i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
CARRERA DE ODONTOLOGIA
"Estudio comparativo del Efecto Antibacteriano del peróxido de hidrógeno al 3.18%,
hipoclorito de sodio al 1.85% y ácido hipocloroso en concentraciones de 125ppm y
500ppm contra cepas de Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans, estudio in-vitro."
Trabajo teórico de titulación previo a la obtención del título de Odontólogo General
Autor: Paredes Vinueza Erick Mauricio
Tutor: Dr. Marcio Alejandro Farfán Chacha
Quito, Octubre 2018
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo ERICK MAURICIO PAREDES VINUEZA en calidad de autor del trabajo de
investigación “ESTUDIO COMPARATIVO DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DEL
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 3.18%, HIPOCLORITO DE SODIO AL 1.85% Y
ACIDO HIPOCLOROSO EN CONCENTRACIONES DE 125PPM Y 500PPM
CONTRA CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y STREPTOCOCCUS
MUTANS, ESTUDIO IN-VITRO.”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer el
uso del contenido total o parcial que me pertenece, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido con los artículos 5, 6, 8, 19 y
demás pertenecientes a la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización y publicación
de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el
Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
.....................................................
ERICK MAURICIO PAREDES VINUEZA
1003502778
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Dr. Marcio Alejandro Farfán Chacha, en mi calidad de tutor del trabajo de titulación,
modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por ERICK MAURICIO PAREDES
VINUEZA , cuyo título es: “ESTUDIO COMPARATIVO DEL EFECTO
ANTIBACTERIANO DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 3.18%, HIPOCLORITO
DE SODIO AL 1.85% Y ÁCIDO HIPOCLOROSO EN CONCENTRACIONES DE
125PPM Y 500PPM CONTRA CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y
STREPTOCOCCUS MUTANS, ESTUDIO IN-VITRO”, previo a la obtención de grado de
Odontólogo, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo
metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del tribunal
examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea
habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad Central
del Ecuador.
En la ciudad de Quito, 04 de Marzo del 2018.
DR. ALEJANDRO FARFÁN
DOCENTE-TUTOR
17005354224
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por la Dra. Alicia Freire y la Dra. María Fernanda Caicedo. Luego de
receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del título de
Odontólogo presentado por el señor ERICK MAURICIO PAREDES VINUEZA.
Con el título: “ESTUDIO COMPARATIVO DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DEL
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 3.18%, HIPOCLORITO DE SODIO AL 1.85% Y
ACIDO HIPOCLOROSO EN CONCENTRACIONES DE 125PPM Y 500PPM
CONTRA CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y STREPTOCOCCUS
MUTANS, ESTUDIO IN-VITRO”
Emite el siguiente veredicto:
Fecha:
Para constancia de lo actuado firman
Nombre Apellido Calificación Firma
Presidente. Dra. Alicia Freire ............................................……………. …………….
Vocal. Dra. Fernanda Caicedo ……………. …………….......................................
v
Dedicatoria
Tu amor, tu cariño y tu ternura son y serán siempre lo más preciado que Dios pudo darme en
mi vida, tenerte conmigo es la mayor felicidad y es la fuerza que necesito para seguir adelante,
dedico mi trabajo de tesis a mi amada hija Ericka Valentina quien es y será siempre mi fuente
de inspiración y a mi hermosa novia y futura esposa por haber estado siempre apoyándome y
enseñándome que la vida es hermosa cuando estas con las personas que amas.
A mis padres Mauricio y Sandra quienes siempre han sido mi apoyo, mi ejemplo a seguir a lo
largo de mi carrera universitaria y quienes serán siempre mis seres más amados, los que con su
paciencia y su generosidad siempre me han enseñado a ser una persona de bien y por quienes
en este momento estoy culminando mi etapa universitaria.
A mis hermanos con los cuales he compartido mi vida entera y agradezco todos los momentos
felices y tristes que he compartido con ellos los cuales me apoyaron y ayudaron a lo largo de
mi etapa de estudio.
Gracias a toda mi familia mis abuelos, tías, tíos, primos por estar al pendiente de mi cuando lo
necesitaba.
El objetivo logrado también es parte de toda mi familia amigos, compañeros los cuales han
estado siempre pendientes de mi sin recibir nada a cambio.
Gracias a todos.
vi
AGRADECIMIENTOS
Dios, siempre pendiente de mi y de mi familia dándome salud, bondad y generosidad, siempre
ayudándome a seguir adelante y enseñándome cada día más lo hermosa que es la vida.
Muchas gracias a mi tutor Dr. Alejandro farfán por ser mi maestro, gran amigo y un grandioso
ser humano, ayudándome y guiándome para poder obtener conocimiento y por la paciencia en
esta etapa universitaria.
Agradezco a la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Odontología por abrirme las
puertas a esta prestigiosa institución y ayudarme en mi profesión
Muchas gracias a mis maestros, compañeros y amigos por guiarme durante toda mi vida
universitaria .
Realmente gracias a todos y cada uno que con un granito de arena aparecieron en mi vida para
ayudarme con un consejo o simplemente por darme una palabra de aliento en los momentos de
flaqueza.
