UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA FACULTAD DE VETERINARIA
DOCTORADO EN VETERINARIA
UTILIZACIÓN DE COMPUESTOS TIOL EN LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES
A PARTIR DE OVOCITOS DE CABRAS PREPÚBERES
Tesis doctoral presentada como compendio de publicaciones por:
AIXA EFRAILDA URDANETA VARGAS
Bellaterra, Enero del 2005
II
Universitat Autónoma de Barcelona
Departament de Ciencia Animal i dels Aliments
María Teresa Paramio Nieto, Profesora Titular del Departamento de Ciencia Animal i
dels Aliments de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona,
Y
María Dolors Izquierdo i Tugas, Profesora Lectora del Departamento de Ciencia Animal
i dels Aliments de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona,
INFORMAN:
Que Aixa Efrailda Urdaneta Vargas ha realizado su trabajo de investigación sobre el
tema “Utilización de compuestos tiol en la producción in vitro de embriones a
partir de ovocitos de cabras prepúberes” en el Departament de Ciencia Animal i del
Aliments, bajo nuestra dirección y con el financiamiento del proyecto AGL2000-0353, con
la finalidad de aspirar al grado de Doctor.
María Teresa Paramio Nieto María Dolors Izquierdo i Tugas
Aixa Efrailda Urdaneta Vargas
Bellaterra, a 20 de enero de 2004
III
Al único y verdadero Dios.
A mis seres amados:
Mi esposo José Antonio
Mis hijas: Arianna y Aixa
Mi madre Bárbara
Mis hermanos: Saulo y Julexy.
IV
AGRADECIMIENTOS
• A Dios, ser supremo, creador de todo cuanto existe, por ser la fortaleza de mi vida.
• A mi tutora, Dra. María Teresa Paramio Nieto, eternamente agradecida
por su confianza, estímulo y apoyo, por entender en todo momento mi situación y ayudarme a alcanzar tan difícil reto.
• A la Dra. María Dolors Izquierdo i Tugas, mi codirectora de tesis, por su
amistad, estímulo e invaluable colaboración durante la realización de este trabajo.
• A mi esposo, M.V. José Antonio Romero Romero, por su apoyo
incondicional, paciencia y dedicación, por estar siempre a mi lado, creer en mí y contribuir a que este sueño se hiciera realidad.
• A mi madre, Sra. Bárbara V. de Urdaneta, por su amor, entrega y
dedicación. Eternamente agadecida por lo que haces por nosotros.
• A la Lic. Ana Raquel Jiménez y de Macedo, por su amistad, compañerismo, ayuda incondiconal, por confiar en mi y contribuir en cada una de las fases de este trabajo.
• A mis amigos venezolanos y compañeros de postgrado: Atilio, Xomaira,
Armando, Westalia, William, Denice, Wilfido, Ana Graciela, Antonio, Fanny, Jorge, Gilda, María, por todos los momentos compartidos, demostración de afecto, amistad, compañerismo y ayuda incondiconal.
• A mis amigos y compañeros estudiantes del doctorado: Begoña A, Rosa,
Zenón Gerardo, Jaime, Cristóbal, Paul, Juan, José Luis, Olga, Claudia, Ernesto, Ania, Marta, Lorena, por su amistad y compañerismo en la UAB durante la realización de este trabajo.
• A los compañeros becarios del laboratorio: Elizabeth, Esther, Pedro, Mar,
Marc, María José, gracias, a pesar del poco tiempo compartido, porque sus experiencias y estudios previos contribuyeron de una u otra manera en el desarrollo del presente trabajo.
• A la Sra. Eulalia Cortadella de Güell y su hijo Sr. Antonio Güell por su
amistad, afecto y hospitalidad en tierras catalanas.
• A los hermanos de la Iglesia Bautista de Cerdanyola, por su ayuda, afecto y hospitalidad durante mis estudios de doctorado, gracias tambén por sus oraciones.
V
• A la Ilustre �UNIVERSIDAD DEL ZULIA-VENEZUELA�, Institución responsable de mi formación y apoyo financiero durante mis estudios de doctorado.
• Al personal de la Cátedra de Histología y Embriología de la Facultad de
Ciencias Veterinarias de la Universidad del Zulia, en especial a la Dra. Zulamita Medina de Aguilar, Dr. Nelson Pirela C., Dra. Rafaela Muñoz G., y Dra. Rixa Rincón R., por asumir mi carga académica y sacrificar parte de su tiempo en pro de mi formación.
• A todas aquellas personas e instituciones que de una u otra manera
apoyaron el desarrollo de este trabajo.
VI
ABSTRACT Urdaneta-Vargas, Aixa Efrailda. 2005. Use of thiol compunds in the in vitro embryos production from prepubertal goat oocytes. 213 pp. Text in English With the aim of trying to improve in vitro embryo production (IVEP) from prepubertal goat oocytes, three studies were designed in this investigation. The objetive of first study was to assess, in oocytes selected by the brillant cresyl blue (BCB) test, the effect of the addition to in vitro culture (IVC) medium of either glutathione (GSH) alone or GSH in combination with glucose on the embryo development. Oocytes were exposed to BCB and were classified as: oocytes with a blue cytoplasm (BCB+) and oocytes without blue cytoplasm (BCB-). BCB+ oocytes showed higher percentage of nuclear maturation than the BCB- and control group (82.6%, 55.7% and 74.7%, respectively). The percentage of polyspermic oocytes was higher in BCB- than BCB+ oocytes. Supplementation of in vitro culture (IVC) medium with 1mM de GSH did not affect embryo development, but the porcentage of total embryos developed after culture was higher in BCB+ oocytes than in BCB- oocytes independently of the GSH supplementation. The addition of glucose, alone or with GSH, did not affect embryo development. The aim of the second study was to evaluate the effect of adding different concentrations (100µM, 200µM and 400 µM) of cyteamine to the IVM medium and to the in vitro embryo culture (IVC) medium (50 µM or 100 µM) on the embryo development of prepubertal goat oocytes BCB-selected. The addition of 400 µM cysteamine to the IVM improved normal fertilisation and embryo development of BCB- oocytes at the same rates as those obtained from BCB+ oocytes. The proportions of morulae plus blastocyst development were not affects by the treatments. Finally, was studied the effect of adding cysteamine (400 µM) to IVM medium, glutathione (1mM) to IVF medium and ionomycin to the sperm capacitation medium. This treatment improved normal fertilisation, zygotes with male pronucleus and embryo development of prepubertal goat oocytes, however did not improve blastocyst development. Key words: Goat, prepubertal, glutathione, cysteamine, IVF, ionomycin.
VII
RESÚMEN Urdaneta-Vargas, Aixa Efrailda. 2005. Utilización de compuestos tiol en la producción in vitro de embriones a partir de ovocitos de cabras prepúberes. 213 pp Texto en Castellano Con el fin de mejorar la producción in vitro de embriones (PIVE) desde ovocitos de cabra perpúber, fueron diseñados tres estudios en esta investigación. El objetivo del primer estudio fue determinar en ovocitos seleccionados mediante el test azul de cresol brillante (BCB), el efecto de la adición de gutatión (GSH) solo o en combinación con glucosa al medio de cultivo in vitro (CIV), sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra perpúber. Los ovocitos fueron expuestos al test de BCB y fueron clasificados como: ovocitos con citoplasma azul (BCB+) y ovocitos sin el citoplasma azul (BCB-). Los ovocitos BCB+ mostraron mayor porcentaje de maduración nuclear que los ovocitos BCB- y grupo control (82.6%, 55.7% y 74.7% respectivamente). El porcentaje de ovocitos poliespérmicos fue mayor en ovocitos BCB- que en los BCB+. La suplementación del medio de cultivo (CIV) con 1 mM de GSH, no afectó el desarrollo embrionario, pero el porcentaje de embriones totales desarrollados después del cultivo fue mayor en ovocitos BCB+ que en los BCB-, independientemente de la suplementación con GSH. La adición de glucosa, sola o con GSH no afectó el desarrollo embrionario. La finalidad del segundo estudio era evaluar el efecto de agregar diferentes concentraciones de cisteamina (100µM, 200µM o 400µM) al medio de MIV y al medio de CIV (50 µM o 100 µM) sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra perpúber seleccionados por el test BCB. La adición de 400 µM de cisteamina al medio MIV mejoró la fecundación normal y desarrollo embrionario de ovocitos BCB- a los mismos niveles de los ovocitos BCB+. Las proporciones de mórulas mas blastocistos desarrollados no fueron afectados por los tratamientos. Finalmente, fue estudiado el efecto de la adición de cisteamina (400 µM) para el medio de MIV, glutatión (1mM) al medio FIV e ionomicina al medio de capacitación espermática. Este tratamiento mejoró la fecundación normal, cigotos con pronúcleos masculinos y el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra prepuber, sin embargo no mejoró el desarrollo de blastocistos. Key words: Cabra, Prepúberes, GSH, Cisteamina, FIV, Ionomicina.
VIII
INDICE DE CONTENIDO Pág Constancia II Dedicatoria III Agradecimiento IV Abstract VI Resumen VII Indice de Contenido VIII Capítulo I: Introducción y Objetivos 1 1. Introducción 1 2. Objetivos 7 3. Referencias Bibliográficas 8 Capítulo II: Revisión Bibliográfica 12 1. Maduración del ovocito 12 1.1. Bases fisiológicas de maduración 12 1.1.1. Ovogénesis y foliculogénesis 12 1.1.2. Activación folicular, crecimiento y maduración del ovocito 14 1.1.2.1. Maduración nuclear 14 1.1.2.2. Maduración citoplasmática 16 1.1.2.3. Maduración de la zona pelúcida 18 1.2. Control de la maduración 20 1.2.1. Factores que inhiben la maduración 20 1.2.2. Control del reinicio y progresión meiótica 22 1.3. Maduración in vitro 25 1.3.1. Obtención de los ovocitos 25
1.3.1.1. Origen de los ovocitos 25
IX
1.3.1.2. Técnicas de recogida de los ovocitos
26
1.3.2. Factores que afectan a la calidad de los ovocitos
27
1.3.2.1. Edad de la hembra donante
27
1.3.2.2. Estimulación hormonal de la hembras donantes
28
1.3.3. Selección de los ovocitos
29
1.3.3.1. Selección según la morfología del ovario
29
1.3.3.2. Diámetro y/o aspectos de los folículos ováricos
29
1.3.3.3. Diámetro del ovocito
31
1.3.3.4. El test de azul de cresol brillante (BCB)
33
1.3.3.4.1. Propiedades y antecedentes
33
1.3.3.4.2. Vía de las pentosas fosfato y la enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenada (G6PD)
33
1.3.3.4.3. El test de BCB como métodos de selección para MIV-FIV
34
1.3.4. Factores que afectan a la maduración
36
1.3.4.1. Medio de cultivo
37
1.3.4.2. Condiciones de cultivo
37
1.3.4.3. Papel de las células del cumulus durante la MIV
39
1.3.4.4. Suplementación del medio de MIV
40
2. Fecundación de los ovocitos
42
2.1. Bases fisiológicas
42
2.1.1. Capacitación del espermatozoide
42
2.1.2. Penetración de las envolturas ovocitarias y reacción acrosómica de los espermatozoides
44
2.1.3. Fusión de los gametos 45 2.1.4. Activación del ovocito 46 2.1.4.1. Movilización del calcio intracelular y cambios del potencial de membrana 46
X
2.1.4.2. Exocitosis de los gránulos corticales y bloqueo de la poliespermia
47
2.1.4.3. Reanudación de la meiosis
48
2.1.5. Formación, desarrollo y migración de los pronúcleos. Formación del huso de la primera división mitótica
48
2.2. Anomalias de la fecundación
50
2.3. Factores que influyen sobre la eficacia de la FIV 52 2.3.1. Procedencia de los ovocitos
52
2.3.2. Preparación de los espermatozoides para la FIV
53
2.3.2.1. Técnicas de lavado y de separación de los espermatozoides del plasma seminal
54
2.3.2.2. Agentes capacitantes e inductores de la reacción acrosómica in vitro
55
2.3.2.3. Agentes químicos estimulantes de la motilidad espermática en la gota de FIV
56
2.3.2.4. Concentración espermática en el medio de FIV y tiempo de co-cultivo de los gametos
56
2.3.3. Sistema de cultivo durante la FIV
57
2.3.3.1. Condiciones de cultivo en la FIV: Temperatura, pH, atmósfera
57
2.3.3.2. Medios para el tratamiento del semen y la FIV 58 2.3.3.3. Presencia de células en el medio de FIV 59 3. Desarrollo embrionario
60
3.1. Primeros estadios de desarrollo embrionario 60 3.1.1. División embrionaria y formación del blastocisto 60 3.1.2. Activación del genoma embrionario y control de la embriogénesis 64 3.2. Cultivo in vitro de embriones 65
3.2.1.Condiciones de cultivo
66
XI
3.2.1.1. Temperatura y Luz
66
3.2.1.2. Atmósfera gaseosa
67
3.2.1.3. pH y osmolaridad
68
3.2.1.4. Calidad del agua y condiciones de esterilidad
69
3.2.2. Sistema de cultivo
70
3.2.3. Medio de cultivo
71
3.2.4. Suplementos del medio de cultivo
73
3.2.4.1. Substratos energéticos
73
3.2.4.2. Suplementos séricos
75
3.2.4.3. Factores de crecimiento
75
3.2.4.4. Co-cultivo celulares
76
3.2.5. Acondicionamiento del medio de cultivo con células somáticas 77 4. Compuestos tiol en la producción in vitro de embriones
78
4.1. Glutatión
78
4.1.1. Funcionalidad del glutatión
79
4.1.1.1. Acción redox del glutatión
79
4.1.2. Estructura y biosíntesis del glutatión
80
4.1.3. Síntesis del GSH durante la maduración del ovocito: Papel en la PIV
81
4.1.3.1. Papel del GSH en la descondensación de la cabeza del espermatozoide
82
4.1.3.2. Papel del GSH en la protección celular contra el daño oxidativo
83 4.1.3.3. Papel del GSH en el desarrollo embrionario 84 4.1.4. Efecto de la adición de compuestos tiol en la PIV 87
XII
4.1.5. Efecto de la adición de GSH en la PIV 87
4.1.5.1. GSH en el medio de MIV
88
4.1.5.2. GSH en el medio de FIV
88
4.1.5.3. GSH en el medio de CIV
90
4.1.6. Utilización de la cisteamina en la PIV
92
4.1.6.1. Propiedades de la cisteamina
92
4.1.6.2. Antecedentes y modo de acción
92
4.1.6.3. Cisteamina en el medio de MIV
93
4.1.6.4. Cisteamina en el medio de CIV
97
5. Referencias Bibliográficas
98
Capítulo III: Effect of addition of glutathione and glucose to the culture medium on embryo development of IVM-IVF prepubertal goat oocytes
129
Summary
130
1.Introduction
131
2.Materials and methods
133
2.1. Oocyte collection
133
2.2. Brillant cresyl blue test
133
2.3. In vitro maturation of oocytes
134
2.4. Sperm preparation
134
2.5. In vitro fertilisation of oocytes
135
2.6. Evaluation of oocytes after IVM and IVF
135
2.7. In vitro embryo culture
135
2.8. Statistical analysis
136
2.9. Experimental design
136
3. Results
137
3.1. Experiment 1 137
XIII
3.2. Experiment 2
139
4. Discussion
140
5. References
143
Capítulo IV: Supplementation with cysteamine during maturation and embryo culture on embryo development of pre-pubertal goat oocytes selected with brillant cresyl blue test.
148
Summary
149
1.Introduction
150
2.Materials and methods
151
2.1. Oocyte collection
151
2.2. BCB test
152
2.3. IVM of oocytes
152
2.4. Sperm preparation
152
2.5. IVF of oocytes
153
2.6. Evaluation of oocytes after IVM and IVF
153
2.7. In vitro embryo culture
154
2.8. Statistical analysis
154
2.9. Experimental design
155
3. Results
155
3.1. Experiment 1
155
3.2. Experiment 2
156
4. Discussion
160
5. References
163
Capítulo V: Cystesmine, glutathione and ionomycin treatments improve IVF of prepubertal goat oocytes
168
Summary 169
XIV
1. Introduction
170
2.Materials and methods
171
2.1. Oocyte collection
171
2.2. In vitro maturation of oocytes
172
2.3. Sperm preparation and capacitation
172
2.4. In vitro fertilisation of oocytes
173
2.5. Evaluation of oocytes after IVM and IVF
173
2.6. In vitro embryo culture
174
2.7. Statistical analysis
174
2.8. Experimental design
174
3. Results
175
3.1. Experiment 1
175
3.2. Experiment 2
177
4. Discussion
179
5. References
182
Capítulo VI: Discusión General
187
Capítulo VII: Conclusiones
195
Capítulo VIII: Anexos
196
Capítulo: I Introducción y Objetivos
1
CAPITULO I:
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1. INTRODUCCIÓN
La producción in vitro (PIV) de embriones mediante técnicas de maduración,
fecundación y cultivo embrionario in vitro (MIV, FIV, CIV) permite la obtención en
el laboratorio de un gran número de embriones que pueden utilizarse tanto para
estudios científicos como para su aplicación con fines comerciales.
La PIV de embriones posee varias aplicaciones en los programas de reproducción
animal entre las que podemos citar: la producción de un elevado número de
embriones en la misma fase de desarrollo, a bajo coste económico, necesarios en
muchos procesos biotecnológicos como la transferencia, la microdisección de
embriones, el sexaje, la clonación y la transgenia. También es posible la
obtención de una mayor descendencia en animales de gran valor genético, la
predicción de la fertilidad de los machos, el aprovechamiento de las hembras en
diferentes estadios reproductivos, animales muertos o con problemas de fertilidad,
así como también la posibilidad de utilización en los programas de recuperación
de especies en peligro de extinción.
En los últimos años, se han realizado considerables esfuerzos para mejorar las
técnicas de maduración, fecundación y cultivo in vitro de ovocitos de animales
domésticos. En algunas de estas especies se ha logrado transferir a hembras
receptoras embriones producidos in vitro y obtener animales vivos.
La recolección de cigotos y embriones a partir de hembras vivas, superovuladas,
es útil y posible, pero éstos suelen hallarse en diferentes estadios de desarrollo y
los costes de su práctica son elevados. El uso de ovarios recogidos en el
matadero como fuente de ovocitos para la PIV es útil para el desarrollo y permite
la realización de las nuevas tecnologías antes mencionadas.
Capítulo: I Introducción y Objetivos
2
El bovino es la especie en la que se ha desarrollado en gran medida estas
biotecnologías reproductivas y donde se ha observado un creciente interés y
considerables éxitos en la producción de embriones pre-implantacionales
mediante técnicas de FIV y clonación de embriones mediante transferencia
nuclear para la producción de animales transgénicos.
La utilización de la especie caprina en programas biotecnológicos como la
transferencia génica ofrece una serie de ventajas sobre el bovino, puesto que el
caprino posee diversos productos de valor comercial como son: leche, carne, piel,
etc. Así, a través de su leche se podrían obtener substancias interesantes para la
industria farmacéutica, y además podría mejorarse genéticamente las
características de la leche, quesos y carne (Ebert y Schinder, 1993). A nivel
experimental el caprino posee un período de gestación más corto, menor intervalo
generacional, gestación de mellizos y trillizos, mayor facilidad de manejo y menos
costos de manutención.
Si comparamos al caprino con otras especies domésticas, los trabajos realizados
sobre la FIV son pocos. Sin embargo, se ha demostrado que los ovocitos de esta
especie son aptos para ser fecundados y producir embriones viables en el
laboratorio. Ya se ha descrito el nacimiento de cabritos a partir de ovocitos
madurados y fecundados in vitro y cultivados temporalmente en oviducto de oveja
(Crozet y col., 1993). También a partir de ovocitos madurados, fecundados y
cultivados in vitro hasta el estadio de 4-8 células (Keskintepe y col., 1994a) o
hasta el estadio de blastocisto (Cognie y col., 1995; Keskintepe y col., 1996).
Por otro lado, algunos investigadores han utilizado hembras sexualmente
inmaduras como donantes de ovocitos para la FIV, tanto en especies de
laboratorio como en aquellas de interés ganadero (Duby y col., 1996). Utilizar
ovocitos de hembras prepúberes en esquemas de selección genética permitiría
reducir el intervalo generacional y de esta manera obtener resultados más
rápidamente, ya que estas hembras podrían tener descendencia antes de
alcanzar la pubertad (Duby y col., 1996).
Capítulo: I Introducción y Objetivos
3
Debido a que en España la carne de caprino comercializada procede
principalmente de animales lactantes de aproximadamente 2 meses de edad, en
nuestro laboratorio utilizamos ovocitos foliculares procedentes de ovarios de
cabras prepúberes sacrificadas en el matadero para su consumo. Esta fuente de
ovocitos es la más utilizada, ya que posee como ventajas la disponibilidad de un
abundante número de ovocitos y la reducción de los costes si los comparamos
con la utilización de animales vivos. No obstante, uno de los principales
inconvenientes del uso de ovarios procedentes del matadero es la gran
variabilidad del estado fisiológico de las hembras e implica el uso de hembras de
distinta edad, raza, estado nutricional, etc.
En los estudios realizados en nuestro laboratorio, tras la MIV de estos ovocitos se
ha observado que poseen una tasa normal de maduración meiótica, ya que
alcanzaron elevados porcentajes de ovocitos en estadio de metafase II (Martino y
col., 1994a). Sin embargo, tras la FIV se detectaron una serie de anormalidades
como la falta de descondensación de la cabeza del espermatozoide (Martino y
col., 1995; Mogas y col., 1997b) y la poliespermia (Martino y col., 1994b; Mogas y
col., 1997b). Posteriormente, el estudio citogenético de embriones de 2-4 células
demostró un elevado porcentaje de embriones haploides tras la MIV, FIV, CIV
(Villamediana y col., 2001) y el bajo porcentaje de embriones desarrollados hasta
el estadio de blastocisto ya que la mayoría de ovocitos divididos arrestan su
desarrollo en el estadio de 8 células (Izquierdo y col., 1999).
Estudios previos en nuestro laboratorio con ovocitos de cabras prepúberes
demostraron que ovocitos más competentes podrían ser seleccionados usando la
tinción azul de cresol brillante (BCB) (Rodríguez-González y col., 2002). Esta
tinción ayuda a determinar la actividad de la enzima glucosa 6-fosfato
deshidrogenada (G6PD), una enzima sintetizada por los ovocitos en crecimiento
pero con actividad disminuida en los ovocitos que han finalizado su fase de
crecimiento (Wassarman, 1988). Así, tras la exposición al colorante BCB, en los
ovocitos que han finalizado su fase de crecimiento disminuye la actividad de la
G6PD y exhiben un citoplasma con una coloración azul (BCB +), debido a que
Capítulo: I Introducción y Objetivos
4
esta enzima no reduce el BCB a un compuesto incoloro (BCB -). En el estudio
realizado por Rodríguez-González y col. (2002), los ovocitos BCB+ mostraron un
mayor diámetro, mayor porcentaje de maduración nuclear, una alta tasa de
fecundación normal y mayor número de embriones que alcanzaron el desarrollo
mas allá del estadio de 8 células que aquellos ovocitos sin coloración o no teñidos
(BCB-). Sin embargo, el desarrollo embrionario hasta el estado de mórula y
blastocisto no difirió estadísticamente del de los ovocitos BCB- (Rodríguez-
González y col., 2002).
Durante la fecundación el núcleo del espermatozoide es descondensado y
transformado en un pronúcleo masculino. Esta transformación del núcleo
espermático durante la FIV ha sido relacionada con los niveles de glutatión
intracelular (GSH) (Sutovsky and Schatten, 1997).
El GSH, es un tripéptido reductor (γ-glutamyl-cysteinyl-glycine) que interviene en
varios mecanismos del metabolismo celular tales como: transporte de
aminoácidos, síntesis de proteínas, DNA, reducción de puentes disulfuros y
protección de las células contra el daño oxidativo. Durante el desarrollo y
maduración del ovocito en el ovario, el contenido de GSH se incrementa a medida
que el ovocito se aproxima a la ovulación (Perreault y col., 1988). Cuando los
ovocitos son madurados in vitro, la síntesis de GSH puede ser estimulada por la
adición de compuestos tiol de bajo peso molecular.
Varios autores han estudiado el efecto de adicionar compuestos tiol (Glutatión
(GSH), Cisteamina, Cistina, Cisteína y β mercaptoetanol) a los medios de MIV,
FIV y CIV sobre el desarrollo del embrión. La adición de compuestos tiol al medio
de MIV ha mejorado el desarrollo de embriones de vaca (De Matos y col., 1995;
Luvoni y col., 1996; De Matos y Furnus, 2000) cabra (Rodríguez-González y col.,
2003a) búfala (Gasparrini y col., 2000) y oveja (De Matos y col., 2002b). La
cisteamina es un tiol de bajo peso molecular que al estar presente durante la MIV
y la CIV incrementa la concentración intracitoplasmática de glutatión en el ovocito
y el embrión. La adición de cisteamina al medio de MIV de ovocitos bovinos
Capítulo: I Introducción y Objetivos
5
mejora el porcentaje de blastocistos obtenidos (De Matos y col., 1995, 1996).
Resultados similares fueron encontrados en oveja (De Matos y col., 2002b), búfalo
(Gasparrini y col., 2000), cerdo (Grupen y col., 1995; Yamauchi y Nagai, 1999) y
ratón (De Matos y col., 2003).
En un intento por incrementar el desarrollo embrionario se ha estudiado la adición
de compuestos tiol al medio de MIV (Mayor y col., 2001; Rodríguez-González y
col., 2001). Estudios previos en nuestro laboratorio demostraron que 100 µM de
Cisteamina añadida al medio de MIV de ovocitos de cabras prepúberes
incrementaba los niveles de GSH intracelular y mejoraba significativamente el
porcentaje de formación del pronúcleo masculino y el desarrollo embrionario tras
la FIV (Rodríguez-González y col., 2003a).
En bovinos, De Matos y col. (2002) demostraron que el porcentaje de embriones
que alcanzaron el estadio de blastocisto incrementó cuando 100 µM de
Cisteamina se adicionaron al medio de MIV y los resultados mejoraron
posteriormente cuando 50 µM de cisteamina se adicionaron al medio de CIV.
En cabras adultas, Lee y col. (2000) cultivando embriones de 1 o 2 células
producidos in vivo en medio SOF (Fluido Oviductal Sintético) suplementado con
10% de FBS (Suero Fetal Bovino) y 1 mM de glutatión, encontraron que el 91% de
éstos se desarrollaron hasta el estadio de blastocisto. En este estudio se
demostró una fuerte y específica acción del GSH extracelular mejorando el
desarrollo in vitro de embriones de cabra pre-implantacionales, actuando
específicamente sobre el estadio de bloqueo de 8 a 16 células.
El GSH también ha sido utilizado durante la preparación del espermatozoide
durante la fecundación. Añadiendo GSH al medio del esperma de porcino (Jeong
y Yang, 2001) y bovino (Earl y col., 1997; Taneja y col., 1998) y/o al medio de FIV
en porcino (Boquest y col., 1999) y bovino (Van Soon y col., 1998) se han
obtenido mejoras en la formación del blastocisto. Así, en estos casos el GSH
podría ser beneficioso para la estabilización de la membrana del espermatozoide
Capítulo: I Introducción y Objetivos
6
y protegerlo contra el daño oxidativo, lo cual contribuye a mejorar la fecundación y
el desarrollo embrionario.
Por otro lado, Wang y col. (2002) mejoraron significativamente la FIV de ovocitos
caprinos cuando los espermatozoides fueron capacitados en presencia de 100-
200 nM de ionomicina y heparina. La ionomicina es un ionóforo de calcio que
puede incrementar la entrada de calcio a través de la membrana espermática e
inducir la reacción acrosómica (Ball y col., 1983) obteniéndose una mayor tasa de
fecundación si la comparamos con el tratamiento convencional del semen con
heparina (Wang y col., 2002).
Para mejorar la cantidad y calidad del desarrollo embrionario se requiere del
entendimiento de las necesidades metabólicas de los embriones pre-
implantacionales. Un diseño al cual se recurre para estudiar el metabolismo
embrionario consiste en estudiar el incremento del uso de la glucosa a medida
que progresa el desarrollo del embrión (Thompson y col., 1991). En el bovino, la
presencia de glucosa antes de la transición materno-embrionaria puede tener un
efecto detrimental sobre el desarrollo embrionario (Kim y col., 1993; Matsuyama y
col., 1993). Por otro lado, en ovinos, la adición de glucosa a los 3 días de cultivo in
vitro ha tenido un efecto positivo sobre el desarrollo hasta el estadio de mórula y/o
blastocisto (Ledda y col., 1992). En el porcino la actividad glicolítica en embriones
producidos in vitro se incrementó significativamente después de la fase de 8
células, mientras que en los embriones producidos in vivo en esta especie se
incrementó en el estadio de blastocisto (Swain y col., 2002). Así mismo, Lim y col.
(1994) después de adicionar diferentes concentraciones de glucosa al medio de
cultivo al 5º día post-inseminación (p.i) concluyeron que el porcentaje de
embriones desarrollados hasta el estadio de blastocisto mejoró significativamente
al adicionar 2.78 mM de glucosa en comparación con otras concentraciones de 0,
1.39, 4.17, 5.56 y 6.95 mM de glucosa.
Capítulo: I Introducción y Objetivos
7
2. OBJETIVOS
Este estudio fue realizado con la finalidad de incrementar la producción de
embriones procedentes de ovocitos de cabras prepúberes. Para ello los objetivos
parciales de este estudio fueron:
1.- Determinar el efecto de la adición de glutatión (GSH) al medio de CIV sobre la
capacidad de desarrollo de ovocitos de cabras prepúberes seleccionados
mediante el test azul de cresol brillante (BCB) y madurados con 100 µM de
cisteamina.
2.- Determinar el efecto de la doble suplementación del medio de cultivo con
glutatión y glucosa sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos de cabras
prepúberes.
3.-Evaluar el efecto de la adicion de diferentes concentraciones de cisteamina al
medio de maduración (MIV) sobre la maduración nuclear, fecundación y desarrollo
embrionario in vitro de ovocitos de cabra prepúberes.
4.- Evaluar el efecto de la suplementación del medio de cultivo (CIV) con 50 o 100
µM de cisteamina sobre el desarrollo embrionario in vitro.
5.- Mejorar el desarrollo in vitro de los embriones procedentes de ovocitos de
cabras prepúberes utilizando tioles en el medio de MIV (400 µM de cisteamina) y
FIV (1 mM de GSH) combinado con la utilización de ionomicina (200 nM) en el
medio de capacitación espermática.
Capítulo: I Introducción y Objetivos
8
3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ball, G.D., Leibfried. M.L., Lenz, R.W., Ax, R.L., Bavister, B.D., First, N.L. (1983).
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Capítulo: I Introducción y Objetivos
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Capítulo: I Introducción y Objetivos
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Capítulo: I Introducción y Objetivos
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Capítulo II: Revisión Bibliográfica
12
CAPÍTULO II:
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1. MADURACIÓN DEL OVOCITO 1.1. BASES FISIOLÓGICAS DE LA MADURACIÓN 1.1.1. Ovogénesis y Foliculogénesis
En la mayoría de mamíferos, los gametos (ovocitos y espermatozoides) se
originan mediante el proceso conocido como gametogénesis. Durante la vida
embrionaria las gónadas se desarrollan como dos eminencias o protuberancias a
lo largo de la porción ventral del mesonefros, denominados pliegues o crestas
genitales o gonadales. Las células germinales primordiales, que se originan en
la pared del saco vitelino cerca del alantoides, emigran por movimientos
ameboides siguiendo el mesenterio dorsal del intestino posterior alcanzando la
gónada indiferenciada. En la gónada genéticamente femenina, estas células
penetran en el mesénquima subyacente, rodeadas de cúmulos celulares aislados
diferenciándose en ovogonias (Sadler, 1996; Van den Hurk y col., 1997).
En los mamíferos las células germinales primordiales, al igual que las ovogonias,
entran en un período de actividad mitótica que se completa generalmente durante
la vida fetal en los rumiantes (Hirshfield, 1991; revisado por Van den Hurk y col.,
1997), mientras que en otras especies como el hámster, conejo, gato y cerdo se
prolongan hasta después del nacimiento.
Tras completar las divisiones mitóticas, las ovogonias se transforman en ovocitos primarios al entrar en el proceso de meiosis. Estas células se bloquean en el
diplotene (dictiotene) de la profase de la primera división meiótica.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
13
Poco después de su formación, los ovocitos primarios se rodean de una capa de
células planas, constituyendo así un folículo primordial, localizados en una
posición mas cortical dentro del ovario (revisado por Van den Hurk y col., 1997).
De la reserva de folículos primordiales, formados durante la vida fetal o poco
después del nacimiento, algunos comienzan a crecer gradual y sucesivamente
durante toda la vida o cuando menos hasta que dicha reserva se agota.
Con la activación e inicio de la foliculogénesis, el folículo primordial adquiere una
capa cuboidal de células de la granulosas y se le denomina entonces folículo intermedio, para luego transformarse en folículo primario; Esta transformación y
posterior crecimiento del folículo puede ocurrir en cualquier momento de la vida de
la hembra de los mamíferos, desde el período fetal, durante la pubertad,
gestación, hasta finalizar el período reproductivo (Gordon, 1994).
La multiplicación de las células de la granulosa originan varias capas de células
alrededor del ovocito, denominándose así, folículos secundarios. Durante esta
etapa de crecimiento del folículo, se forma, la zona pelúcida (ZP), una cubierta
glicoprotéica entre el ovocito en crecimiento y la capa mas interna de las células
de la granulosa, también se disponen fibras de tejido conectivo paralelas a la
membrana basal, ubicada por debajo de la granulosa para formar la teca, que al
final del período, esta constituida además por una red capilar y células epiteliales
que producen hormonas.
Finalmente el folículo secundario se transforma en folículo terciario con la
aparición de la cavidad antral.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
14
1.1.2. Activación folicular, crecimiento y maduración del ovocito
Con el inicio del desarrollo folicular se producen en el ovocito una serie de
cambios fisiológicos que lo capacitan para la fecundación y posterior desarrollo
embrionario (Leibfried � Rutledge y col., 1987). Este proceso puede dividirse en
dos fases: crecimiento y maduración del ovocito. Éstas coinciden
aproximadamente con el inicio de dos etapas de desarrollo folicular, la primera se
inicia con la foliculogénesis y su duración es bastante larga, mientras que la fase
de maduración se inicia tras el estímulo de folículo dominante por el pico de LH
preovulatorio, que desencadena la maduración en el ovocito e induce a nivel del
folículo un aumento de la actividad proliferativa de las células de la granulosa y
una acumulación de líquido folicular (Baker, 1982). Esta fase concluye con la
ovulación y su duración es mucho mas corta.
Durante la fase de maduración en el núcleo del ovocito finaliza el primer bloqueo
meiótico en estado de vesícula germinal (VG) y la meiosis evoluciona hasta
alcanzar la metafase ΙΙ (ovocito secundario). La meiosis queda bloqueada por
segunda vez en este punto, y sólo se completara en el caso que el ovocito sea
fecundado (Baker, 1982).
La maduración incluye no sólo cambios nucleares, si no también cambios en el
citoplasma, zona pelúcida, metabolismo del ovocito, y células foliculares que lo
rodean.
