, 2007).
4.3.1.- CLASIFICACIÓN.
De acuerdo al estado de agregación de la fase líquida los sistemas
cromatográficos se dividen en (Cruz et al, 2016):
Cromatografía de gases (GC).
Cromatografía líquida (LC).
Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC).
Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).
Cromatografía en capa fina (TLC).
De acuerdo a la naturaleza de las moléculas de adsorción y la
superficie del adsorbente (Cruz et al, 2016):
Moléculas gaseosas/Superficie sólida.
Moléculas líquidas/Superficie sólida.
Moléculas gaseosas/Superficie líquida.
Moléculas líquidas/Superficie líquida.
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4.3.2.- SELECCIÓN Y DISEÑO.
Selección.
Depende del:
Rendimiento.
Productividad.
Economía.
Escala de separación.
Velocidad de separación.
Presión. Adsorbente.
Fase móvil (Cruz et al, 2016).
Diseño.
Columna:
Corriente continua dado un diámetro interior y una longitud.
Acero inoxidable vidrio o materiales plásticos.
Estable mecánicamente y químicamente (Cruz et al, 2016).
Tabla No.8.- Diseño de la cromatografía.
Fuente: (Cruz et al, 2016).
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CONCLUSIONES.
Las bioseparaciones son muy importantes como una operación unitaria en
la producción de alimentos, ya que permite separar impurezas y/o sustancias deinterés que se encuentran en ellos, por medio de membranas capaces de retener
partículas diminutas de hasta diámetros de unas cuantas micras (0.1 a 15µ). Así
mismo, estas técnicas son muy utilizadas en la purificación del agua para hacerla
potable. Debido a que su finalizad es para consumo humano, ésta requiere de una
estricta calidad y cumplimiento de normas de higiene. Para ello, se aplican las
membranas, quienes son capaces de retener impurezas del agua, ya sea de
carácter físico, químico o biológico (en el caso de los microorganismos retenidos
que se encuentran presentes en el agua).
Gracias a la filtración por medio de membranas se pueden separar
endotoxinas, virus, proteínas, microplasmas, levaduras, hongos y bacterias.
Es importante mencionar que en una bioseparación interfiere la porosidad
del medio, la presión del filtrado, el área de la membrana, resistencia mecánica
del material, tiempo, temperatura, y el espesor.
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