vii
INDICE
DERECHOS DE AUTOR ......................................................................................................... ii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ...................................... iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL ............................................. iv
Dedicatoria .................................................................................................................................. v
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. vi
LISTA DE TABLAS .................................................................................................................. xi
GRAFICOS .............................................................................................................................. xii
RESUMEN ............................................................................................................................... xiv
1. CAPITULO 1 .................................................................................................................. 1
1.1 Introducción .......................................................................................................................... 1
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................ 2
1.2.1 FORMULACION DEL PROBLEMA .............................................................................. 2
1.3 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 3
1.4 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 4
1.4.1 General ........................................................................................................................... 4
1.4.2 Específicos. ..................................................................................................................... 4
1.5 HIPOTESIS .......................................................................................................................... 5
1.5.1 Hipótesis de investigación( H1) .................................................................................... 5
1.5.2 Hipótesis Nula (H0) ....................................................................................................... 5
2. CAPITULO 2 .......................................................................................................................... 6
MARCO TEORICO .................................................................................................................... 6
2.1 MICROBIOLOGÍA ......................................................................................................... 6
2.1.1 MICROBIOLOGÍA ORAL ......................................................................................... 6
viii
2.1.2 FLORA MICROBIANA ORAL .................................................................................. 7
2.2 MEDIOS DE CULTIVO ................................................................................................. 7
2.3 GENERO STREPTOCOCCUS ............................................................................................ 8
2.3.1 Clasificación según manifestaciones clínicas en general ........................................... 8
2.3.2Streptococcus mutans ......................................................................................................... 9
2.3.3 Transmisión, colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral ....... 9
2.4 STAPHYLOCOCCUS ........................................................................................................ 10
2.4.1 Género Staphylococcus ................................................................................................... 10
2.4.2 Metabolismo ..................................................................................................................... 11
2.4.3 Staphylococcus aureus .................................................................................................... 11
2.4.4 Staphylococcus aureus en cavidad oral .......................................................................... 12
2.4.5 Factores predisponentes del huésped .............................................................................. 13
2.5 ANTISEPTICOS: ............................................................................................................... 14
2.5.1 PERÓXIDO DE HIDRÓGENO ..................................................................................... 15
2.5.1.1 Mecanismo de acción ............................................................................................... 15
2.5.2 HIPOCLORITO DE SODIO ........................................................................................... 15
2.5.2.1 MECANISMO ANTIBACTERIANO DEL NaOCl ..................................................... 16
2.5.3 ACIDO HIPOCLOROSO ................................................................................................ 16
2.5.3.1 Obtención. ................................................................................................................. 17
2.5.3.2 Efecto Antimicrobiano ............................................................................................ 18
2.5.3.3 Usos en odontología ................................................................................................. 18
3. CAPITULO 3 ........................................................................................................................ 19
3.1 METODOLOGÍA: .............................................................................................................. 19
3.1.1 TIPO DE ESTUDIO ................................................................................................... 19
ix
3.1.2 POBLACION Y MUESTRA ........................................................................................... 19
3.1.3 MUESTREO .................................................................................................................... 19
3.1.4 CRITERIOS DE INCLUSIÓN .................................................................................. 20
3.1.5 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN ................................................................................. 20
3.1.6 CONCEPTUALIZACION DE LAS VARIABLES ......................................................... 21
3.1.6.1 VARIABLE DEPENDIENTE: ............................................................................... 21
3.1.6.2 VARIABLES INDEPENDIENTES: ...................................................................... 21
3.1.7 OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES ....................................................... 21
3.1.8 ASPECTOS BIOETICOS ............................................................................................... 25
3.1.8.1 Beneficencia .............................................................................................................. 25
3.1.8.2 Beneficios potenciales del estudio directo. ............................................................. 25
3.1.8.3 Riesgo potencial del estudio. ................................................................................... 25
3.1.8.4 Declaración de conflicto de intereses...................................................................... 26
3.1.8.5 Confidencialidad ...................................................................................................... 26
3.1.9 METODO DE RECOLECCION DE LA INFORMACION: ......................................... 27
PROTOCOLO ..................................................................................................................... 27
3.1.10 ANALISIS ESTADISTICO. .......................................................................................... 38
4. CAPITULO 4 ........................................................................................................................ 39
4.1 RESULTADOS ................................................................................................................... 39
Prueba de Normalidad .............................................................................................................. 39
Streptococcus mutans ............................................................................................................... 39
Staphylococcus aureus ............................................................................................................. 40
Streptococcus mutans: Comparación entre sustancias (24 Horas y 48 Horas) ..................... 41
24 HORAS ................................................................................................................................. 44
x
48 HORAS ................................................................................................................................. 47
Staphylococcus aureus: Comparación entre sustancias (24 Horas y 48 Horas) ................... 49
24 HORAS ................................................................................................................................. 52
48 HORAS ................................................................................................................................. 55
5. CAPITULO 5 ................................................................................................................... 58
5.1 Discusión. ........................................................................................................................ 58
6. CAPITULO 6 ........................................................................................................................ 60
6.1 CONCLUSIONES .............................................................................................................. 60
6.2 RECOMENDACIONES. .................................................................................................... 61
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................ 62
8. ORGANIZACION Y PLANIFICACION DE LA INVESTIGACION ............................... 67
8.1 Presupuesto ......................................................................................................................... 67
8.2 Cronograma ........................................................................................................................ 68
9. ANEXOS ............................................................................................................................... 69
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Pruebas de Normalidad Streptococcus mutans..................................................39 y 40
Tabla 2 Pruebas de normalidad Staphylococcus aureus..................................................40 y 41
Tabla 3 Comparacion entre sustancias Streptococcus mutans.........................................42 y 43
Tabla 3 Prueba Kruskall Wallis 24horas Streptococcus mutans......................................44
Tabla 5 Comparación de sustancias por pareja..................................................................45
Tabla 6 Kruskall Wallis 48 horas Streptococcus mutans..................................................47
Tabla 7 Comparación de sustancias por pareja...................................................................48
Tabla 8 Comparación entre sustancias 24 y 48 horas Staphylococcus aureus.................49 y 51
Tabla 9 Kruskall Wallis 24 horas Staphylococcus aureus..................................................52
Tabla 10 Comparación entre sustancias..............................................................................53
Tabla 11 Kruskall Wallis 48 horas Staphylococcus aureus...............................................55
Tabla 12 Comparación entre sustancias.............................................................................57
xii
GRAFICOS
IMAGEN 1 Y 2 Materiales organizados en la cámara de flujo laminar y microorganismos
listos para la siembra.................................................................................................................27
IMAGEN 3 Y 4 Cajas petri con agar sangre listas para el cultivo ...........................................28
IMAGEN 5,6 Y 7 Siembra de microorganismos en tubo de ensayo con la prueba de turbidez
Mc Farland e inoculación de microorganismos........................................................................29
IMAGEN 8 Y 9 Siembra con técnica de hisopado...................................................................30
IMAGEN 10 Y 11Preparación de los discos para colocación en cajas petri...........................31
IMAGEN 12 Y 13 Materiales listos para la colocación de discos empapados con las sustancias
a investigar.................................................................................................................................32
IMAGEN 14,15,16,17 Y 18 Colocación de sustancias en los discos de inhibición..................33
IMAGEN 19 Y 20 Colocación de los discos en cajas petri.......................................................34
IMAGEN 21 Discos de inhibición colocados en las cajas
petri............................................................................................................................................35
IMAGEN 22,23 Y 24 Colocación de cajas en la jarra de anaerobiosis, incubación de los
cultivos con los discos de inhibición colocados a 38°c.......................................................36- 37
IMAGEN 25,26 Y 27Medicion de los halos de inhibición..................................................38-39
IMAGEN 28 Observación de los halos con utilización de luz..................................................40
xiii
LISTA DE ANEXOS.
ANEXO 1 Solicitud dirigida al Coordinador de Titulación de la Facultad de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.........................................................................................................69
ANEXO 2 Solicitud de aceptación de tutoría de tesis dirigida al Dr. Alejandro Farfán.........................70
ANEXO 3 Solicitud de aceptación del tema de tesis............................................................................71
ANEXO 4Declaracion de conflictos de interés.................................................................................72-73
ANEXO 5 Declaración de derecho de autor...........................................................................................74
ANEXO 6 Carta de confidencialidad.......................................................................................................75
ANEXO 7 Solicitud dirigida a la decana de la Facultad de Ciencias Químicas para uso de
laboratorios............................................................................................................................................76
ANEXO 8 Certificado de uso de laboratorio y pruebas bacteriológicas en la Facultad de Ciencias
Químicas.................................................................................................................................................77
ANEXO 9 Certificado de Uso de materiales utilizados en el laboratorio................................................78
ANEXO 10 Autorización de uso de instalaciones de deposito de materiales infecciosos......................79
ANEXO 11 Certificado de Protocolo de desechos infecciosos utilizados en el trabajo de
investigación...........................................................................................................................................80
ANEXO 12 Resultados obtenidos en la investigación in vitro.................................................................81
ANEXO 13 Certificado y Factura de compra de cepas bacterianas Streptococcus Mutans(ATCC25175) y
Staphylococcus aureus (ATCC6538P).....................................................................................................82
ANEXO 16. Abstract-traduccion de
resumen.................................................................................................................................................83
ANEXO 17 Repositorio
Digital................................................................................................................................................84-85
xiv
TEMA: "ESTUDIO COMPARATIVO DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DEL PERÓXIDO
DE HIDROGENO AL 3.18%, HIPOCLORITO DE SODIO AL 1.85% Y ACIDO
HIPOCLOROSO EN CONCENTRACIONES DE 125PPM Y 500PPM CONTRA CEPAS DE
STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y STREPTOCOCCUS MUTANS, ESTUDIO IN-VITRO."