1.1.2.1. Maduración nuclear
En el ovocito, la maduración del núcleo es un proceso necesario que le permite
reducir la carga cromosómica de la especie exactamente a la mitad,
convirtiéndose en una célula haploide, así, cuando los dos gametos (ovocito
maduro y espermatozoide) se fusionan en la fecundación, se restablece el número
diploide de cromosomas en el embrión.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
15
Al inicio de la fase de maduración, el núcleo del ovocito primario (inmaduro), se
encuentra bloqueado en la profase (dictiotene) de la primera división meiótica,
estadio de vesícula germinal (germinal vesicle, GV) (Figura: 1). Tras alcanzar la
madurez sexual y en respuesta a la elevación preovulatoria de la hormona
luteinizante (pico de LH), el ovocito primario del folículo dominante reinicia el
proceso de división meiótica (Gordon, 1994). El núcleo del ovocito entra en
diacinésis, y al final de la profase Ι se disgrega la envoltura nuclear y ocurre la
ruptura de la vesícula germinal (germinal vesicle break down, GVBD) (Figura: 2).
Al mismo tiempo se produce una polimerización de los microtúbulos, desaparecen
los nucléolos y los cromosomas se condensan y se orientan formando el huso
acromático correspondiente a la metafase Ι . Los ovocitos carecen de centríolos
en los extremos del huso, en lugar de éstos, se encuentra un material
pericentriolar constituyendo los �centros organizadores de microtúbulos�.
Figura 1: Ovocito en Vesícula Germinal Figura 2: Ruptura de la VG.
Tras la metafase Ι , el ovocito entra rápidamente en la anafase Ι y la telofase Ι,
se separan los cromosomas homólogos y se produce la extrusión del primer
corpúsculo polar, se reduce el número de cromosomas a la mitad y se origina el
ovocito secundario. Esta nueva célula es de mayor tamaño (más citoplasma)
que el primer corpúsculo polar, debido a la posición excéntrica del núcleo del
ovocito y a la dirección adoptada por el eje del huso meiótico.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
16
A diferencia de la profase Ι, que es muy larga, la profase ΙΙ, prácticamente no
existe y el ovocito secundario comienza la segunda división meiótica, entrando
directamente a la metafase ΙΙ, en este momento la meiosis se interrumpe
nuevamente (segundo bloqueo) y el ovocito es ovulado. La segunda división
meiótica termina cuando el ovocito es penetrado por un espermatozoide y se
produce la extrusión del segundo corpúsculo polar.
1.1.2.2. Maduración citoplasmática
La maduración del ovocito implica además de los cambios nucleares, otra serie de
cambios a nivel del citoplasma y de sus membranas, que aunque no son tan
evidentes, poseen una gran influencia sobre la fecundación y futura capacidad de
desarrollo de los ovocitos.
Durante la maduración in vitro (MIV), se ha observado que ovocitos liberados de
los folículos antrales (no necesariamente folículos dominantes), y colocados en
medios adecuados de maduración, que con frecuencia incluyen gonadotropinas
(FSH, LH) y suero sanguíneo, son capaces de completar la maduración nuclear
espontáneamente, similar a los eventos que ocurren in vivo (Edwars, 1965;
Hunter y col., 1972; Thibault, 1977; citados por Suzuki y col., 1994). Sin embargo,
la fecundación in vitro (FIV) de estos ovocitos y el posterior desarrollo
embrionario han resultado menos eficiente al compararlos con aquellos
madurados in vivo (Greve y col., 1987; Leibfried � Rutledge y col., 1987; Thibault
y col., 1987). Estos hallazgos han sugerido que la maduración nuclear no es
suficiente y que los ovocitos requieren de un proceso de maduración
citoplasmática para lograr una fecundación y desarrollo embrionario normal (Ball y
col., 1983; Fukushima y Fukui, 1985; Mermillod y col., 1999).
La maduración citoplasmática puede definirse como una serie de cambios a nivel
citoplasmático que le confieren al ovocito maduro la habilidad para que se
produzca la correcta descondensación de la cromatina del espermatozoide y la
posterior formación de los pronúcleos tras la penetración espermática, así como
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
17
también la adquisición de competencia citoplasmática para soportar el desarrollo
embrionario temprano (Prather y Day, 1998; Mermillod y col., 1999).
La maduración citoplasmática del ovocito está formada por dos fases (Gordon,
1994):
a) Una fase inicial inductiva, que dura hasta la GVBD, durante la cual parece
producirse una reorganización de los elementos somáticos del folículo (células del
cúmulus, etc.), y en la cual los cambios estructurales y sintéticos son muy pocos.
b) Una fase de síntesis, que ocurre posterior a la fase inductiva, donde la mayoría
de los componentes del ovocito se organizan.
Se ha reportado que durante el período que transcurre entre la GVBD y la
metafase ΙΙ, se sintetizan varios factores indispensables para lograr una
fecundación normal. En este sentido se han mencionado el factor de crecimiento
del pronúcleo masculino (male pronucleus growth factor, MPGF) y el factor de
desarrollo del pronúcleo espermático (sperm pronucleus development factor,
SPDF) (Yanagimachi, 1981).
Durante la maduración citoplasmática del ovocito se producen una serie de
cambios importantes a nivel estructural y molecular, que se han estudiado
detalladamente en bovinos (Kruip y col., 1983) y en ovinos (Moor y Gandolfi,
1987). Cuando el ovocito se encuentra en el estadio de VG, posee un citoplasma
ocupado por vesículas y elementos del retículo endoplásmico rugoso (RER) y
mitocondrias ubicadas en la periferia. Durante la GVBD el RER desaparece y se
forma agregados de mitocondrias, gotas de lípidos y cisternas de retículo
endoplásmico liso (REL) denominadas �unidades metabólicas�. Al final de la
maduración, estos agregados se distribuyen homogéneamente por el citoplasma y
la mayoría de los orgánulos toman una posición en el centro del ovocito, excepto
los gránulos corticales (GC) que migran y se sitúan inmediatamente debajo de la
membrana plasmática del ovocito. La localización periférica de estos orgánulos y
la correcta exocitosis de su contenido hacia el espacio perivitelino es un evento
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
18
fundamental durante la fecundación, para evitar la penetración poliespérmica en
los ovocitos mamíferos (Moor y Gandolfi, 1987; Yanagimachi, 1994; Damiani y
col., 1996). Otros cambios observados durante la maduración, es la formación y
el ensanchamiento del espacio perivitelino y la reordenación de la unidades
metabólicas en ovocitos bovinos ovulados (Hyttel y col., 1986 a, b).
Durante la maduración citoplasmática se producen también cambios en la
actividad metabólica del ovocito, de hecho aumenta el metabolismo oxidativo a lo
largo del proceso (Rieger y Loskutoff, 1994). Asimismo, ocurren cambios en la
síntesis de proteínas y modificaciones transcripcionales de las mismas (Moor y
Gandolfi, 1987). La reprogramación de la síntesis proteica tras GVBD es esencial
para alcanzar la maduración meiótica, adquirir la capacidad de descondensar el
núcleo del espermatozoide que lo fecunda y el posterior desarrollo de los
pronúcleos. La formación de los pronúcleos tras la fecundación requiere la
prolongación de la síntesis de proteínas por lo menos hasta el estadio temprano
de metafase ΙΙ (Ding y col., 1992), así como también, para el desarrollo de un
embrión normal, puesto que existen evidencias que demuestran que algunas
proteínas sintetizadas durante la maduración, permanecen en los primeros
estadios de desarrollo embrionario (Moor y Gandolfi, 1987).
1.1.2.3. Maduración de la Zona Pelúcida
La zona pelúcida (ZP) es una envoltura externa, localizada entre la superficie del
ovocito y las células de la granulosa, es secretada por el ovocito en crecimiento y
su composición es específica de cada especie.
La ZP está constituida principalmente por glucoproteínas, pero también posee
polisacáridos, mucopolisacáridos y otras proteínas (Hafez, 1993; revisado por
Betteridge, 1995). Estructuralmente la ZP, tiene una apariencia fibrosa, similar a
una esponja, y a pesar de su compleja apariencia, en la mayoría de las especies
está compuesta por 3 tipos de glucoproteínas: ZP1, ZP2 y ZP3 (Harris y col.,
1994; Briggs y col., 1999).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
19
La zona pelúcida tiene importantes funciones en las fases iniciales de la
fecundación: es la responsable de la inducción de la reacción acrosómica en el
espermatozoide, es intermediaria en la especificidad de especie durante la
interacción de los gametos (O� Rand, 1988), previene la poliespérmia tras la
fecundación, bloqueando la penetración del ovocito por mas de un
espermatozoide (Crozet y Dumont, 1984) y protege al embrión en desarrollo
previo a la implantación (Modlinski, 1970 citado por McLeskey, 1998).
Aunque la ZP se sintetiza durante la fase de crecimiento del ovocito, la capacidad
para ser reconocida, inducir la reacción acrosómica y ser penetrada por el
espermatozoide, se adquiere posteriormente, hacia los estadios finales de la
maduración del ovocito (revisado por Thibault y col., 1987).
La maduración de la zona pelúcida implica cambios en su estructura, uno de esos
cambios, es el desarrollo de numerosos poros es su cara externa, los cuales son
llenados con proteoglicanos secretados por la células del cumulus, éstos
ayudarán al espermatozoide en la penetración de la ZP (revisado por Plachot y
Mandelbaum, 1990).
Durante la fase de maduración, previo a la ovulación, se inicia también una
transformación en las células que rodean al ovocito. desarrollándose complejos de
unión focales entre el ovocito y las células foliculares, así como también uniones
entre estas últimas; Estos complejos de unión se siguen manteniendo, mientras
que el área de contacto entre las células va disminuyendo hasta establecerse
finalmente la zona pelúcida. Mas tarde con la descarga del pico de LH, las
prolongaciones de las células de la corona (capa mas interna del cumulus
oophorus) se alargan, lo que resulta en la dispersión de las células del cumulus y
la zona pelúcida alcanza su madurez (Szöllösi, 1993).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
20
1.2. Control de la Maduración 1.2.1. Factores que inhiben la maduración
Los ovocitos de mamíferos están bloqueados en el estadio de diplotene
(dictiotene) de la primera profase meiótica, interrupción que finaliza una vez que
el animal ha alcanzado su madurez sexual y se producen las primeras
ovulaciones. En repuesta al pico preovulatorio de LH, el ovocito consigue
reemprender la meiosis con la ruptura de la vesícula germinal (GVBD), se
consideraba que la competencia para llevar a cabo esta ruptura era adquirida
durante el crecimiento folicular, sin embargo se ha observado que la GVBD es
independiente del crecimiento del ovocito (Canipari y col.,1984).
Se ha observado que ovocitos plenamente competentes no reinician la meiosis
antes del pico preovulatorio de gonadotropina; Ahora bien cuando estos ovocitos
con o sin células del cumulus, se cultivan fuera de sus folículos, reinician
espontáneamente la meiosis en cualquiera de las especies de mamíferos que han
sido estudiados (revisado por Thibault, 1987).
Esta evidencia y el hecho de que las células de la granulosa posean receptores
para la LH, a diferencia del ovocito, demuestra que el mantenimiento del primer
bloqueo meiótico y el posterior reinicio de la meiosis se basan en algún
mecanismo originado en las células de la granulosa, en otras palabras las células
foliculares son las responsables de esta interrupción de la meiosis (Thibault y
col., 1987).
Hasta estos momentos se han descrito por lo menos 3 inhibidores del reinicio de
la meiosis: el adenosin monofosfato cíclico (cAMP), el factor inhibidor de la
meiosis (Oocyte Meiosis Inhibitor, OMI) y las purinas.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
21
Adenosin monofosfato cíclico (cAMP)
Se ha observado que niveles elevados de cAMP en los ovocitos previenen la
GVBD del ovocito y por tanto el reinicio de la meiosis (revisado por Eppig y
Downs, 1984, 1988; Racowsky, 1991; Eppig, 1993).
Por otro lado, tanto en experimentos realizados in vivo como in vitro, se ha
observado una disminución de los niveles citoplasmáticos del cAMP entre la
GVBD y la metafase Ι (revisado por Thibault y col., 1987).
No se conoce exactamente si los niveles de cAMP presentes en el ovocito y que
intervienen en el bloqueo meiótico, son sintetizados por el ovocito o por las células
foliculares. Estas últimas sintetizarían el cAMP bajo el estímulo de las
gonadotropinas y éste pasaría libremente a través de las uniones gap que existen
entre las células y el ovocito. Después del pico preovulatorio de LH, a pesar de
producirse un incremento en la síntesis de cAMP en las células foliculares, la
disminución de esos niveles en el interior del ovocito es posible debido a un
incremento en la degradación del cAMP o bien una falta de transferencia,
provocada por la rápida disociación de las comunicaciones intercelulares.
Factor inhibidor de la meiosis (Oocyte Meiosis Inhibitor, OMI)
Tsafriri y Chaning en 1975, observaron que en el fluido folicular del cerdo existía
un componente que era capaz de inhibir la meiosis en ovocitos de cerdos y rata. A
este factor producido por las células de la granulosa se le denominó OMI (Oocyte
Meiosis Inhibitor).
El efecto inhibitorio del fluido folicular, así como de este factor sobre la meiosis no
ha podido ser demostrado por otros investigadores (Sirard y First , 1988).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
22
En otros trabajos se ha observado que la inhibición de la meiosis in vitro solo
ocurría cuando el contacto entre el complejo cumulus-ovocito y las células de la
granulosa era mas eficaz (Sato y Ishibashi, 1977; Leibfried y First, 1980; Thibault
y col., 1987).
Años más tarde se ha demostrado que el efecto inhibitorio de las células de la
granulosa es dosis dependiente y es amplificada por el líquido folicular o por
contacto directo con el ovocito (Sirard y col., 1992).
Purinas
Algunas bases y nucleósidos púricos (hipoxantina, adenosina, guanosina, etc.)
presentes en el fluido folicular de cerdo y ratón también podrían ser responsables
de la inhibición de la meiosis en el folículo (Downs y Eppig, 1985). Aparentemente
estas bases favorecen el mantenimiento de un nivel citoplasmático elevado de
cAMP, al inhibir la enzima responsable de su destrucción, la fosfodiesterasa
(Eppig, 1993).
1.2.2. Control del reinicio y progresión meiótica
El reinicio de la meiosis se basa en el postulado de dos hipótesis:
a) Eliminación de los factores inhibidores y b) Aparición de factores inductores.
a) Eliminación de factores inhibidores
El ovocito es capaz de reiniciar la meiosis solo cuando adquiere cierto tamaño
dentro del folículo (dominante). Tras la elevación preovulatoria de la hormona
luteinizante (pico de LH) y debido a la acción de la Hormona Folículo Estimulante
(FSH), las células del cumulus secretan ácido hialurónico que provoca la
separación física entre el ovocito y las células foliculares. La interrupción de la
comunicación entre el ovocito y las células foliculares provoca la eliminación del
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
23
efecto inhibidor de las células de la granulosa y la disminución del nivel
intracitoplasmático de cAMP en el ovocito (revisado por Thibault y col, 1987;
Eppig, 1991; Downs, 1993).
Los intentos por demostrar que la interrupción de la comunicación entre las
células foliculares y el ovocito suceden antes del reinicio de la meiosis son
contradictorios. Diferentes estudios han demostrado que esta interrupción no
ocurre hasta después de la ruptura de la vesícula germinal (Moor y col., 1981;
Eppig y Downs, 1988). Esta unión permitiría el paso de factores producidos por
las células de la granulosa necesarios para la maduración citoplasmática del
ovocito (Racowsky, 1991). Otra posibilidad es que sea un cambio cualitativo o
cuantitativo en la transferencia del factor inhibitorio el responsable de la
eliminación de la inhibición meiótica y no la separación física entre el ovocito y las
células foliculares (Moor y col., 1981).
b) Aparición de factores inductores - Factor inductor
Aunque no se ha confirmado su existencia de forma definitiva, varios estudios
suponen la aparición en las células foliculares de un factor inductor del reinicio de
la meiosis, que pasaría al ovocito a través de las uniones gap.
Se han mencionado como posibles candidatos: el calcio, algunos productos de la
glicólisis como el ATP o el piruvato, factores de crecimiento, prostaglandinas,
insulina y activina A (revisado por Racowsky, 1991)
- MPF (Maturation Promoting Factor o M-phase Promoting Factor)
Los trabajos de diferentes autores (Motlik, 1989; Procházka y col., 1989),
realizando microyección de citoplasma entre ovocitos, demostraron que los
ovocitos en fase de maduración contienen una sustancia no específica de especie
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
24
capaz de inducir la GVBD y la condensación cromosómica. Esta sustancia es el
factor promotor de maduración (MPF, maturating promoting factor ó M-phase
promoting factor). Este factor es capaz de inducir el paso de la fase G2 a la fase
M de la mitosis o meiosis en numerosas especies, desde anfibios, donde se
describió por primera vez, hasta en los mamíferos.
El MPF está compuesto por dos subunidades: Una subunidad reguladora, la
ciclina B, y una subunidad catalítica, la p34 (Nurse, 1990; Karp, 1996). El MPF,
presente en forma inactiva en los ovocitos inmaduros, se activaría por una serie
de reacciones de fosforilación-desfosforilación de sus subunidades,
desencadenando dos de los primeros cambios nucleares que ocurren tras el
reinicio de la meiosis, como son: la GVBD y la condensación de la cromatina
(Hashimoto y Kishimoto, 1988). Para ello se requiere de la síntesis de la ciclina B,
su reubicación en el núcleo y la desfosforilación de algunos residuos en la
subunidad catalítica (Naito y col., 1995).
La activación del MPF, se produce de forma cíclica. Su actividad aumenta para
inducir la metafase Ι, disminuye después de una proteólisis de la subunidad
ciclina, para permitir el paso a la anafase Ι y telofase Ι, y posteriormente vuelve a
activarse antes de la metafase ΙΙ (Hashimoto y Kishimoto, 1988; Mattioli y col.,
1991; Parrish y col., 1992). La formación de la segunda metafase requiere
nuevamente de la producción de niveles elevados de MPF-quinasa activa, esta
última es estabilizada por el producto mos del proto-oncogen c-mos y de esta
manera bloquea la progresión del ciclo celular en la metafase ΙΙ. La penetración
del espermatozoide y el incremento de las concentraciones de calcio intracelular
inducen una degradación de las ciclinas que permiten finalizar el ciclo meiótico
(Sagata, 1996).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
25
Síntesis proteíca
La síntesis de proteínas específicas, así como también de ARNm, es necesaria en
algunas especies de mamíferos para que se produzca el reinicio de la meiosis
(cerda: Moltík y Fulka, 1986; oveja: Moor y Crosby, 1986; Moor y Gandolfi, 1987;
vaca: Hunter y Moor, 1987), pero no así en el ratón donde la VGBD se produce
con inhibición de la síntesis de ARN y proteínas (Crozet y Szöllösi; 1980; Fulka y
col., 1986).
1.3. MADURACIÓN IN VITRO
Los sistemas de maduración in vitro tienen como finalidad conseguir en el
laboratorio que el ovocito continúe con las mismas transformaciones que sufre in
vivo durante el período de maduración folicular previo a la ovulación, de esta
manera se pueden obtener ovocitos viables para la interacción de los gametos, la
formación del cigoto y el desarrollo embrionario.
1.3.1. Obtención de los ovocitos
1.3.1.1. Origen de los ovocitos
Los ovocitos inmaduros utilizados para la maduración in vitro pueden ser
obtenidos a partir de:
a) Ovarios de hembras vivas, mediante la punción de los folículos por vía
laparoscópica.
b) Ovarios de hembras sacrificadas en el matadero.
c) Ovarios procedentes de hembras ovarioectomizadas.
La utilización de ovarios de matadero, procedentes del sacrificio comercial de las
hembras, es la fuente de ovocitos mas utilizada para la MIV, FIV y CIV, ya que
proporciona un mayor número de ovocitos si lo comparamos con los otros
sistemas, a un precio relativamente bajo. La desventaja de este sistema es la
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
26
variabilidad tanto del origen como del estado fisiológico de las hembras
sacrificadas, lo cual significa que los ovocitos obtenidos proceden de hembras de
diferentes razas, edades, condiciones de llegada al matadero, etc., generalmente
imprevisibles y desconocidos.
1.3.1.2. Técnica de recogida de los ovocitos
Para recoger los ovocitos de los folículos se utilizan principalmente 3 técnicas:
a) La disección, b) La aspiración y c) Los sistema de recogidas en masa.
a) La disección folicular (Lu y col., 1987, 1988) consiste en separar cada
folículo y una vez aislado, extraer el ovocito; esta técnica permite mantener la
máxima integridad de las células del cumulus que los rodean (Gordon, 1990;
Lonergan y col., 1991), así como también, identificar el grado de atresia folicular.
Aunque se pueden obtener ovocitos de mayor calidad, es necesario emplear
mucho tiempo para recuperarlos, con lo cual, su aplicación es limitada en
experiencias donde se requiere un gran número de ovocitos.
b) La aspiración de los folículos consiste en aspirar el contenido folicular
mediante una aguja conectada a una jeringa u otro medio de succión, extrayendo
el ovocito de la pared folicular, acompañada siempre de pérdida de las células del
cumulus (Gordon, 1990). Esta técnica es frecuentemente utilizada en bovinos por
la rapidez del procedimiento, además de permitir seleccionar los folículos según
su tamaño. Sin embargo, no se recuperan todos los ovocitos de los folículos
aspirados, solo un 30 a 60 %, o sea, disminuye la cantidad de ovocitos
recuperados por ovarios, y solo el 45% de los ovocitos son clasificados como
morfológicamente normales (Gordon, 1994).
c) Las técnicas de recogidas en masa se basan en la obtención del mayor
número de ovocitos del tejido ovárico, realizando cortes sucesivos, picando o
rallando los ovarios sumergidos en un medio de cultivo. Con estas técnicas se
recupera un gran número de ovocitos en poco tiempo, pero su calidad es muy
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
27
variable, ya que proceden de folículos de diversos tamaños y diferentes grados de
atresia, por lo que se hace necesario realizar una estricta selección de los
ovocitos antes de la MIV (Martino y col., 1994).
1.3.2. Factores que afectan la calidad de los ovocitos
1.3.2.1. Edad de las hembras donantes
En los diferentes laboratorios de FIV, se han utilizado como donantes de ovocitos,
tanto hembras sexualmente maduras (adultas) como también inmaduras o
prepúberes.
La utilización de ovocitos procedentes de hembras prepúberes presenta una serie
de ventajas al compararse con las hembras adultas, debido a la posibilidad de
reducir el intervalo generacional en los programas genéticos (Duby y col; 1996).
Desde el punto de vista productivo este hecho, permitiría una mejora genética
mas rápida, ya que hasta ahora, el intervalo generacional es un factor invariable, y
por tanto, limitante dentro de los esquemas de selección genética. Así, el uso de
animales prepúberes como donantes de ovocitos en especies económicamente
importante, permitiría reducir el tiempo entre generaciones y se iniciaría mas
rápido el testaje de la progenie en algunos programas reproductivos (Gordon,
1982). Así mismo, la combinación de la ovulación múltiple y la transferencia
embrionaria (MOET) con la FIV de ovocitos de animales prepúberes predice un
incremento en la ganancia genética sobre los programas convencionales de
testaje de progenie (Lohuis y col., 1995; Duby y col., 1996; Nicholas, 1996).
Estudios realizados en varias especies sugieren que la calidad y el número de
ovocitos obtenidos de hembras prepúberes es inferior a los de hembras adultas,
sin embargo la literatura existente aporta resultados contradictorios: Así, mientras
que algunos autores han observado que los ovocitos procedentes de animales
prepúberes tras la MIV, FIV y CIV, se desarrollan en menor grado que los
procedentes de animales adultos (bovino: Dahlhausen y col., 1981; Kajihara y col.,
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
28
1991; Torner y col., 1992; Palma y col., 1993; Revel y col., 1993), para otros
investigadores, los ovocitos de hembras prepúberes y los de adulta proporcionan
resultados similares de metafase ΙΙ tras la MIV (caprino: Martino y col.,1995;
Mogas,1994; bovino: Armstrong y col.,1992; Revel y col.,1995), tras la FIV y
primeros estadios de división (caprino: Mogas, 1994; bovino: Revel y col.,1995) y
tras el CIV hasta estadio de blastocisto (caprino: Mogas y col., 1997b; Koeman y
col., 2000; Izquierdo y col., 2002; bovino: Armstrong y col.,1994; Irvine y col.,1993;
Revel y col.,1993; Thonon y col.,1993; ovino: Earl y col.,1995; Ledda y col.,1996).
Armstrong y col. en 1992 observaron un mayor porcentaje de división y desarrollo
a partir de ovocitos de hembras prepúberes que los procedentes de hembras
adultas.
También se han producido nacimientos de terneros a partir de ovocitos ovulados
(Armstrong y col., 1992) o madurados in vitro (Kajihara y col., 1991; Revel y col.,
1995) procedentes de terneras prepúberes estimuladas hormonalmente.
1.3.2.2. Estimulación hormonal de las hembras donantes
Con la finalidad de incrementar el número de folículos por ovario con un diámetro
apropiado para contener un ovocito plenamente competente se han utilizados
tratamientos de estimulación ovárica con FSH ó PMSG antes de la recogida de
los ovocitos, sin embargo, los resultados entre diferentes laboratorios son
contradictorios.
El uso de tratamientos hormonales de estimulación ovárica presenta como
principales inconvenientes, la respuesta variable de las hembras estimuladas y la
posibilidad de una activación de los ovocitos antes de la recogida (Kumar y col.,
1990).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
29
1.3.3. Selección de los ovocitos
Para evaluar la calidad del ovocito, diferentes autores han empleado varios
criterios siguiendo diferentes esquemas de clasificación. La mayoría se basan en
la selección de los ovocitos siguiendo parámetros visuales de valoración
morfológica del complejo cumulus ovocito (COCs), el aspecto del citoplasma
ovocitario y el tamaño del ovocito. Otros métodos de selección empleados se
basan en la morfología del ovario, el diámetro folicular, y también el uso de una
tinción vital que evalúe el crecimiento del ovocito, es el caso del test azul de cresol
brillante (BCB).
1.3.3.1. Selección según la morfología del ovario
Para realizar una selección efectiva de ovocitos con mayor competencia para el
desarrollo, la morfología del ovario es un parámetro simple y no invasivo (Gandolfi
y col., 1997).
En un estudio realizado por Gandolfi y col., 1997, se dividieron los ovarios en
tres categorías basándose en:
A) La presencia de un folículo > 10 mm de diámetro.
B) La presencia de más de 10 folículos de 2-5mm de diámetro y ninguno de los
folículos de > 10mm.
C) La presencia de < 10 folículos de 2-5mm de diámetro y ningún folículo >10mm.
En este estudio se observó que COCs aislados de la categoría C presentaron
tasas menores de maduración así como también de formación de blastocistos y
con menos células/blastocistos que los de las categorías A y B.
1.3.3.2. Diámetro y/o aspecto de los folículos ováricos El diámetro folicular juega un papel muy importante en la selección de los
ovocitos, ya que varios estudios describen que la competencia de los ovocitos
para el desarrollo puede estar influenciada por el tamaño del folículo del que
procedan (Tan y Lu, 1990; Pavlok y col.,1992; Lonergan y col.,1994; Blondin y
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
30
col.,1995; Yang y col., 1998) y por su calidad (Hazelger y col., 1995; Carolan y
col.,1996; Mermillod y col., 1999).
La adquisición de la competencia meiótica y para el desarrollo ocurre de manera
progresiva en los ovocitos con el aumento del tamaño de los folículos y está
correlacionada con la transcripción de la síntesis de ARN nucleolar (Moor y col.,
1987; Fair y col., 1995; Briggs y col., 1999).
Estudios realizados en diferentes especies han indicado que los ovocitos que
proceden de folículos de pequeños diámetro son incapaces de reanudar la
meiosis o ésta se bloquea en el estadio de metafase Ι. (Moor y Trounson, 1977;
aDe Smedt y col., 1994; Fair y col., 1995). Barnes y col., en 1991, describieron
que los ovocitos bovinos procedentes de folículos de diámetro pequeño, a pesar
de ser capaces de realizar la maduración nuclear, eran citoplasmaticamente
inmaduros. Asimismo, Arlotto y col. (1996) observaron que ovocitos bovinos de
tamaño grande procedentes de folículos grandes tenían mayor capacidad para el
desarrollo que los que procedían de folículos más pequeños, a pesar de tener el
mismo potencial de maduración. Estos hallazgos, que describen la relación entre
la competencia para el desarrollo ovocitario y el tamaño folicular señalan
indirectamente una conexión entre el crecimiento del ovocito y la competencia
para el desarrollo.
En caprinos, también se ha descrito una relación entre el tamaño del folículo y la
adquisición de la competencia meiótica. De Smedt y col. (1994) describieron que
la adquisición de la competencia meiótica ocurre progresivamente durante el
crecimiento folicular. Así, observaron que ovocitos recuperados a partir de
folículos de 0.5 - 0.8 mm de diámetro eran capaces de reanudar la meiosis (con
VGBD), los ovocitos provenientes de folículos de 1.0 - 1.8 mm podían alcanzar la
metafase Ι, (Figura: 3) y los ovocitos procedentes de folículos mayores de 2
mm eran capaces de progresar a metafase ΙΙ (Figura: 4). Así, Crozet y col., 1995
han obtenido porcentajes de metafase ΙΙ del 70%, 83%, y 97% en los ovocitos
procedentes de folículos pequeños (2 - 3 mm), medios (3.1 - 5 mm) y grandes (>5
mm) respectivamente.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
31
Figura 3: Ovocito en MI Figura 4: Ovocito en MII
En cabras prepúberes se han observado resultados similares, puesto que la
mayoría de los ovocitos alcanzan la competencia meiótica en los folículos con
diámetro ≥ 3 mm (Martino y col., 1994). Así, con ovocitos procedentes de folículos
pequeños (1 - 1.9 mm de diámetro) se ha obtenido un 21.1% de metafase ΙΙ, con
los procedentes de folículos medianos (2 - 2.9 mm de diámetro) un 56.6% de
metafase ΙΙ, y con los de folículos grandes (3 - 6 mm de diámetro) un 74,8% de
metafase ΙΙ.
La apariencia macroscópica del folículo, también es un aspecto a tener en cuenta
para seleccionar ovocitos más viables. Se ha descrito que los ovocitos
procedentes de folículos translucidos debido a una avanzada atresia, tienen
reducida su viabilidad (Greve y Madison, 1991).
1.3.3.3. Diámetro del ovocito
La relación entre la competencia de desarrollo del ovocito y el tamaño folicular,
indirectamente indica la existencia de una relación entre el crecimiento del
ovocito y su capacidad de desarrollo (Otoi y col., 1997; Mermillod y col.,
1999). El crecimiento del ovocito lo capacita progresivamente para reanudar la
meiosis, y la competencia meiótica aparece cuando el ovocito presenta un 80-
90% de su tamaño máximo. Sin embargo hasta que no alcanza su tamaño
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
32
máximo no es capaz de llegar a la metafase ΙΙ y completar la maduración
(Thibault y col., 1987).
Los ovocitos bovinos adquieren la competencia meiótica completa al alcanzar 115
µm de diámetro, pero no alcanzan la competencia total para el desarrollo hasta
blastocistos con este diámetro, si no cuando posean 120 µm (Otoi y col., 1997).
En la especie ovina, se ha indicado que los ovocitos adquieren la capacidad para
continuar hasta metafase Ι cuando alcanzan el 80% de su tamaño total, pero son
incapaces de progresar hasta metafase ΙΙ si no se ha completado el crecimiento.
En ovocitos de ovejas prepúberes, la adquisición de la competencia meiótica,
estaría estrechamente relacionada con el diámetro del ovocito, ya que con
ovocitos de 142 µm de diámetro procedentes de ovarios de prepúberes y de
adultas se han obtenido similares tasas de maduración (79.8 vs 70.6%) (Ledda y
col., 1997, 1999).
En cabras adultas, Crozet y col., 2000, evaluaron la competencia meiótica de dos
grupos de ovocitos en crecimiento in vitro sobre monocapa de células de la
granulosa; el grupo A: < 95 µm y el grupo B: > 95 µm, después de 9 días de
cultivo, el 7% de los ovocitos del grupo A y el 42% de los del grupo B resultaron
competentes para reanudar la meiosis, asimismo los ovocitos de ambos grupos
acumularon la subunidad catalítica p34cdc2 del MPF. Estos resultados
demostraron que ovocitos procedentes de folículos antrales tempranos pueden
crecer, acumular p34cdc2 y adquirir la habilidad para reemprender la meiosis en
estas condiciones de cultivo.
En cabras prepúberes se ha observado un crecimiento del diámetro del ovocito en
la medida que aumenta el diámetro del folículo, así como también, una correlación
positiva entre el diámetro del ovocito y el porcentaje alcanzado de metafase ΙΙ
(Martino y col., 1994). Así, en un estudio realizado por Rodríguez y col., 2002,
se observó que empleando el test BCB, ovocitos clasificados como BCB+ (con un
diámetro promedio de 136 ± 6.3 µm) alcanzaron el estado de MII en 81.4%,
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
33
mientras que ovocitos BCB- (con un diámetro de 125 ± 10.3 µm), lograron el
52.5%.
En ovocitos porcinos, también se ha demostrado la relación entre el diámetro del
ovocito y la competencia meiótica (Motlik., 1989).
1.3.3.4. El test de azul de cresol brillante (BCB)
1.3.3.4.1. Propiedades y Antecedentes
El azul de cresol brillante (BCB) es una tinción catiónica oxazina que fue usada
comercialmente para estampar calicó (tela delgada de algodón) y teñir utilizando
como solución mordaz al tanino. Actualmente, el BCB se utiliza casi
exclusivamente como una tinción biológica con amplia aplicación en hematología
para la demostración y recuento de reticulocitos y plaquetas. Ha sido también
aplicado como método vital para la demostración de secreciones mucosas de los
celomatos marinos y como tinción vital para la identificación de células
estomacales aisladas y cultivadas de cobaya, aunque el mecanismo de tinción no
es muy claro (Geibel y col., 1995).
1.3.3.4.2. Vía de las pentosas fosfato y la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD).
La vía de las pentosas fosfato (PPP), es una de las rutas implicadas en el
metabolismo de los azucares, cuyo significado metabólico en los tejidos animales,
no es el de obtener energía de la oxidación de la glucosa, sino mas bien es una
ruta multifuncional cuyo fin primario es generar poder reductor en forma de
NADPH. Las enzimas implicadas en esta vía están localizadas en el citosol, lo que
indica que la oxidación no depende de la mitocondria o del ciclo de los ácido
tricarboxílicos. Otra función importante de esta vía es convertir hexosas en
pentosas, específicamente ribosa 5-fosfato. Esta azúcar de 5 átomos de carbono
y sus derivados son componentes del ATP, CoA, NAD, FAD, ARN y ADN. La PPP
también cataliza las interconversiones de azúcares de 3-, 4-, 6- y 7- átomos de
carbono, algunos de los cuales entran en la secuencia glucolítica.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
34
La actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es indispensable
para la síntesis de las pentosas, y para la protección de las células contra el
estrés oxidativo (Pandolfi y col., 1995). La G6PD se encuentra entre las proteínas
sintetizadas por los ovocitos inmaduros (Wassarman, 1988a). Ésta se sintetiza y
se acumula durante el estadio de crecimiento ovocitario (Mangia y Epstein., 1975).
El gen que codifica para la G6PD es un gen constitutivo, cuya expresión es
ubicua, se expresa en todo los tejidos y se replica durante la primera mitad de la
fase S del ciclo celular. Se han detectado transcripciones maternas para G6PD en
todo los estadios de ovocito y embriones humanos (Taylor y col., 1997).
La actividad de la G6PD es importante para el crecimiento celular y para la
regulación del nivel redox intracelular durante el crecimiento de las células, ya que
juega un papel importante al proporcionar NADPH, principal compuesto reductor
intracelular producido en la PPP (Tian y col., 1998). Así, la actividad de la G6PD
es mayor en células en proliferación.