Autor: Erick Mauricio Paredes Vinueza
Tutor: Marcio Alejandro Farfán Chacha
RESUMEN
La presente investigación in- vitro tuvo como objetivos el análisis comparativo entre 3
sustancias antisépticas como son: ácido hipocloroso en concentraciones de 125ppm y
500pppm, hipoclorito de sodio al 1,85% y peróxido de hidrógeno al 3,18% frente a
microorganismos Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus. Método: Estudio
experimental in vitro, se procedió con la activación de las cepas microbianas las cuales se
encontraron en un medio apropiado de refrigeración a 5ºc, posteriormente en una cámara de
flujo laminar se realizó cultivos de agar sangre mediante la técnica de hisopado formando
estrías perpendicularmente, se realizaron 10 cajas petri 5 cultivos de Streptococcus mutans y 5
cultivos de Staphylococcus aureus y se colocaron las sustancias antisépticas con micropipeta
en los discos de inhibición y colocaron en cada cultivo, para la incubación se introdujo las
placas en la jarra de anaerobiosis junto a una vela, se incubaron de 35 a 37ºC por 24, 48 y 72
horas, con ayuda de una regla se procedió a la medición de los halos de inhibición y los datos
obtenidos del análisis microbiológico se organizaron en una hoja de registro. Resultados: Se
utilizó la prueba de Kolmogórov- Smirnov para comprobar si las muestras son paramétricas,
posteriormente se realizó Kruskal Wallis. dando como resultado dos grupos, uno con valores
bajos como son el peróxido de hidrógeno al 3,18%, agua destilada y ácido hipocloroso en
concentración de 125ppm y uno con valores realmente altos como hipoclorito de sodio al
1,85% y ácido hipocloroso en concentración de 500ppm. Conclusión: El ácido hipocloroso en
concentración de 500ppm es la sustancia con mayor capacidad antiséptica frente a todas las
sustancias analizadas peróxido de hidrógeno al 3,18%, ácido hipocloroso en concentración de
125ppm e incluso mayor al hipoclorito de Sodio al 1,85%.Palabras clave:
Antisépticas/Bacterias/Staphylococcus/Streptococcus/Halos de inhibición/Cultivos/Efecto
antibacteriano/Anaerobiosis
xv
TOPIC: "COMPARATIVE STUDY OF THE ANTIBACTERIAL EFFECT OF
HYDROGEN PEROXIDE AT 3.18%, SODIUM HYPOCHLORITE AT 1.85% AND
HIPOCLOROUS ACID IN CONCENTRATIONS OF 125PPM AND 500PPM
AGAINST STAPYLOCOCCUS AUREUS AND STREPTOCOCCUS MUTANS,
STUDIES IN-VITRO."
Author: Erick Mauricio Paredes Vinueza
Supervising Professor: Marcio Alejandro Farfán Chacha
ABSTRACT
The present in vitro research has as objectives the comparative analysis between 3 antiseptic
substances such as: Hypochlorous acid in concentrations of 125ppm and 500pppm, Sodium
hypochlorite at 1.85% and Hydrogen peroxide at 3.18% against microorganisms Streptococcus
mutans and Staphylococcus aureus. Method: Experimental study in vitro, proceeding with the
activation of microbial strains which were found in an appropriate refrigeration medium at 5ºc,
then blood agar cultures were performed using the Hysstop technique, forming striations
perpendicularly, 10 petri dishes were made 5 cultures of Streptococcus Mutans and 5 cultures
of Staphylococcus Aureus and the antiseptic substances are placed with micro pipette in the
inhibition discs and placed in each culture, for the incubation the plates are introduced in the
jar for anaerobiosis next to a candle, they are incubated from 35 to 37ºC for 24, 48 and 72
hours, with the help of a rule, the inhibition zones were measured and the data obtained from
the microbiological analysis were organized in a record sheet. Results: The Kolmogórov-
Smirnov test was used to check if the samples are for metrics, then Kruskal Wallis was
performed. resulting in two groups, one with low values such as 3.18% Hydrogen Peroxide,
Distilled Water and Hypochlorous Acid in concentration of 125 ppm and one with really high
values such as 1.85% Sodium Hypochlorite and Hypochlorous Acid in 500ppm concentration.
Conclusion:Hypochlorous acid in a concentration of 500 ppm is the substance with the
highest antiseptic capacity compared to all the substances analyzed. 3.18% Hydrogen
Peroxide, Hypochlorous Acid at a concentration of 125 ppm and even higher than 1.85%
Sodium Hypochlorite.
Key words: Antiseptics / Bacteria / Sthaphylococcus / Streptococcus / Inhibition Halos / Crops
/ Antibacterial effect / Anaerobiosis
1
1. CAPITULO 1
1.1 Introducción
Según Palmer(1) la cavidad oral provee un microambiente ideal para el crecimiento de
múltiples especies bacterianas. Dentro de la flora oral se pueden encontrar especies residentes
que componen la flora normal así como bacterias transeúntes y otras asociadas a enfermedad.
La placa dental es uno de los tipos de biofilm o biopelícula más estudiados y es la forma de
crecimiento más frecuente de las bacterias de la cavidad oral.
Para mejorar su reducción y de la inflamación gingival según Slots(2) se han desarrollado
múltiples sustancias anti placa. Teniendo en cuenta que la flora normal mantiene en equilibrio
el ecosistema oral y reduce la posibilidad de infecciones por patógenos exógenos, se puede
decir que estos tratamientos deben apuntar a controlar más que a erradicar la placa dental .
Según Wang et al(9) en algunas circunstancias clínicas en odontología, se hace necesaria la
utilización de sustancias antimicrobianas de alta potencia. Los pacientes con enfermedades
periodontales severas y pacientes con alto riesgo de caries dental pueden requerir protocolos
de desinfección de cavidad oral.
La caries dental y la enfermedad periodontal constituyen las enfermedades orales de mayor
impacto poblacional en muchos países industrializados y en la mayoría de los países en
desarrollo y son consideradas enfermedades prevenibles mediante un correcto control de la
placa dental(2)
Según Laufarie et al (10)buscando una reducción más efectiva del biofilm dental, se han
desarrollado múltiples sustancias antimicrobianas para inhibir la formación de placa sobre las
superficies dentales. Sin embargo, los antisépticos a diferencia de los antibióticos, son
potencialmente tóxicos para agentes infecciosos y células del huésped, por lo tanto, su
aplicación en los seres humanos se limita a heridas infectadas, la piel y mucosas.
Evaluando las propiedades del ácido hipocloroso, este agente podría ser utilizado como
sustancia antimicrobiana en cavidad oral. (2)
2
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Dentro de las enfermedades crónicas según Graciano(5)., las bucales son las más usuales; la
importancia de éstas en la Salud Pública se debe a la prevalencia, impacto individual y social;
y los costos para su tratamiento una vez establecido el problema. La etiología multifactorial de
esta enfermedad ha sido tema de diversas investigaciones que plantean que el desarrollo de
caries dental se debe, entre otras causas, a la presencia de microorganismos cariogénicos en la
cavidad bucal.
Mariani(3) expresa que a través de los años se han realizado investigaciones en cuanto a la
prevención de los males que afectan a la cavidad bucal, entre dichos males se menciona a la
caries dental puesto que se considera la enfermedad más frecuente en el hombre y a la vez un
proceso patológico que destruye las estructuras que conforman el diente, constituyendo un
problema de Salud Pública.
Aunque la importancia de los Staphylococcus como patógeno médico se ha reconocido por
muchos años Smith(4)expresa que la presencia de especies de Staphylococcus como un
componente de la flora oral es sorprendente, algunas infecciones en la región oral son
causadas, al menos en parte, por S. aureus
1.2.1 FORMULACION DEL PROBLEMA
Por tanto, ¿Es influyente en la prevención contra la actividad microbiana de Streptococcus
mutans y Staphylococcus aureus el uso de sustancias como: peróxido de hidrógeno,
hipoclorito de sodio y ácido Hipocloroso?
3
1.3 JUSTIFICACIÓN
A lo largo de los años se han buscado alternativas para prevenir las enfermedades que han
afectado a la cavidad bucal y de manera especial la caries dental, las mismas que no han
logrado reducir la caries en la población, puesto que una posible explicación se debe a la falta
de colaboración del paciente.
Según Bascones et al(6) debido al amplio problema de microorganismos patógenos en cavidad
oral, un estudio de los diferentes tipos de antisépticos de uso común en odontología los cuales
son utilizados para diferentes tratamientos, alterando su concentración podrían ser utilizados
como inhibidores de bacterias patógenas, el objetivo de esta investigación es analizar las
sustancias para poder tener idea de la capacidad inhibitoria de cada una de ellas y así entender
el uso que se podría dar en la actividad clínica y en la prevención de enfermedades buco-
dentales.
La resistencia a múltiples sustancias según Cabrera(7) hoy día es un problema de Salud Pública
que se viene observando a nivel mundial después de la aparición de los antibióticos, el uso
indiscriminado de los antibióticos y la presión selectiva ambiental realizada por antisépticos y
desinfectantes ha generado una respuesta de supervivencia en los microorganismos, que los
capacita para evadir con eficacia la acción bactericida de algunos de estos agentes químicos.
4
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 General
Evaluar el efecto antimicrobiano de tres principios activos: peróxido de hidrógeno ,hipoclorito
de sodio y ácido hipocloroso utilizados como soluciones antisépticas sobre microorganismos
cepas atenuadas de Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans
1.4.2 Específicos.
Analizar la capacidad de inhibición microbiana del Hipoclorito de sodio al 1.85%
contra cepas de Staphylococcus aureus ATCC6538 y Streptococcus mutans
ATCC25175 cultivados in Vitro.
Determinar el efecto antimicrobiano del peróxido de hidrógeno al 3,18%contra
microorganismos Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans
Evaluar el efecto antimicrobiano del ácido hipocloroso en concentraciones de 125ppm
y 500ppm contra microorganismos Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans
Comparar el efecto antimicrobiano de peróxido de hidrógeno, hipoclorito de sodio y
ácido hipocloroso como antisépticos de uso común en odontología.
5
1.5 HIPOTESIS
1.5.1 Hipótesis de investigación( H1)
Los principios activos de sustancias de uso común en Odontología: Peróxido de hidrógeno
,hipoclorito de sodio y Ácido Hipocloroso tienen efecto antimicrobiano y antiséptico ante
Staphylococcus aureus (ATCC6538) y Streptococcus mutans (ATCC25175)
1.5.2 Hipótesis Nula (H0)
Los principios activos de sustancias de uso común en Odontología: Peróxido de hidrógeno
,hipoclorito de sodio y Ácido Hipocloroso no tienen efecto antimicrobiano y antiséptico ante
Staphylococcus aureus (ATCC6538) y Streptococcus mutans (ATCC25175)
6
2. CAPITULO 2
MARCO TEORICO
2.1 MICROBIOLOGÍA
Según Sevillano(8)el objeto de estudio de la Microbiología está constituido por un gran y
diverso grupo de organismos microscópicos, que incluye tanto formas pluricelulares sin
diferenciación, como unicelulares e incluso formas a celulares. Todos ellos comparten una
organización biológica sencilla sin especialización tisular y un tamaño pequeño, que obliga el
uso del microscopio para su observación.
Liebana(26)enfatiza los métodos de aislamiento que se crearon en principio para trabajar con
bacterias y, posteriormente, han sido adaptados al estudio de otros microorganismos. La
necesidad de utilizar la técnica metodológica de los cultivos puros es una de las características
que mejor han definido a la Microbiología durante muchos años.
En la actualidad no siempre se utilizan cultivos puros para el estudio de los microorganismos,
bien porque el cultivo de algunos de ellos ha sido imposible de conseguir en condiciones de
laboratorio, bien porque su crecimiento es dependiente de una célula hospedadora. (26)
2.1.1 MICROBIOLOGÍA ORAL
El origen de la microbiología oral coincide con el descubrimiento de las bacterias, ya que
Leeuwenhoek observó en su saliva y en el material depositado en los dientes, que denominó
materia alba, los citados animáliculos. En lo que se refiere a los grandes procesos microbianos
de la cavidad bucal, los que afectan al periodonto, como la gingivitis y la periodontitis, en
1745 Pierre Fauchard relacionó lo que hoy se conoce como placa y el sarro o tártaro con la
aparición de estas afecciones. (8)
7
2.1.2 FLORA MICROBIANA ORAL
La micro flora oral según Ojeda et al(14) es un complejo ecosistema que contiene una amplia
variedad de especies microbianas. De no tomarse medidas de higiene oral, las superficies de
los dientes acumulan grandes masas microbianas, mientras que la descamación de células
epiteliales no permite la acumulación en las superficies de la mucosa oral.
Graciano(5) enfatiza que los estreptococos conforman el mayor número del total de la
población bacteriana en la placa dental. Muchos de los estreptococos pueden ser identificados
como una de las siguientes especies: S. mutans, S. sanguis, S. mitior, S. salivarius, y S. milleri.
Las especies más importantes en el humano son Streptococcus mutans y Streptococcus
sobrinus.