Krisher en (1999) sugirió que la actividad de la PPP durante la maduración de
ovocitos bovinos es importante para mantener el potencial de desarrollo.
El nivel de la enzima G6PD ha sido semicuantificado en embriones por medio de
la modificación de un ensayo colorimétrico visual para la G6PD en sangre. Este
test mide la reducción de la tinción azul vital BCB a un componente incoloro. En
presencia del sustrato glucosa-6-fosfato (G6P) y el coenzima nicotinamida
adenina dinucleótido fosfato (NAPD), la G6PD convierte G6P a 6-fosfogluconato
y libera NADPH. La tasa de reducción de la tinción vital BCB por el NAPDH
constituye una medida semicuantitativa del nivel de G6PD (Motulsky y Campbell-
Kraut, 1962: citado por Williams, 1986).
1.3.3.4.3. El test de BCB como método de selección para MIV-FIV
El test de BCB ha sido empleado como método para evaluar la selección de
ovocitos porcinos para la MIV y FIV (Ericson y col., 1993). En este caso dicho test
se fundamenta en el hecho de que la enzima G6PD se sintetiza dentro del ovocito
durante la ovogénesis y solo es activa en aquellos ovocitos que aún no han
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
35
completado su crecimiento y no se tiñen, ya que la G6PD, reduce el BCB a una
tonalidad clara, mientras que los que han finalizado el crecimiento se tiñen de
azul. (Los ovocitos porcinos se clasifican dependiendo de la coloración azul que
presentan tras el período de incubación con BCB proporcionando un 47.8% de
ovocitos oscuros (color retenido), un 43.4% de ovocitos intermedios (color parcial)
y un 8.8% de ovocitos claros (incoloros)). Los ovocitos con color retenido u oscuro
presentaron mayores tasas de maduración, penetración, poliespermia y formación
de los dos pronúcleos que los ovocitos control. Así mismo, los ovocitos incoloros o
claros presentan menores porcentajes de estos parámetros que los ovocitos
oscuros y el control. Estos resultados sugirieron que la reducción de BCB, como
medida de la actividad de la enzima G6PD, estaba negativamente asociada con el
porcentaje de maduración del ovocito, fecundación y desarrollo de los pronúcleos
(masculino y femenino). Así la tinción de ovocito con BCB podría ser un método
útil para seleccionar ovocitos para MIV-FIV. Roca y col (1995) describieron que la
reducción del BCB como criterio para la selección de ovocitos inmaduros de
cerdos, es un test rápido y útil que puede mejorar el ensayo de penetración in vitro
homologa para valorar la capacidad fecundante de semen porcino.
En bovino, Pujol y col. en (2000) demostró que el test de BCB era una
herramienta útil para seleccionar ovocitos de ternera mas competentes antes de la
maduración in vitro. El porcentaje medio de ovocitos teñidos con esta técnica fue
del 62,4% (rango 50-77.5%). Los ovocitos clasificados como BCB + (Figura: 5)
presentan mayores tasas de división y blastocistos (76.4%, 9.2%) que los ovocitos
BCB � (45.1%, 0.7%) y los ovocitos de ternera empleados como control
(61.8%, 3.4%).
Sin embargo, no se encuentran diferencias en el número de células de los
blastocistos en los 3 grupos. Aunque evidentemente en los ovocitos clasificados
como BCB + existió una mejora en términos de desarrollo embrionario, el
porcentaje de blastocistos obtenido, no mejoro si lo comparamos con los ovocitos
de vaca adulta (23.8%), aunque la tasa de división fue similar en ambos grupos.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
36
Figura 6: Ovocitos BCB+ y BCB-
En un estudio reciente, Rodríguez y col. (2002), demostraron que el test de BCB
es un método útil para seleccionar ovocitos de cabras prepúberes mas
competentes para la producción in vitro de embriones. El porcentaje medio de
ovocitos clasificados como BCB + fue de 29.4%, el diámetro de éstos, fue
significativamente mayor que los ovocitos clasificados como BCB � (136.6 ± 6.3
µm vs 125.5 ± 10.2 µm). El porcentaje de ovocitos BCB + que alcanzó el estadio
de metafase ΙΙ, fue significativamente mayor que en los ovocitos BCB � (81.4%
vs 52.5%) y ovocitos control (72.4%). La tasa de fecundación normal, también
resultó mayor en los ovocitos BCB + que en los BCB - y control (23.5%, 8.2%,
11.9%) respectivamente. Asimismo el porcentaje de embriones totales tras
evaluar el desarrollo embrionario ≥ 8 células y mórulas mas blastocistos fue
significativamente mayor en el grupo de ovocitos clasificados como BCB + (41.3%
y 12.0%) respectivamente que en los ovocitos BCB� (21.3% y 3.6%)
respectivamente.
1.3.4. Factores que afectan la maduración
En la actualidad, todos los investigadores reconocen que las condiciones de
cultivo utilizadas para la maduración in vitro tiene una gran influencia sobre la
fecundación y el posterior desarrollo embrionario.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
37
1.3.4.1. Medios de cultivo
Los medios de cultivo utilizados para la maduración in vitro de los ovocitos son
muy diversos y comprenden desde el empleo de soluciones fisiológicas simples
como el Brinster�s BMOC-3 y el Krebb�s Ringer Tampon modificado, hasta medios
mas complejos como el TCM-199, el Ham�s F10, Ham�s F12 y el MEM, entre
otros. Aunque los medios antes mencionados han proporcionados resultados
satisfactorios, el TCM-199 (medio de cultivo tisular), es actualmente el medio más
ampliamente utilizado en los sistemas de MIV y FIV (Greve y Madison, 1991;
Bavister y col., 1992; Brackett y Zuelke, 1993). Este medio está formado por sales
de Earle suplementadas con piruvato, lactato, aminoácidos, vitaminas, purinas,
otras sustancias consideradas esenciales para los cultivos celulares en general.
También pueden contener los tampones HEPES y bicarbonato de sodio.
1.3.4.2. Condiciones de cultivo
- pH y Osmolaridad
Independientemente del medio utilizado, el pH óptimo para la maduración debe
oscilar entre 7,2 y 7,4 (Staigmiller, 1988).
El medio de MIV debe ser isotónico con los fluidos naturales de los tejidos. La
osmolaridad debe oscilar entre 285 y 320 mOsm/Kg, considerado el rango óptimo
que permite obtener porcentajes de maduración convenientes (Straigmiller, 1988;
Gordon, 1994).
- Condiciones de incubación
Atmósfera
La composición de la atmósfera gaseosa para una maduración óptima, está muy
relacionada con la composición del medio de cultivo empleado. Así, los medios
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
38
tamponados con bicarbonato necesitan un cierto nivel de CO2 para el normal
funcionamiento de las células y mantener constante el pH del medio. Mientras
que los medios en los que se ha empleado como tampón HEPES o fosfatos, no
necesitan una fase gaseosa controlada de CO2 para mantener relativamente
constante el pH.
Las condiciones atmosféricas óptimas para la MIV y FIV de ovocitos bovinos son
de un 5% de CO2 en aire (Pinyopummintr y Bavister, 1995).
Temperatura El cultivo de los ovocitos se realiza normalmente a la temperatura corporal
fisiológica de la especie en estudio, de la cual proceden los ovocitos. En el caprino
es de 38 - 39 ºC (revisado por Gordon, 1994).
- Tiempo de cultivo durante la maduración
El tiempo para completar la maduración in vitro es ligeramente diferente entre
especies. El tiempo de maduración necesario por los ovocitos de vaca y oveja
oscila entre las 24 y la 26 horas (revisado por Staigmiller, 1988; Greve y Madison,
1991).
Contrariamente los ovocitos de cerda requieren aproximadamente 48 horas para
completar la metafase ΙΙ (McGaughey y Polge, 1971) y el de cabra 27 horas (D�
Smedt y col., 1992; Kenkistepe y col., 1994; Martino y col., 1994; Crozet y col.,
1995).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
39
- Sistema de cultivo
Para la maduración in vitro de ovocitos se suelen utilizar dos sistemas de cultivo:
a) Microgotas de medio cubiertas con aceite mineral.
b) Mililitros de medio en una placa de petri, generalmente con células de la
granulosa.
En un estudio de maduración empleando ovocitos de cabras prepúberes, no se
encontraron diferencias entre los resultados obtenidos en ambos sistemas
(Martino y col., 1994).
1.3.4.3. Papel de las células del cumulus durante la MIV
La presencia de las células del cumulus, es quizás el factor principal entre los
existentes, para completar satisfactoriamente la maduración del ovocito
(Trounson, 1992). Las células del cumulus parecen no ser necesarias para la
maduración nuclear del ovocito (Chian y col., 1994). No obstante, su presencia
acelera el proceso de maduración, promoviendo la maduración normal del
citoplasma, demostrado por la reducción de las fecundaciones anormales
(Vanderhyden y Armstrong, 1989). La importancia de estas células se basan en la
impermeabilidad de la membrana del ovocito a varios metabolitos de bajo peso
molecular, tal es el caso de la colina, uridin, inositol, etc. El paso de estas
sustancias se cree ocurre exclusivamente por medio de los procesos celulares y
las uniones gap de las células del cumulus (Gordon, 1994). Durante la maduración
existe una cooperación metabólica entre el ovocito y las células del cumulus. De
hecho estas células permanecen en contacto, vía las uniones gap, durante todo el
período de maduración (Sutovsky y col., 1993). Además, estas células generan
señales que controlan y regulan el metabolismo del ovocito, así como también
muchos aspectos de su maduración (revisado por Greve y Madison, 1991). Así,
las células de la granulosa y/o del cumulus pueden actuar directamente sobre el
ovocito mediante sus uniones gap o a través de receptores para sus productos de
secreción (Thibault y col., 1987).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
40
1.3.4.4. Suplementación del medio de maduración
- Sueros
En la mayoría de los protocolos de maduración in vitro de ovocitos de mamíferos
es común la adición de macromoléculas de distintas fuentes, específicamente
algún tipo de suero para conseguir la expansión del cumulus, una maduración
completa del ovocito y un desarrollo embrionario normal. El suero es una
combinación compleja de componentes que incluye proteínas, ácidos grasos,
vitaminas, hormonas, elementos trazas y factores de crecimiento; actúa como una
fuente de albúmina que equilibra la osmolaridad y elimina moléculas
potencialmente perjudiciales e iones metálicos que pueden actuar como fuente de
radicales libres de oxígeno. Aunque no es necesario para completar la
maduración nuclear (Sus y col., 1988), varios autores indican la importancia del
suero para mantener la fecundabilidad y la viabilidad para el desarrollo de
ovocitos bovinos (Leibfried-Rutledge y col., 1986).
La suplementación de los medios de maduración con suero se ha utilizado de
forma regular en los sistemas de maduración in vitro para proporcionar una
fuente de proteínas y energía al ovocito durante la maduración.
El suero puede actuar por medio de las células del cumulus o directamente en el
ovocito. Los efectos beneficiosos del suero se basarían en el hecho de prevenir el
endurecimiento espontáneo de la zona pelúcida, ya que si éste se produce, el
espermatozoide no podría penetrarla (Eppig y Schroeder, 1986). Por tanto los
beneficios parecen estar ligados a su capacidad para mantener la penetrabilidad
de los ovocitos (Vanderhyden y Armstrong, 1989).
Las formas de suero bovino empleadas con más frecuencia han sido el suero fetal
bovino (FBS o FCS), el suero de vaca o hembra en estro (ECS u OCS), el suero
bovino de macho castrado (SS o DBS), el suero de vaca en proestro y el suero de
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
41
vaca superovulada (Gordon,1994). El suero de una hembra en celo es rico en
gonadotropinas (FSH, LH) y estradiol, mientras que estas hormonas se
encuentran en concentraciones mas baja en el FSB. Se ha demostrado que el
suero de macho castrado (SS, DBS) es igual de efectivo que el suero de hembra
en celo (OCS) (Lonergan, 1992, citado por Gordon, 1994).
En un estudio de la progresión de la organización citoesquelética y nuclear
durante la MIV de ovocitos de cabras se sugirió que el FBS no era suficiente para
alcanzar la progresión meiótica normal, mientras que la MIV en presencia de
suero de cabra en celo permitió una organización y una dinámica microtubular
normal (Palacios y col., 1998).
- Hormonas
La suplementación del medio de maduración con las hormonas gonadotrópicas
(FSH/LH) y esteroides (17 β-estradiol) demuestran resultados muy contradictorios.
Así mientras algunos autores describen un efecto beneficioso de tal
suplementación sobre la posterior fecundación y desarrollo embrionario
(Fukushima y Fukui, 1985; First y Parrish, 1987; Schellander y col, 1990; Mogas,
1994), otros no observan ningún efecto positivo (Sirard y col, 1988) y para
algunos incluso tiene un efecto negativo y perjudicial (Olson y col,1990; Galli y
Moor,1991).
En la MIV de ovocitos de cabras prepúberes, la suplementación del medio de
maduración con LH, FSH, y estradiol no mejoró la tasa de maduración pero si la
posterior fecundación y el desarrollo embrionario, los mejores resultados se
obtuvieron con 10 mg/ml de LH, 10mg/ml de FSH y 1 mg/ml de 17 β-estradiol
(Mogas, 1994).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
42
2. FECUNDACIÓN DE LOS OVOCITOS
La fecundación es un proceso complejo de interacción celular que tiene como
resultado la unión de los gametos femenino y masculino, la restauración del
número cromosómico somático de las especies y el inicio del desarrollo de un
nuevo ser. Para que la fecundación sea correcta es necesario que previamente el
ovocito haya madurado y el espermatozoide esté capacitado.
2.1. Bases Fisiológicas 2.1.1. Capacitación del espermatozoide
Austin y Chang en 1951, trabajando independientemente, observaron que los
espermatozoides de mamíferos procedentes del eyaculado deben permanecer
cierto tiempo en el tracto genital femenino para poder fecundar el ovocito
(Bazer y col., 1993).
En 1992, Austin propuso el término capacitación para definir los cambios
fisiológicos y bioquímicos que ocurren en el espermatozoide durante este tiempo y
que le permite adquirir la capacidad fecundante (revisado por Yanagimachi, 1994).
La capacitación espermática prepara el espermatozoide para adherirse y penetrar
el ovocito (Bazer y col., 1993).
La capacitación implica una serie de cambios intracelulares y alteraciones
bioquímicas de la membrana plasmática del espermatozoide, principalmente a
nivel de la cabeza.
El aspecto fundamental de la capacitación espermática es la remoción de la
cobertura de proteínas depositadas sobre el espermatozoide durante su recorrido
por el tracto genital masculino (revisado por Hernández, 2001). Se ha descrito la
eliminación gradual y/o alteración de las glucoproteínas periféricas, la
reordenación de las glucoproteínas integrales, la reducción en el colesterol de
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
43
membrana y los cambios en la distribución y composición de ciertos fosfolípidos
de membrana (Yanagimachi, 1981; Fournier-Delpech y Thibault, 1991, citado por
Izquierdo, 1996).
Los primeros eventos de la capacitación consisten en un reordenamiento
bioquímico de la membrana plasmática del espermatozoide que conduce a un
incremento en la permeabilidad al calcio, lo que resulta en un aumento de las
concentraciones intracelulares de este ion y de cAMP (Hunter, 1987).
In vivo la capacitación espermática no se produce en un sitio especifico del tracto
genital femenino, llevándose a cabo quizás en todas sus partes (Yanagimachi,
1994). Es un proceso espontáneo que puede ocurrir en una gran variedad de
medios artificiales sin presencia de ninguna hembra; Lo cual podría indicar que el
tracto genital femenino mas que inductor de la capacitación, regularía el proceso a
través de los distintos fluidos secretados por las diferentes porciones del tracto
(revisado por Yanagimachi,1994).
Durante la capacitación los espermatozoides de prácticamente todos los
mamíferos sufren un cambio en su movimiento flagelar. De esta manera, previo a
la reacción acrosómica o al mismo tiempo que ésta, se producen cambios
drásticos en el patrón de movimiento del espermatozoide, el cual pasa de una
movilidad progresiva y lineal a un patrón de movimiento flagelar asimétrico y
vigoroso con cambios frecuentes de dirección, y casi circular (revisado por
Yanagimachi, 1994). Este nuevo movimiento recibe el nombre de hiperactivación
espermática, la cual incrementa la probabilidad de los espermatozoides de entrar
en contacto con el ovocito, así como también atravesar las cubiertas ovocitarias
(Bazer y col., 1993).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
44
2.1.2. Penetración de las envolturas ovocitarias y reacción acrosómica de los espermatozoides.
En la mayoría de los mamíferos, en el momento de la fecundación, el cumulus
está todavía asociado al ovocito (Yanagimachi, 1988), mientras que en los
rumiantes este se pierde rápidamente justo después de la ovulación (Crozet,
1984; Crozet y Dumont, 1984; Crozet y col., 1987b; Hyttel y col., 1988b).
Se ha observado que los espermatozoides son capaces de atravesar las células
del cumulus sin haber sufrido reacción acrosómica (Cherr y col., 1986). Es más,
se ha observado también que esta envoltura es atravesada por los
espermatozoides capacitados que mantienen intacto su acrosoma (Crozet,
1991a). Por lo que el mecanismo más importante para la penetración del cumulus
parece ser la fuerza mecánica del espermatozoide y no la hialuronidasa liberada
durante la reacción acrosómica. Sin embargo la existencia de hialuronidasa
asociada a la membrana plasmática parece facilitar el paso de los
espermatozoides a través de la matriz de ácido hialurónico en aquellas especies
que la presentan (Yanigimachi, 1988). Se ha comprobado que la penetración del
cumulus no es especie específica (Yanagimachi, 1994).
Al llegar los espermatozoides a la zona pelúcida, estos se adhieren a ella y sufren
la reacción acrosómica, esta consiste en la fusión de la membrana plasmática del
espermatozoide con la membrana acrosómica externa (Hyttel y col., 1988b). La
formación de vesículas permite la salida de los enzimas existentes en el acrosoma
y la exposición y contacto de la membrana acrosómica interna con la zona
pelúcida. Este evento es indispensable para que el espermatozoide pueda
penetrar la zona pelúcida y entrar en contacto con la membrana plasmática del
ovocito (Crozet, 1991a). Todo este proceso es dependiente de Ca+2, cuya concentración aumenta intracelularmente debido a los cambios sufridos en la
membrana durante la capacitación (Kurpisz, 1993). Los espermatozoides una vez
capacitados se unen firmemente a las zonas pelúcida antes de penetrarla
mediante la interacción de proteínas altamente específicas y afines. La zona
pelúcida es una envoltura del ovocito formada esencialmente por glucoproteínas.
La zona pelúcida contiene tres glucoproteínas: llamadas Zona Proteína (ZP)
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
45
1, 2, 3 (ZP1, ZP2, ZP3) (Wassarmann, 1988b, 1990). La ZP1 es una proteína
estructural, la ZP2 es un receptor secundario del espermatozoide una vez que
este ha reaccionado, la ZP3 actúa como un receptor de espermatozoides
uniéndose a las proteínas presentes en la membrana espermática.
Después de efectuar su reacción acrosómica, el espermatozoide se desprende de
las vesículas acrosómicas en la superficie de la zona pelúcida y penetra a través
de ella siguiendo una trayectoria oblicua, lo que le permitirá conservar intacto el
segmento ecuatorial para fusionarse con la membrana plasmática del ovocito.
Esto sucede debido a la combinación de la acción mecánica, producida por el
movimiento hiperactivo de la cola y la acción de los enzimas acrosómicos, que
digieren componentes estructurales de la zona pelúcida (Yanagimachi, 1988).
2.1.3. Fusión de los gametos. Tras penetrar la zona pelúcida, la cabeza del espermatozoide cruza el espacio
perivitelino y entra en contacto con la membrana plasmática del ovocito. La
interacción de las membranas plasmáticas del ovocito y del espermatozoide
implica al menos dos pasos distintos: la unión y la fusión (McLeskey y col., 1998).
La unión, conlleva un contacto molecular de las dos membranas. Puede ocurrir en
cualquier punto de la superficie de la membrana plasmática del ovocito y puede
involucrar cualquier región de la membrana espermática incluyendo la membrana
acrosómica interna, ello sugiere que esta unión puede estar mediada por
interacciones celulares no específicas (Yanagimachi, 1994).
La fusión, el segundo paso, tiene requerimientos más estrictos si se le compara
con la unión. Requiere que se produzca la reacción acrosómica, ya que ésta, no
solo permite al espermatozoide atravesar la zona pelúcida sino que también
provoca cambios ultraestructurales profundos en la membrana que incluyen la
aparición y la migración de proteínas (Yanagimachi, 1994). La fusión solo ocurre
en dominios celulares específicos, así como también temperatura, pH y
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
46
condiciones iónicas precisas (revisado por McLeskey y col., 1998). La fusión rara
vez ocurre en el área sobre la placa metafásica (Shalgi y Phillips, 1980; Phillips y
Shalgi, 1982; Talansky y col., 1991). La región responsable del inicio de la fusión
es aun controversial, sin embargo el segmento ecuatorial del espermatozoide
parece ser esencial para la fusión con la membrana plasmática del ovocito
(McLeskey y col., 1998). Posteriormente de ésta, la región acrosómica es
transportada hacia el interior del ooplasma en una vesícula formada por la
membrana acrosómica interna del espermatozoide y la membrana plasmática del
ovocito (Hyttel y col., 1989b). A medida que este proceso transcurre comienza la
liberación del contenido de los gránulos corticales al espacio perivitelino.
2.1.4. Activación del ovocito
Con la penetración del espermatozoide, el ovocito es activado dando lugar a una
serie de eventos moleculares y morfológicos que permiten el desarrollo normal del
ovocito fecundado (Crozet, 1991a).
2.1.4.1. Movilización del calcio intracelular y cambios en el potencial de membrana
La activación del ovocito se inicia con la liberación masiva al citoplasma de las
reservas de calcio del retículo endoplasmático liso (Crozet, 1991a). El incremento
de la concentración de calcio intracelular produce un incremento de la
permeabilidad de la membrana al potasio, lo cual provoca cambios en el potencial
de la membrana. Estos cambios se manifiestan como una sucesión de
hiperpolarizaciones negativas a manera de ola comenzando cerca del sitio de
penetración del espermatozoide y propagándose hacia el resto de la membrana
del ovocito, este evento produce el primer bloqueo de la poliespermia (Sun y
col., 1994).
La principal hipótesis de como el espermatozoide dispara la liberación del calcio,
sugiere que el espermatozoide libera un factor activador que se difunde en el
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
47
interior del citoplasma después de la fusión espermatozoide-ovocito (Mehlmann y
Kline, 1994).
El incremento intracelular de Ca2+ durante la fecundación resulta en la inactivación
del factor citostático (mos) y en la degradación de la ciclina B, causando la
inactivación del MPF. Los incrementos repetidos de Ca2+ que se inician con la
fecundación continúan durante la extrusión del corpúsculo polar y parece que se
detiene con la formación de los pronúcleos (Keith Jones, citado por Kline, 1996).
2.1.4.2. Exocitosis de los gránulos corticales y bloqueo de la poliespermia
Durante la fecundación y tras la activación, los gránulos corticales alineados por
debajo de la membrana plasmática del ovocito maduro sufre un proceso de
exocitosis de su contenido hacia el espacio perivitelino, al que se le denomina
reacción cortical. La exocitosis de estos gránulos corticales se produce como
consecuencia de la movilización del Ca2+ intracelular, estos gránulos contienen
enzimas hidrolíticas, entre ellas, proteasas y peroxidadas que modifican la zona
pelúcida induciendo la reacción zonal (Hyttel y col., 1988a). Esta reacción
consiste en una modificación de las características químicas y físicas de la zona
pelúcida, que da lugar al endurecimiento de su estructura y una modificación de
los receptores para los espermatozoides que existen en ella. Así, estas enzimas
inhiben la parte oligosacarida de la ZP3, zona de unión con los espermatozoides
capacitados, e hidrolizan la ZP2, receptor para los espermatozoides reaccionados.
Estos cambios representan un mecanismo para prevenir la poliespermia.
El bloqueo de la fecundación poliespérmica no se restringe a la zona pelúcida,
también tiene lugar en la membrana plasmática del ovocito (Crozet, 1993).
Durante la fecundación in vitro, se produce una mayor proporción de ovocitos
poliespérmicos que en la fecundación in vivo (Xu Y Greve, 1988; Hyttel, 1989a).
La poliespermia se relaciona con anomalías en la liberación y dispersión del
contenido de los gránulos corticales. La causa de la poliespermia en los ovocitos
podría tratarse de la no dispersión del contenido de los gránulos, por un retraso en
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
48
la migración periférica de los gránulos corticales durante la maduración in
vitro, mientras que la falta de dispersión del contenido es debido al ambiente que
existe durante la fecundación in vitro (revisado por Hyttel y col., 1989a).
2.1.4.3. Reanudación de la meiosis
En la mayoría de los mamíferos vertebrados los ovocitos son fecundados en el
estadio de metafase de la segunda división meiótica. Durante la activación del
ovocito, éste reemprende la meiosis continuando con la anafase ΙΙ, la telofase ΙΙ,
dividiéndose asimétricamente en dos células de tamaño distinto: el ovocito
fecundado y el segundo corpúsculo polar.
2.1.5. Formación, desarrollo y migración de los pronúcleos
- Formación del huso de la primera división mitótica La formación de ambos pronúcleos (masculino y femenino) ocurre en la periferia
del cigoto y de manera prácticamente simultánea (Hyttel y col., 1988a). Antes de
transformarse en un pronúcleo masculino funcional, la cabeza del
espermatozoide, sufre una serie de modificaciones (Crozet, 1991a). Una vez
incorporado el espermatozoide al citoplasma del ovocito se produce la separación
entre su cabeza y su cola y su membrana nuclear comienza a degenerar, de esta
manera, la cromatina paterna queda expuesta al citoplasma materno. El primer
paso en la transformación del núcleo espermático es la reducción de los puentes
disulfuro de las protaminas asociadas al ADN, probablemente por acción del
glutatión reducido (GSH), las protaminas parecen ser eliminadas y se produce la
descondensación de la cromatina (revisado por Yanagimachi, 1994).
Posteriormente, el ADN es empaquetado con histonas de origen ovocitario y se
forma una nueva envoltura nuclear alrededor de la cromatina, formándose así el
pronúcleo masculino.
La transformación del núcleo espermático en un pronúcleo masculino es un
proceso complejo en el que también intervienen degradaciones enzimáticas,
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
49
fosforilación proteica, modificaciones de carga, etc. (Crozet, 1991a) y para que se
realice con normalidad es necesario que el ovocito esté citoplasmáticamente
maduro, que en el citoplasma ovocitario se haya sintetizado el factor MPGF-
male pronucleus growth factor (Thibault y Gerard,1973, citado por Yanagimachi,
1981), y glutatión (GHS) cuya forma reducida pudiera participar en la
descondensación de la cromatina espermática (Crozet, 1993).
En las primeras etapas, la cromatina femenina está en un estado de
condensación mayor que la masculina. Tras completar la segunda división
meiótica, los cromosomas femeninos son rodeados por una envoltura nuclear y se
forma el pronúcleo femenino (Hyttel y col., 1988a).
Tras la activación, el ovocito pasa progresivamente del estado metafásico al
interfásico (Crozet, 1991a). La síntesis activa del ADN materno y paterno,
correspondiente a la fase S del primer ciclo celular, se efectúa de forma
simultánea en ambos pronúcleos, pero su replicación no comienza hasta que los
pronúcleos no están completamente desarrollados, (Figura: 7), (Crozet, 1991ª;
Laurincik y col., 1996).
Figura 7: Fecundación normal (2 pronúcleos)
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
50
Durante el primer ciclo celular del cigoto se producen cambios en los perfiles de
síntesis proteica, los cuales están controlados, de una parte por el programa
propio del ovocito y de otra, por un programa de fecundación desencadenado por
la penetración del espermatozoide (Crozet, 1991a).
Los pronúcleos formados a la periferia del ovocito, se desplazan hacia el centro
del cigoto, gracias a la restauración del citoesqueleto, hasta que sus membranas
se encuentra en estrecha aposición, los cromosomas se condensan, iniciándose
la profase de la primera división mitótica y las membranas de los pronúcleos se
ondulan y se rompen (Yanagimachi, 1994). Al final de la profase, en el cigoto se
pueden observar 2 grupos distintos de cromosomas condensados, los de origen
paterno y los maternos. En el transcurso de la metafase ambos grupos de
cromosomas migran hacia la placa metafásica de la primera división mitótica, en
donde se alinean. Luego las cromátidas hermanas se separan, migran en
direcciones opuestas, se forman las membranas nucleares, ocurre la
citocinesis y observamos la primera división embrionaria, con la formación de 2
blastómeras diploides como en cualquier proceso mitótico.
2.2. Anomalías de la Fecundación
Las anomalías durante la fecundación in vivo se producen de forma muy
esporádica (Hyttel y col., 1988b). Sin embargo en los sistemas de MIV y FIV, la
frecuencia de estas anomalías aumenta. Las anomalías nucleares más comunes
en la FIV son la poliespérmia, la asincronía entre el desarrollo del pronúcleo
masculino y del femenino, la poliginia y la partogenesis.
La poliespérmia, (Figura: 8) o penetración del ovocito por más de un
espermatozoide, es una de las anomalías nucleares más frecuentes durante la
fecundación in vitro de ovocitos madurados tanto in vivo (Hyttel y col., 1988c)
como in vitro (Hyttel y col., 1988b), pudiéndose generar embriones poliploides.
Parece ser debida a un fallo en la exocitosis y/o dispersión del contenido de los
gránulos corticales bajo la membrana plasmática. La poliespérmia también se ha
asociado a la fecundación de ovocitos inmaduros, debido a una incorrecta
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
51
migración y exocitosis de dicho gránulos (Cran, 1989), como de ovocitos
sobremadurados (Pavlok y col., 1988), o por una disminución en la efectividad de
las enzimas corticales sobre la zona pelúcida (Long y col., 1994).
Figura 8: Cigoto poliespérmico.
La asincronía en el desarrollo de los pronúcleos (Figura: 9), se caracteriza por un
retraso u error en la formación y/o desarrollo de uno de los pronúcleos, pero
principalmente del pronúcleo masculino (Xu y Greve, 1988; Saeki y col., 1991), y
este hecho se ha atribuido a una falta del factor citoplasmático responsable de la
descondensación de la cabeza del espermatozoide, el MPGF, debido a una
maduración citoplasmática deficiente (Thibault y Gerard, 1973). Otras causas
posibles de esta anomalía podrían ser la omisión de la LH o de la HCG del medio
utilizado para la FIV (Ijaz y Hunter, 1989) o bien la FIV de ovocitos
sobremadurados (Chian y col., 1992).
Figura 9: Fecundación asincrónica
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
52
La poliginia, es una anomalía producida por el fallo en la extrusión del primer y/o
segundo corpúsculo polar (Xu y Greve, 1988) o por la fragmentación del
pronúcleo femenino, lo cual da como resultado un cigoto con un grupo extra de
cromosomas femeninos (Anderson, 1991).
La partenogénesis ha sido descrita como la producción de un embrión a partir de
un gameto femenino sin la participación del gameto masculino (Beatty, 1957,
revisado por Mogas, 1994). La pre-activación de la citocinesis es distinta de la
fragmentación, ya que comprende una división simétrica del ooplasma similar a
una citocinesis normal (Xu y Greve, 1988). Esta activación puede ocurrir una vez
que los ovocitos son madurados y sufren envejecimiento en el medio de cultivo
(Ware y col., 1989). También puede ser provocada por el pH, los componentes del
medio y la calidad de los ovocitos (Sato y col., 1988). La frecuencia de la
activación partenogenética puede depender de la composición química del medio
de cultivo y el tiempo de co-cultivo de los dos gametos (Ayoub y Hunter, 1993).
2.3. Factores que influyen sobre la eficacia de la FIV
La eficacia de la fecundación in vitro, depende de una correcta maduración del
ovocito y la capacitación del espermatozoide. Son varios los factores que pueden
tener efecto sobre los resultados de la fecundación. Así, durante la FIV se han de
tener en cuenta la procedencia de los ovocitos, la concentración de los
espermatozoides, el tiempo de interacción de los gametos, el medio utilizado, las
condiciones de cultivo, y también la suplementación del medio. Estos factores
pueden interferir significativamente en el éxito de la FIV y por tanto en el
subsiguiente desarrollo embrionario.
2.3.1. Procedencia de los ovocitos
En la FIV se pueden utilizar ovocitos ovulados (madurados in vivo) o provenir de
un tratamiento de maduración in vitro. Diversos autores han descrito una
menor capacidad de desarrollo de los ovocitos bovinos madurados in vitro con
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
53
respecto a los madurados in vivo (Leibfried-Rutledge y col., 1987; Laurincik y col.,
1994). Pero otros no (Crozet y col., 1987a).
En el caprino se han descrito niveles parecidos de penetración total y fecundación
normal empleando ambos grupos de ovocitos (De Smedt y col., 1992; Crozet y
col., 1995; Martino y col., 1995).
La estimulación ovárica con tratamientos hormonales da como resultado
respuestas muy variables. De esta manera, después de la FIV los resultados con
ovocitos provenientes de hembras estimuladas son igualmente variables
(Armstrong y col., 1992,1994; Duby y col., 1995).
Se ha demostrado que a partir de ovocitos de animales prepúberes se puede
producir descendencia viable tras MIV-FIV-CIV (Kajihara y col., 1991; Amstrong y
col., 1992, 1997; Revel y col., 1995; O�Brien y col., 1996; Khatir y col., 1998; Ptak
y col., 1999).
2.3.2. Preparación de los espermatozoides para la FIV
En la metodología de preparación de los espermatozoides para la FIV, se debe
tener en cuenta la efectividad del sistema de capacitación utilizado, de modo que
se pueda controlar la poliespérmia y garantizar que los espermatozoides puedan
fecundar los ovocitos.
Un factor importante a tomar en cuenta es el origen del semen, si se trata de
semen fresco o congelado. Se ha demostrado que los espermatozoides
procedentes de semen fresco requieren de un periodo de incubación más largo
para su capacitación que los procedentes de semen congelado (Wheeler y Seidel,
1986). El uso de semen fresco también produce mejores tasas de penetración
(Seaton y col., 1991), el problema que presenta es que su calidad es menos
predecible, debido a las posibles diferencias de los eyaculados. También se ha
observado que los espermatozoides de distintos machos difieren no solo en la
capacidad de fecundar ovocitos in vitro (Hanada, 1985; Fukui y col., 1988), si no
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
54
también tienen su influencia sobre el desarrollo embrionario (Fukui y col., 1988).
Estas diferencias podrían deberse a variaciones en la edad de los machos
(Sirard y Lambert, 1985), a las condiciones ambientales y de manejo, a la
composición del plasma seminal, relación entre el volumen y número de
espermatozoides del eyaculado (Fukui y col., 1988).
2.3.2.1. Técnicas de lavado y de separación de los espermatozoides del plasma seminal
Después de obtener el semen, procedente del eyaculado para el caso de semen
fresco o bien si es congelado, el siguiente paso consiste en lavar los
espermatozoides, en el primer caso para eliminar el plasma seminal, puesto que
éste contiene sustancias que estabilizan la membrana plasmática del
espermatozoide e impiden su capacitación y posterior reacción acrosómica (First y
Parrish, 1987) y en el segundo caso, para eliminar los crioprotectores y/o
conservantes utilizados.