Los sitios anatómicos más estudiados para a investigación de Staphylococcus aureus según
Pinto(11.), son la mucosa nasal y piel, sin embargo la cavidad bucal es un potente reservorio de
dicha bacteria en distintas investigaciones se ha concluido que la colonización de S.aureus en
cavidad oral es común en los trabajadores de la salud y se puede tener riesgo de infecciones en
tratamientos como exodoncias y raspado y alisado radicular.
2.2 MEDIOS DE CULTIVO
El cultivo en agar sangre es considerado como el Gold estándar ya que permite realizar
recuentos bacterianos para establecer proporciones relativas, mediante métodos cuantitativos
en medios no selectivos. (27)
Actualmente hay 5 medios de cultivo diferentes para el aislamiento de Streptococcus mutans Y
Staphylococcus aureus. Según Ojeda et al(14). Estos son:
Agar Mitissalivarius con bacitracina (MSB),
Agar MitisSalivarius con bacitracina y kanamicina (MSKB)
Agar glucosa-sacarosa-teluritobacitracina (GSTB)
8
Agar Tripticasa de soya con sacarosa y bacitracina (TYS20B)
Agar triptona extracto de levadura cisteína con sacarosa y bacitracina (TYCSB).
El agar sangre es el medio más ampliamente usado para aislar S. mutans y otras especies
orales de estreptococos y Staphylococcus siendo de gran utilidad para identificar la población
de alto riesgo de caries dentales y su aplicación permitiría desarrollar programas de
prevención en salud oral en poblaciones específicas y vulnerables evitar procedimientos
extensos en el paciente(14).
2.3 GENERO STREPTOCOCCUS
Son Cocos gram positivos en cadenas o pares, son capnófilos (microorganismos cuyo
desarrollo se ve favorecido por la presencia de anhídrido carbónico "CO2")no tienen mayores
requerimientos nutricionales, no producen catalasa a diferencia de los Staphylococcus, algunos
poseen cápsula, la cual los permite serotipificar(5)
2.3.1 Clasificación según manifestaciones clínicas en general
Según Amaro J. (12).
• Streptococcus pyogenes: causante de Impétigo no buloso, amigdalitis, fiebre escarlata o
escarlatina.
• Streptococcus agalactiae: causante de infecciones urogenitales, aborto séptico, meningitis
neonatal.
• Streptococcus pneumoniae: principal agente causal de la neumonía adquirida en la
comunidad. Además es agente de otitis media y meningitis.
• Streptococcus grupo viridans: saprófito oportunista, causante de endocarditis y abscesos
dentales.
• Streptococcus mutans: frecuente causa de caries dentales
9
• Enterococcus faecalis: causante de infecciones urinarias, infecciones de heridas operatorias,
infecciones en diabéticos. (12)
2.3.2Streptococcus mutans
Se caracteriza por ser Gram positivo, anaerobio facultativo que forman parte de la placa
bacteriana, también se caracteriza por ser acidófilo, acidogénico y acidúrico, además tiene la
capacidad de generar polisacáridos extracelulares y por ende favorecer la adhesión del mismo
a las piezas dentales. (5)
Generalmente es conocido como patógeno dental e igualmente se considera que causa
bacteriemia y endocarditis infecciosa. En cuanto a la virulencia en sangre, estas cepas
sobreviven en la sangre por mayor tiempo debido a su baja antigenicidad. Otros estudios
revelan la participación de este serotipo en la patogénesis de enfermedades cardiovasculares,
en la cuales se ha detectado su alta frecuencia.(12)
Shafer(13) reconoció al Streptococcus mutans como la principal cepa altamente acidógena y
cariogénica dentro del grupo de los estreptococos, teniendo la capacidad de metabolizar
sacarosa dietética y de sintetizar glucano, por medio de la glucosiltransferasa superficial y
extracelular, de tal manera que esta enzima otorga al S. mutans su establecimiento en la placa
dental, el glucano se lo reconoce como un gel insoluble, viscoso que permite que la bacteria se
adhiera fuertemente en la superficie dental otorgando también protección contra la difusión de
amortiguadores salivales.
2.3.3 Transmisión, colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
La caries dental es una enfermedad dental transmisible en la cual los estreptococos del grupo
Streptococcus mutans juegan un papel principal. Como en muchas enfermedades infecciosas,
se requiere la colonización de un patógeno antes de que ocurra la infección. Hay un rango de
10
factores de virulencia importante para el establecimiento de Streptococcus mutans en la
compleja comunidad microbiana de la biopelícula dental. (3)
Una característica importante de Streptococcus mutans es la persistencia de sus genotipos en
la cavidad oral de adultos, adolescentes y niños mayores de cinco años. Este fenómeno es
conocido como persistencia y revela la relativa estabilidad que estos alcanzan en un
hospedador y la relación con la expresión de características fenotípicas que les pueden dar
ventajas para la supervivencia, como la capacidad de formar biopelícula, de adherirse y
soportar fluctuaciones del pH. (12)
Se ha considerado comúnmente que la colonización de la cavidad oral de los niños por S.
mutans ocurre al producirse la erupción del primer diente, es decir, alrededor de los seis meses
de edad, (14)
Se reconoce la diversidad genotípica de S..mutans en cuatro sitios de muestreo (saliva, dorso
de la lengua, mucosa alveolar y biopelícula dental), sin embargo, la biopelícula dental es un
lugar muy importante dado el gran número de genotipos de Streptococcus mutans y las cepas
aisladas. (12)
2.4 STAPHYLOCOCCUS
2.4.1 Género Staphylococcus
El nombre del género Staphylococcus se refiere a que las células de estos cocos se desarrollan
en un patrón que recuerda a un racimo uvas, sin embargo, los microorganismos presentes en
muestras clínicas aparecen como células aisladas, en pares o en cadenas cortas. Son
anaerobios facultativos. Estas bacterias están presentes en la piel y las mucosas del ser
humano. (4)
Los estafilococos conforman un importante grupo de patógenos en el ser humano y originan
un amplio espectro de enfermedades sistémicas que pueden poner en peligro la vida,
infecciones de la piel, los tejidos blandos, los huesos y el aparato genitourinario e infecciones
oportunistas en mucosa oral. (27)
11
En la comunidad, las infecciones por Staphylococcus aureus son a menudo agudas, piogénicas
y superficiales, aunque también puede producir, con menor frecuencia, infecciones profundas
como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. (3)
2.4.2 Metabolismo
La forma de obtener energía es tanto a través de la fermentación como de la respiración
anaerobia. En cuanto a los requerimientos de cultivo, no son demasiado exigentes desde el
punto de vista nutricional, creciendo en medios pobres y simples. En su relación con el
oxígeno son aerobios-anaerobios facultativos.(12)
Es muy resistente a las condiciones ambientales normales. Es capaz de sobrevivir hasta tres
meses en un cultivo a temperatura ambiente. Muere expuesto a temperaturas mayores de 60 °C
por una hora. En cuanto a los agentes químicos, es sensible a la mayoría de los desinfectantes
y antisépticos, que lo matan en pocos minutos. (4)
2.4.3 Staphylococcus aureus
En los últimos años, la incidencia de bacteremia por Staphylococcus ha aumentado
significativamente, ya que una especie de esta familia bacteriana ha aumentado su frecuencia
de aparición; se trata de la especie Staphylococcus aureus, que se ha convertido en la principal
causa de infecciones en el torrente circulatorio (BSI) e intoxicaciones ocasionadas por
alimentos. (11)
Establece que la patogenicidad de las infecciones por Staphylococcus aureus se relaciona con
diversos componentes de la superficie bacteriana de manera general, los componentes del
microbio son peptidoglicanos y ácidos teicoicos, además de la proteína A. Así pues, la
patogenia provocada por este microorganismo surge cuando se produce la combinación de los
factores de virulencia con la disminución de las defensas del huésped .(8)
12
Estas condiciones según Socorro et al(43)propician que Staphylococcus aureus posea
características de virulencia y daño bastante particulares aunado a esto, la situación se ve
agravada debido a que el patógeno ha ido desarrollando múltiple resistencia contra los
antibióticos, propiciando que cada vez sea mucho más difícil el tratamiento y la curación de
las enfermedades ocasionadas por esta bacteria.
Sin embargo Bascones(6)enfatiza que el Staphylococcus aureus es importante no solo porque
ocasiona infecciones en diversas partes del organismo humano, sino porque es una de las
principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales
enfermedades son causadas por diversas acciones, incluyendo la capacidad del patógeno de
producir toxinas, siendo esto relativamente común en determinados sectores de la población y
en algunas regiones geográficas desfavorecidas por la falta de sistemas de salud y de control
de infecciones adecuados.
2.4.4 Staphylococcus aureus en cavidad oral
Según Nicolosi(30) existe en traumas directos en los que pueda existir infección, se hallan
aquellos procesos odontológicos invasivos como las extracciones dentales, cirugías gingivales,
obturación de conductos, limpiezas dentales acompañadas de sangrado y cualquier otro tipo de
procedimientos dentales o quirúrgicos que impliquen ruptura de tejido y mucosas con paso de
microorganismos a sangre circulante y sin profilaxis previa al tratamiento.
Los sitios anatómicos más estudiados para a investigación de Staphylococcus aureus, son la
mucosa nasal y piel, sin embargo la cavidad bucal es un potente reservorio de dicha bacteria
en distintas investigaciones se ha concluido que la colonización en cavidad oral es común en
los trabajadores de la salud y se puede tener riesgo de infecciones en tratamientos como
exodoncias y raspado y alisado radicular. (11.)
Según Guidol(28)estudios realizados por diferentes entidades de salud, la infección por
Staphylococcus aureus se ha diseminado de forma epidémica en más de un 25% en cavidad
oral lo que dificulta su tratamiento.
13
La mortalidad actual relacionada con infecciones graves causadas por Staphylococcus aureus
junto al incremento en la incidencia de endocarditis que en general está en relación con el uso
creciente de catéteres y la realización de manipulaciones vasculares así como de procesos
dentales invasivos, se añade el hecho de que hasta hace poco no disponíamos de alternativas
terapéuticas a los antibióticos glucopéptidos, que han sido los fármacos de referencia para el
tratamiento de estas infecciones según Rea(29).
Es uno de los microorganismos que se aísla con mayor frecuencia en las infecciones
nosocomiales y odontológicas, presenta una patogenicidad variable que le permite causar
desde infecciones superficiales hasta infecciones con compromiso vital (endocarditis,
septicemias, meningitis). El Staphylococcus Aureus es la causa más común de endocarditis
infecciosa en zonas más desarrolladas y pueden formar biofilm sin necesidad de daño
endotelial es decir sin realizar intervención quirúrgica y causar heridas en mucosa oral.(29)
2.4.5 Factores predisponentes del huésped
Las infecciones causadas por Staphylococcus aureus, no solo dependen de los factores de
agresión que este microorganismo posee, sino también de alteraciones en los mecanismos de
defensa del huésped. (31)
Dentro de los factores pre disponentes del huésped tenemos según Rea(29):
• Defectos de quimiotaxis leucocitaria congénitos o adquiridos (diabetes mellitus, artritis
reumatoide).
• Defectos de opsonización por anticuerpos (hipogamaglobulinemia).
• Defectos en la muerte intracelular luego de la fagocitosis (enfermedad gránulo matosa
crónica). Heridas de piel (quemaduras, incisiones quirúrgicas, eczema).
• Presencia de cuerpos extraños (suturas, vías venosas, prótesis).
• Infecciones por otros agentes, particularmente virus (influenza).
14
• Enfermedades crónicas como alcoholismo, falla renal crónica, enfermedades malignas, etc.
(29)
2.4.6 Patogenia
S. aureus produce infecciones de dos maneras: En forma directa, por invasión y posterior
destrucción tisular local (proceso supurado), o luego de haberse diseminado por vía
sanguínea.(30)
Las Infecciones por acción de toxinas como infecciones causadas por la liberación al medio de
sustancias tóxicas, que pueden ejercer su acción a cierta distancia del foco infeccioso.(31)
2.5 ANTISEPTICOS:
El uso de antisépticos en Odontología tiene por objetivo según Romero(16):
• Eliminar la posibilidad de infección (cuando se usan para realizar los campos operatorios),
• Tratar infecciones (candidiasis, gingivitis ulceronecrotizante aguda)
• Contribuir a resolver posibles infecciones en heridas de forma más eficaz y segura posible
(utilizados para lavado de seno maxilar, cavidades quísticas, lechos quirúrgicos,
coadyuvantes en tratamiento de enfermedad periodontal).
Un antiséptico debe poseer algunas propiedades específicas para cumplir con su objetivo:
• Debe actuar rápidamente aún en presencia de exudados,
• Ser de eficacia prolongada,
• Tener tensión superficial baja,
• No ocasionar irritación ni dolor en el sitio de aplicación, no ser alergénico, A la vez, es
deseable que sea inodoro, que no manche o tiña las superficies donde se aplica y que tenga
sabor agradable (16)
15
2.5.1 PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
Según Martínez l (15)actúa como antiséptico y desinfectante de uso externo de corta duración y
amplio espectro de acción, incluyendo gérmenes anaerobios. Se utiliza en solución acuosa del
3%-4% sobre piel, heridas y sobre la mucosa bucal como un agente de desbridamiento y
eliminando tejido muerto. (El desbridamiento se utiliza para limpiar el material muerto o
contaminado de una herida y auxiliar en la sanación)
En contacto con diversos catalizadores inorgánicos u orgánicos, tales como la enzima catalasa,
presente en todos los tejidos, se descompone oxígeno y producir efervescencia, por lo que su
mayor utilidad es para el desbridamiento de heridas.