Para lavar el semen y concentrar la fracción de espermatozoides móviles, han
sido propuestas numerosas técnicas en la bibliografía. La mas convencional y
utilizada es el método del �swim-up� (nadar hacia arriba) (Berger y col., 1985;
Parrish y col., 1986). También han sido utilizados otros métodos como: la
centrifugación en gradientes de densidad de BSA (White y col., 1984) o percoll
(Utsumi y col., 1991; Seidel y col., 1995), o la separación mediante columnas de
lana de vidrio o de sephadex (Stubbings y Wosik, 1991).
Con eyaculados caprinos, al comparar algunas de las técnicas de lavado y
selección tales como el swim-up, percoll, ficoll y centrifugación e incluso entre
éstos y la simple dilución del eyaculado, no se encontraron diferencias en los
resultados de fecundación y división entre los diferentes sistema (Palomo,1995),
lo cual parece indicar que cuando el semen es de buena calidad, un número
suficiente de espermatozoide son capaces de capacitarse, reaccionar y penetrar
ovocitos in vitro, aunque previamente no hayan sido seleccionados e incluso
lavado el plasma seminal pero sí muy diluido en el medio.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
55
2.3.2.2. Agentes capacitantes e inductores de la reacción acrosómica
in vitro
Desde que Chang (1951) y Austin (1951) señalaron la necesidad de que los
espermatozoides fueran capacitados para adquirir el poder de fecundar ovocitos
(Bazer y col., 1993), se han empleado diferentes métodos para inducir la
capacitación espermática in vitro.
Los mecanismos que acontecen durante la capacitación de los espermatozoides
de mamíferos no son totalmente conocidos, en la actualidad los procedimientos
de capacitación artificial están dirigidos a estimular la secuencia de eventos que
normalmente transcurren en el tracto reproductivo de una hembra.
Se han descrito varios métodos, entre éstos: La incubación en soluciones
hipertónicas (HIS-High Ionic Strength, 380 mOsm; Brackett y col.,1982), el
tratamiento con fluido folicular (Fukui y col.,1983) o fluido oviductal (Parrish y
col.,1989), el uso de calcio ionóforo A23187 (Shorgan,1984 revisado por
Mogas,1994), suero ovino (Crozet y col.,1987b) la incubación con BSA (Parks y
Ehrenwald,1990), el co-cultivo con células oviductales (Guyader y Chupin,1991),
entre otros, pero el método más utilizado es la incubación con heparina
(glicosaminoglicanos) (Parrish y col.,1986).
Los glucosaminoglicanos (GAGs) han sido identificados como eficientes
inductores de la capacitación espermática in vitro. Este grupo de carbohidratos
(polisacáridos) conformado por unidades repetitivas de disacáridos incluyen a la
heparina, heparan sulfato, condroitin sulfato, keratan sulfato y el ácido hialurónico.
Los GAGs están presentes a nivel del fluido folicular y son vertidos al oviducto en
el momento de la ovulación. Además, están presentes a lo largo del tracto
reproductivo de la hembra (revisado por Hernández, 2001). De ellos, la heparina
ha sido el más potente inductor de capacitación y su uso está muy generalizado
en los laboratorios de FIV. También se ha descrito una mayor repetibilidad y
mejor adaptación a las diferencias entre machos (First y Parrish, 1988).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
56
2.3.2.3. Agentes químicos estimulantes de la motilidad espermática en la gota de FIV Tras lavar y seleccionar los espermatozoides mas móviles por medio de alguna de
las técnicas descritas anteriormente, en muchos laboratorios de FIV se utiliza
algún agente químico que permita estimular y mantener esa motilidad.
La cafeína y la mezcla de penicilamina, hipotaurina y epinefrina (PHE) han sido
los mas empleados (revisado por Gordon, 1994). En el caprino, para el
tratamiento de espermatozoides de semen fresco, el uso de sustancias como la
cafeína y la mezcla de PHE no mejoran los resultados de penetración y desarrollo
embrionario al compararlo con la utilización de heparina e hipotaurina (Izquierdo y
col., 1998).
2.3.2.4. Concentración espermática en el medio de FIV y tiempo de co-cultivo de los gametos
En condiciones in vitro la incidencia de poliespérmia es superior que en
condiciones in vivo.
In vivo, solo unos pocos espermatozoides están presente cerca de los ovocitos
durante la fecundación (Cummins y Yanagimachi, 1982) mientras que in vitro, la
concentración espermática varía normalmente entre 104 y 106
espermatozoides/ml. Por ésto en condiciones in vitro, puede ocurrir la
penetración espermática múltiple antes del establecimiento completo del bloqueo
de la poliespérmia. Desafortunadamente, son pocas las condiciones de cultivo
que pueden mantener la movilidad espermática a concentraciones comparables
a las de in vivo. Así, no solo la concentración espermática si no también el tiempo
de interacción espermatozoide-ovocito ha de ser controlado para reducir la
incidencia de poliespérmia (First y Parrish, 1987).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
57
Por otro lado, los ovocitos incubados con una concentración alta de
espermatozoides en un volumen relativamente reducido de medio de fecundación
están expuestos a la acción de enzimas hidrolíticas liberadas por los
espermatozoides muertos, lo que puede tener un efecto perjudicial en su potencial
de desarrollo. Así, la duración del co-cultivo de los gametos no debería
sobrepasar el tiempo necesario para que se produzca la máxima penetración
(revisado por Gordon., 1994).
Trabajando en la especie caprina, en nuestro laboratorio, Palomo (1995) describe
que una concentración de 4x106 espermatozoides vivos/ml en las gotas de FIV
proporciona el mayor número de embriones con más de 2 células.
En relación a la duración de co-cultivo, este varía entre los protocolos de los
distintos laboratorios de FIV (17 horas: De Smedt y col., 1992; Cognie y col.,
1995; Crozet y col., 1995; 18 horas: Cox y col., 1994; 20 horas: Pawshe y col.,
1994; 24 horas: Younis y col., 1991; Kenkistepe y col., 1994; Mogas, 1994; 25
horas: Song e Irritan, 1988).
Mogas (1994) trabajando en cabras prepúberes, observó que el tiempo necesario
para encontrar un espermatozoide en el citoplasma era inferior a las 4 horas y
aunque no se encontraron diferencias en la tasa de penetración y poliespérmia
cuando el co-cultivo de los gametos tuvo una duración entre 6 y 28 horas, los
mejores porcentaje de división se obtuvieron de ovocitos que permanecieron en el
medio de FIV entre 20 y 28 horas, y la tasa máxima cuando el co-cultivo duró 24
horas.
2.3.3 Sistema de cultivo durante la FIV
2.3.3.1. Condiciones de cultivo en la FIV: Temperatura, pH, atmósfera
-Temperatura de incubación El proceso de la fecundación es altamente dependiente de la temperatura (Cheng
y col., 1986; First y Parrish, 1987).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
58
En el caprino, la temperatura de incubación a utilizar debe oscilar entre los 38
ºC y los 39.5 ºC (First y Parrish, 1987).
Se ha observado en otras especies, como bovino, ovino y porcino que la
fecundación disminuye drásticamente cuando la temperatura de incubación pasa
de 39ºC a 37ºC (revisado por Crozet, 1991).
-pH del medio de capacitación y FIV Para la capacitación espermática, así como también para la penetración de los
ovocitos, se puede trabajar en un rango de pH que va desde 7.0 a 7.8,
teniéndose en cuenta que el pH óptimo del medio utilizado para la capacitación
defiere del óptimo para la fecundación.
Se ha observado que el pH óptimo para la capacitación es de 7.8, y para la
fecundación es de 7.4 (Cheng y col., 1986). No obstante estos resultados no
coinciden con los hallados en bovinos por Lu y col. en 1987, quienes obtuvieron
mejores tasas de fecundación y desarrollo al utilizar un pH de 7.4 para la
capacitación y 7.8 para la fecundación, encontrando mas crítico el valor del pH en
la fecundación que durante la capacitación.
-Atmósfera de incubación
Se ha indicado que la atmósfera de incubación durante el proceso de FIV debe
poseer un 5% de CO2, necesaria para el mantenimiento de un pH adecuado del
medio, cuando éste se halla tamponado con bicarbonato, sin embargo una baja
tensión de O2 parece no ser esencial (First y Parrish,1987).
2.3.3.2. Medios para el tratamiento del semen y la FIV
El medio utilizado para diluir o suspender los espermatozoides después de retirar
el plasma seminal, ha de permitir la capacitación de éstos y mantener su motilidad
(Fournier- Delpech y Thibault, 1991, citado por Izquierdo 1996).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
59
Los medios empleados durante la etapa de la fecundación suelen estar basados
en la composición de las secreciones tubáricas (B2 Ménézo), en el plasma
sanguíneo ( Hank� s, TCM199) o simplemente son variantes de medios salinos
(TALP, DM, Krebs-Ringer).
En los rumiantes los medios de capacitación y fecundación mas utilizados son el
medio Tyrode modificado, TALP (Parrish y col.,1986); utilizado en el caprino por
varios autores entre ellos: Cox y col.(1994), Pawshe y col. (1994), Palomo (1995),
Mogas y col. (1997a, b), Izquierdo y col. (1998), Villamediana y col. (2001),
Rodríguez y col. (2001, 2002), y el medio BO (Brackett y Oliphant,1975), descrito
para la capacitación de espermatozoides de conejo, denominado medio definido
modificado (mDM), y modificado por diversos autores, adecuándolo a las
necesidades de las distintas especies de trabajo (ovino: Crozet y col.,1987a,
caprino: Younis y col.,1991, De Smedt y col.,1992) .
En nuestro laboratorio, Izquierdo y col. (1998) concluyen que la combinación del
medio mDM con heparina para la capacitación del semen y el medio TALP con
hipotaurina en las gotas de FIV para la fecundación es el protocolo que
proporciona mejores resultados de fecundación y desarrollo en ovocitos de cabras
prepúberes.
2.3.3.3. Presencia de células en el medio de FIV
La presencia de las células del cumulus y su papel durante la fecundación es
controversial. En algunos estudios donde los ovocitos madurados in vitro son
denudados la fecundación mejora (Lu y col., 1987; Fukui y col., 1988) mientras
que otros autores indican que dichas células son importantes para maximizar la
penetración de los espermatozoides a través de la zona pelúcida, ayudando en la
reacción acrosómica (Fukui, 1990; Saeki y col., 1994).
En caprinos, varios autores también han observado que la presencia de estas
células, bien rodeando al ovocito o formando una monocapa, proporciona mejores
resultados de fecundación (Song e Iritani, 1988; Kenkistepe y col., 1996).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
60
En los medios de capacitación y fecundación se han utilizado también otras líneas
celulares somática, específicamente células del epitelio oviductal (CEO) bovino:
Pollard y col., 1991; Guyader y Chupin, 1991; Miller y col., 1994; porcino: Nagai y
Moor, 1990; Kano y col., 1994).
Se ha especulado que tanto las células de las granulosa como las CEO podrían
secretar algún factor que mantendría la motilidad y la viabilidad de los
espermatozoides (revisado por Gordon, 1994). El efecto beneficioso de los co-
cultivos podría deberse a la producción de factores embriotróficos por parte de las
células somáticas, así como también a su acción detoxificante de los productos
nocivos existentes en el medio de cultivo (Bongso y Fong, 1991).
3. DESARROLLO EMBRIONARIO
3.1. Primeros estadios del desarrollo embrionario
El período embrionario se inicia con la fecundación. El desarrollo de los
embriones, hasta su implantación en el útero, se caracteriza por una sucesión
de divisiones celulares hasta la formación del blastocisto y la eclosión de la zona
pelúcida.
3.1.1. División embrionaria y formación del blastocisto
En los mamíferos, la primera división mitótica (el inicio del estadio de 2 células)
separa al cigoto en 2 células denominadas blastómeras, de aproximadamente el
mismo tamaño y que tiene lugar entre las 11 y las 20 horas post-inseminación
irrespectivamente de la especie. La segunda división (inicio del estadio de 4
células) es algo asincrónica, lo que resulta en la existencia de un estadio de 3
células por un corto período de una o dos horas aproximadamente. La duración
de este estadio difiere según la especie estudiada. A partir de la tercera división
(inicio del estadio de 8 células), las divisiones celulares son iguales, cortas, con
breves fases G y dominadas por las fases S y M, es decir, que cada mitosis está
seguida inmediatamente por la síntesis de ADN en las dos células hijas, sin
poderse detectar fases de pausa (Barnes y Eyestone, 1990). En estas primeras
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
61
etapas (Figura: 10, 11), las blastómeras formadas son esféricas, están unidas
mediante puentes citoplasmáticos y a medida que transcurre la división son cada
vez mas pequeñas, ya que no se produce un incremento en el volumen total del
embrión (Anderson, 1991).
Figura 10: Embrión de 2 células. Figura 11: Embriones primeros estadios de desarrollo.
-Formación de la mórula: Polarización y Compactación Mientras las blastómeras están encerradas en la zona pelúcida, deben
acomodarse a este espacio limitado. Una vez que el embrión ha formado de 8 a
16 blastómeras y en algunos casos más, se denomina mórula, debido a su
parecido con una mora. En este momento, las blastómeras se aplanan unas
contra otras para formar un embrión redondo. Las células de la superficie del
embrión poseen asimetría de contacto, ya que sus caras internas están en
contacto con otras células, mientras que las externas se encuentran libres en el
espacio perivitelino. En cambio, las células que se hallan en el interior del
embrión se encuentran en íntimo contacto con otras células. Esta asimetría de
contacto provoca la polarización celular, la cual implica una serie de cambios en
los tipos de uniones intercelulares, en la morfología de las células y en la
distribución de los elementos citoplasmáticos en su interior (Anderson, 1991).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
62
Las principales transformaciones se producen en la distribución de las
microvellosidades (observándose solo en el exterior, en la zona libre), en la
organización del citoesqueleto y en la distribución de los organelos, los cuales se
sitúan en la región basal. En estas células, debido a la distribución de los
transportadores de membranas, los iones de Na + entran por la zona apical hacia
el interior del embrión, ésto comporta una corriente de cargas negativas hacia el
exterior que induce la polarización. Durante esta etapa las células cambian de
aspecto, se aplanan las unas contra las otras maximizándose el contacto entre
ellas, aparecen uniones en hendidura entre todas las blastómeras y en las
externas aparecen uniones estrecha que aíslan las células interiores del medio
exterior (Anderson, 1991). Los procesos combinados de aplastamiento de las
blastómeras y polarización se conocen como compactación.
-Formación del blastocisto: Cavitación Cuando la mórula está formada por un número determinado de células, parece
ser que las bombas Na+ /K+ situadas en las membranas de las células periféricas
bombean Na+ hacia los espacios intercelulares del interior del embrión. El agua
sigue al Na+ como resultado del gradiente de presión osmótica que se produce.
Los espacios intercelulares del interior del embrión se agrandan y acumulan
líquido en el interior formando una sola cavidad denominada blastocele, lo que
resulta en la formación de una vesícula cavitada, el blastocisto (Figura: 12). En
este momento del desarrollo, por primera vez se diferencian dos tipos celulares
distintos. En la superficie del embrión se forman células epiteliales, derivadas de
las células polares, capaces de transportar líquido activamente, que contribuirán
a la formación del trofoectodermo, mientras que las internas, las apolares,
formaran el botón embrionario, embrioblasto o masa célular interna (MCI)
(revisado por Anderson,1991; Gordon, 1994). Durante el proceso de gastrulación,
de esta masa celular interna se derivaran las 3 capas germinales del embrión:
ectodermo, mesodermo y endodermo, de donde se derivan todos los tejidos del
futuro ser, mientras que el trofoectodermo formará las membranas accesorias y la
placenta (Anderson, 1991).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
63
Figura 12: Blastocisto (Tinción Hoechst).
Después de formado el blastocele, éste aumenta su tamaño rápidamente hasta
que el embrión parece una esfera vacía, el blastocisto expandido (Figura: 13-14). Tras la expansión, los blastocistos eclosionan y escapan de la
zona pelúcida para poder implantarse en el útero (Dickmann, 1969, citado por
Izquierdo 1996).
La salida del blastocisto parece suceder por el aumento de su tamaño, la
disminución del espesor de la zona pelúcida y por la acción de enzimas líticos
producidos por el embrión y por el útero. Esto último solo parecen tener una
función de apoyo al proceso, ya que in vitro los blastocistos son capaces de
eclosionar sin la acción de las mencionadas enzimas del ambiente uterino
(Betteridge, 1995).
Figura 13: Blastocisto expandido. Figura 14: Blastocisto expandido.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
64
3.1.2. Activación del genoma embrionario y control de la embriogénesis
El período pre-implantacional del desarrollo de los mamíferos incluye la formación
del cigoto, la activación del genoma embrionario y el inicio de la diferenciación
celular. Durante este período, el control de la embriogénesis es realizado por
información materna, el genoma embrionario y factores epigénicos (revisado por
Izquierdo, 1996).
Durante la ovogénesis y específicamente durante la fase de crecimiento del
ovocito, se sintetizan y acumulan los ARNm y las proteínas maternas necesarias
para el primer período de desarrollo del embrión, por lo que el control de
esta etapa es realizado por material de origen materno (Barnes y
Eyestone,1990). El subsiguiente desarrollo embrionario es ya dependiente de la
activación transcripcional del genoma del embrión. Este cambio en el control de la
embriogénesis se caracteriza por una serie de cambios importantes en el patrón
de la síntesis proteica, tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo
(Crosby y col., 1988).
El momento en el cual se produce el cambio de control por parte de las moléculas
de origen materno a las moléculas transcritas a partir del genoma embrionario
difiere entre especies. Así, en el bovino se ha observado que la transición del
genoma maternal al embrionario se produce en los estadios de 4 y 8 células
(Jones y First, 1990), mientras que en el caprino la activación del genoma
embrionario se inicia en el estadio de 2 células y es total en el de 8. Este hallazgo
ha sido comprobado por la observación de que en los embriones caprinos de 2 -4
células se activan la transcripción del ARNm (Chartrain y col., 1987). Sin embargo
para otros autores es en el estadío de 8-16 células (4to ciclo celular) coincidiendo
con la llegada del embrión al útero (Harper, 1982; Bavister, 1995) y con el inicio
de la compactación del embrión (Sakkas y col., 1989) cuando se produce el inicio
de la mayor transcripción del ARNr de origen embrionario (Pivko y col., 1995).
La transición del control materno a embrionario parece ser especialmente sensible
a las condiciones adversas, puesto que cuando las condiciones ambientales y/o
de cultivo no son óptimas para que se inicie la transcripción del genoma
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
65
embrionario se produce un bloqueo en el desarrollo (Barnes y Eyestone, 1990;
Barnes y First, 1991; Van Soom y col., 1992; Bavister, 1995).
Tanto en el caprino (Wright y Bandioli, 1981) como en el ovino (Crosby y col.,
1988) y el bovino (Petters, 1992) el bloqueo del desarrollo parece producirse en
torno al estadio de 8-16 células.
Las causas de este bloqueo no son del todo conocidas pero están asociadas a
diferencias en la transcripción del genoma embrionario y la posterior síntesis
proteica posiblemente porque el medio utilizado carece de substratos
imprescindibles para la síntesis de proteínas esenciales (First y Parrish, 1987), y
de un ambiente inadecuado para la transcripción debido a los efectos tóxicos de
los radicales de oxigeno intracelulares (Betteridge y Rieger, 1993).
Ouhibi y col. (1990) han especulado que la regulación del desarrollo de embriones
preimplatacionales podría incluso depender de factores paracrinos que se originan
en el tracto reproductivo y estar influenciada por algunos factores autocrinos
secretados por los propios embriones.
3.2. Cultivo in vitro de embriones.
El cultivo in vitro de embriones constituye la última de las etapas en el proceso
de PIV. Durante esta etapa los embriones son transferidos de un medio a otro con
el fin de procurar proporcionarles las mejores condiciones para su crecimiento y
desarrollo. El objetivo es proveer las condiciones que favorezcan la división
celular, formación del blastocele y el normal desarrollo del embrión desde el
estadío de cigoto hasta blastocisto.
Aunque algunos autores describen resultados con un desarrollo similar al
fisiológico cuando se cultivan embriones en un sistema in vitro (Ellington y col.,
1990b; Czlonkowska y col., 1991; Wright y Ellington, 1995), muchos laboratorios
todavía obtienen bajos niveles de desarrollo hasta blastocisto.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
66
El desarrollo de embriones in vitro ha supuesto una fuente constante de
dificultad, especialmente en los embriones producidos por MIV/FIV. Es difícil
determinar si el problema se debe directamente a unas condiciones subóptimas
de cultivo para los embriones o bien si es el resultado de una disminución de la
competencia de desarrollo de los ovocitos madurados y fecundados in vitro
(Trouson, 1992).
En la determinación del potencial de desarrollo, parece ser que existen factores
moleculares, celulares y/o genéticos, intrínsecos al ovocito y/o al embrión que
poseerían un papel mucho más significativo que las condiciones de cultivo (Van
Blerkom y col., 1990). No obstante en muchas ocasiones, se combinan una
disminución en la competencia para el desarrollo y unas condiciones subóptimas
de cultivos para producir un retraso en los embriones, anormalidades en el
desarrollo y una reducción de la viabilidad.
Las condiciones de cultivo parecen influir como mínimo, en tres fases críticas del
desarrollo embrionario, como son: a) La transición del control del desarrollo de
maternal a embrionario, b) El estadío de compactación de la mórula, y c) La
formación del blastocisto (Grisart y col., 1994).
3.2.1. Condiciones de cultivo
Los componentes del sistema de cultivo críticos para la supervivencia del embrión
son varios y entre ellos se encuentran: la temperatura, la luminosidad, el pH, la
presión osmótica, la concentración de iones y fuentes de energía, los
componentes del suero, la fase gaseosa, la calidad del agua y el tipo de cultivo.
3.2.1.1. Temperatura y luz
La temperatura de incubación de los embriones está determinada por la
temperatura fisiológica de la especie animal a la que pertenecen.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
67
En bovinos se ha observado mayor número de blastocistos y blastocistos
expandidos en un intervalo de 37 ºC y 39 ºC (Wang y col., 1991).
La exposición de los embriones a la luz de forma repetida o durante un largo
espacio de tiempo y mas aún a la luz ultravioleta, afecta negativamente a todas
las etapas de desarrollo de los embriones debido a la producción de radicales
superóxido (revisado por Nakayama y col.,1994).
Para proteger a los embriones de los efectos dañinos de la luz, se ha añadido al
cultivo, ácido paramino benzoico (PABA).
3.2.1.2. Atmósfera gaseosa
Varios autores coinciden en la necesidad de incubar los embriones en una
atmósfera rigurosamente controlada y usar una humedad máxima para prevenir la
evaporación del medio.
Las atmósferas gaseosas más utilizadas en los laboratorios de FIV para el cultivo
de embriones de rumiantes son:
- 5% de CO2 en aire. -10% de CO2 en aire. - 5% O2, 5% CO2 y 90% N2. - 10% O2, 5% CO2 y 85% N2. La atmósfera gaseosa empleada está muy relacionada con el sistema de cultivo
usado.
- Oxígeno
Los embriones preimplantacionales se desarrollan correctamente in vivo en un
ambiente con una tensión de oxígeno baja, del 3.5% al 8.5% dependiendo de la
especie (Bavister, 1995).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
68
Los cigotos y embriones jóvenes son sensibles a la toxicidad del O2, sobre todo si
en el medio no están presentes células somáticas.
Los embriones bovinos cultivados en medio 199 con suero y sin células, se
desarrollan mejor con una atmósfera de 5% O2 , 5% CO2 y 90% N2 que en una
con 5% de CO2 en aire (Fujitani y col.,1996). Se ha descrito que una
concentración de oxígeno cercano a la atmosférica (20%) tiene un efecto adverso
sobre el desarrollo de embriones bovinos (Nagao y col., 1994), ovinos (Thompson
y col., 1990) y caprinos (Batt y col., 1991).
Por otro lado, se ha observado la existencia de una interacción entre la atmósfera
gaseosa del incubador y el sistema de cultivo utilizado. Así, embriones co-
cultivados toleran un mayor porcentaje de O2 que los cultivados en medio sólo o
acondicionado con células somáticas (Cognie y col., 1994).
- CO2 y Bicarbonato de Sodio En el medio de cultivo, la principal función del complejo CO2 /HCO3 es la de
actuar como tampón del pH extracelular, aunque también intervienen en la
conversión del piruvato a oxacelato para la formación de los intermediarios del
ciclo de Krebs (Kane, 1987), por lo que debería estar siempre incluido en la
composición del medio de cultivo (Thompson, 1996). El CO2 también podría ser
necesario como regulador del pH intracelular también actuando como un ácido
suave permeable (Bavister, 1988).
3.2.1.3. pH y osmolaridad Dependiendo de la composición del medio y de la especie a la que pertenecen
los embriones que se van a cultivar, el medio de cultivo se debe equilibrar a un pH
determinado. Al igual que en otros fluidos corporales, el pH de los fluidos
oviductales y uterinos es regulado por la concentración de bicarbonato y
equilibrada con CO2 (Thompson, 1996).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
69
Un tampón muy utilizado en los medios de cultivo es el HEPES. Sin embargo
parece que al reemplazar el bicarbonato por HEPES se produce un efecto
tóxico directo para el embrión durante la exposición del medio a la luz (Thompson,
1996), y también puede deprimir el pH intracelular (Bavister, 1995).
Los embriones preimplantacionales parecen ser muy adaptables a un amplio
rango de presiones osmóticas (Bavister, 1995). No obstante, la osmolaridad
óptima del medio de cultivo depende de la etapa de desarrollo en la que se
encuentre el embrión y de la especie a la que pertenezca dicho embrión.
3.2.1.4. Calidad del agua y condiciones de esterilidad durante el proceso de CIV La calidad del agua es de importancia vital, debido a que el agua constituye cerca
del 98% del contenido de muchos medios de cultivo. En ratón, se ha demostrado
que el uso de agua tridestilada, comparada con el agua bidestilada aumentaba
significativamente el porcentaje de embriones de 2 células que se desarrollaban in
vitro hasta blastocisto (Whittingham, 1971). En 1995, Nagao y col., también
describieron este efecto sobre el desarrollo de embriones bovinos, el porcentaje
de blastocistos y el número de células de éstos fueron mayores en el medio
elaborado con agua Milli-Q que en otros grupos: agua corriente, desionizada,
bidestilada, aunque no hubo diferencias entre ellos. También observó una
disminución en el desarrollo de blastocistos cuando el agua utilizada no era
fresca, sino embotellada durante 1 ó 2 semanas. La calidad del agua parece ser
importante cuando se han eliminado las proteínas del medio, probablemente las
proteínas puede quelar o unirse a las sustancias tóxicas del medio, y así inhibir su
acción sobre los embriones (Kane, 1987).
Por otro lado, la esterilidad del proceso es otro factor importante para alcanzar el
éxito del cultivo. Los utensilios, medios, soluciones, sueros, etc, que se
emplearan para el cultivo de los embriones deben estar libres de agentes
contaminantes, así como de cualquier microorganismo vivo. Puede evitarse la
presencia de microorganismos en el cultivo empleando una campana de flujo para
manipular los gametos y embriones. Además esterilizar todo el material que entre
en contacto con ellos, dependiendo de la naturaleza de cada componente;
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
70
Los materiales sólidos, de cristal o metal, se esteriliza mediante calor, seco o
húmedo, o por exposición a antisépticos, o a los vapores de óxido de etileno o de
formol, mientras que los constituyentes líquidos se suelen filtrar (Nibart, 1991,
citado por Izquierdo, 1996).
3.2.2. Sistema de cultivo El sistema de cultivo ideal debería excluir tanto el co-cultivo con células somáticas
como los suplementos séricos, debido a que estos sistemas no son totalmente
definidos y sus resultados no siempre se pueden reproducir.
Uno de los sistemas de cultivo más utilizados es el realizado en microgotas
cubiertas con aceite mineral. El aceite se utiliza para evitar la evaporación del
medio y la entrada de microorganismos.
Los embriones también pueden ser cultivados en un tubo, placa de petri o pocillo
con un volumen de medio determinado.
En cuanto al número de embriones cultivados en un volumen de medio
determinado, varios autores han descrito que el cultivo en grupo en un volumen
pequeño de medio pueden ejercer un efecto beneficioso sobre el desarrollo de los
embriones hasta la etapa de blastocisto (Ferry y col., 1994; Gandolfi, 1994; Keefer
y col., 1994; Trounson y col., 1994; Van Inzer y col., 1995). El efecto beneficioso
podría ser debido a la interacción cooperativa entre los embriones, mediante los
factores de crecimiento secretados por ellos, actuando de manera tanto autocrina
como paracrina sobre los embriones del cultivo.
La relación ideal es de 1 embrión por µl de medio de cultivo acondicionado con
CEO, siempre en grupos de más de 10 embriones (Ferry y col., 1994).
Aunque los efectos del tamaño de la gotas del medio de cultivo y la relación entre
el número de embriones y el volumen del medio de cultivo utilizado, puede inferir
en el nivel de desarrollo embrionario in vitro, su importancia se ve supeditada por
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
71
la composición del medio de cultivo y por las condiciones físicas empleadas para
el cultivo de embriones (Bavister, 1995).
El cambio periódico del medio de las gotas por medio fresco es otro aspecto del
cultivo a tener en cuenta, este procedimiento se realiza con la finalidad de evitar la
acumulación de sustancias tóxicas para el embrión, tal es el caso del ion amonio
producto de la degradación proteica (Trounson y col., 1994). Se ha indicado que
la renovación del medio de cultivo cada 48 horas mejora el desarrollo de los
embriones (Carolan y col., 1995). Pero también hay laboratorios que no cambian
el medio durante todo el CIV porque se especula que los embriones secretan al
medio substancias beneficiosas para otros embriones.
En la mayoría de laboratorios utilizan el mismo sistema de cultivo durante todo el
desarrollo preimplantacional, sin embargo algunos investigadores han empezado
a utilizar unas determinadas condiciones de cultivo durante las primeras etapas de
desarrollo y otras para los embriones que han superado el estadío de bloqueo
(revisado por Bavister, 1995).
3.2.3. Medios de cultivo
En condiciones in vivo, los embriones hasta el estadio de mórula se encuentran
en el oviducto, sin embargo in vitro, la mayoría de medios utilizados para el cultivo
de embriones poseen una composición iónica distinta a la que existe en el fluido
oviductal. Esto se debe a que muchas veces las composiciones de los medios se
han basado en la del suero sanguíneo y la composición de éste es distinta a la del
fluido oviductal.
Algunos de los medios de cultivo utilizados se basan en hallazgos empíricos
basados en las necesidades de los embriones cultivados y que se han ido
modificando a medida que se hacen nuevos descubrimientos, mientras que la
formulación de otros se basa en la composición del plasma sanguíneo o del fluido
oviductal. En la literatura, los medios de cultivo se clasifican en medios simples
(TALP, CZB, SOF�.) y medios complejos (TCM199, Ham�sF10, Ménézo B2,
MEM�).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
72
Los medios simples suelen ser soluciones salinas suplementadas con substratos
energéticos, y algunos, también, con una fuente proteica (Thompson, 1996). Estos
medios se suelen preparar en el laboratorio, por lo que pueden existir variaciones
entre las preparaciones de los distintos laboratorios, debido a la precisión de los
investigadores en las pesadas de los distintos ingredientes. También acostumbran
a catalogarlos como medios definidos, puesto que son medios cuya composición
es conocida y concreta, o semidefinidos cuando se suplementan con suero o
BSA, ya que la adición de éstos últimos a un medio simple de cultivo altera
drásticamente la composición original del medio (Bavister, 1995).
Los medios complejos se acostumbra a utilizarlos en los sistemas de co-cultivo
con células somáticas. Estos contienen en su formulación numerosos
componentes, como por ejemplo: aminoácidos, sales, purinas, vitaminas,
nucleótidos, etc., reflejando tanto las necesidades de los embriones como las de
las células utilizadas para el co-cultivo (Bavister, 1995). Estos medios suelen
adquirirse en casas comerciales y pueden contener algunos compuestos no
determinados. Además, la concentración de ciertas substancias del medio puede
variar entre lotes, por lo que a estos medios se les llama también medios
indefinidos.
Las condiciones de cultivo utilizadas son dependientes del medio utilizado, por
ejemplo, mientras que con el medio TCM199 los mejores resultados de desarrollo
hasta blastocisto se obtienen al añadir células y suero al medio y en una
atmósfera con un 5% de CO2 en aire, los mejores resultados con el medio SOF,
suplementado con suero y con o sin células se obtienen al utilizar una
atmósfera con un 5% de O2, un 5% de CO2 y un 90% de N2 (Fukui y col.,1991). El
medio SOF proporciona mejores tasas de división y desarrollo hasta blastocisto
que el medio TCM199, sin embargo al acondicionar ambos medios con células
oviductales, estos proporcionan resultados similares (Vansteenbrugge y col.,
1996).
En cabras adultas, Crozet y col., 1995 cultivando embriones con EOC en una
atmósfera de 5% de CO2 en aire, medio B2 y FCS obtuvieron 26% de
blastocistos. En otro estudio realizado por Cognie y col., 1995, empleando como
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
73
medio de cultivo SOF y FCS lograron 31% de blastocistos; mientras que
Pawshe y col., 1996 con TCM-199 y factores de crecimiento alcanzaron un 40%.
Por otra parte, cuando la atmósfera estuvo compuesta de 5% CO2, 5% O2 y
90% N2 , con células del cumulus en medio TCM-199 y uso de FCS, Kenkistepe
y col., 1996 alcanzaron 32% de blastocistos.
En cabras prepúberes, a partir de ovocitos madurados y fecundados in vitro se ha
obtenido un 10% de blastocistos, empleando TCM-199 con células del epitelio
oviductal (EOC) sin suero (Izquierdo y col., 1999).
Los embriones, durante sus primeras divisiones parecen ser bastantes
intolerantes a los medios complejos y prefieren un medio relativamente simple,
con componentes específicos como sales, substrato energéticos y aminoácidos
para mantener el desarrollo normal, mientras que en un estado más avanzado del
desarrollo, las mórulas y los blastocistos prefieren medios más complejos para
evolucionar (Pinyopummint y Bavister,1994; Barnett y Bavister,1996), de allí la
idea de que un cultivo en dos pasos, con un medio sencillo inicial y uno más
complejo para las etapas posteriores, podría mejorar los resultados.
Dos medios han sido formulados para el cultivo del cigote en humano hasta el
estadio de blastocisto (Barnes y col., 1995). Estos medios han sido denominados
G1 y G2. El medio G1 fue formulado para apoyar el desarrollo del cigoto hasta
el estadio de 8 células, mientras que el medio G2 fue formulado para permitir el
desarrollo del embrión desde el estadio de 8 células hasta blastocisto.
3.2.4. Suplementos del medio de cultivo 3.2.4.1. Substratos energéticos
Los principales substratos energéticos utilizados para el cultivo de embriones son:
glucosa, piruvato, lactato, acetato, glutamina, ácidos grasos de cadena corta y
larga contenidos por el BSA, aminoácidos, etc.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
74
Al evaluar la aptitud de los distintos substratos energéticos para mantener el
desarrollo embrionario lo importante es tener en cuenta no solo las interacciones
entre estos substratos energéticos, así como no energéticos presentes en el
medio y las condiciones del cultivo, ya que, por ejemplo una tensión de O2
inadecuada puede alterar la utilización de los substratos energéticos por parte de
los embriones (revisado por Barnett y Bavister, 1996).
Por otro lado, la repuesta de los embriones a los nutrientes y substratos
energéticos parece estar modulada por las concentraciones de Na+, O2,
CO2/HCO3 e indirectamente por el pH intracelular.
El requerimiento energético es uno de los factores más importante que
|condicionan el desarrollo embrionario. En general, los patrones de utilización de
glucosa en embriones bovinos producidos por superovulación incrementó
significativamente entre el estado de 16 células y mórula y entre el estado de 8 y
16 células en embriones producidos in vitro, en el tiempo de activación del
genoma del embrión (Khurana y Neimann, 2000).