Debido a la formación rápida de burbujas de oxígeno, el peróxido de hidrógeno produce
efectos mecánicos de limpieza de restos de tejidos y para despegar las curas y gasas de las
heridas. Sin embargo, en cavidades cerradas, existe peligro de provocar lesiones tisulares y de
producir embolia gaseosa. La acción del peróxido de hidrógeno se puede ver disminuida en
presencia de materia orgánica (proteínas, sangre, pus). Su acción es bastante corta por lo que
no se aconseja el empleo único del peróxido de hidrógeno como antiséptico.(15)
2.5.1.1 Mecanismo de acción
Reheimer(17) indicó que su acción bactericida se debe a dos motivos: a la producción de iones
hidroxilo y radicales libres, que actúan oxidando componentes esenciales del microorganismo
(lípidos, proteínas y DNA). Liberación de O2 por las catalasas tisulares, que actúa impidiendo
la germinación de esporas de anaerobios como Clostridium tetani. Además, el O2 liberado en
su descomposición en forma de burbujas favorece la eliminación de detritus celulares,
bacterias y tejidos desvitalizados. En el interior de la bacteria, por acción de la
mieloperoxidasa sobre los cloruros y sobre el peróxido de hidrógeno, se forma hipoclorito
(presenta poder oxidante y germicida).
2.5.2 HIPOCLORITO DE SODIO
16
Compuesto químico que se origina por la mezcla de un cloro, hidróxido de sodio y agua, fue
desarrollado en 1787 por el francés Berthollet como un blanqueador de telas. Es hasta el siglo
XIX donde Luis Pasteur comprueba su poder se desinfección, incorporando su uso como
agente de defensa contra gérmenes y bacterias. En 1870, Labarraque, obtiene el hipoclorito de
sodio del 1% al 2% como cloro activo y usa esta solución como desinfectante de heridas. (17).
Según Canalda et al(18) el hipoclorito un desinfectante universal, siendo definido como un
líquido claro, pálido, verde amarillento, alcalino, el cual presenta una acción disolvente sobre
tejidos necróticos y residuos orgánicos, además es un potente agente antimicrobiano.
Considerado bactericida y fungicida.
El hipoclorito de sodio según De Nardo(21) ha sido utilizado en algunos estudios de inhibición
de microorganismos su gingivales en bolsas periodontales . Concentraciones de hipoclorito de
sodio al 0,05% también ha sido utilizado en enjuague bucal para la reducción de la gingivitis
en un período de 21 días. Sin embargo, el hipoclorito de sodio presenta algunos efectos
colaterales que incluyen irritación de las membranas mucosas cuando se usa a altas
concentraciones, efectos decolorantes y efectos corrosivos no es aconsejable utilizar en
mucosas orales se utilizan en endodoncia.
2.5.2.1 MECANISMO ANTIBACTERIANO DEL NaOCl
Para Vega(20) utilizada comúnmente en odontología como antiséptico, fungicida y
desinfectante, gracias a su actividad microbiana, tiene una gran compatibilidad biológica en
diferentes concentraciones. Al liberar oxigeno y cloro destruye al microorganismo, esta fase,
aun no se ha establecido de forma exacta como se realiza pero, se cree que el mecanismo de
desinfección por cloro se va a realizar por inhibición de algunas reacciones enzimáticas claves
dentro de la célula, destruyendo las proteínas e inactivando al acido nucleíco.
2.5.3 ACIDO HIPOCLOROSO
El HOCl biológicamente, se clasifica dentro de un grupo de pequeñas moléculas conocidas
como especies reactivas del oxígeno (ROS) sintetizadas por células del sistema inmune
17
(neutrófilos y macrófagos) en un proceso inmunológico conocido como "estallido
respiratorio", durante la fagocitosis de antígenos según Weiss (21). Cuando un patógeno invade
los tejidos, los polimorfo nucleares neutrófilos y macrófagos son activados y la fagocitosis de
los antígenos es el resultante del ensamblaje e inicio del estallido respiratorio. (20).
Debido a que la concentración de cloro en el plasma es mil veces mayor que la de otros
compuestos halogenados Según Kekstrom et al(24),el sistema H2 O2 – mieloperoxidasa utiliza
el cloro formando HOCl que es altamente reactivo en contra de componentes esenciales de la
célula microbiana.
Sam(22) indica que el HOCl, resultante del estallido respiratorio, se libera entonces a nivel
extracelular reaccionando con la taurina formando cloramina de taurina un oxidante de larga
duración que también tiene propiedades antibacteriana y antiinflamatoria.
2.5.3.1 Obtención.
Para Weiss(23)el HOCl es un ión no disociado del cloro dependiente del oxígeno, altamente
inestable y altamente reactivo. Por ser uno de los ácidos hipo halogenados más fuertes, es
también uno de los más poderosos oxidantes entre los oxácidos clorados y es el responsable
directo de la acción bactericida de los compuestos derivados del cloro.
Riveros(33) expresa que en Colombia en 1993, a través de la implementación de un protocolo
modificado de acidificación más procesos secundarios de súper oxidación del agua, se
desarrolla una técnica para la estabilización de HOCl para su uso en medicina(Superoxidacion
del Agua). Este desarrollo dio inicio a procesos investigativos dirigidos a la optimización y
refinamiento de los métodos de obtención de la molécula hasta desarrollar una solución
antimicrobiana a base de HOCl con potenciales aplicaciones profilácticas y terapéuticas en
medicina humana, aprobada por el instituto de vigilancia en alimentos y medicamentos de
Colombia (INVIMA).
En 2006 según Garcia(31), la FDA (Food and DrugAdministration) en los EE.UU aprobó una
solución cuyo componente activo es el ácido hipocloroso; el Aquatine
(SteriloxDental'sAquatineEndodonticCleanser, Aquatine EC, Sterilox, Puricore, Malvern, PA,
18
USA) fue aprobado para ser usado como irrigante en endodoncia siendo otro producto
patentado para uso en odontología.
2.5.3.2 Efecto Antimicrobiano
El ácido hipocloroso según Galvan(33)es el componente activo del hipoclorito de sodio sin sus
efectos adversos, de esta manera, se podría considerar como un potente anti placa para uso en
cavidad oral ya que se ha demostrado un alto efecto antimicrobiano (33). Calderón(34) describe
que los procesos de obtención y optimización de la molécula continuaron y en el año 2009
Lafaurie et al(10)evaluaron la eficacia In Vitro del HOCl contra microorganismos
potencialmente patógenos de cavidad oral. El ácido hipocloroso logró inhibición bacteriana
del 99.9% a una concentración de 0.05% (500ppm).
Esta actividad microbicida, a pesar de ser más efectiva para formas bacterianas que para
esporas, abarca microorganismos clínicamente relevantes como lo son bacterias Gram
negativas, Gram positivas, parásitos y hongos (8.).
2.5.3.3 Usos en odontología
Recientemente según Mainnemare et al(25), se desarrollaron soluciones de HOCl a 125 y 500
ppm a un pH de 5,8 para ser utilizado en investigación para uso odontológico. Actualmente, se
están realizando pruebas microbiológicas de citotoxicidad sobre células de la mucosa oral,
efectos del pH sobre la capacidad buffer de la saliva, efecto erosivo sobre el esmalte dental, su
efecto sobre la oxidación de proteínas y estudios de sustantividad y efecto anti placa que
sustenten su uso en cavidad oral como agente antimicrobiano y en cicatrización de heridas.