A diferencia de la mayoría de células somáticas, los embriones de varias especies
de mamíferos en estado de clivaje, parecen no utilizar la glucosa como una fuente
de energía hasta un estado avanzado de desarrollo (Leese, 1991).
En el humano, debido al efecto negativo que ejerce sobre los embriones cuando
esta presente en un medio de cultivo simple, ha surgido la creciente tendencia a
remover la glucosa del medio para el desarrollo del embrión (Quinn, 1995; Pool y
col., 1997, citado por Gardner y Lane 1997). Sin embargo antes de eliminar la
glucosa del medio de cultivo embrionario es importante considerar lo
siguiente: a) el embrión posee un transportador específico para glucosa desde al
menos el estadio de 2 células, lo cual indica alguna función para esta hexosa
(revisado por Gardner y Lane, 1997), b) en presencia de reguladores apropiados
(tales como los aminoácidos) la glucosa no afecta negativamente el desarrollo
embrionario y c) la glucosa además de ser una fuente de energía, tiene otras
funciones importantes. La glucosa es un precursor anabólico clave y se requiere
para la síntesis de triglicéridos y fosfolípidos y como un precursor para azúcares
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
75
complejos de mucopolisacaridos y glicoproteínas. La glucosa metabolizada por
la vía pentosa fosfato (PPP) genera ribosa, requerida para la síntesis de ácidos
nucleicos y el NADPH, necesaria para la biosíntesis de lípidos y otras moléculas
complejas (Gardner y Lane, 1997). El NADPH, es además requerido para la
reducción del glutatión intracelular como importante antioxidante para el embrión
(Rieger, 1992). Así, la importancia de la glucosa se incrementaría una vez que el
genoma embrionario es activado y los niveles biosintéticos se han incrementado.
3.2.4.2. Suplementos séricos El desarrollo de los embriones bovinos hasta mórula o blastocisto pueden ser
mantenidos en una solución salina suplementada con un substrato energético y
aminoácidos, sin embargo, los factores séricos son necesarios para maximizar el
desarrollo blastocitario (Brackett y Zuelke, 1993).
Las principales fuentes proteicas del medio en muchos protocolos son la BSA y/o
el suero añadido a él. En el medio de cultivo los suplementos séricos juegan
varios papeles importantes: 1) reducen la embriotoxicidad de algunos
suplementos del medio o productos del metabolismo embrionario, 2) es una
fuente de nutrientes para los embriones jóvenes, y 3) proporciona factores de
crecimiento que estimulan el crecimiento embrionario, actuando sobre los
embriones y/o bien sobre las células somáticas (Eckert y Niemann, 1995). Sin
embargo, tanto la BSA como los sueros son mezclas complejas e indefinidas de
diferentes proteínas contaminados con diversos pequeños péptidos, substratos
energéticos y concentración variable de factores embriotróficos (Takagi y col.,
1991; Bavister y col., 1992), que hacen difícil la interpretación de los resultados
obtenidos en su presencia, ya que parecen introducir al medio de cultivo
componentes beneficiosos pero también otros perjudiciales (Bavister, 1995).
3.2.4.3. Factores de crecimiento En varias especies de mamíferos se ha conseguido con éxito el cultivo in vitro de
embriones preimplantacionales, pero al compararlos con el desarrollo in vivo
parecen tener un desarrollo inferior. Esta inferioridad puede ser superada en gran
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
76
parte, añadiendo factores de crecimiento al medio de cultivo. (revisado por
Izquierdo, 1996)
Los factores de crecimiento son proteínas de acción local que se unen a
receptores específicos existentes en las membranas plasmáticas de las células,
activando sistemas de segundos mensajeros (Hyttel y col., 1990). Estos factores
tienen un papel importante en los procesos de proliferación, diferenciación y
morfogénesis en las etapas tempranas de desarrollo (Heyner y col., 1993). El
embrión sintetiza los factores TGF-α, TGF-β2, PDGF, IGF-Ι y IFG-ΙΙ, así como su
receptor, mientras que para la insulina y el EGF solo sintetiza el receptor (Ferry y
col., 1994).
3.2.4.4. Co-cultivos celulares El sistema de co-cultivo con células somáticas ha sido utilizado en muchos
estudios desde que en 1987 Gandolfi y Moor demostraron que los cigotos ovinos
se desarrollaban hasta blastocistos cuando eran co-cultivados con células
epiteliales de oviductos ovinos a 39 °C en atmósfera humeda de 5% CO2 en aire,
mientras que los cultivados sin células no avanzaban mas allá de las 16 células.
Varios autores también han indicado que cuando son cultivados en un medio sin
células, los embriones son incapaces de superar el 4º ciclo de división
embrionario, mientras que si se añadían células a los medios se obtenían buenos
porcentajes de desarrollo hasta blastocisto (Ellington y col., 1990c; Nakao y
Nakatsuji, 1990; Pinyopummintr y Bavister, 1991). En el caprino, Prichard y col.
(1991), también han descrito este hecho utilizando medio TCM-199 para el cultivo.
Adicionalmente la transferencia a hembras receptoras de embriones co-cultivados
in vitro hasta los estadios de mórula o blastocisto con células del cumulus (Aoyagi
y col., 1990; Fukuda y col., 1990), células oviductales (Lu y col., 1988; Eyestone
y First, 1989; Aoyagi y col., 1990; Xu y col., 1992), vesículas trofoblasticas
(Aoyagi y col., 1990) o células del saco amniótico (Aoyagi y col., 1990), han
resultado con el crecimiento de animales vivos a un nivel similar a los embriones
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
77
producidos in vivo. Lo cual indica que estos sistemas son útiles para obtener un
buen desarrollo de los embriones producidos in vitro.
El co-cultivo con células somáticas es un sistema que se halla entre el cultivo
totalmente definido y el uso de recipientes intermediarios (Betteridge y Rieger,
1993).
No está claro, el mecanismo por el cual las células somáticas promueven el
desarrollo embrionario, pero hay evidencias de que está relacionado con factores
específicos producidos por las células (Gandolfi y Moor, 1987; Gandolfi y col.,
1989).
En la literatura se describe el efecto beneficioso del uso de una gran variedad de
tipos celulares como: las células del cumulus/granulosa, vesículas trofoblásticas,
células del epitelio epididimal, células uterinas, fibroblastos, células del saco
amniótico, líneas celulares comerciales y particularmente células del epitelio
oviductal sobre el desarrollo embrionario, ya que se ha observado que los
llamados factores de crecimiento celular, sintetizados por estos tejidos, pueden no
ser estrictamente ni tejido-específico ni especie-específico (Goto y col., 1992).
3.2.5. Acondicionamiento del medio de cultivo con células somáticas Un medio se dice que está acondicionado, cuando previo a su uso se expone
durante un tiempo determinado a un cultivo de células somáticas, posteriormente
son retiradas de él, y es entonces cuando es utilizado para el cultivo de
embriones. Se pueden emplear para ello tanto medios simples como complejos,
pero tras ser acondicionados siempre son indefinidos.
Estos medios parecen poseer sustancias embriotróficas sintetizadas por las
células que mejoran el desarrollo embrionario.
Con el cultivo con células somáticas y con medios acondicionados, siempre se
obtienen mejores resultados que con el cultivo en medio solo, debido
probablemente a la síntesis de sustancias embriotróficas o a la inhibición de
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
78
componentes presentes en el medio (Eyestone y col., 1991). Al comparar el uso
de medio acondicionado con CEO o del co-cultivo con ellas, se obtuvo un
desarrollo similar hasta mórula en los dos sistemas pero con un menor porcentaje
de blastocistos en el medio acondicionado que con el co-cultivo (Hernández-
Ledezma y col., 1995). Este mismo hecho ha sido observado por otros
investigadores, quienes indican que el desarrollo en el medio acondicionado es
menor (Izquierdo y col., 2002) y está retrasado en comparación con el co-cultivo,
ya que los blastocistos formados tienen un menor número de blastómeros
(Ellington y col., 1990c; Rieger y col., 1992,1995; Trounson y col., 1994). La
aptitud del embrión en co-cultivo para incrementar la secreción de factores
específicos sintetizados por las células somáticas puede explicar la incapacidad
del medio acondicionado para promover los mismos niveles de desarrollo que el
co-cultivo directo (Ellington y col., 1990c; Eyestone y col., 1991). Asimismo
algunos factores presentes en el medio acondicionado puede ser rápidamente
utilizado por los embriones y desaparecer del medio (Kane y col., 1992).
El uso de medio acondicionado presenta varias ventajas sobre el co-cultivo
(Eyestone y col.,1991; Bavister y col.,1992) estos son:
1) La disminución del riesgo de contaminación del medio.
2) La eliminación del efecto confuso de la presencia de tejidos adicionales.
3) El facilitar los procesos bioquímicos para la búsqueda de factores
embriotróficos solubles.
4) El hecho de que se pueda almacenar, ya que puede ser congelado y
descongelado una vez, sin perder sus efectos beneficiosos (Eyestone y col.,
1990).
4. COMPUESTOS TIOL EN LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES. 4.1. Glutatión
El glutatión (L-γ- glutamil-L-cisteínglicina) es el mayor componente sulfhidrilo no
proteico presente en las células de mamíferos, presente en concentraciones de
0.5 - 10 mmol/L (Meister, 1983). Es un gran tiol libre intracelular que tiene
importantes funciones biológicas (Chance y col., 1979; Meister y Anderson, 1983;
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
79
Lafleur y col., 1994): durante la proliferación celular, en el transporte de
aminoácidos, en la síntesis de proteínas y ADN, en la reducción de disulfidos y
otros grupos químicos, en la protección celular contra la oxidación y como reserva
de cisteína. El glutatión celular tiene un papel clave en dichos procesos biológicos,
pero principalmente, en la protección de las células contra la oxidación. La
modificación oxidativa de los componentes celulares debido a ROS (Especies
Reactivas de Oxígeno, Estrés de Oxígeno) es uno de los procesos perjudiciales
más importante para la función celular. En la mayoría de las células, los sistemas
antioxidantes eficaces, como los ejercidos por las enzimas superóxido dismutasa,
catalasa superoxidativa o los componentes tiol, actúan como tampones
metabólicos y pueden atenuar el efecto oxidativo mediante la eliminación de
agentes ROS (Del Corso y col., 1994).
Muchas de las funciones del glutatión se basan en el poder reductor del grupo
sulfidrilo (SH) que es un fuerte nucleófilo, por lo que le confiere protección contra
el daño causado por oxidantes neutrofilos y radicales libres (Meister y Anderson,
1983). Por esta razón la abreviatura aceptada para el glutatión es GSH.
4.1.1. Funcionalidad del Glutatión 4.1.1.1. Acción redox del Glutatión
En las células animales, el glutatión presente en elevadas concentraciones (∼5
mol), actúa como amortiguador de sulfhidrilos. Pasa cíclicamente de una
forma tiol reducida (GSH) a una forma oxidada (GSSG), en la cual los dos
tripéptidos están unidos por un puente disulfuro. Esta reacción está catalizada por
la enzima glutatión peroxidasa, un enzima que contiene un átomo de selenio (Se)
unido covalentemente en forma de seleno cisteína. El selenio resulta esencial
para la actividad enzimática.
El GSH puede considerarse como una especie de tampón redox. Posiblemente
ayuda a mantener los grupos sulfhidrilos de las proteínas en su forma reducida y
el hierro del grupo hemo en forma de ión ferroso (Fe 2+), a la vez que actúa como
agente reductor para la glutarredoxina.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
80
El GSSG es reducido de nuevo a GSH por una glutatión reductasa, una
flavoproteína que utiliza NADPH como dador de electrones.
El GSH es un antioxidante intracelular crítico debido a su relativa abundancia y
capacidad para ciclar rápidamente entre las formas reducida y oxidada.
Generalmente, la mayoría (>90%) del total del glutatión intracelular se encuentra
como GSH.
La ratio intracelular entre las formas reducidas y oxidadas del glutatión es muy
alta (Meister, 1983) y se ha sugerido que el GSSG se reduce a GSH
inmediatamente en la mayoría de los sistemas celulares (Meister y col., 1988) y
en los ovocitos de mamíferos (Perreault y col., 1984), por lo que se considera que
el glutatión medido se encuentra en su mayoría en forma reducida.
4.1.2. Estructura y Biosíntesis del Glutatión
El glutatión (GSH) es un tripéptido derivado de la glicina, el glutamato y la cisteína
(Figura: 15, 16).
γ-Glu Cys Gly
________________ ______ __________
+NH3 O O γ-Glu-Cys-Gly
I II II I -OOC-CH-CH2-CH2-C-N-CH-C-N-CH2-COO- S I I I I H CH2 H S I I
SH γ-Glu-Cys-Gly
Glutatión reducido (GSH) Glutatión oxidado (GSSG) Figura 15. Estructura del glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
81
El GSH se sintetiza mediante el ciclo γ- glutamil, y su síntesis es dependiente de
la disponibilidad en el medio de cisteína. Se sintetiza en dos pasos,
catalizados por reacciones ATP dependientes a partir de aminoácidos libres
(Lehniger y col., 1993).
El primer paso consiste en una condensación del grupo γ-carboxilo del glutamato
con el grupo α- amina de la cisteína. El grupo carboxilo es activado en un principio
por el ATP para dar lugar a un intermedio de tipo fosfato de acilo que es atacado
por el grupo amina de la cisteína y forma una amida.
El segundo paso es similar, siendo activado el grupo α- carboxilo de la cisteína a
una forma de fosfato de acilo que permite la condensación con la glicina.
Cisteína Glicina
∩ ∩
ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi Glutamato γ -Glu-Cys γ-Glu-Cys-Gly
γ-Glutamil-cisteín sintetasa Glutatión sintetasa Glutatión (GSH)
Figura 16. Biosíntesis del glutatión (GSH).
4.1.3. Síntesis del GSH durante la maduración del ovocito: Papel en la PIV
La síntesis de GSH intracelular durante la MIV ha sido descrita en varias
especies: ratón (Calvin y col., 1986), hámster (Perreault y col., 1988), cerdo
(Yoshida y col., 1993a, b) y vaca (Miyamura y col., 1995; De Matos y col., 1995,
1996, 1997), cabras prepúberes (Rodríguez-González, 2001).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
82
El contenido en GSH aumenta durante el desarrollo y la maduración del ovocito
en el ovario mientras el ovocito se aproxima al momento de la ovulación (Perreault
y col., 1988; Rodríguez-González, 2001).
En el porcino, se observó que ovocitos madurados e inseminados mostraban
concentraciones más baja de GSH que los madurados pero no inseminados, lo
cual podría ser el resultado del bloqueo de la síntesis de GSH inducida por la
penetración espermática, o reflejaría el uso de parte del GSH para descondensar
los espermatozoides penetrados (Yoshida y col., 1993a).
Los niveles de GSH en ovocitos bovinos también se modulan durante la
maduración, siendo éstos superiores en ovocitos cultivados durante 18h y 21h
respecto a los no cultivados tras la fecundación (Miyamura y col., 1995).
El GSH fundamentalmente tiene 3 funciones a lo largo de la producción in vitro de
embriones:
1) Participación en la descondensación de la cabeza del espermatozoide y en su
posterior transformación a pronúcleo masculino.
2) Protección celular contra el daño oxidativo.
3) Papel en el desarrollo embrionario in vitro.
4.1.3.1. Papel del GSH en la descondensación de la cabeza del espermatozoide En 1975, Mahi y Yanagimachi postularon que el GSH podría jugar un papel en la
descondensación del núcleo del espermatozoide por reducción de los enlaces
disulfido de las protaminas o bien por activación de una enzima sulfidril que
segmentaría los enlaces disulfidos. Mas tarde, en 1981 Weisel y Schultz
demostraron la actividad de la enzima glutatión reductasa en los ovocitos del
ratón. Posteriormente se ha descrito la síntesis de GSH durante la maduración
ovocitaria como un prerrequisito para la descondensación de la cromatina
espermática y el inicio de la formación del pronúcleo masculino después de la
penetración del espermatozoide.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
83
La capacidad para formar el pronúcleo masculino en ovocitos de cerdo está
correlacionada positivamente con la concentración intracelular de GSH (Yoshida,
1993a; Funahashi y col., 1994). La descondensación espermática debe tener
lugar de forma más lenta o incompleta en ovocitos que contienen niveles de GSH
más bajos de lo normal, y esto se traduce en el desarrollo asincrónico de los
pronúcleos (Yoshida, 1993a). En 1993, Yoshida y col., concluyeron que suficiente
GSH en el ovocito es importante para reducir y/o completar la descondensación
del núcleo del espermatozoide en sincronización con la activación del ovocito,
asegurando la transformación en pronúcleo masculino.
En la mayoría de ovocitos de mamíferos la capacidad para descondensar la
cabeza del espermatozoide depende directamente del estadio de maduración del
ovocito. Así, se ha observado que la máxima actividad descondensante de la
cabeza del espermatozoide se da en ovocitos maduros, en metafase ΙΙ, y que es
mínima o ausente en ovocito inmaduros, en estadio de vesícula germinal
(Iwamatsu y Chang, 1972; Usui y Yanagimachi, 1976; Berrios y Bedford, 1979).
Adicionalmente, la actividad descondensante disminuye tras la fecundación y está
de nuevo ausente o disminuida en ovocitos en estadio de pronúcleos (Usui y
Yanagimachi, 1976; Komar, 1982).
La cantidad de GSH absoluta en el ovocito, no es probablemente el único factor
determinante en la capacidad descondensante. Además existen estudios en los
que se indica que la descondensación de la cabeza del espermatozoide en el
ovocito depende del tiempo y la temperatura, sugiriendo un requerimiento
enzimático (Perrault y col., 1987).
4.1.3.2. Papel del GSH en la protección celular contra el daño oxidativo Se ha postulado una relación entre el incremento en la formación de radicales
libres en los embriones cultivados in vitro y el bloqueo del desarrollo embrionario
(Nasr-Esfahani y col., 1990,1991; Noda y col., 1991; Umaoka y col., 1992; Goto y
col., 1993), sin embargo los mecanismos antioxidantes en los embriones aún son
temas de discusión. Los intermediarios activos derivados del oxígeno tales como:
radicales superóxido (O2-), radicales hidroxilo (OH) y peróxido de hidrógeno
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
84
(H2O2) reaccionan con proteínas, lípidos y ADN, trayendo como resultado la
interacción de enzimas, peroxidación de las membranas lipídicas y alteraciones
en el ADN. Las células eucariotas han desarrollado su propio sistema de
protección contra los productos de la oxidación del oxígeno. Estas contienen en
el compartimiento citosólico, Cu/Zn SOD (superóxido dismutasa), GSH (glutatión)
a elevadas concentraciones (Yu, 1994), catalasa y otros componentes tiol que
actúan como tampones metabólicos, pudiendo atenuar el estrés oxidativo
mediante la eliminación de agentes oxidantes. No obstante la capacidad
antioxidante no es ilimitada, y el pool de tioles reducidos se agota rápidamente
mientras se acumulan los productos de la oxidación de los disulfidos (Del Corso y
col., 1994).
Se ha demostrado que el GSH protege a los gametos y embriones contra el daño
oxiradical producido por ROS (Nasr-Esfahani y col., 1992; Griveau y Le Lannou,
1994; Luvoni y col., 1996).
El GSH actúa como antioxidante celular interaccionando con radicales superóxido
e hidroxilos. Como sustrato en la reducción de H2O2 catalizada por la glutatión
peroxidasa, el GSH detoxifica los peróxidos intracelulares. Se sintetiza
intracelularmente y se transporta a través de las membranas (Meister, 1983).
Se ha descrito además un papel extracelular del GSH en la prevención de la
peroxidación lipídica de las membranas celulares por agentes oxidantes
extracelulares (Thomas y col., 1988; Avissar y col., 1989).
4.1.3.3. Papel del GSH en el desarrollo embrionario Durante el desarrollo del ovocito en el ovario, el GSH se acumula en el ovocito,
protegiéndolo en estadios posteriores a la fecundación (Telford, 1990; Gardiner y
Reed, 1995a, b).
El incremento en el contenido de GSH proporciona a los ovocitos madurados in
vitro grandes cantidades de GSH adecuados para la protección de los embriones
hasta el estadio de blastocisto, mejorando la eficiencia de la producción in vitro de
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
85
blastocistos a partir de ovocitos inmaduros (Telford, 1990; Gardiner y Reed,
1995a, b; De Matos, 1995,1996).
En el ratón y la rata, el GSH aumenta su capacidad para eliminar peróxido de
hidrógeno citotóxico en el momento de la activación genómica (Nasr-Esfahani y
col., 1990), lo cual parece necesario para superar el bloqueo de desarrollo in vitro
en el estadio de 2 células (Nasr-Esfahani y col., 1992). También se ha
demostrado una disminución en el contenido de GSH tras la exposición de
embriones de ratón a peróxido de hidrógeno exógeno (Nasr-Esfahani y col.,
1992).
El GSH también juega un papel importante en la termotolerancia de los embriones
murinos preimplantacionales (Arechiga y col., 1995). Asimismo, en el ratón, se ha
observado que el GSH contenido en el fluido del tracto reproductivo femenino
puede ayudar a proteger a los embriones preimplantacionales de los efectos
adversos de la reducción de GSH embrionario endógeno o inducida por tóxicos,
ya que in vivo se pueden utilizar el GSH de las secreciones del tracto reproductivo
para recuperarse (Gardiner y col., 1998).
En ratas, la síntesis de GSH es esencial para el crecimiento normal y la depleción
de GSH por BSO tiene un efecto embriotóxico (Slott y Hales, 1986).
Gardiner y Reed (1994) observaron que ovocitos de ratón fecundados in vivo y
cultivados in vitro sufrían un bloqueo en el estadío de 2 células y mostraban un
contenido de GSH disminuido en comparación con los ovocitos desarrollados in
vivo, sugiriendo que la disminución de los niveles de GSH es una respuesta de los
embriones al estrés oxidativo. Asimismo, demostraron que los niveles de GSH
durante el desarrollo preimplantacional desde el ovocito fecundado hasta el
estadio de blastocisto disminuye aproximadamente 10 veces, de 7 mM a 0,7 mM.
Sin embargo, desconocían si este efecto se debía a una depleción del GSH
almacenado en el ovocito combinado con la incapacidad del embrión para
sintetizar GSH. En cambio, los embriones en estadio temprano poseen grandes
cantidades de GSH originado en los ovocitos.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
86
En el bovino, se ha sugerido que los embriones con bajas concentraciones de
GSH podrían haber estado sujetos a daños oxidativos, resultando en una baja
tasa de desarrollo (Takahashi y col., 1993). El GSH, además de su función como
antioxidante, debe jugar un papel importante a nivel intracelular en estadios
específicos del desarrollo embrionario bovino (Lim y col., 1996). La fluctuación de
la concentración de GSH en los embriones bovinos es parcialmente consistente
con la de los embriones de ratón, puesto que en los embriones bovinos se
encontró una mayor concentración de GSH en estadio de 1 célula que en el
estadio de 2 a 8 células (Lim y col., 1996). No obstante, los resultados de Lim y
col. (1996) demuestran que la biosíntesis de GSH en el embrión bovino es
diferente al del embrión de ratón, quizás porque los embriones bovinos utilizan
ARNm originado tanto del genoma embrionario como materno para dicha síntesis.
En un estudio realizado con ovocitos bovinos madurados in vitro, se evaluó el
efecto de la síntesis de GSH sobre el desarrollo embrionario. En este estudio se
indica que un incremento de GSH durante la MIV mejora el desarrollo embrionario
y su calidad, obteniéndose más embriones que alcanzaban el estadio de
blastocisto el día 6, siendo éste el estadio más adecuado para su congelación (De
Matos y col.,1996).
En el porcino, también se ha indicado que el desarrollo embrionario mejora con el
aumento de los niveles de GSH intracelular en los ovocitos, y se ha sugerido que
la concentración de GSH intracelular puede ser un marcador valioso para valorar
la competencia de desarrollo de los ovocitos después de la FIV (Abeydeera y col.,
1998ab). Sin embargo, Boquest y col. (1999) no vieron afectadas las
concentraciones de GSH intracelular por la presencia de GSH, y la mayor
producción de blastocistos no pareció ser el resultado de un aumento de GSH
intracelular dentro del ovocito. Extracelularmente, el GSH previene la peroxidación
lipídica de las membranas celulares por ROS extracelulares (Thomas y col., 1988;
Avissar y col., 1989). Cumpliendo su función como antioxidante, el GSH pudo
haber reducido la exposición de los ovocitos y los espermatozoides al estrés
oxidativo de la fecundación, eliminando los ROS excesivos presentes en el medio,
lo que habría resultado en mayores tasas de desarrollo.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
87
4.1.4. Efecto de la adición de compuestos tiol en la PIV Los componentes tioles, entre otras funciones se consideran reservas naturales
de poder reductor, los cuales pueden ser rápidamente utilizados por la célula
como defensa contra el estrés oxidativo. No obstante, esta capacidad como
antioxidante no es ilimitada y el pool de tioles reducidos se agota rápidamente
mientras que los disulfidos productos de la oxidación se acumulan (Del Corso y
col., 1994).
La presencia y disponibilidad de aminoácidos precursores es un factor regulador
en la síntesis de GSH, y es muy probable que en las células de mamíferos los
aminoácidos suministrados desde fuera de la célula sean un punto de control
(Bannai, 1986).
Se ha comprobado que el uso de un inhibidor específico de la síntesis de GSH, la
BSO, neutraliza el efecto promotor de los compuestos tiol sobre la síntesis de
GSH y el desarrollo en embriones bovino (Takahashi y col., 1993).
4.1.5. Efecto de la adición de GSH en la PIV Diversos estudios han analizado el efecto de la adición de GSH en el medio de
maduración, capacitación espermática, fecundación y/o cultivo embrionario in
vitro.
La mayoría de las células somáticas de mamíferos y los ovocitos no pueden
captar el GSH intacto, ya que no poseen un sistema de transporte para importar
GSH directamente al citoplasma (De Felice y col., 1987; Meister, 1991). No
obstante, el metabolismo extracelular o de membrana del GSH puede formar
productos como la γ-glutamilcisteína, cisteinglicina o cisteína que si pueden ser
transportados dentro de las células y utilizados para la biosíntesis de GSH
(Meister, 1991) .
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
88
4.1.5.1. GSH en el medio de MIV
La adición de GSH exógeno al medio de MIV no incrementó la proporción de
ovocito que se dividían y desarrollaban posteriormente in vitro (Luvoni y col.,
1996), este hallazgo puede explicarse por la afirmación de que las células del
cumulus que rodean a los ovocitos son ricos en GSH (Zuelke y col., 1997). Esto
debería ser suficiente para proteger a los ovocitos del daño de los radicales libres
(Legge, 1991).
Por otro lado, el medio comercial TCM 199 empleado para la MIV, contiene una
pequeña cantidad de GSH y de su precursor, la cisteína, por lo que la presencia
de GSH podría ser suficiente para proteger a los ovocitos del estrés oxidativo y
por su parte la cisteína podría mantener un buen nivel de síntesis de GSH durante
la MIV (Luvoni y col., 1996).
4.1.5.2. GSH en el medio de FIV Se ha demostrado que la adición de GSH al medio de preparación de los
espermatozoides o al medio de FIV aumenta la producción in vitro de blastocistos
en bovino (Earl y col., 1997; Van Soom y col., 1998; Taneja y col., 1998) y en el
porcino (Boquest y col., 1999). Earl y col. en (1997) observaron que la adición de
GSH durante la separación de los espermatozoides móviles con percoll mejoraba
la producción de blastocistos y opinaron que este hallazgo se debía posiblemente
a la protección del semen del daño producido por radicales libres. Sin embargo
Van Soom y col. (1998) encontraron que el GSH ejercía una influencia positiva
sobre la formación de blastocistos y la eclosión cuando se añadía durante la
fecundación, pero no se halló ningún efecto cuando se añadía durante la
preparación espermática. Con estos resultados estos autores concluyeron que los
espermatozoides dañados o anormales podrían ser una fuente de ROS, y que
tenían más oportunidad para generar ROS durante las 24 horas de fecundación
que durante los 30 minutos de separación por percoll. Por tanto, la eliminación de
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
89
ROS mediante GSH podría ser más efectiva durante un período prolongado de
co-incubación ovocito-espermatozoides. Aunque la calidad embrionaria no mejoró
por adición de GSH durante la FIV, el número total de células mejoró por adición
de GSH durante la separación con percoll. Estudios en el porcino, no revelaron un
aumento en la tasa de blastocistos ni en el número de células al añadir
0.25 mM de GSH durante el lavado espermático, atribuyendo las discrepancias
entre estudios a diferencias en los espermatozoides o a los procedimientos
empleado en los laboratorios (Boquest y col.,1999).
En bovinos, la inclusión de GSH en el medio de FIV presenta un efecto toro-
dependiente, relacionado con las diferencias en la producción de cantidades ROS
por espermatozoides de diferentes toros, así, el porcentaje de blastocistos
depende de la fuente de semen utilizada, mostrando un efecto positivo, negativo o
ausencia de efecto en función del toro donante (Kim y col., 1999). El efecto
positivo del GSH fue también dependiente de la concentración,
sugiriendo que una excesiva eliminación de ROS tiene un efecto negativo sobre el
resultado de la PIV, esto puede estar relacionado con el hecho de que los ROS
son necesarios para la adquisición de la capacidad fecundante por los
espermatozoides (De Lamirande y Gagnon, 1992, citado por Rodríguez-González,
2001).
La adición de GSH durante la FIV de ovocitos bovinos cultivados individualmente
en una gota pero no de ovocitos en grupo, incrementó la proporción de
fecundación normal y disminuyó la fecundación poliespérmica comparado con la
adición de hipotaurina y con el control (Fukui y col., 2000).
En ovocitos porcino, se observó una mayor tasa de producción de blastocistos
tras MIV-FIV al añadir GSH en las gotas de inseminación a concentraciones de
0.125 y 0.25 mM comparado con el control, pero las tasas de penetración,
poliespermia, formación del pronúcleo masculino y división embrionaria no fueron
afectadas, por lo que las mayores tasas de blastocistos no se pueden atribuir a
mejoras en la dinámica de la fecundación durante la FIV. Además, el número de
células de la masa celular interna y del trofoectodermo de los blastocistos
obtenidos, no mejoró como resultado del tratamiento con GSH (Boquest y col.,
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
90
1999). Estos resultados son comparables con los obtenidos en bovino donde se
ha observado que la presencia de GSH en el medio de fecundación doblaba las
tasas de producción de blastocistos, pero no mejoró el número de células de los
blastocistos (Van Soom y col., 1998). Sin embargo, en un estudio anterior en
bovinos, no se obtuvieron efectos beneficiosos al añadir 1 mM de GSH durante la
FIV (Luvoni y col., 1996). Al añadir 0.5 mM de GSH al medio de FIV, tampoco
mejoraron la proporción de formación de blastocistos, lo que indicaría que los
efectos beneficiosos del GSH durante la inseminación posiblemente se eliminen al
añadir GSH a elevadas concentraciones. Es posible que una concentración de
GSH elevada, pueda interrumpir el proceso de capacitación espermática, lo que
conlleva a bajas tasas de penetración (Boquest y col., 1999).
4.1.5.3. GSH en el medio de CIV
La protección de los embriones contra el estrés oxidativo debe ser un prerrequisito
para el desarrollo in vitro, porque es bien conocido que son extremadamente
sensibles a los radicales superóxido. Tanto los ovocitos como los embriones están
expuestos inevitablemente a más oxigeno y otros daños in vitro que in vivo,
debido a la exposición transitoria a oxigeno atmosférico y luz visible con las
manipulaciones necesarias. Se sabe que la iluminación aumenta la generación de
radicales del oxigeno (Halliwell y Gutteridge, 1990).
El GSH actúa como tampón redox y protege a las células de los ROS, sirven
como almacén y transporte de la cisteína y funciona en la reproducción y
desarrollo temprano (Gardiner y Reed, 1994).
Estudiando el efecto del GSH extracelular sobre el desarrollo embrionario in vitro,
algunos autores han mostrado una mejora en el desarrollo de los cigotos de ratón
tras el bloqueo a las 2 células hasta el estadio de blastocisto (Nasr-Esfahani y
col., 1992). El embrión preimplantacional de ratón no tiene la capacidad para
sintetizar GSH de novo hasta el estadio de blastocisto, así que los embriones que
se desarrollan in vitro podrían ser sensibles a los agentes que disminuyen el GSH,
como los ROS.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
91
La eficacia del GSH exógeno para incrementar el desarrollo enfatiza un posible
papel extracelular, ya que la mayoría de células no pueden captar GSH intacto
(Meister, 1983) y la adición de GSH no aumenta el nivel intracelular en los
embriones de ratón tras una reducción (Gardiner y col., 1998). El GSH
extracelular puede eliminar de forma no enzimática ROS del medio o sobre la
superficie extracelular de los embriones, previniéndolos del daño causante, como
la peroxidación lipídica (Thimas y Reed, 1990, citado por Rodríguez-González,
2001). En otros estudios se ha demostrado que el GSH extracelular protege las
proteínas de superficie de la célula del daño oxidativo (Smith y col., 1996).
En 1996, Luvoni y colaboradores, demostraron un efecto positivo sobre el
desarrollo de blastocistos cuando el GSH se añadía durante el cultivo embrionario
in vitro, mientras que la adición de GSH durante la MIV o la FIV no tenía efecto.
Como se ha mencionado uno de los efectos del GSH es la reducción del H2O2
actuando como sustrato de la GSH peroxidasa. Estos autores hallaron el mayor
efecto al añadir el GSH el día 6 post-inseminación, se corresponde con el
momento en que los embriones progresan del estadio de 8-16 células hasta el
estadio de mórula, siendo la fase en que podrían ser más sensibles al estrés
oxidativo. Por su parte la inclusión de GSH en el medio definido de CIV, 5 días
después del inicio del cultivo, no mostró un efecto beneficioso sobre el desarrollo
de embriones bovinos (Brackett y col., 1993).
En embriones de ratón cultivados in vitro, Legge y Sellens (1991) observaron que
la adición de 1 mM de GSH a un medio sin suero, promovía el desarrollo hasta el
estadio de mórula o blastocisto en el 50% de cigotos cultivados y con una tensión
de oxigeno del 20%. Estos autores sugieren que el bloqueo en estadios de 2
células en CIV, es consecuencia, al menos en parte, del daño de los radicales
libres que sucede en los embriones durante la recogida y el cultivo, y que la
suplementación del medio con GSH, que elimina radicales, puede mejorar el
desarrollo in vitro.
Lee y col. (2000) estudiaron el efecto de la adición de GSH en el medio de CIV
sobre el desarrollo de embriones tempranos de cabras adultas superovuladas, y
encontraron que la ausencia de GSH no permitía el desarrollo de los embriones
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
92
mas allá del bloqueo de las 8-16 células, mientras que la adición de GSH
mejoraba el desarrollo in vitro de los embriones tempranos hasta blastocisto. La
acción del GSH dependía de la presencia de fuentes proteicas añadidas al medio
de cultivo. Así, la adición de un 10% de FCS resultó en un 91% de blastocistos
con una media celular de 185 ± 12 células. De esta manera, se demostró que el
GSH podría mejorar el desarrollo in vitro de embriones de cabra tempranos
actuando sobre el estadio de bloqueo de 8-16 células, sugiriendo que el GSH
debe ser uno de los reguladores más importantes sobre el desarrollo in vivo
de los embriones de cabra. También se menciona la posibilidad de que el GSH
extracelular pueda actuar indirectamente sobre los embriones mediante la
albúmina sérica y/u otras proteínas (Lee y col., 2000).
4.1.6. Utilización de la cisteamina en la PIV 4.1.6.1. Propiedades de la cisteamina.
La Cisteamina es un tiol de bajo peso molecular, cuya estructura es la siguiente:
H2 NCH2CH2SH 4.1.6.2. Antecedentes y Modo de Acción La cisteamina incrementa el GSH intracelular en las células de linfoma de ratón
(Ishii y col., 1981; Zmuda y Friedenson, 1983) y en las células CHO (Chinese
hamster ovary) (Issels y col., 1988). También se ha observado que en estas
células CHO la adición de cisteamina al medio de cultivo provoca un incremento
pronunciado en el consumo de [35S] cistina (Meier y Issels, 1995). Por otra parte,
en las células LAK, el consumo de cistina promovido por cisteamina
probablemente ocurre en forma de cisteína, la cual es transportada por el sistema
ASC (alanina-serina-cisteína).
Ishii y col en (1981) describieron que el tratamiento de las células L-1210 de ratón
con cisteamina aumentaban el movimiento del sulfuro a través de la membrana
plasmática, en forma de disulfido mixto hidroxi-terminal mediante en sistema L.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
93
También es probable el consumo de disulfidos mixtos cisteína-cisteamina
mediante el mencionado sistema (Christensen, 1990; Meier y Issels, 1995).
La cisteamina reacciona con la cistina por intercambio sulfhidril-disulfido para
producir el disulfido mixto de cisteína y cisteamina, por lo que el aumento del
transporte de membrana ocurre por un sistema diferente del empleado
normalmente por la cistina. En este caso, el componente sulfhidrilo funciona
como un sistema de distribución transmembrana para la cistina mediante el
intercambio sulfhidril-disulfido estimulado por él (Pisoni y col., 1985, 1987).
4.1.6.3. Cisteamina en el medio de MIV La cisteamina transporta grupos tioles libres al citoplasma (Issel y col., 1988;
Meister, 1991) y mediante el incremento de la concentración de GSH en el
ooplasma pueden mejorar la fecundación y la competencia para el desarrollo de
los ovocitos de porcino (Grupen y col., 1995) y bovino madurados in vitro
(Takahashi y col,. 1993; De Matos y col., 1995, 1996, 1997), ovinos (De Matos y
col., 1999; hámster (Kito y Bavister, 1997), caprinos (Rodríguez, 2001).
La adición de cisteamina al medio en concentraciones excesivas puede prevenir
la completa oxidación de la cisteína a cistina. La cisteamina reaccionaría con la
cisteína y posiblemente tambien reaccionaría con la cistina por intercambio
sulfidril-disulfido formando un disulfido mixto (Ishii y col., 1981). También se ha
demostrado que para disponer de una fuente de cisteína, las células de
mamíferos toman disulfidos mixtos similares vía transportador de leucinas y se
separan dentro de la célula (Ishii y col., 1981).
Por otro lado, la cisteamina puede estar implicada directamente en la reducción
de las uniones disulfido de las protaminas, por ejemplo en la cromatina del núcleo
espermático, un requisito para la formación del pronúcleo masculino (Mattioli y
col., 1988).
Bannai (1984) e Issels y col. (1988) trabajaron bajo la hipótesis de que los
compuestos tioles de bajo peso molecular como la cisteamina, cuando estaban
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
94
presentes en el medio de maduración, debían reducir la cistina a cisteína
aumentando la síntesis de GSH. Sin embargo, no se encontró ningún efecto
aditivo al añadir al medio de MIV conjuntamente cisteína y cisteamina (De Matos y
col., 1996).
Se ha demostrado que la adición de cisteamina al medio de maduración produce
un incremento del contenido de GSH en ovocitos bovinos y una mejora en la tasa
de desarrollo celular hasta blastocisto (De Matos y col., 1995, 1996).
De Matos y col. (1996) concluyeron que el incremento en la síntesis de GSH
provocado por la cisteamina, proveía a los ovocitos madurados in vitro de grandes
reservas de GSH disponibles para la protección del embrión hasta el estadio de
blastocisto, incrementando la eficiencia de la producción de blastocistos a partir
de ovocitos inmaduros.
Mas tarde, De Matos y col. (1997) demostraron que la adición de cisteamina al
medio de MIV producía un incremento en el nivel de GSH intracelular tanto en
complejos cumulus ovocitos (COCs) como en ovocitos denudados. No obstante,
observaron que el efecto de la cisteamina mejoraba cuando los ovocitos estaban
rodeados por células del cumulus y que, por tanto, estas células contribuían al
efecto estimulante ejercido por la cisteamina sobre la síntesis de GSH, ya que en
los complejos cumulus ovocito se halló un mayor contenido de GSH que en los
ovocitos denudados. La adición de cisteamina al medio de MIV incrementó el
contenido de GSH en ovocitos denudados, probablemente por conversión de
cistina a cisteína y por promoción de la captación de cisteína, aumentando de esta
manera la síntesis de GSH (De Matos y col., 1997).
La suplementación del medio de MIV con cisteamina, aumenta el contenido
intracelular de GSH de ovocitos bovinos y mejoran el desarrollo embrionario y su
calidad, produciendo más embriones que alcanzan el estadio de blastocisto el día
6, que los embriones procedentes de ovocitos madurados en un medio no
suplementado (De Matos y col., 1995, 1996). Se ha considerado la posibilidad de
que la cisteamina pudiera ser beneficiosa si se añade en pasos posteriores a la
maduración (De Matos y col., 1995). Sin embargo la adición de 50, 100 o 250 µM
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
95
de cisteamina en el medio de MIV de ovocitos bovinos, no mejoró las tasas de
división y desarrollo embrionario in vitro, e incluso, la adición de 250 µM de
cisteamina pareció ser tóxica para el embrión. Por otro lado, la adición de 0.5-
1mM de hipotaurina al medio de CIV mejoró la producción y la calidad de los
blastocistos (Guyader y col., 1998).
El aumento de las tasas de división y desarrollo embrionario hasta los estadios de
mórula y blastocisto podrían explicarse según De Matos y Furnus (2000) por la
mejorada protección contra el estrés oxidativo durante la FIV y los estadios
tempranos de desarrollo embrionario, debido a los elevados niveles de GSH
intracelular hallados en los presuntos cigotos. Este hallazgo es similar a los
resultados obtenidos por otros autores previamente (Takahashi y col., 1993; Lim y
col., 1996; Luvoni y col., 1996; Caamaño y col., 1996) quienes mostraban que el
incremento en la síntesis de GSH debido a la adición de compuesto tioles durante
el cultivo in vitro de embriones en estadio tempranos mejoraba la tasa de
desarrollo de blastocisto. De Matos y Furnus (2000) observaron que en los
ovocitos tratados con β mercaptoetanol, cisteína y cistina los niveles de GSH, las
tasas de división, formación de mórula y blastocistos fueron más elevados en los
ovocitos tras la MIV y en los presuntos cigotos tras la FIV que en el control.
Mientras que el contenido de GSH en los embriones de 6-8 células fue similar
entre tratamientos. Los resultados de este estadio permite concluir que los
elevados niveles de GSH intracelular tras la inducción de su síntesis por los
componentes tiol en ovocitos bovinos permanecen durante la FIV y aun están
presentes al inicio de la CIV, mejorando las tasas de desarrollo.
Gasparrini y col. (2000), en ovocitos de búfalo encuentran que la adición de 50
µmol de cisteamina al medio de MIV mejoraba el porcentaje de embriones que se
desarrollaban hasta mórula compacta y blastocisto y embriones transferibles
(grados 1 y 2 ), pero no mejoraba las tasas de maduración nuclear y división.
En ovinos, la cisteamina y el BME en el medio de MIV estimularon la síntesis de
GSH, pero solo la cisteamina mejoró el desarrollo embrionario (De Matos y col.,
1999).
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
96
La adición de 50 µM o 500 µM de cisteamina al medio de MIV en ovocitos de
porcino, aumento la incidencia de desarrollo pronuclear sincrónico en ovocitos
monoespérmicos (43% y 45%, respectivamente vs 10% del control) y
poliespérmico (68% y 75% respectivamente vs 43% en el control) (Grupen y col.,
1995). Así mismo en este estadío se demostró que la adición de 500 µM al medio
de maduración tenía un efecto beneficioso sobre el desarrollo embrionario in vitro
(12% de blastocisto vs 1% en el grupo control). La mejora en el desarrollo puede
deberse en parte, a un aumento en la incidencia de formación pronuclear
sincrónica tras la fecundación. Además, los niveles aumentados de componentes
tiol en el citoplasma, acumulados durante la maduración, puede persistir en los
embriones en división y contribuir a la división celular mitótica (Chance y col.,
1979). Esta interpretación permitiría explicar porque ambas concentraciones de
cisteamina aumentaron la formación sincrónica de los pronúcleos mientras que
solamente la concentración más alta estimuló de manera significativa el desarrollo
embrionario, ya que la mayor concentración de cisteamina permite una mayor
acumulación de tioles citoplasmáticos. Posteriormente Yamauchi y Nagai (1999)
describieron que la cisteamina no debía tener efecto en el aumento de la
maduración meiótica en ovocitos porcinos denudados, puesto que utilizando una
concentración de 500 µM, observaron degeneración de los ovocitos, ninguno
maduró a metafase ΙΙ. Los resultados de este estudio indican que las células del
cumulus podrían neutralizar el efecto dañino de una elevada concentración de
cisteamina en el cultivo de ovocitos.
En ovocitos porcinos, Nagai y col. (2001) realizaron otro estudio comparando
varias concentraciones de cisteamina en el medio de MIV (0, 5, 150, 250, 375 y
500 µM), y observaron que elevadas concentraciones de cisteamina (superiores a
250 µM) inhibían la maduración de los ovocitos denudados. No obstante, tras
exponerlos a una concentración óptima de cisteamina durante la MIV, se
promovía la formación de pronúcleo masculino.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
97
4.1.6.4. Cisteamina en el medio de CIV La adición de cisteamina en el medio de cultivo embrionario y su efecto sobre la
competencia para el desarrollo también ha sido evaluado. Takahashi y col. (1993)
observaron que el incremento en la concentración de GSH intracelular (53.0 vs
14.6 pmol) causado por la adición de cisteamina al medio de cultivo era
beneficioso para el desarrollo de embriones bovinos en estadio de 6-8 células
hasta el estadio de blastocisto. El mayor desarrollo hasta blastocisto se obtuvo en
embriones cultivados en presencia de 10 y 50 µM de cisteamina con respeto a la
no adición de cisteamina, pero no obtuvieron ningún blastocisto cuando incluyeron
500 µM de cisteamina.
La hipotaurina y la taurina (hipotaurina oxidada) parecen tener un efecto positivo
sobre el desarrollo embrionario (Reed y col., 1992; Dumoulin y col., 1992). Por su
parte la cisteamina es un precursor de la hipotaurina y se transforma a hipotaurina
por oxidación in vitro (Huxtable, 1992). Este hecho hizo postular a Takahashi y
col. (1993) que podría haber alguna contribución de la cisteamina con relación al
efecto de la hipotaurina sobre el desarrollo de los embriones en sus
experimentos.
Capítulo II: Revisión Bibliográfica
98
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo III: GSH y Glucosa
129
CAPITULO III
EFFECT OF THE ADDITION OF GLUTATHIONE AND GLUCOSE TO THE CULTURE MEDIUM ON EMBRYO DEVELOPMENT OF IVM-IVF PREPUBERTAL GOAT OOCYTES EFECTO DE LA ADICIÓN DE GLUTATIÓN Y GLUCOSA EN EL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE OVOCITOS DE CABRA PREPUBER MIV-FIV Aixa Urdaneta, Ana Raquel Jiménez, Dolors Izquierdo and María-Teresa Paramio1
1Departament de Ciencia Animal i dels Aliments, Universitat Autónoma de
Barcelona; E-08193, Bellaterra, Spain.
Date submitted: 9. 12. 02 Date accepted: 28. 01. 03
Zygote (2003); 11 (May): 131-138
Capítulo III: GSH y Glucosa
130
EFFECT OF THE ADDITION OF GLUTATHIONE AND GLUCOSE TO THE
CULTURE MEDIUM ON EMBRYO DEVELOPMENT OF IVM-IVF PREPUBERTAL GOAT OOCYTES.
Aixa Urdaneta, Ana Raquel Jiménez, Dolors Izquierdo and María-Teresa Paramio1
Departament de Ciencia Animal i dels Aliments. Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain
Date submitted: 9.12.02. Date accepted: 28.01.03.
Summary
Our previous studies have shown that larger and more competent oocytes can be
selected using the brilliant cresyl blue (BCB) test. The objective of this study was
to assess, in BCB-selected oocytes, the effect on the embryo development of the
prepubertal goat of the addition to in vitro culture (IVC) medium of either
glutathione (GSH) alone or GSH in combination with glucose. Oocytes were
exposed to 26 µM of BCB and were classified as: oocytes with a blue cytoplasm or
grown oocytes (BCB+) and oocytes without blue cytoplasm or growing oocytes
(BCB-). Oocytes were matured in TCM-199 with 100µM of cysteamine.
Presumptive zygotes were cultured in synthetic oviductal fluid (SOF) in the
presence or absence of 1 mM of glutathione (experiment 1) for 7 days (8 days
post-insemination, p.i.). In experiment 2 we tested the addition to culture of 2.78
mM of glucose at day 5 p.i. BCB+ oocytes showed higher percentages of nuclear
maturation than the BCB- and control groups (82.6%; 55.7% and 74.7%,
respectively). The percentage of polyspermic oocytes was higher in BCB- than
BCB+ oocytes. Supplementation of SOF medium with 1 mM GSH did not affect
embryo development but the percentage of total embryos developed after culture
was higher in BCB+ oocytes than BCB-oocytes independently of the GSH
supplementation. Glucose, alone or with GSH, added at 5 days p.i. did not affect
embryo development. In conclusion, prepubertal goat oocytes we unable to
develop beyond the 8-cell stage embryo under the culture conditions in this study.
Key words: Goat, Prepubertal, IVF, GSH, Glucose.
Capítulo III: GSH y Glucosa
131
1. Introduction
The use of prepubertal animals as donors offers the potential of reducing
generation intervals and increasing the rate of genetic gain through embryo
transfer (Betterigde et al., 1989; Duby et al., 1996). The birth of live calves
(Kajihara et al., 1991; Revel et al., 1995; Khatir et al., 1998) and lambs (O�Brien et
al., 1997; Ptak et al., 1999) following in vitro maturation (IVM) and in vitro
fertilisation (IVF) of oocytes obtained from prepubertal donors has been reported,
and numerous researchers have investigated the developmental competence of
oocytes from prepubertal females. Although oocytes from prepubertal animals had
normal rates of meiotic maturation, male pronucleus formation was delayed or
even not completed (Damiani et al., 1996). In our studies with prepubertal goat
oocytes (30-60 days old) the principal anomalies of IVF were the failure of male
pronucleus (MPN) formation in both monospermic and polyspermic fertilisation
(Martino et al., 1995; Mogas et al., 1997), the high incidence of haploid embryos
(Villamediana et al., 2001) and the low percentage of embryos developed to
blastocyst stage because most of the cleavage oocytes arrest their development at
the 8-cell stage (Izquierdo et al., 1999). In our laboratory, previous studies with
prepubertal goat oocytes showed that more competent oocytes could be selected
using brilliant cresyl blue (BCB) stain (Rodríguez-González et al., 2002). BCB stain
helps determine the activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), an
enzyme synthesised in growing oocytes but with decreased activity in oocytes that
have finished their growth phase (Wassarman, 1988). Thus oocytes that have
finished their growth phase show decreased G6PD activity and exhibit a cytoplasm
with a blue coloration (BCB+) because G6PD does not reduce BCB to a colourless
compound. In our previous study, prepubertal goat BCB+ oocytes showed a larger
oocyte diameter, greater nuclear maturation, a higher rate of normal fertilisation
and more embryos undergoing development to beyond the 8-cell stage than BCB-
oocytes. However, embryo development to morula and blastocyst stages was low
and not statistically different from that in BCB- oocytes (Rodríguez-González et al.,
2002). In another attempt to increase embryo development from prepubertal goat
oocytes, we studied the addition of different thiol compounds to the IVM medium
(Mayor et al., 2001 and Rodríguez-González et al., 2001) reaching the conclusion
Capítulo III: GSH y Glucosa
132
that the addition of 100 µM of cysteamine to IVM improved MPN formation. The
low rates of embryo development in our studies could be caused by an inherent
deficiency of prepubertal oocytes as was shown in cows (Salamone et al., 2001) or
by suboptimal culture conditions of these oocytes. In adult goats, Lee et al. (2000)
found that culturing 1- or 2-cell in vivo produced embryos in synthetic oviductal
fluid (SOF) medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1mM
glutathione (GSH) resulted in 91% of them developing to blastocyst stage. This
study clearly showed a strong and specific action of extracellular GSH improving in
vitro development of goat early-stage embryos by specifically acting on the 8- to
16-cell block stage. Several authors have studied the effect of thiol compounds
(GSH, cysteamine, cystine, cysteine and β-mercaptoethanol) added to the IVM
medium, IVF medium and in vitro culture (IVC) medium on embryo development.
The addition of thiol compounds to the IVM medium has improved the
development of bovine, buffalo, porcine and ovine embryos (De Matos et al., 1995,
1996, 2002b; Grupen et al., 1995; Yamauchi & Nagai, 1999; Gasparrini et al.,
2000). The effect of thiol compounds on embryo development is mediated by the
increases of intracellular GSH levels in oocytes, zygotes and embryos (Takahashi
et al., 1993; De Matos et al., 1996, 2002a; Abeydeera et al., 1998; De Matos &
Furnus, 2000). Thus, De Matos et al. (2002a) demonstrated that the percentage of
embryos reaching the blastocyst stage increased when 100 µM cysteamine was
added to the IVM medium, and results were further improved when 50 µM of
cysteamine was added to the IVC medium.
Understanding the metabolic needs of preimplantation embryos is vital to improve
the quantity and quality of embryo development. One recurring pattern observed in
embryo metabolism is increased glucose usage as preimplantation development
progresses (Thompson et al., 1991). In cattle, the presence of glucose before the
maternal-zygotic transition can have a detrimental effect on embryo development
(Kim et al., 1993; Matsuyama et al., 1993) however, in ovine oocytes, the addition
of glucose after 3 days of in vitro culture had a positive effect on embryo
development to morula and/or blastocyst stage (Ledda et al., 1992). In pig, in vitro
produced embryos have significantly increased glycolitic activity after the 8-cell
stage, whereas in vivo derived embryos have increased glycolysis at the
Capítulo III: GSH y Glucosa
133
blastocyst stage (Swain et al., 2002). Lim et al. (1994), after adding different
concentrations of glucose to culture medium at day 5 postinsemination (p.i.),
concluded that a glucose concentration of 2.78 mM significantly improved the
percentage of embryos developed to blastocyst stage in comparison with glucose
concentrations of 0, 1.39, 4.17, 5.56 and 6.95 mM.
The present study was undertaken to determine, in prepubertal goat oocytes
matured with 100 µM cysteamine: (1) the effect on the subsequent embryo
development of oocytes selected by brilliant cresyl blue before IVM of
supplementing the IVC medium with glutathione; and (2) the effect of a double
supplementation of culture medium with 1mM of glutathione and 2.78 mM of
glucose.
2. Materials and methods
2.1. Oocyte collection
We obtained ovaries from goats, 30 to 60 days old, from a local slaughterhouse and
transported them at 37ºC in Dulbecco�s phosphate-buffered saline (PBS; P-4417,
Sigma Chemical, St. Louis, MO) containing 50 µg/ml gentamicin. We recovered the
follicular contents by slicing the ovaries in a 60 mm culture dish with TCM199
(Sigma, M-2520), supplemented with 2,2 mg/ml NaHCO3, 2% (v/v) steer serum
(Donor Bovine Serum, CanSera, Ontario, Canada) and 50 µg/ml gentamicin. We
selected only oocytes with one o more complete layers of cumulus cells and
homogeneous cytoplasm.
2.2. Brilliant cresyl blue test
Immediately after oocyte collection, we washed the oocytes three times in mPBS,
i.e. PBS with 1090 mg/l glucose, 35.2 mg/l pyruvate, 0.4% (w/v) bovine serum
albumin (BSA; fraction V, A-9647, Sigma, USA) and 50 µg/ml gentamicin. Then we
exposed the oocytes to 26 µM of BCB (B-5388, Sigma, USA) diluted in mPBS for
90 min at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air. After this, we
Capítulo III: GSH y Glucosa
134
washed the oocytes three times in mPBS and classified them into two groups,
depending on their cytoplasm coloration: BCB+ oocytes showed blue cytoplasm
coloration and BCB- oocytes were those without blue coloration. After this
classification, we washed the oocytes three times in maturation medium.
2.3. In vitro maturation of oocytes
The maturation medium was TCM199 (M-752, Sigma, USA) supplemented with
275 µg/ml sodium pyruvate (P-3662, Sigma, USA), 146 µg/ml L-glutamine (G-
5763, Sigma, USA), 10% (v/v) steer serum, 10 µg/ml o-LH (L-5269, Sigma, USA),
10 µg/ml o-FSH (Ovagen, Immuno Chemicals Products Ltd., Auckland, New
Zealand), 1 µg/ml 17β estradiol (E-2257, Sigma, USA), 100 µM cysteamine (M-
9768, Sigma, USA) and 50 µg/ml gentamicin. We transferred groups of 20-25
oocytes to 100-µl microdrops of maturation medium and incubated them for 25 h
at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air under mineral oil (M-3516,
Sigma, USA).
2.4. Sperm preparation
At the end of the maturation period, oocytes were inseminated with fresh semen.
We collected ejaculates from two Murciano bucks of proven fertility into artificial
vaginas and transported them at 37ºC within 30 min to the laboratory. We
evaluated the motility of sperm cells under an inverted microscope and separated
motile sperm fraction by swim-up. We placed 70 µl of semen in each of several
conical tubes under 2 ml Defined Medium (Brackett & Oliphant, 1975) modified by
Younis et al. (1991) and referred to as mDM here, and incubated it for 45-60 min in
a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5ºC. After incubation, 600 µl from
the top of each tube was removed and pooled in a sterile 15-ml centrifuge tube
and centrifuged at 200 g for 10 min. After discarding the supernatant, we
resuspended the resulting sperm pellet 1:1 with mDM medium containing heparin
(100 µg/ml heparin-sodium salt; 170 USP/mg) and incubated it for 45-60 min in a
humidified air atmosphere of 5% CO2 at 38.5ºC (final concentration: 84x106
sperm/ml, approximately).
Capítulo III: GSH y Glucosa
135
2.5. In vitro fertilisation of oocytes
After maturation, we transferred groups of 20-25 oocytes into 100 µl fertilisation
microdrops of modified Tyrode�s medium (TALP), as described by Parrish et al.
(1986), supplemented with 1 µg/ml hypotaurine (H-1384, Sigma, USA) under
mineral oil. After capacitation, we assessed sperm concentration with a
hemacytometer, and added an aliquot (5 µl) of the sperm suspension to the
fertilisation microdrops (final concentration: 3.5x106 sperm/ml). We cultured it for
24 h in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5ºC.
2.6. Evaluation of oocytes after IVM and IVF
To evaluate the nuclear stage after maturation we fixed a sample of oocytes at 25
h of IVM and stained it with 1% lacmoid (L-7512, Sigma, USA). We measured
oocyte maturation by the percentage of oocytes reaching the metaphase II (MII)
stage.
To evaluate the pronuclear stage after 17 h of IVF we processed a sample of
oocytes in the same way as the oocytes fixed after IVM. We considered oocytes
with a sperm tail in the cytoplasm to be fertilised and classified them into one of
three groups: 2PN (female pronucleus, male pronucleus and sperm tail; normal
fertilisation), polyspermy (two or more sperm tails in the cytoplasm with condensed
heads or two or more decondensed heads in the cytoplasm), and asynchrony
(female pronucleus and a condensed sperm head).
2.7. In vitro embryo culture
Following 24 h of sperm exposure we washed the oocytes in the culture medium
with the aid of a fine pipette to separate oocytes from any sperm cells. We cultured
the embryos in groups of 20-25 in 20-25-µl microdrops (1 µl culture medium per
embryo) of SOF (Tervit et al., 1972) modified by Takahashi & First (1992) and
Capítulo III: GSH y Glucosa
136
supplemented with 1 mM glutathione. Microdrops were placed in 35 mm culture
dishes under mineral oil in a humidified atmosphere of 5% CO2, 5% O2 and 90%
N2. Presumptive embryos were maintained in culture for 7 days. After 24 h in
culture (that is, 48 h p.i.), 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, Life Technologies)
was added to the microdrops (0.1 µl serum per embryo).
To examine the effect of glucose on the development embryos, 2.78 mM of
glucose was added to IVC medium at 5 days p.i. until the final of in vitro culture.
At the end of the culture period, we assessed total cell number of embryos with
fluorescent microscopy after Hoechst staining and recorded the percentage of total
embryos, morulae (embryos with 16 or more cells and without blastocoele) and
blastocysts (embryos with 60 or more cells with blastocoele formation).
2.8. Statistical analysis
We calculated differences among treatment groups by means of chi-square
analysis or Fischer�s exact test where appropriate. We calculated overall chi-
square and found it significant before performing the Fischer�s exact test to detect
differences between treatment groups. We performed Kruskal-Wallis test with
Dunn's Multiple Comparisons post-test to analyze differences among groups in
embryo cell number, using GraphPad InStat (version 3.01 for Windows 95,
GraphPad Software, San Diego, California, USA). Differences with a probability
value of 0.05 or less were considered significant.
2.9. Experimental design
In Experiment 1, we analyzed the effect of BCB selection of oocytes on nuclear
maturation and in vitro fertilisation. We designed three groups of treatment: BCB+,
BCB-, and control. The control group was oocytes not exposed to BCB stain and
matured during 27 hours. All groups were transferred to microdrops of maturation
medium. Embryo development was studied in conventional IVC with absence
(glutathione (GSH)-free medium) or presence of 1mM GSH during the whole
culture.
Capítulo III: GSH y Glucosa
137
In experiment 2, we analyzed the effect of supplementation of the IVC medium
with 1mM GSH and the addition of glucose at 5 days p.i. on embryo development.
3. Results
3.1. Experiment 1 Table 1 shows the nuclear stage after IVM of 359 BCB-exposed oocytes and 178
control oocytes. Most oocytes in all groups were capable of undergoing germinal
vesicle breakdown (GVBD). However, the percentage of oocytes blocked at
metaphase I was higher (31.8%) in BCB- oocytes than BCB+ oocytes (12.5%;
p<0.0001) and control oocytes (20.78%; p<0.02). The percentage of BCB+
oocytes reaching the MII stage was higher (82.6%; p< 0.0001) than that of BCB-
(55.7%) or control oocytes (74.7%).
Oocyte Classifi cation
Total oocytes
GV N (%)
GVBD N
(%)
M I N (%)
AN-Tel I
N (%)
M II N (%)
BCB+
167 0 (0) 1
(0.6) 21
(12.5)a 3 (1.8) 138 (82.63)d
BCB-
192 13 (6.8) 0 (0) 61
(31.8)b 0 (0) 107 (55.70)e
Control
178 4 (2.24) 1
(0.56)37
(20.78)c 0 (0) 133 (74.71)f
GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdown; M I, mataphase I; An-Tel I, anaphase-telophase I; M II, metaphase II. a Values in the same column with different letters (a,b,c,d,e,f) differ significantly (p<0.05).
Table 2 shows the IVF parameters of 507 oocytes. There were not significant
differences among treatments in total fertilised oocytes, oocytes with 2PN and
oocytes with asynchronous fertilisation. The percentage of polyspermic oocytes
Capítulo III: GSH y Glucosa
138
was significantly higher in BCB- oocytes than BCB+ oocytes (p<0.005). Not
differences were found between the control group and the other two groups.
Table 2. Effect of the oocyte selection using brillant cresyl blue (BCB) on in vitro
fertilisation of prepubertal goat oocytes (12 replicates)a
Fertilised oocytes Oocyte classific
ation
Total oocytes
Total n (%)
2PN n (%)b
Asynchronous n (%)b
PolyspermicN (%)b
BCB+
151 39 (25.8) 35 (89.76) 4 (10.2) 0 (0)a
BCB-
191 47 (24.6) 35 (74.5) 3 (6.3) 9 (19.1)b
Control
165 56 (33.9) 48 (85.7) 3 (5.3) 5 (8.9)a,b
2PN, two pronuclei + one sperm tail; Polyspermic, oocytes with two o more sperm tails in the cytoplasm with non-decondensed heads or two or more decondensed heads in the cytoplasm; Asynchronous, oocytes with a condensed sperm head and one female pronucleus. a Values in the same column with different letters (a,b) differ significantly (p<0.05). b Percentages calculated from total fertilised oocytes.
Table 3 shows the rates of cleavage and development to the blastocyst stage of
oocytes exposed to BCB and cultured with GSH supplementation. The percentage
of total embryos developed after culture was higher in the group of BCB+ oocytes
than in the BCB- oocytes, both in the presence or in the absence of GSH.
However, there were not significant differences among treatments in the other
parameters studied. Most of the embryos were blocked before reaching the 8-cell
stage independently of oocyte treatments. There were no significant differences
Capítulo III: GSH y Glucosa
139
among treatments in the percentage of oocytes developed to blastocyst stage, nor
in the mean cell number of blastocysts.
Table 3. Effect of oocyte selection by brilliant cresyl blue (BCB) and
supplementation with 1 mM glutathione at in vitro culture on embryo development
of prepubertal goat oocyte. ( 7 replicates)a
Embryo development at day 8 post -insemination
Treatment Insemin
ated
oocytes
Total
embryos
n(%)b
2-7 cell
embryos
n(%)b
8-16 cell
embryos
n(%)b
Morula +
Blastocyst
n(%)b
Blastocysts
n(%) b N°
BCB+ 237 109 (46)a 86 (78.9) 16 (14.7) 7 (6.4) 1(0.9) 32 GSH
BCB- 323 82 69 (84.1) 8 (9.7) 5 (6.1) 2 (2.4) 54±8.5
BCB+ 221 91 (41.2)a 78 (85.7) 6 (6.5) 7 (7.6) 3 (3.2) 60±34.5 GSH
Free BCB- 285 55 38 (69.1) 9 (9.7) 8 (14.5) 2 (3.6) 70±42.4
a Values in the same column with different letters (a, b) differ significantly (P<0.001). b Percentages calculated from total number of embryos.
3.2. Experiment 2 Table 4 shows the effect of addition of 2.78 mM glucose to both culture media
(with or without GSH). This supplementation at 5 days p.i. did not improved
embryo development beyond the 8-cell stage. There were no significant
differences among treatments in the mean cell number of blastocysts.
Capítulo III: GSH y Glucosa
140
Table 4. Effect of addition of glucose to culture medium on embryo development
of prepubertal goat oocytes (7 replicates)
Embryo development at day 8 post-insemination
Blastocysts
Treatment
Inseminated
oocytes Total
embryos
n (%)
2-7 cell
embryos
n (%)a
8-16 cell
embryos
n (%)a
Morulae
Blastocys
n (%)a n (%)a Nº of
cells
Glucose 414 122 111 11 (9.1) 0 0
GSH No-
glucose 410 120(29.5) 107(89.2) 13(10.8) 0 0
Glucose
461 136(29.5) 105(77.2) 18 (13.2) 9 (6.6) 4 (2.9) 85±17.3 No-
GSH
No- Glucose
337 69 (20.5) 65 ( 94.2) 3 (4.3) 1 (1.4) 0
a Percentages calculated from total number of embryos.
4. Discussion
Immature oocytes stained with the BCB (BCB+) showed higher rates of nuclear
maturation than BCB- and control group oocytes. These results confirm previous
observations by Rodríguez-González et al. (2002) for IVM oocytes in the absence
of cysteamine. Meiotic competence of oocytes is determined by oocyte diameter
(Martino et al., 1994; Crozet et al., 1995; Hyttel et al., 1997). Rodríguez-González
et al. (2002) showed in prepubertal goat oocytes that the diameter of BCB+
oocyte was larger than that of BCB- oocytes (136.6 µm and 125.5 µm,
respectively) and control oocytes (129.3 µm). In pigs, oocytes selected as blue
after staining with the BCB test, were significantly larger than colourless oocytes
(Roca et al., 1998). However the high rates of polyspermic and asynchronous
fertilisation found by Rodríguez-González et al. (2002) in prepubertal goat oocytes,
Capítulo III: GSH y Glucosa
141
both BCB+oocytes (47% and 9%, respectively) and BCB-oocytes (49.8% and
13.5%, respectively), suggested that incomplete or abnormal cytoplasmic
maturation ocurred in prepubertal goat oocytes in spite of oocyte diameter
selection by BCB. In the present study our oocytes were matured in the presence
of 100 µM cysteamine and the fertilisation anomalies (polyspermy and
asynchrony) were dramatically reduced both in BCB+ oocytes (0 and 10.2%,
respectively) and BCB- (19.1 and 6.3%, respectively). There were no differences
in polyspermic and asynchronous fertilisation between BCB+ oocytes and the
control group. Addition of cysteamine to the maturation medium increases the
GSH contents in bovine (De Matos et al., 1995, 1996, 1997), ovine (De Matos et
al., 2002b) and porcine oocytes (Yamauchi & Nagai, 1999; Nagai, 1996),
enhancing the rate of MPN in porcine (Grupen et al., 1995; Nagai et al., 1996) and
hamster oocytes (Kito & Bavister, 1997), and improving embryo development in
bovine (De Matos et al., 1995, 1996, 2002a), ovine (De Matos et al., 1999, 2002b),
porcine (Grupen et al., 1995; Yamauchiand & Nagai, 1999) and buffalo oocytes
(Gasparrini et al., 2000). In this study, using oocytes from 2-month-old females,
the addition of cysteamine to the maturation medium improved normal IVF
(oocytes with two pronuclei and one sperm tail) but embryo development of these
oocytes remained limited. In one attempt to improve embryo development, and
knowing that Lee et al., (2000) achieved a rate of 97% of goat blastocysts from in
vivo 2-cell embryos adding 1 mM of GSH to IVC medium, we tested this IVC
medium with BCB+ and BCB- oocytes. Under our conditions the supplementation
with GSH did not improve embryo development from BCB+ and BCB- oocytes.
Several authors have studied the effect of GSH and other compound thiols on in
vitro embryo development. De Matos et al. (2002a) observed that the percentage
of embryos reaching the blastocyst stage was higher when 100 µM cysteamine
was added during IVM and this was further improved when 50 µM cysteamine was
added to embryo culture. The effect of cysteamine on embryo development is
attributed to the increases in intracellular GSH levels and its positive effect in
protecting the cells against oxidative damage. Extracellular GSH could not
increase the intracellular GSH levels of mouse embryos after intracellular GSH
depletion (Gardiner & Reed, 1994). Lee et al. (2000) suggested that extracellular
GSH may non-enzymatically scavenge reactive oxygen species in the medium or
Capítulo III: GSH y Glucosa
142
on the extracellular surface of the embryos, preventing them for causing damage,
such as lipid peroxidation, on the embryo surface. In our case, with IVM-IVF-IVC
embryos from prepubertal females, the quality and viability of these embryos were
not sufficient to enable the effect of extracellular GSH.
In experiment 2, the addition of glucose to the embryo culture media did not
improve embryo development. Energy requirements are one of the most important
factors conditioning embryo development. In general, the pattern of glucose
utilisation in bovine embryos produced by superovulation increased significantly
between the 16-cell and morula stage and in IVP embryos between the 8- and 16-
cell stage, the time of activation of the embryonic genome (Khurana & Neimann,
2000). However specie-specific effects are evident. In hamster embryos, glucose
is inhibitory at all stages of embryo development (Seshagiri & Bavister, 1989). In
murine (Chatot et al., 1989) and bovine embryos (Kim et al., 1993), glucose has an
inhibitory effect when present before the activation of the embryonic genome. In
pigs, IVP embryos have significantly increased glycolitic activity after the 8-cell
stage, whereas in vivo-derived embryos increased glycolysis at the blastocyst
stage (Swain et al., 2002). In the goat, the time of embryonic genome activation is
at the 8-cell stage (Kelk et al., 1994). In prepubertal goat oocytes, testing different
culture media, embryo development arrested before the 8-cell stage (Izquierdo et
al.; 1999, 2002). In our study, although glucose was added at day 5 p.i., most of
the embryos were blocked before the 8-cell stage and the addition of glucose was
irrelevant. This lack of response to any of the factors tested in this study could be
explained as a low and inherent inability of prepubertal oocytes to develop beyond
the 8-cell stage. In cattle, Salamone et al. (2001) showed that the activity of MPF
and MAPK and the relative amount of IP3R were substantially lower in calf than
adult oocytes. These cytoplasmic differences were correlated with the different
response to parthenogenetic activation and nuclear transfer embryo development.
They showed that cleavage and embryo development up to the morula stage was
similar in calf and adult cytoplasts. However, blastocyst production was
significantly lower in calf oocytes. The conclusion of the study was that key
ooplasmic components associated with fertilisation, cleavage and development are
compromised in calf oocytes. Driancourt et al. (2001) studying the differences
between calf and cow oocytes concluded that the estradiol output of calf oocytes
Capítulo III: GSH y Glucosa
143
was low because their aromatase activity was markedly reduced. Studying the
two-dimensional pattern of proteins neosynthesized by follicular walls and
comparing them using image analysis, these authors concluded that patterns of
follicular proteins were different in calves and cows.
In conclusion, it would seem that the lower development ability exhibited by
prepubertal goat oocytes will be difficult to overcome through changes in the
oocyte culture conditions. Further studies will be necessary to understand the
characteristics and differences between oocytes from adult and juvenile females.
Acknowledgements This study was supported by MCYT (grant AGL2000-0353).
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Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
149
CAPITULO IV
SUPPLEMENTATION WITH CYSTEAMINE DURING MATURATION AND EMBRYO CULTURE ON EMBRYO DEVELOPMENT OF PREPUBERTAL GOAT OOCYTES SELECTED BY THE BRILLIANT CRESYL BLUE TEST SUPLEMENTACIÓN CON CISTEAMINA DURANTE LA MADURACIÓN Y CULTIVO EMBRIONARIO SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE OVOCITOS DE CABRA PREPÚBERES SELECCIONADOS POR EL TEST AZUL DE CRESOL BRILLANTE Aixa Urdaneta, Ana Raquel Jiménez-Macedo, Dolors Izquierdo and María-Teresa
Paramio1
1 Departament de Ciencia Animal i dels Aliments, Universitat Autónoma de
Barcelona; E-08193, Bellaterra, Spain.
Date submitted: 19. 06. 03 Date accepted: 12. 09. 03
Zygote (2003); 11 (Nov): 347-354
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
150
SUPPLEMENTATION WITH CYSTEAMINE DURING MATURATION AND EMBRYO CULTURE ON EMBRYO DEVELOPMENT OF PRE-PUBERTAL
GOAT OOCYTES SELECTED WITH BRILLANT CRESYL BLUE TEST Aixa Urdaneta, Ana Raquel Jiménez, Dolors Izquierdo and María-Teresa Paramio1
Departament de Ciencia Animal i dels Aliments. Universitat Autònoma de
Barcelona, Barcelona, Spain
Date submitted: 19.06.03. Date accepted: 12.09.03.
Summary Our previous studies have shown that the addition of 100 µM cysteamine to the in
vitro maturation (IVM) medium increased the embryo development of prepubertal
goat oocytes. The aim of the present study was to evaluate the effect of adding
different concentrations of cysteamine to the IVM medium and to the in vitro
embryo culture medium (IVC) on the embryo development of prepubertal goat
oocytes selected by the brilliant cresyl blue (BCB) test. Oocytes were exposed to
BCB and classified as: oocytes with a blue cytoplasm or grown oocytes (BCB+) or
oocytes without blue cytoplasm or growing oocytes (BCB-). In Experiment 1,
oocytes were matured in a conventional IVM medium supplemented with 100 µM,
200 µM, or 400 µM cysteamine. In Experiment 2, oocytes were matured with 400
µM cysteamine and following in vitro fertilization (IVF), were cultured in SOF
medium supplemented with 50 µM and 100 µM cysteamine. In Experiment 1,
BCB+ oocytes matured with 100 µM and 200 µM cysteamine showed higher
normal fertilization and embryo development rates than BCB- oocytes. Oocytes
matured with 400 µM of cysteamine did not presente these differences between
BCB+ and BCB- oocytes. In Experiment 2, the addition of 50 µM and 100 µM
cysteamine to culture medium did not affect the proportion of total embryos
obtained from BCB+ oocytes (35.89% and 38.29%, respectively) but was
significantly different in BCB- oocytes (34.23% and 29.04%, respectively, P<0.05).
In conclusion, the addition of 400 µM cysteamine to the IVM improved normal
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
151
fertilization and embryo development of BCB- oocytes at the same rates as those
obtained from BCB+ oocytes. The proportions of morulae plus blastocyst
development were not affected by the treatments.
Key words: Goat, Cysteamine, Prepubertal, IVF, IVC.
1. Introduction Cysteamine is a low molecular weight thiol that, when present during in vitro
maturation (IVM) and in vitro culture (IVC) embryos, increases the intracytoplasmic
oocyte glutathione (GSH) concentration and improves embryo development rates
(De Matos et al., 1995; Luvoni et al., 1996; De Matos and Furnus, 2000). GSH
participates in various mechanisms such as aminoacid transport, protein
synthesis, reduction of disulphides and protection against oxidative damage.
Addition of cysteamine to the IVM medium of cow oocytes improves in vitro
blastocyst development (De Matos et al.,1995,1996). Similar results were found
in sheep (De Matos et al., 2002b), buffalo (Gasparrini et al., 2000), pig (Grupen et
al., 1995; Yamauchi and Nagai, 1999) and mouse (De Matos et al., 2003).
Previous studies in our laboratory (Rodríguez-González et al., 2003a) showed that
100 µM cysteamine added to maturation medium significantly improved the
proportion of male pronucleus (MPN) formation in in vitro fertilization (IVF) oocytes
of prepubertal goats, but embryo development was not increased. In cow,
cysteamine supplementation of the IVC medium increased the proportion of
blastocyst development by stimulating intracellular glutathione synthesis (De
Matos et al., 2002a).
Oocytes recovered from ovaries of slaughtered prepubertal goats are
heterogeneous. Brilliant cresyl blue (BCB) stain permits us to determine the
activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), an enzyme synthesized
in growing oocytes but with decreased activity in oocytes that have finished their
growth phase. Thus, oocytes that have finished their growth phase show a
cytoplasm with a blue coloration because they do not reduce BCB to a colourless
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
152
compound. The BCB test has been used successfully to select oocytes for IVM-
IVF in pigs (Ericsson et al., 1993; Roca et al., 1998) and heifers (Pujol et al.,
2000). In our earlier studies with prepubertal goat oocytes (Rodríguez-González et
al., 2002), we showed that oocytes exposed and stained with BCB were larger
(136.6 µm vs. 125.5 µm diameter) and increased the proportion of oocytes with
MPN compared with unstained oocytes. Also, we have demonstrated that oocytes
supplemented with 100 µM cysteamine increased the proportion of BCB+ oocytes
that developped further to 8-cell embryos (Rodríguez-González et al. 2003b).
However, blastocyst development rates were still lower in BCB+ oocytes than
those obtained with oocytes from adult goats (Cognié et al. 1995; Crozet et al.,
1995; Pawshe et al. 1996; Kenkistepe et al., 1996, 1998). The effect of cysteamine
on in vitro embryo production has different effects depending of the concentration,
the species and the type of oocyte used in study (Grupen et al., 1995, De Matos et
al., 2002b, 2003).
With the aim of trying to improve in vitro embryo production (IVEP) from
prepubertal goat oocytes, two experiments were designed � Experiment 1, with the
aim of evaluating the effects on embryo development of BCB-selected oocytes of
using different concentrations of cysteamine in the IVM medium (100 µM, 200 µM
and 400 µM), and Experiment 2, with the aim of evaluating the effects on embryo
development of BCB-selected oocytes of using different concentrations of
cysteamine in the IVC medium (50µM and 100 µM).
2. Materials and methods
2.1. Oocyte collection
Ovaries were obtained from 45-60-days-old goats from a local slaughterhouse and
transported at 37ºC in Dulbecco�s PBS (P-4417, Sigma) containing 50 µg ml-1 of
gentamicin. Oocytes were recovered by slicing the ovaries in TCM199 (M-2520,
Sigma), supplemented with 2.2 mg ml-1 NaHCO3, 2% (v/v) steer serum (Donor
Bovine Serum, CanSera, Ontario, Canadá) and 50 µg ml-1 gentamycin. Oocytes
with one or more complete layers of cumulus cells and homogeneous cytoplasm
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
153
were selected. Selected oocytes were randomly distributed among treatment
groups.
2.2. BCB test
Immediately after oocyte collection, oocytes were washed three times in mPBS
[PBS with 1090 mg l-1 glucose, 35.2 mg l -1 sodium pyruvate, 0.4% (w/v) bovine
serum albumin (A-9647, fraction V, Sigma) and 50 µg ml-1 gentamycin]. Then, the
oocytes were exposed to 26 µM BCB (B-5388, Sigma) diluted in mPBS for 90 min
at 38.5 ºC in humidified air containing 5% CO2. Following BCB exposure, oocytes
were washed three times in mPBS and classified into two groups, depending on
their cytoplasm coloration: BCB+ oocytes with blue cytoplasm and BCB- oocytes
without blue coloration. After classification, oocytes were washed three times in
maturation medium.
2.3. IVM of oocytes
The maturation medium was TCM199 (M-7528, Sigma) supplemented with 275 µg
ml-1 sodium pyruvate, 146 µg ml-1 L-glutamine (G-5763, Sigma), 10% (v/v) steer
serum, 10 µg ml-1 ovine-LH (L-5269, Sigma), 10 µg ml-1 ovine-FSH (Ovagen,
Immuno Chemicals Products Ltd., Auckland, New Zealand), 1 µg ml-1 17β
estradiol (E-2257, Sigma), 100µM, 200µM and 400 µM cysteamine (M-9768,
Sigma) and 50 µg ml-1 gentamycin. Groups of 20-25 oocytes were transferred to
100-µl microdrops of maturation medium and incubated for 25h at 38.5ºC in
humidified air with 5% CO2 under mineral oil (M-8410, Sigma).
2.4. Sperm preparation
At the end of the maturation period, oocytes were inseminated with fresh semen.
Ejaculates were collected from two Murciano bucks of proven fertility into artificial
vaginas and transported at 37ºC to the laboratory within 30 min. The motility of
sperm cells were evaluated under an inverted microscope and separated motile
sperm fraction by swim-up. 70 µl of semen was placed in each of several conical
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
154
tubes under 2 ml Defined Medium (Brackett and Oliphant, 1975) as modified by
Younis et al. (1991), here referred to as mDM. Spermatozoa were incubated for
45-60 min in humidified air with 5% CO2 at 38.5ºC. After incubation, 600 µl from
the top of each tube was removed and pooled in a sterile 15-ml centrifuge tube
and centrifuged at 200 g for 10 min. After discarding the supernatant, the
resulting sperm pellet was resuspended 1:1 with mDM medium containing heparin
(100 µg ml-1 heparin sodium salt) and incubated it for 45-60 min in a humidified air
with 5% CO2 at 38.5ºC (final concentration approximately 84x106 sperm ml-1).
2.5. IVF of oocytes
After maturation, groups of 20-25 oocytes were transferred into 100-µl fertilization
microdrops of modified Tyrode�s medium (TALP), as described by Parrish et al.
(1986), supplemented with 1 µg ml-1 hypotaurine (H-1384, Sigma) under mineral
oil. After capacitation, sperm concentration was assessed with a hemacytometer,
and a 5 µl aliquot of the sperm suspension was added to the fertilization
microdrops (final concentration: 3.5x106 sperm ml-1). Gametes were cultured for
24 h in humidified air with 5% CO2 at 38.5ºC.
2.6. Evaluation of oocytes after IVM and IVF
To evaluate the nuclear stage after maturation a sample of oocytes was fixed at
25 h of IVM and stained it with 1% lacmoid (L-7512, Sigma). Oocyte maturation
was measured by the proportion of oocytes reaching the metaphase II (MII) stage.
To evaluate the pronuclear stage after 17 h of IVF, a sample of oocytes was
processed in the same way as the oocytes fixed after IVM. Oocytes with a sperm
in the cytoplasm were considered to be fertilized and classified into three groups:
2PN (female pronucleus, male pronucleus and one sperm tail; normal fertilization),
polyspermy (two or more sperm tails in the cytoplasm with condensed heads or
two or more decondensed heads in the cytoplasm), and asynchrony (female
pronucleus and a condensed sperm head).
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
155
2.7. In vitro embryo culture
Following 24 h of sperm exposure, oocytes were washed and denuded with the aid
of a fine pipette to separate oocytes from any sperm cells. Embryos were cultured
in groups of 20-25 embryos in 20-25-µl microdrops (1 µl culture medium per
embryo) of synthetic oviductal fluid (SOF; Tervit et al., 1972) as modified by
Takahashi and First (1992) in 35 mm culture dishes under mineral oil in a
humidified atmosphere with 5% CO2, 5% O2 and 90% N2. Presumptive zygotes
were maintained in culture for 7 days (Experiment 1). Culture medium was not
changed during this period. After 24h in culture (that is, 48 h after insemination),
10% (v/v) steer serum was added to the microdrops (0.1 µl serum per embryo). In
Experiment 2, the presumptive zygote were cultured for 24h (day 1) in SOF. At
the end of day 1, embryos were washed twice in SOF and transferred to SOF with
50µM or 100 µM cysteamine, and cultured for 48h (days 2-3). At the end of day 3,
the medium was remplaced and embryos were cultured with SOF without
cysteamine for another 5 days in the culture medium.
At the end of the culture period, the total cell number of embryos was assessed
with fluorescent microscopy after Hoechst staining and the percentage of embryos
at different developmental stage was recorded.
2.8. Statistical analysis
The difference between treatment groups was detected by X2 analysis or Fischer�s
exact test, where appropriate � the overall X2 score was calculated and found to
be significant before performing the Fischer�s exact test to detect differences
between treatment groups, using GraphPad InStat [version 3.01 for Windows 95,
GraphPad Software, (San Diego, California, USA)]. Differences with a probability
of 0.05 or less were considered to be significant.
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
156
2.9. Experimental design
Experiment 1
We analysed the effect on embryo development of 100 µM, 200 µM and 400 µM
cysteamine added to the IVM medium of prepubertal goat oocytes. Experiment 2,
was designed based on the results obtained in Experiment 1.
Experiment 2
We analysed the effect of adding 50µM or 100 µM cysteamine for 48 h (days 2-3
of IVC) on embryo development of oocytes from prepubertal goats matured with
400 µM cysteamine.
3. Results
3.1. Experiment 1
The proportion of oocytes stained by the BCB test (BCB+ oocytes) was 48.06%
(1140/2372). Table 1 shows the results of nuclear stage IVM oocytes and IVF
oocytes. The proportion of oocytes at MII stage were higher in BCB+ oocytes than
BCB- oocytes, in each one of the cysteamine concentration studied. No significant
differences in the proportion of total fertilized oocytes were detected among
cysteamine groups and BCB-selected oocytes. The proportion of 2PN oocytes was
higher (P<0.05) in BCB+ oocytes than BCB- oocytes in the 100 µM and 200 µM
cysteamine groups (86.4% vs 58.8% and 86% vs, 65.6%, respectively). Oocytes
matured with 400 µM cysteamine did not show differences in the proportion of 2PN
oocytes between BCB+ and BCB-oocytes ( 78.78% vs, 71.42%, respectively).
Table 2 shows the proportions of embryo development of prepubertal goat
oocytes. BCB+ oocytes matured with 100 µM and 200 µM cysteamine BCB+
showed higher proportions (P<0.05) of total embryos (36.5% and 33.9%,
respectively) than BCB-oocytes (17.9% and 11%, respectively). However, oocytes
matured with 400 µM cysteamine did not show these differences between
Capítulo IV: Suplementación del MIV and CIV con cisteamina
157
(35.7% and 29.3%, respectively). At the end of day 8 of IVC, the highest proportion
of morulae plus blastocysts was obtained from BCB+oocytes matured with 400 µM
cysteamine, but this proportion was not statistically different of those obtained
from BCB-oocytes.
3.2. Experiment 2
The proportion of oocytes stained by the BCB test was 42.0% ( 764/1819). Table 3
shows the proportion of embryo development of oocytes matured with 400 µM
cysteamine and cultured in SOF medium supplemented with 50 µM and 100 µM
cysteamine. No significant differences in total embryos were detected between
BCB+ and BCB-oocytes cultured with 50 µM cysteamine (35.89% and 34.23%,
respectively), but there were differences in the 100 µM cysteamine group (38.29%
and 29.04%, respectively; P<0.05). The proportion of morulae plus blastocysts
obtained was similar among groups.
158
Table 1. Effect of oocyte selection using the brillant cresyl blue (BCB) test and different concentrations of cysteamine added to the IVM medium on nuclear of IVM and IVF oocytes of prepubertal goats (nine replicates). ________________________________________________________________________________________________ IVM IVF _____________________________ _________________________________________________ Treatment Total Total oocytes MII oocytes Total 2 PN Asynchronous Polyspermic n (%) n (%) * n (%)* n (%)* n (%)*
MII: Metaphase II; 2PN, two pronuclei + one sperm tail; Asynchronus, oocytes with a condensed sperm head and one female pronucleus; Polyspermic, oocytes with two or more sperm tails in the cytoplasm with non decondesed heads or two or more decondesed heads in the cytoplasm.
ab,c,d,e Values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05).
*Percentages calculated from total fertilised oocytes.
Cysteamine 100 µM BCB+ 131 89 (67.93)ae 101 37 (36.63) 32 (86.48)a 2 (5.40) 3 (8.10)
BCB- 128 74 (57.81)bd 101 34 (33.66) 20 (58.82)b 6 (17.64) 8 (23.52) 200µM BCB+ 153 134 (87.58)c 102 43 (42.15) 37 (86.04)a 2 (4.65) 4 (9.30) BCB- 152 108 (71.05)a 105 32 (30.47) 21 (65.62)b 2 (6.25) 9 (28.12) 400µM BCB+ 144 111 (77.08)a 100 33 (33.0) 26 (78.78)ab 2 (6.06) 5 (15.15) BCB- 153 94 (61.43)de 104 35 (33.65) 25 (71.42)ab 1 (2.85) 9 (25.71)
159
Table 2. Effect of oocyte selection using the brillant cresyl blue (BCB) test and different concentrations of cysteamine added to the IVM medium on embryo development of prepubertal goat oocytes (nine replicates). _____________________________________________________________________________________________________________________________________ Embryo development at day 8 post-insemination Treatment ________________________________________________________________________________________ Total 2-to 7 cell 8-to 16 cell Morulae + Inseminated embryos embryos embryos BlastocystsCysteamine oocytes n (%) n (%)* n (%)* n (%)* ________________________________________________________________________________________ 100µM BCB+ 203 74 (36.45)a 56 (75.67) 15 (20.27) 3 (4.05)cd BCB- 195 35 (17.94)b 30 (85.71) 3 (8.57) 2 (5.71)ce 200µM BCB+ 221 75 (33.93)a 64 (85.33) 9 (12.0) 2 (2.66)cd BCB- 253 28 (11.06)b 25 (89.28) 2 (7.14) 1 (3.57)cde 400µM BCB+ 204 73 (35.78)a 51 (69.89) 12 (16.43) 10 (13.69)e BCB- 215 63 (29.30)a 50 (79.36) 10 (15.87) 3 ( 4.76)de ________________________________________________________________________________________ a,b,,c,d,e* Values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05). * Percentages calculated from total embryos.
160
Table 3. Effect of oocyte selection using the brillant cresyl blue (BCB) test and different concentrations of cysteamine added to the IVC medium on embryo development of prepubertal goat oocytes (nine replicates).
_________________________________________________________________________________________ Embryo development at day 8 post-insemination Treatment ________________________________________________________ Total 2-to 7 cell 8-to 16 cell Morulae + Inseminated embryos embryos embryos Blastocysts Cysteamine oocytes n (%) n (%) * n (%)* n (%)* _________________________________________________________________________________________ 50µM BCB+ 273 98 (35.89)a 79 (80.61) 13 (13.26) 6 (6.12) BCB- 368 126 (34.23)a 105 (83.33) 17 (13.49) 4 (3.17) 100µM BCB+ 282 108 (38.29)a 92 (85.18) 12 (11.11) 4 (3.70) BCB- 396 115 (29.04)b 101 (87.82) 11 ( 9.56) 3 (2.60) __________________________________________________________________________________________ a,b. Values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05). * Percentages calculated from total embryos.
Capítulo IV: Suplementación de MIV y CIV con Cisteamina
161
4. Discussion
This study demonstrated that BCB+ oocytes matured with 100µM and 200 µM
cysteamine significantly increased the proportion of oocytes reaching MII, the
number of normal fertilized oocytes (2 PN oocytes) and total number of embryo
obtained compared with BCB- oocytes. However, these differences between
BCB+ and BCB- oocytes were not found in oocytes matured with 400 µM
cysteamine. With prepubertal goat oocytes matured without cysteamine, we have
already shown that BCB+ were larger and more competent for embryo
development than BCB- oocytes. The presence of 100 µM cysteamine in the IVM
medium significantly increased the number of fertilized oocytes with MPN
formation (Rodríguez-González et al., 2003a) compared with matured oocytes
without cysteamine. Based on our results, we conclude that high concentrations
of cysteamine in the IVM medium (400 µM) increased embryo development of
BCB- oocytes. Consequently, more oocytes (BCB+ plus BCB- oocytes) for an in
vitro embryo production program would be available from prepubertal goat
ovaries.
In experiment 2, we show that the addition of 50 µM and 100 µM cysteamine to
the IVC medium has no effect on embryo development. Comparing the results
from both experiments (Experiments 1 and 2), we observe that the total number of
embryos obtained from overall oocytes matured with 400 µM cysteamine in
experiment 1 (32.4%, 136/419), was similar to those obtained in experiment 2, in
which embryos were cultured with 50 µM (34.9%, 224/641) or 100 µM (32.8%,
223/678) cysteamine.
In conclusion, the supplementation of the IVC medium with cysteamine during the
second and third days after insemination did not affect embryo development of
prepubertal goat oocytes matured with 400 µM cysteamine . In our previous study,
the addition of glucose and GSH to IVC did no affect the embryo development of
these oocytes (Urdaneta et al.,2003), Oocytes cannot incorporate cysteamine to
synthesize GSH. Cysteamine acts by converting the cystine present in TCM199 (a
cystine-rich medium) to cysteine, and cystine is incorpored by the oocyte into
GSH synthesis (Nagai, 2001). We have shown that the presence of cysteamine,
cysteine, cystine and β-mercaptoethanol to the IVM medium of prepubertal goat
Capítulo IV: Suplementación de MIV y CIV con Cisteamina
162
oocytes increased intracellular GSH levels (Rodríguez-González et al., 2003b).
Oocytes with or without cumulus can take up cysteine. Mori et al. (2000) showed
the effect of the cumulus cells on intracytoplasmic GSH synthesis, and Yaumachi
and Nagai (1999) concluded that cysteamine increased the content of GSH and
promoted MPN formation in cumulus-free porcine oocytes. Several estudies have
shown that the addition of cysteamine to the oocyte maturation medium increases
intracytoplasmic GSH levels in different species ( De Matos et al., 1996, 1997,
2000, 2002a,b, Nagai et al., 1996; Yamauchi and Nagai, 1999, Rodríguez-
González et al 2003b). GSH, the major non-protein sulfhydryl compund in
mammalian cells, is a endogenous, ubiquitous reducing agent that protects cells
from oxidation (Lafleur et al., 1994). In prepubertal goat oocytes, the high
incidence of asynchronous fertilization (oocytes with feminine pronucleus and
intact sperm head) found in our previous studies (Mogas et al., 1997) could be
due to the low intracytoplasmic GSH levels of these oocytes. The addition of
cysteamine to the IVM medium has reduced this fertilization anomaly of
prepubertal goat oocytes (Rodríguez-González et al., 2003a). Several authors
have found an effect of intracytoplasmic GSH levels on MPN formation (Yoshida
et al., 1993; Funahashi et al., 1994; Perreault et al., 1994; Grupen et al., 1995;
Nagai et al., 1996; Kito and Bavister, 1997). In cattle (De Matos et al., 1995,
1996), buffalo (Gasparrini et al., 2000) and sheep (De Matos et al., 2002b), the
addition of cysteamine to the maturation media improved in vitro blastocyst
development. In pig (Grupen et al., 1995), the addition of 50 µM or 500 µM
cysteamine increased the proportion of 2PN oocytes (43% and 45%, respectively,
vs 10% in the control group), but a 500 µM concentration also increased the
proportion of blastocysts (12% vs 1% control group). This might be because both
cysteamine concentrations affected the MPN formation but only the highest
concentration affected futher embryonic development. In our study, with 400 µM
cysteamine added to IVM medium, the proportion of total embryos obtained from
BCB- oocytes was significantly increased compared with BCB+ oocytes. The
proportion of morulae plus blastocysts was not affected by cysteamine
concentration or oocyte type. Cysteamine supplementation to the IVC medium
did not improve blastocyst development. De Matos et al. (2003) tested different
cysteamine concentrations added to the IVM medium and observed the positive
effect of cysteamine on blastocyst development of oocytes from adult mice, but
Capítulo IV: Suplementación de MIV y CIV con Cisteamina
163
this effect was not observed in oocytes recovered from prepubertal females.
Also, these authors reported the positive effect on blastocyst development of
cysteamine addition to the IVC medium of adult mouse embryos. This effect was
not observed in oocytes from prepubertal mice. However, in both experiments
(cysteamine addition to IVM and IVC media), the blastocyst rates obtained from
prepubertal mice oocytes matured and cultured without cysteamine were similar
to those obtained from ovulated oocytes. The authors suggest that the oocyte
population isolated from prepubertal mice was of a higher quality than oocytes
recovered from adult mice. This high oocyte quality would not need cysteamine
supplementation to develop up to blastocyst stage. The low number of morulae
plus blastocysts found in our study with prepubertal goat oocytes could be due to
a lower quality of oocytes obtained from prepubertal goat ovaries recovered from
a comercial slaughterhouse. In goats, Wang et al. (2002) studied embryo
development of IVM-IVF-IVC oocytes from gonadotropin-primed prepubertal and
adult females, and observed significant differences in blastocyst development
(6% vs 16%, respectively) but no differences in recipient pregnancy rates and
proportion of kids born were observed following embryo transfer. Baldasarre et al.
(2002, 2003) obtained transgenic kids born from microinjected IVM-IVF zygotes
from gonadotropin-primed prepubertal goats. Recently, Koeman et al. (2003)
observed significantly more oocytes recovered from gonadotropin-primed
prepubertal goats than gonadotropin-primed adults, and no significant differences
in blastocyst development assessed by morphological appearance (25% vs
24%, respectively). However, these proportions were reduced (6% and 7%,
respectively) when assessing embryo development using cell counts.
In conclusion, prepubertal goat oocytes selected by the BCB test (BCB+ oocytes)
and matured with 100 µM and 200 µM cysteamine supplementation significantly
improved the proportion of normal fertilized oocytes and the proportion of total
embryos obtained compared with BCB- oocytes. However, the addition of 400 µM
cysteamine to the IVM medium allows an increase in the proportion of normal
fertilized oocytes and the total number of embryos obtained from BCB- oocytes at
the same proportions as those obtained from BCB+ oocytes. Consequently, this
supplementation might increase the number of oocytes per prepubertal goat
ovary used for in vitro embryo production. The addition of cysteamine to the
Capítulo IV: Suplementación de MIV y CIV con Cisteamina
164
IVC medium had no effect on the embryo development of prepubertal goat
oocytes. Further studies are necessary to identify in vitro conditions able to
support development of goat oocytes to the blastocyst stage.
Acknowledgements This study was supported by MCyT (Grant AGL 2000-0353).
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Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
169
CAPITULO V CYSTEAMINE, GLUTATHIONE AND IONOMYCIN TREATMENTS IMPROVE IVF OF PREPUBERTAL GOAT OOCYTES TRATAMIENTOS CON CISTEAMINA, GLUTATIÓN E IONOMICINA MEJORAN LA FIV DE OVOCITOS DE CABRA PREPUBER Aixa Urdaneta, Ana Raquel Jiménez, María-Teresa Paramio and Dolors
Izquierdo1
1 Departament de Ciencia Animal i dels Aliments, Universitat Autónoma de
Barcelona; E-08193, Bellaterra, Spain.
Date submitted: 7. 05. 04 Date accepted: 8. 07.04
Zygote (2004); in press
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
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CYSTEAMINE, GLUTATHIONE AND IONOMYCIN TREATMENTS IMPROVE IVF OF PREPUBERTAL GOAT OOCYTES
Aixa Urdaneta, Ana Raquel Jiménez, María-Teresa Paramio and Dolors
Izquierdo1
Departament de Ciencia Animal i dels Aliments. Universitat Autònoma de
Barcelona, Barcelona, Spain
Date submitted: 7.05.04. Date accepted: 8.07.04.
Summary
The aim of this study was to improve in vitro embryo development of prepubertal
goat oocytes studying the effect of adding cysteamine to IVM medium, glutathione
to IVF medium and ionomycin to the sperm capacitation medium. In Experiment 1,
we analysed the effect of 1 mM glutathione added to fertilisation medium of
oocytes matured with 400 µM cysteamine. The control group were oocytes
without cysteamine and GSH. In Experiment 2, oocytes matured and fertilised in
presence of 400 µM cysteamine and 1 mM glutathione, respectively, were
inseminated with spermatozoa treated with ionomycin or heparin. In Experiment 1,
the percentages of total and normal fertilised oocytes were significantly higher for
oocytes supplemented with cysteamine and GSH (40.26% and 30.2%,
respectively) than oocytes from the control group (16.66%, and 10.61%,
respectively). The percentage of total embryos obtained after 7 days of culture
was significantly higher in the group supplemented with cysteamine and GSH
(30.62%) than the control group (8.09%). In Experiment 2, percentages of total
and normal fertilised oocytes were significantly higher for group of spermatozoa
capacitated with Ionomycin (52.21% and 37.17%, respectively) than with heparin
(38.62 and 28.35%, respectively). After 7 days of culture, total embryo rate was
significantly higher in the group of sperm capacitated with Ionomycin (44.91%)
than with heparin (38.69%). However the percentage of embryos developed up to
blastocyst stage was not affected by any of the treatments studied.
Keywords: Goat, Cysteamine, Glutathione, Ionomycin, Prepubertal
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
171
1. Introduction
In vitro matured prepubertal goat oocytes often show deficiencies after their in
vitro fertilisation (IVF) as indicated by a low incidence of male pronuclear
formation (Martino et al., 1995; Mogas et al., 1997), which would cause a high
number of haploid embryos (Villamediana et al., 2001) and a low developmental
competence to the blastocyst stage (Izquierdo et al., 1999).
During fertilisation, the sperm nucleus is decondensed and transformed into a
male pronucleus (MPN). This transformation of the sperm nucleus during IVF has
been related to the levels of intracellular glutathione (GSH) (Sutovsky and
Schatten, 1997). The tripeptide glutathione (γ-glutamyl-cysteinyl-glycine) is a
reducing agent that plays a number of important roles in cellular metabolism
(reviewed by Knapen et al., 1999), participating in various mechanisms such as
amino acid transport, DNA and protein synthesis, reduction of disulphide bonds
and protecting cells against oxidative damage. During the development and
maturation of the oocyte in the ovary, GSH content increases as the oocyte
approaches the time of ovulation (Perrault et al., 1988). When the oocytes are in
vitro matured, GSH synthesis can be stimulated by the addition of low molecular
weight thiol compounds.
Cysteamine is a low molecular weight thiol which when present during IVM
increases the intracytoplasmic oocyte GSH concentration in cattle (De Matos et
al., 1995; Luvoni et al., 1996; De Matos and Furnus, 2000), goat (Rodriguez et al.,
2003), buffalo (Gasparrini et al. 2003) and ewes (De Matos et al., 2002). Addition
of cysteamine to the IVM medium of cow oocytes improves in vitro blastocyst
development (De Matos et al., 1995, 1996). Similar results were found in sheep
(De Matos et al., 2002), buffalo (Gasparrini et al., 2000), pig (Grupen et al., 1995;
Yamauchi and Nagai, 1999) and mouse (De Matos et al., 2003). Previous studies
in our laboratory (Rodríguez-González et al., 2003) showed that 100 µM of
cysteamine added to the IVM medium of prepubertal goat oocytes increased
intracellular GSH levels and significantly improved the percentages of male
pronucleus (MPN) formation after IVF and embryo development. Later, Urdaneta
et al. (2003) concluded that the addition of 400 µM of cysteamine to the IVM
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
172
medium improved embryo development of prepubertal goat oocytes compared to
100 µM. However, the percentage of blastocysts obtained in both studies was low.
During fertilisation, several researchers add GSH to the sperm preparation
medium (pig: Jeong and Yang, 2001; bovine: Earl et al., 1997; Taneja et al.,
1998), and/or IVF medium (pig: Boquest et al., 1999; bovine: Van Soom et al.,
1998) obtaining an improvement in blastocyst formation rate. The use of GSH
during sperm preparation could be beneficial to membrane stabilization of the
spermatozoa and the sperm protection from free radical damage, and thus, to
help subsequent fertilisation and development.
Goat oocytes have significantly improved in vitro fertilisation when spermatozoa
are capacitated with ionomycin (Wang et al., 2002). Ionomycin is a calcium
ionophore that can increase Ca+2 cycling across phospholipid membranes and
induce acrosome reaction (Ball et al., 1983). Wang et al. (2002) studying various
factors affecting the effectiveness of the IVM-IVF system of goat oocytes
concluded that spermatozoa treated with heparin plus 100-200 nM of ionomycin
gave significantly higher fertilisation rates compared to the conventional goat
heparin-sperm treatment.
The aim of this study was to improve in vitro embryo development of prepubertal
goat oocytes by studying the effect of adding 400 µM of cysteamine to IVM
medium, 1 mM glutathione to the IVF medium and 200 nM of ionomycin to the
sperm capacitation medium.
2. Materials and methods
2.1. Oocyte collection
We obtained ovaries from prepubertal (approximately 2 months old) goats from a
local slaughterhouse and we transported them at 37ºC in Dulbecco�s phosphate-
buffered saline (PBS; P-4417, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) supplemented
with 50 µg/ml gentamicin. Oocytes were recovered by cutting the surface of
ovaries with a razor blade in a 60 mm culture dish with TCM199 (M-2520; Sigma,
USA), supplemented with 2,2 mg/ml NaHCO3, and 50 µg/ml gentamicin. We
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
173
selected only oocytes with one o more complete layers of unexpanded cumulus
cells and homogeneous cytoplasm.
2.2. In vitro maturation of oocytes
The oocyte maturation medium was TCM199 (M-7528; Sigma, USA)
supplemented with 275 µg/ml sodium pyruvate (P-3662; Sigma, USA), 146 µg/ml
L-glutamine (G-5763; Sigma, USA), 10% (v/v) steer serum, 10 µg/ml o-LH (L-
5269; Sigma, USA), 10 µg/ml o-FSH (Ovagen, Immuno Chemicals Products
Ltd., Auckland, New Zealand), 1 µg/ml 17β estradiol (E-2257; Sigma, USA) and 50
µg/ml gentamicin. A group of oocytes were supplemented with 400 µM
cysteamine (M-9768; Sigma, USA). The COCs were culture in groups of 20-25 to
100-µl microdrops of maturation medium and incubated them for 27 h at 38.5ºC in
a humidified atmosphere of 5% CO2 in air under mineral oil (M-8410; Sigma,
USA).
2.3. Sperm preparation and capacitation
The oocytes were inseminated with fresh semen, at the end of the maturation
period. We collected ejaculates from two Murciano-Granadino bucks of proven
fertility into artificial vaginas and transported them at 37-38 ºC within 30 min to the
laboratory. The motility of sperm cells was evaluated under an inverted
microscope and separated motile sperm fraction by swim-up (Parrish et al., 1986).
70 µl of semen was placed in each of several conical tubes under 2 ml Defined
Medium (Brackett and Oliphant, 1975) modified by Younis et al. (1991) and
referred to as mDM here, and incubated it for 45-60 min in a humidified
atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5ºC. After incubation, 600 µl from the top of
each tube containing highly motile spermatozoa was removed and pooled in a
sterile 15-ml centrifuge tube and centrifuged at 200 x g for 10 min.
After discarding the supernatant, the resulting sperm pellet was treated with 2
methodologies: 1) the sperm pellet was resuspended 1:1 (v:v) with mDM medium
containing heparin (heparin-sodium salt; 170 UI/mg; final concentration: 50 µg/mL
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
174
of heparin) and incubated in a humidified air atmosphere of 5% CO2 at 38.5ºC,
(final concentration: 84x106 sperm/ml, approximately) for 45-60 min (heparin
group) and 2) the sperm pellet was resuspended 1:1 (v:v) with mDM medium
containing 20 µg/ml heparin, 1 mM 8-Br-cAMP and 400 nM Ionomycin for 15 min
(Ionomycin group; final concentration: 10 µg/ml heparin, 0.5 mM 8-Br-cAMP and
200 nM Ionomycin).
2.4. In vitro fertilisation of oocytes
After maturation, groups of 20 oocytes were transferred into 80 µl fertilisation
microdrops of modified Tyrode�s medium (TALP), as described by Parrish et al.
(1986), supplemented with 1 µg/ml hypotaurine (H-1384, Sigma, USA). After
capacitation, sperm concentration was assessed with a haemocytometer, and
added an aliquot (5 µl) of the sperm suspension to the fertilisation microdrops
(final concentration: 3.5x106 sperm/ml). Oocytes and sperm were incubated for 24
h in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5 ºC.
2.5. Evaluation of oocytes after IVM and IVF
To evaluate the nuclear stage after IVM, a sample of oocytes was fixed in ethanol
(90%): acetic acid (3:1 v/v) after mechanically denuding the oocytes in a 3%
sodium citrate solution. After 24-48h, fixed oocytes were stained with 1% lacmoid
(L-7512; Sigma, USA) in 45% acetic acid solution. The oocytes were examined
under phase contrast microscopy. We measured oocyte maturation by the
percentage of oocytes reaching the metaphase II (MII) stage.
To evaluate the pronuclear stage after 17 h of IVF a sample of oocytes was
processed in the same way as the oocytes fixed after IVM. Oocytes with a sperm
tail in the cytoplasm was considered to be fertilised and classified them into one of
three groups: 2PN (female pronucleus, male pronucleus and one sperm tail;
normal fertilisation), polyspermy (two or more sperm tails in the cytoplasm with
condensed heads or two or more decondensed heads in the cytoplasm), and
asynchrony (female pronucleus and a condensed sperm head).
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
175
2.6. In vitro embryo culture
At 24-h after insemination, the oocytes were washed in the culture medium with
the aid of a fine pipette to separate oocytes from any sperm cells. Groups of 20-25
presumptive zygotes were cultured in vitro for 7 days (8 days postinsemination;
day 0: the day of insemination) in 20-25 µl microdrops (1 µl culture medium per
embryo) under mineral oil in a humidified atmosphere of 5% CO2, 5% O2 and 90%
N2 and 38.5 ºC. A semi-defined two-step culture system with G1.2/G2.2 media
(Gardner and Lane, 1997) was used for embryo culture. Embryos were placed in
G1.2 for 3d and then moved to G2.2 for another 4d. After 24 h in culture (that is,
48 h.p.i.), 10% (v/v) foetal bovine serum (FBS, Life Technologies) was added to
the microdrops (0.1 µl serum per embryo).
At the end of the culture period, we assessed total cell number of embryos with
fluorescent microscopy after Hoechst staining and recorded the percentage of
total embryos, morulae (embryos with 16 or more cells and without blastocoele)
and blastocysts (embryos with 60 or more cells with blastocoele formation).
2.7. Statistical analysis
We calculated differences among treatment groups by means of chi-square
analysis or Fischer�s exact test where appropriate. We calculated overall chi-
square and found it significant before performing the Fischer�s exact test to detect
differences between treatment groups, using Graph Pad In Stat (version 3.01 for
Windows 95, Graph Pad Software, San Diego, California, USA). Differences with
a probability value of 0.05 or less were considered significant.
2.8. Experimental design
Experiment 1 We analysed the effect of adding 1 mM (0,3 mg/ml) glutathione to the IVF medium
of oocytes matured with 400 µM cysteamine compared to oocytes matured with
cysteamine but without GSH supplementation and a control group. Control group
was a sample of oocytes matured and fertilised in absence of both cysteamine and
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
176
glutathione, respectively. In this experiment spermatozoa were capacitated with our
conventional protocol (heparin). Experiment 2 was designed based on the results
obtained in experiment 1.
Experiment 2
We analysed the effect of sperm capacitation with ionomycin or heparin on IVF and
embryo development of prepubertal goat oocytes. According to the results of
experiment 1, the oocytes were matured and fertilised in presence of 400 µM
cysteamine and 1 mM glutathione, respectively.
3. Results
3.1. Experiment 1
Table 1 shows the nuclear stage after IVM of 220 prepubertal goat oocytes. The
percentage of oocytes reaching the MII stage was significantly higher when
cysteamine was added to IVM medium (82.72%) compared to oocytes matured in a
conventional IVM medium (53.63%; p< 0.0001).
Table 1. Effect of cysteamine addition to the IVM medium on nuclear maturation of
prepubertal goat oocytes (seven replicates).
Treatment Total
oocytes
VG
n (%)
VGBD
n (%)
MI n (%)
A-TI n (%)
MII
n (%)
0 µM Cysteamine 110 9 (8.18)a 4 (3.63) 38(34.54)a 0 (0) 59(53.63)a
400 µM Cysteamine 110 0 (0)b 0 (0) 19(17.27)b 0 (0) 91(82.72)b
a, b: values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05)
Table 2 shows the IVF parameters of 424 IVM-oocytes. There were significantly
differences of total fertilised oocytes and oocytes with 2 PN among treatments. The
percentages of total fertilised oocytes and oocytes with 2PN were significantly
highers in oocytes supplemented with cysteamine and GSH (40.26% and 30.2%,
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
177
respectively) than oocytes with cysteamine (27.97%, p<0.04, and 16.08%, p<0.007,
respectively) and oocytes at control group (16.66%, p<0.0001, and 10.61%,
p<0.0002, respectively).
Table 2. Effect of cysteamine addition to the IVM medium and GSH to the IVF medium
on in vitro fertilisation of prepubertal goat oocytes (seven replicates).
Fertilised oocytes Treatment
Total
oocytes Total
n (%)
2PN
n (%)
Asynchronous
n (%)
Polyspermic
n (%)
Control group 132 22 (16.66)a 14 (10.61)a 1 (0.76) 7 (5.30)
400µM Cysteamine
GSH -
143 40 (27.97)c 23 (16.08)a 0 (0) 17 (11.89)
400µM Cysteamine
GSH +
149 60 (40.26)b 45 (30.20)b 1 (0.67) 14 (9.40)
a, b, c: values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05)
Control group: oocytes matured without cysteamine and without GSH on IVF medium.
Table 3 shows the rates of cleavage and development to the blastocyst stage of
oocytes at control group, oocytes supplemented with cysteamine and GSH and
oocytes matured with cysteamine. The percentage of total embryos obtained after 8
days of culture was significantly higher in the group supplemented with cysteamine
and GSH (30.62%) than oocytes matured with cysteamine (16.92%; p<0.0003) and
than oocytes at control group (8.09%, p<0.0001). Also the percentage of embryos
developed beyond 8-cells stage was significantly higher in oocytes at cysteamine +
GSH group (22.45%) than those from the other 2 groups (6.98%, p<0.002, and
3.84%, p<0.0001, oocytes matured with cysteamine and control group,
respectively).
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
178
Table 3. Effect of cysteamine addition to the IVM medium and GSH to the IVF medium
on embryo development of prepubertal goat oocytes (seven replicates).
Embryo development at day 8 post-insemination Treatment
Inseminated
Oocytes Total embryos n (%)
>8 cell embryos n (%)*
Morulae n (%)*
Blastocystsn (%)*
M+B
n (%)*
Control group 321 26 (8.09)a 1 (3.84)a 0 (0) 0 (0) 0 (0)
400µM Cysteamine
GSH-
254
43 (16.92)c
3(6.98)a
2 (4.65)
0 (0)
2 (4.65)
400µM Cysteamine
GSH+
320
98 (30.62)b
22 (22.45)b
3 (3.06)
1(1.02)
4 (4.08)
a, b, c: values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05).
Control group: oocytes matured without cysteamine and without GSH on IVF medium.
M+B: morulae plus blastocyst *Percentages calculated from total embryos. 3.2. Experiment 2
Table 4 shows that the percentage of total fertilised oocytes was significantly higher at
group of spermatozoa capacitated with Ionomycin (52.21%) than with heparin (38.62%;
p<0.0007). Also the percentage of oocytes with 2PN was higher at Ionomycin group
(37.17%) than at heparin group (28.35%, p<0.02).
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
179
Table 4. Effect of sperm treatment on the in vitro fertilisation of in vitro matured
prepubertal goat oocytes (nine replicates).
Fertilised oocytes Sperm
Treatment
Total
oocytes Total
n (%)
2PN
n (%)
Asynchronous
n (%)
Polyspermic
n (%)
Ionomycin 339 177 (52.21)a 126 (37.17)a 11 (3.24) 40 (11.80)
heparin 321 124 (38.62)b 91 (28.35)b 5 (1.56) 28 (8.72)
a, b: values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05)
Table 5 shows embryo development of 845 oocytes inseminated with sperm
capacitated with ionomycin and 668 oocytes inseminated with heparin capacitated-
sperm. After 7 days of culture, the percentage of inseminated oocytes that developed to
embryos was 38.69 and 44.91% (p<0.02) for ionomycin and heparin group,
respectively. However the percentage of embryos developed beyond >8-cell stage was
not different between both groups.
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
180
Table 5. Effect of sperm treatment on the embryo development of in vitro matured
prepubertal goat oocytes (nine replicates).
a, b: values in the same column with different letters differ significantly (P<0.05)
*Percentages calculated from total embryos.
4. Discussion
In Experiment 1, our results showed that supplementation 400 µM of cysteamine to
the IVM medium significantly improved nuclear maturation, total fertilisation and
total embryos obtained for prepubertal goat oocytes compared with maturation
without cysteamine, but these differences disappeared when we compared the
percentage of embryos with more than 8-cells. These results agree with previous
results obtained in our laboratory. Thus, Rodríguez-González et al. (2003) observed
that 100 µM of cysteamine added to the IVM medium increased intracellular GSH
levels and significantly improved the percentages of male pronucleus (MPN) and
embryo development. Adding 100 and 400 µM of cysteamine to the IVM medium
Urdaneta et al. (2003) concluded that the higher concentration improved embryo
development of prepubertal goat oocytes.
Intracytoplasmic GSH plays a central role in the protection of cells against oxidative
and electrophilic stress (Knapen et al., 1999). According to de Matos and Furnus
(2000), the high intracytoplasmic bovine oocyte GSH levels obtained after IVM with
thiol compounds remain constant after fertilisation and disappear later at the 6 to 8
Embryo development at day 8 post-insemination Treatment
Inseminated Oocytes
Total embryosn (%)
>8 cell embryos n (%)*
Morulaen (%)*
Blastocysts n (%)*
M+B
n (%)*
Ionomycin 845
327 (38.69)a
40(12.23)
5 (1.52)
7 (2.14)
12 (3.66)
Heparin 668 300 (44.91)b 43(14.33) 1 (0.33) 5 (1.66) 6 (2.0)
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
181
cell embryo stage. In our study, reduction of reactive oxygen species and the
presence of high intracellular content of GSH until the beginning of embryo
development could be responsible, at least in part, for the improvement observed in
maturation, total fertilisation and cleavage rates of oocytes matured in the presence
of 400 µM cysteamine. Moreover, when we added GSH to the IVF medium of IVM-
oocytes with cysteamine, the percentage of total fertilisation, zygotes with 2
pronuclei, total embryos and embryos developed beyond 8-cell stage were
significantly improved, although these treatments did not affect blastocyst rate. In
contrast, some studies have indicated no effect on fertilisation (Boquest et al., 1999;
Kim et al., 1999) or cleavage (Earl et al., 1997; Taneja et al., 1998; Boquest et al.,
1999; Kim et al., 1999) rates with the presence of GSH during sperm-oocyte
coincubation, but all of them observed improvements in blastocyst rates.
In cattle, Kim et al. (1999) have observed that the effect of GSH (1 mM) during IVF
on embryo development was bull-dependent. Thus, there was an adverse effect, no
effect or a beneficial effect on blastocyst formation depending on bull used. They
hypothesize that the male-dependent effect of GSH during IVF is related to
differences in the amounts of ROS production by spermatozoa of particular males.
These authors also studied the effect of different concentrations of GSH. They
found that 1 mM GSH was the best dose to improve blastocyst production and
higher doses (10 mM) adversely affected embryo development. The 1 mM GSH
concentration also improved bovine blastocyst rates according to Earl et al. (1997).
Nevertheless, in pigs 1 mM could be an excessive dose. Thus, Boquest et al.
(1999) using 0.5 mM of GSH, and Jeong and Yang (2001) using 0.98 mM observed
a negative effect on blastocyst development.
Extracellularly, GSH prevents lipid peroxidation of cellular membranes by
extracellular reactive oxygen species. Acting as an antioxidant, GSH may have
reduced the exposure of both oocytes and spermatozoa to oxidative stress at or
just prior to fertilisation, by removing excessive reactive oxygen species present in
the insemination medium. Thus, the addition of GSH to IVF medium could be
beneficial for membrane stabilization of sperm, oocytes and early embryos. GSH
has been detected in the oviductal fluid protecting gametes and embryos (Gardiner
et al., 1998).
In our study, supplementation with cysteamine and GSH for IVM and IVF culture
media improved fertilisation and embryo development. The effect of these
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
182
compounds could be to increase intracellular GSH levels and also to protect
oocytes, zygotes and early embryos against reactive oxygen species. According to
Armstrong (2001), oocytes from juvenile donors and the embryos derived from
them appear less robust and may be less tolerant to sub optimal handling and in
vitro culture conditions than are oocytes from adult females. Thus, development
deficiencies of prepubertal females oocytes may be exacerbated under sub optimal
culture conditions. However, embryo development up to blastocyst stage has not
been improved by the culture media analysed in this study. Rizos et al (2002)
showed that the percentage of blastocyst obtained is related to the quality of
oocytes, and the blastocyst quality is regulated by the culture conditions.
In experiment 2, our data showed that using fresh ejaculates, oocytes inseminated
with sperm treated with ionomycin have significantly improved percentages of total
and normal fertilisation compared to sperm treated with heparin. Ionomycin also
improved fertilisation rates in the horse (Alm et al., 2001) and adult goats (Wang et
al., 2002). As is well known, ionomycin belongs to Ca ionophore molecule family,
and they have been described as potent sperm capacitators. Moreover, it should be
pointed out that in our study the group of oocytes inseminated with sperm treated
with 50 µg/mL of heparin gave a greater percentage of total embryos than normal
fertilised oocytes while in the group of oocytes inseminated with sperm treated with
ionomycin both rates were similar. This fact may be due to the cleavage of
abnormal fertilised oocytes in the group inseminated with sperm treated with
heparin.
In our study, the oocytes obtained from prepubertal goat ovaries recovered from a
commercial slaughterhouse, independently of the oocyte and sperm treatment
used, showed a low embryo developmental competence. Although the birth of live
calves (Khatir et al., 1998), lambs (O�Brien et al., 1997; Dattena et al., 2000), and
piglets (Marchal et al., 2001), has occurred following IVM, IVF and IVC of oocytes
obtained from nonstimulated prepubertal donors, it seems that these oocytes have
cytoplasmic deficiencies that result in abnormal fertilisations and/or their low
developmental competence (reviewed by Armstrong, 2001). In our laboratory,
Villamediana et al. (2001) found a high number of haploid embryos after IVM and
IVF oocytes from prepubertal goats, suggesting that it was due to a deficient
cytoplasmic maturation of oocytes, which inhibits sperm head decondensation. In
bovines, Salamone et al. (2001), studying cytoplasmic biochemical parameters,
Capítulo V: Cisteamina, GSH, e Ionomicina en FIV
183
showed that the activities of MPF (Maturation Promoting Factor) and MAPK
(Mitogen-Activated Protein Kinase) and the relative amount of IP3R (Inositol 1,4,5-
trisphosphate Receptor), a mediator of calcium oscillations, were substantially lower
in calf compared to adult oocytes. These findings suggest that the low
developmental competence of prepubertal oocytes may be attributable to
deficiencies in cytoplasmic mechanisms required for oocyte activation. Moreover,
Oropeza et al. (2004) observed lower blastocyst development in oocytes recovered
by OPU from 6-to-12-month-old calves compared to cow oocytes. These authors
found differences in mRNA expression of developmentally important genes (RNA
for Glut-1; RNA for e IF1A and RNA for the IGF-1) between calves and adult 2-16-
cell embryos. These authors concluded that the reduced developmental
competence of oocytes from prepubertal calves is attributed to a deficient
expression of facilitative glucose transporters and insufficient protein translation.
In conclusion, supplementation with cysteamine (400 µM) to IVM and GSH (1mM)
to IVF culture media improved normal fertilisation and embryo development of
prepubertal goat oocytes. Fresh goat spermatozoa treated with ionomycin
increased the percentage of oocytes fertilized and zygotes with male pronucleus.
However, cysteamine, glutathione and ionomycin did not improve blastocyst
development.
Knowledgement
This study was supported by MCYT (grant AGL2000-0353).
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Capítulo VI: Discusión General
188
DISCUSIÓN GENERAL Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado la capacidad de
los ovocitos foliculares procedentes de hembras prepúberes sacrificadas en el
matadero para madurar, ser fecundados y desarrollarse in vitro hasta la etapa de
blastocisto (Izquierdo, 1996). Sin embargo a pesar de obtener porcentajes
aceptables de desarrollo embrionario, se han observado bajos porcentajes de
blastocistos. Este hecho nos permite afirmar que existe una gran pérdida de
embriones durante la transición entre el estadio de 2 células y el de blastocisto. Las
pérdidas embrionarias durante esta transición han sido asociadas con anomalías
detectadas en la FIV, como la poliespermia (Martino y col., 1994b, 1995; Mogas y
col., 1997b), la falta de descondensación de la cabeza del espermatozoide (Martino
y col., 1995; Mogas y col., 1997b) y una elevada tasa de haploidía en los embriones
obtenidos (Villamediana y col., 2001). Estas anomalías han sido asociadas por
varios autores a una incorrecta maduración citoplasmática del ovocito (Pavlok y col.,
1988; Hunter, 1990; Niwa, 1993).
Entre las posibles causas de estos problemas se ha mencionado: a) la selección
inapropiada de los ovocitos capaces de soportar el desarrollo, b) el uso de un medio
de maduración inadecuado para soportar la maduración citoplasmática y c) las
deficientes condiciones de los medios de cultivo de los embriones. En consecuencia,
el propósito de este trabajo de investigación ha sido utilizar el Test de BCB (Azul de
Cresol Brillante), un método de selección de ovocitos que permite discriminar
aquellos ovocitos con mayor competencia para el desarrollo, y al mismo tiempo
comprobar si la utilización de dos compuestos tiol (Glutatión (GSH) y Cisteamina)
utilizados como suplementos de los medios de MIV, FIV y CIV permitirían mejorar los
resultados de desarrollo embrionario de los ovocitos de cabras prepúberes,
basándonos en el efecto de estos compuestos sobre las concentraciones
intracelulares de glutatión.
En nuestro primer estudio, utilizando ovocitos de hembras de 2 meses de edad, se
pudo comprobar que los ovocitos inmaduros positivos al Test de BCB (BCB+)
poseían tasas superiores de maduración nuclear que los ovocitos negativos al Test
(BCB-). Asimismo la adición de 100 µM de cisteamina al medio de maduración
Capítulo VI: Discusión General
189
mejoró la FIV normal (ovocitos con 2 pronúcleos y una cola espermática) y
proporcionó una reducción dramática de las anormalidades de la fecundación
(poliespermia y asincronía) en ambos tipos de ovocitos (BCB+ y BCB-). Sin
embargo, el desarrollo embrionario de estos ovocitos permaneció limitado al
suplementar el medio de CIV con GSH. Así, bajo nuestras condiciones, la
suplementación con GSH no mejoró el desarrollo embrionario de los ovocitos antes
mencionados.
Varios autores han estudiado el efecto del GSH y otros compuestos tiol sobre el
desarrollo embrionario in vitro. De Matos y col. (2002a) observaron que un mayor
porcentaje de embriones alcanzaron el estadio de blastocisto cuando 100 µM de
cisteamina se adicionó durante la MIV y más aún cuando 50 µM de este mismo
compuesto fue adicionado al medio de cultivo (CIV). El efecto de la cisteamina sobre
el desarrollo embrionario es atribuido al incremento de los niveles de GSH
intracelular que actúa positivamente en la protección de las células contra el daño
oxidativo. Lee y col. (2000) sugirieron que el GSH extracelular puede recoger no-
enzimaticamente especie oxigeno reactivos (ROS) presentes en el medio o en la
superficie extracelular del embrión, previniéndolo del daño que estos pueden causar,
como por ejemplo la peroxidación lipídica. En nuestro caso, con embriones MIV-FIV-
CIV procedentes de ovocitos de hembras prepúberes, la calidad y viabilidad de estos
embriones no fueron suficientes para permitir el efecto del GSH extracelular.
Por otro lado en este mismo estudio, la adición de glucosa y GSH al medio de CIV
no mejoró el desarrollo embrionario. De hecho, la glucosa fue añadida el quinto día
post-inseminación (p.i) y la mayoría de los embriones bloquearon su desarrollo
antes del estadio de 8 células, con lo cual la adición de glucosa fue irrelevante. Esta
falta de repuesta para cualquiera de los factores probados en este estudio podría ser
explicada como una baja capacidad inherente a los ovocitos de cabra prepúber para
desarrollarse más allá del estadio de 8 células.
En un segundo estudio (Experimento 1), se sugirió el desarrollo de un sistema de
MIV que permitiera a los ovocitos el logro de una correcta maduración
citoplasmática. Para ello se probó la suplementación del medio de MIV con varias
concentraciones de cisteamina (100µM, 200µM, 400µM) y en el Experimento 2, la
Capítulo VI: Discusión General
190
adición de 50 o 100µM de cisteamina al medio de CIV. En este estudio se observó
que los ovocitos BCB+ en cualquiera de las concentraciones de cisteamina
estudiada mostraban mayores tasas de fecundación normal y desarrollo embrionario
que los ovocitos BCB-. La suplementación con 400µM de cisteamina al medio de
MIV incrementó el número total de embriones desarrollados a partir de ovocitos
BCB-. Estos resultados nos indican que suplementando el medio de MIV con 400µM
de cisteamina podríamos disponer de un mayor número de ovocitos (BCB+ y BCB-)
por ovario para utilizarlos en programas embrionarios de PIV. No obstante, la adición
de 50 o 100µM de cisteamina al medio CIV no tuvo un efecto positivo sobre el
desarrollo embrionario de estos ovocitos.
La adición de 400µM de cisteamina al medio de MIV, mejoró significativamente la
maduración nuclear, fecundación total y embriones totales obtenidos a partir de
ovocitos de cabra prepúber comparados con la maduración sin cisteamina. Sin
embargo, al comparar el porcentaje de embriones con más de 8 células, no existen
tales diferencias.
Rodríguez-González y col. (2003) observaron que 100µM de cisteamina añadidos al
medio de MIV incrementó los niveles intracelulares de GSH y mejoró
significativamente el porcentaje de pronúcleos masculinos (PNM) y el desarrollo
embrionario. El GSH intracitoplasmático juega un papel importante en la protección
de las células contra el estrés oxidativo y electrofílico (Knapen y col., 1999). De
acuerdo con De Matos y Furnus (2000), los altos niveles de GSH intracitoplasmático
en el ovocito bovino después de la MIV con compuestos tiol, permanecen constantes
después de la fecundación y desaparecen más tarde en el estadio de 6 a 8 células
del embrión. En nuestro estudio, la reducción de especie oxígeno reactivos (ROS) y
la presencia de un alto contenido intracelular de GSH hasta el comienzo del
desarrollo embrionario, podría ser responsable, al menos en parte, de la mejoría
observada en la maduración, fecundación total y tasas de divididos a partir de
ovocitos madurados en presencia de 400µM de cisteamina. Sin embargo, cuando
nosotros adicionamos GSH al medio de FIV de ovocitos madurados in vitro con
cisteamina, el porcentaje de fecundación total, cigotos con 2 pronúcleos, embriones
totales y embriones desarrollados más allá del estadio de 8 células, fue mejorado
significativamente aunque estos tratamientos no afectaron la tasa de blastocistos.
Capítulo VI: Discusión General
191
Extracelularmente, el GSH previene la peroxidación lipídica de las membranas
celulares por ROS extracelulares actuando como un antioxidante. El GSH pudo
haber reducido la exposición de ambos gametos (ovocito y espermatozoide) al
estrés oxidativo justo antes de la fecundación por remoción de especies oxigeno
reactivas excesivas presentes en el medio de inseminación. Así, la adición de GSH
al medio FIV podría ser beneficiosa para la estabilización de la membrana de los
espermatozoides, ovocitos y embriones tempranos. De hecho, ha sido detectado
GSH en el fluido oviductal protegiendo los gametos y embriones (Gardiner y col.,
1998).
Los ovocitos y embriones de donantes jóvenes parecen ser menos resistentes y
pueden ser menos tolerantes a manipulación en condiciones subóptimas de cultivo
in vitro que los procedentes de hembras adultas. Así, el desarrollo deficiente de
ovocitos de hembras prepúberes puede ser exacerbado bajo condiciones de cultivo
subóptimas. Sin embargo, el desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto
no ha sido mejorado por los medios de cultivo analizados en este estudio. Rizos y
col. (2002) demostraron que el porcentaje de blastocistos obtenidos está relacionado
con la calidad del ovocito y la calidad del blastocisto está regulada por las
condiciones de cultivo. Por otro lado, en este estudio (experimento 2), nuestros
resultados demuestran que los ovocitos inseminados con espermatozoides
procedentes de eyaculados frescos tratados con ionomicina han mejorado
significativamente el porcentaje de fecundación normal y total comparado con
esperma tratado solamente con heparina. La ionomicina también mejora la tasa de
fecundación en el caballo (Alm y col., 2001) y en cabras adultas (Wang y col., 2002).
Es bien conocido que la ionomicina pertenece a la familia molecular del calcio
ionóforo, y estos compuestos han sido descritos como potentes capacitadores
espermáticos. En este estudio, los ovocitos obtenidos a partir de cabras prepúberes
sacrificadas en mataderos comerciales, independientemente de los ovocitos y el
tratamiento del esperma usado, mostraron una baja competencia para el desarrollo
embrionario. Aunque se ha obtenido el nacimiento de terneros (Khatir y col., 1998)
corderos (O�Brien y col., 1997; Dattena y col., 2000) y lechones vivos tras la MIV, FIV
y CIV de ovocitos procedentes de donantes prepúberes no estimuladas, estos
ovocitos poseen diferencias citoplasmáticas que dan como resultado fecundaciones
anormales y/o una baja competencia para el desarrollo (revisado por Armstrong,
Capítulo VI: Discusión General
192
2001). En nuestro laboratorio, Villamediana y col. (2001) encontraron un elevado
número de embriones haploides tras madurar y fecundar in vitro ovocitos de cabras
prepúberes, sugiriendo que esto es debido a una maduración citoplasmática
deficiente de los ovocitos, lo cual inhibe la descondensación de la cabeza del
espermatozoide. En el ganado bovino, Salamone y col. (2001), estudiando
parámetros bioquímicos citoplasmáticos, demostraron que las actividades del MPF
(Maturation Promoting Factor), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) y la
cantidad relativa de IP3R (Inositol 1, 4,5-trisphosphate Receptor), un mediador de las
oscilaciones de calcio, fueron sustancialmente más bajas en ovocitos de ternera que
en los de adultas. Estos hallazgos sugieren que la baja competencia para el
desarrollo de los ovocitos de cabra perpúber puede ser atribuida a deficiencias en
mecanismos citoplasmáticos requeridos para la activación de los ovocitos. Así,
Oropeza y col. (2004) obtuvieron un bajo desarrollo hasta blastocisto con ovocitos
recogidos por OPU (ovum pick-up) de terneras de entre 6 a 12 meses de edad
comparado con el de los ovocitos procedentes de vacas. Estos autores encontraron
diferencias en la expresión del mRNA de genes importantes para el desarrollo (RNA
para Glut-1; RNA para el IF1A y RNA para el IGF-1) entre embriones de 2-16 células
de terneras y adultas. Según estos autores, la disminución de la competencia para el
desarrollo de los ovocitos de terneras prepúberes fue atribuida a una expresión
deficiente de los transportadores de glucosa e insuficiente traslación de proteína.
Finalmente la suplementación con cisteamina (400µM) para el medio de MIV y GSH
(1mM) durante la FIV, mejoró la fecundación normal y el desarrollo embrionario de
los ovocitos de cabras prepúberes, así como también se incrementó el porcentaje de
ovocitos fecundados y cigotos con pronúcleo masculino después de capacitar los
espermatozoides con ionomicina. Sin embargo la cisteamina, el GSH y la ionomicina
no mejoraron la tasa de blastocistos en este estudio.
En conclusión, los ovocitos de cabras prepúberes mejoran su competencia para ser
fecundados normalmente y aumentar el porcentaje de ellos que llegan hasta las
primeras divisiones embrionarias, cuando los medios de MIV y FIV son
suplementados con compuestos tiol como las cisteamina y el glutatión. Este
efecto positivo puede ser atribuído a un incremento en la concentración
intracitoplasmática del glutatión y al efecto antioxidante que producen estos
Capítulo VI: Discusión General
193
compuestos extracelularmente. Sin embargo, los compuestos tiol añadidos al medio
de cultivo embrionario no han repercutido de ninguna manera sobre el desarrollo
embrionario, lo que nos indicaría que el reducido número de blastocistos obtenidos
en nuestros estudios es más debido a la baja calidad del ovocito utilizado y
consecuentemente a la baja calidad de los embriones producidos que a las
condiciones del cultivo embrionario al que son sometidos.
Capítulo VI: Discusión General
194
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Rodríguez-González, E., López-Bejar, M., Mertens, M.J. & Paramio, M.T. (2003).
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4-cell embryos produced in vitro. Zygote 9, 193-199. Wang, B., Baldesarre, H., Tao, T., Gauthier, M., Neveu, N., Zhou, J.F., Leduc, M.,
Duguay, F., Bilodeau, A.S., Lazaris, A., Keefer, C., Karatzas, C.N. (2002). Transgenic gotas produced by pronuclear microinjection of vitro derived zygotes. Mol Reprod Dev. 63, 437-443.
Capítulo VII: Conclusiones
196
CAPÍTULO VII: CONCLUSIONES
1) El Test de BCB (Azul de Cresol Brillante) es un método eficaz que permite
seleccionar ovocitos inmaduros de cabras prepúberes con mayor
competencia para el desarrollo.
2) Altas dosis de cisteamina en el medio de MIV incrementaron
significativamente la producción de embriones totales obtenidos de ovocitos
de cabra perpúber comparados con la maduración sin cisteamina.
3) La adición al medio de MIV de altas dosis de cisteamina (400 µM), incrementó
el número total de embriones desarrollados a partir de ovocitos negativos al
Test de BCB (BCB-).
4) La producción de embriones procedentes de ovocitos de cabras prepúberes
se incrementó al suplementar conjuntamente los medios de maduración con
cisteamina, de fecundación con glutatión y de capacitación con ionomicina.
5) Los distintos compuestos utilizados como enriquecedores del medio de cultivo
embrionario (glutatión, glucosa y cisteamina) no tuvieron ningún efecto
positivo sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabras prepúberes.
Capítulo VIII: Anexos
197
CAPÍTULO VIII: ANEXOS
ANEXO 1.
MEDIO DE CAPACITACIÓN DE ESPERMATOZOIDES (mDM) (Brackett y Oliphant, 1975; modifcado por Younis et al., 1991)
mDM Stock
gr/L
Mm
NaCl
6,550 112,00
KCl
0,300 4,02
CaCl2 .2H2O
0,330 2,25
MgCl2 .6H2O
0,106 0,52
NaH2PO4. H2O
0,113 0,83
Rojo Fenol
0,002 -
Gentamicina
0,050 -
mDM Suplemento
gr/L
Mm
NaHCO3
3,104 37,00
Glucosa
2,500 13,90
Piruvato sódico
0,1375 1,56
BSA
6,000 -
Ph Osmolaridad
7.4 280-300 mOsm/Kg
*Se emplea agua bidestilada
Capítulo VIII: Anexos
198
ANEXO 2. MEDIO DE FECUNDACIÓN (TALP)
(Parrish et al.,1986) TALP Stock
gr/L
Mm
NaCl
6,660 114,00
KCl
0,238 3,20
CaCl2 .2H2O
0,294 2,00
MgCl2 .6H2O
0,051 0,25
NaH2PO4. H2O
0,027 0,20
Rojo Fenol
0,010 -
Penicilina G
0,030 -
TALP Suplemento
gr/L
Mm
NaHCO3
2,100 37,00
Glucosa
0,900 13,90
Piruvato sódico
0,02 1,56
BSA
6,000 -
Lactato sódico
1,121 10
Ph Osmolaridad
7.4 280-300 mOsm/Kg
*Se emplea agua bidestilada
Capítulo VIII: Anexos
199
ANEXO 3.
MEDIO DE CULTIVO DE EMBRIONES (SOF) (Tervit y col., 1972, modificado por Takahashi y First, 1992)
SOF Stock
gr/L mM NaCl
6,294 107,70
KCl
0,534 7,16
KH2PO4
0,162 1,19
CaCl2 .2H2O
0,251 1,71
MgCl2 .6H2O
0,100 0,49
NaHCO3
2,106 25,07
SOF Suplemento
gr/L mM Lactato sódico
282 µl/L 3,30
Piruvato sódico
0,033 0,30
BSA
3,000 -
Gentamicina 0,050
-
Rojo fenol
0,0013 -
Glutamina
0,146 1,00
Aa. esenciales (BME)
20 ml/L -
Aa.no esenciales (MEM)
10 ml/L -
pH
Osmolaridad
7.2- 7.3
270-280 mOsm/Kg
*Se emplea
agua bidestilada
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