Uno de los intereses del estudio del HOCl radica en que este es la parte activa de hipoclorito
de sodio con menos efectos adversos. El hipoclorito de sodio ha sido utilizado en algunos
estudios de inhibición de microorganismos subgingivales en bolsas periodontales(34)
19
3. CAPITULO 3
3.1 METODOLOGÍA:
3.1.1 TIPO DE ESTUDIO
Estudio de tipo Experimental IN-VITRO debido que se llevó a cabo ensayos en laboratorio en
el cual las variables llevaron una manipulación en condiciones controladas, y posteriormente
se describió las causas por las que se producen los resultados de manera que quedó en
evidencia la inhibición de Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus utilizando sustancias
químicas antimicrobianas como peróxido de hidrógeno , hipoclorito de sodio y ácido
hipocloroso.
Comparativo debido que se evaluó si existe diferencia significativa entre los agentes
antimicrobianos peróxido de hidrógeno ,hipoclorito de sodio y ácido hipocloroso sobre
microorganismos cepas atenuadas de Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans.
3.1.2 POBLACION Y MUESTRA
Para determinar la muestra se tomaron en cuenta cepas de microorganismos liofilizados de
Staphylococcus aureus (ATCC6538) y Streptococcus mutans (ATCC25175) adquiridas de la
empresa importadora MEDIBAC, que es un distribuidor autorizado de la empresa
“Microbiologics Inc.” en Minnesota, USA para Ecuador, dichas muestras fueron tratadas y
manejadas bajo medidas y parámetros de un laboratorio microbiológico capacitado y
controlado por personal especializado en el Laboratorio de la Facultad de Química de la
Universidad Central del Ecuador
3.1.3 MUESTREO
De tipo no probabilístico por conveniencia debido que se van a utilizar cepas liofilizadas de
Staphylococcus aureus (ATCC6538) y Streptococcus mutans (ATCC25175) para el estudio
sin necesidad de otros microorganismos o muestra.
20
3.1.4 CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Cepas puras de Staphylococcus aureus.
Cepas puras de Streptococcus mutans.
Solución de peróxido de hidrógeno al 3,18%
Solución de hipoclorito de sodio al 1.85%.
Solución de ácido hipocloroso a 125ppm y 500ppm
3.1.5 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Cepas de Streptococcus que no pertenezcan al grupo viridans
Cepas de Staphylococcus que no pertenezcan al grupo Beta hemolítico A
Solución de peróxido de hidrógeno que difiera del 3,18%
Solución de hipoclorito de sodio que difiera del 1.85%.
Solución de ácido hipocloroso que no corresponda a 125ppm y 500ppm.
21
3.1.6 CONCEPTUALIZACION DE LAS VARIABLES
3.1.6.1 VARIABLE DEPENDIENTE:
Sustancias antisépticas las cuales va a tener una acción inhibitoria contra microorganismos
impidiendo su crecimiento o en su caso causando su muerte.
3.1.6.2 VARIABLES INDEPENDIENTES:
Streptococcus mutans: Es una bacteria Gram positiva, anaerobia facultativa que se encuentra
normalmente en la cavidad bucal humana, formando parte de la placa dental o biofilm dental.
Se asocia al inicio y desarrollo de la caries dental.
Staphylococcus aureus: Conocido comúnmente como estafilococo dorado, es una bacteria
anaerobia grampositiva productora de coagulasa y catalasa. Es el patógeno humano más
importante que coloniza la piel de la mayoría de los seres humanos.
3.1.7 OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES
VARIABLES
DEPENDIENT
ES
CONCEPTUALIZ
ACION
DETERMINANTE
S
INDICA
DOR
ESCALA
ANTISEPTICO
S
PEROXIDO DE
HIDRÓGENO
Antiséptico de
acción oxidante a
nivel de
membrana, se
incrementa en la
fase gaseosa actúa
a través de
radicales libres.
Concentración: 3%
Cantidad:20UI
(micro litros)
Tiempo: 6-12-
18horas
Temperatura del
Halo de
inhibici
ón
Milímetro
s
22
ambiente: 35ºc
HIPOCLORITO
DE SODIO
Antiséptico y
desinfectante,
utilizado
comúnmente en
endodoncia, posee
una gran
capacidad
oxidante y actúa
desnaturalizando
las proteínas.
Concentración:
1.8%
Cantidad:20UI(micr
o litros)
Tiempo: 6-12-
18horas
Temperatura del
ambiente: 35ºc
Halo de
Inhibici
ón
Milímetro
s
23
VARIABLES
INDEPENDIENT
ES
CONCEP
TUALIZA
CION
DETERMI
NANTES
INDICADO
R
ESCA
LA
MICROOR
GANISMOS
Streptococcus
mutans
Es una bacteria
Gram positiva,
anaerobia
facultativa que
se encuentra
normalmente en
(ATCC25175)
Crecimiento en
cajas petri
Cuantitativ
a
ACIDO
HIPOCLOROS
O
Sustancia
antimicrobiana,
biológicamente
sintetizada por
neutrófilos y
macrófagos
durante un proceso
inmunológico
conocido como
estallido
respiratorio,
actividad
microbicida
efectiva contra
formas bacterianas
como esporas y
hongos, sin causar
daños a tejidos
Concentración:
125ppm y 500ppm.
Cantidad:20UI(micr
o litros)
Tiempo: 6-12-
18horas
Temperatura del
ambiente: 35ºc
Halo de
inhibici
ón
Milímetro
s.
24
la cavidad bucal
humana,
formando parte
de la placa
dental o biofilm
dental. Se
asocia al inicio
y desarrollo de
la caries dental.
Staphylococcu
s aureus
Conocido
comúnmente
como
estafilococo
dorado, es una
bacteria
anaerobia
grampositiva
productora de
coagulasa y
catalasa. Es el
patógeno
humano más
importante que
coloniza la piel
de la mayoría
de los seres
humanos.
(ATCC6538) Crecimiento en
cajas petri
Cuantitativ
a
25
3.1.8 ASPECTOS BIOETICOS
Por la manera de obtención de la muestra biológica y al ser un estudio in vitro, el presente
proyecto no requiere ser sometido al Comité de Ética de la Universidad Central del Ecuador.
3.1.8.1 Beneficencia
Se aportó a la comunidad Odontológica las propiedades antibacterianas y antioxidantes de los
diferentes antisépticos utilizados en esta investigación ante potenciales microorganismos de
cavidad oral, además exponer los diferentes beneficios de los antisépticos. A pesar de que este
estudio no se realizó en seres humanos tiene un alto beneficio en la sociedad debido que uno
de los compuesto utilizados en esta investigación como es el ácido hipocloroso en diferentes
países ya se utiliza como un potencial antiséptico oral y en mucosas.
3.1.8.2 Beneficios potenciales del estudio directo.
El profesional odontólogo podrá conocer el potencial y el efecto inhibidor de diversos
antisépticos sobre las bacterias Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus las cuales son
comunes en cavidad oral con la finalidad de conocer la sustancia antiséptica con mayor
potencial inhibitorio de las sustancias utilizadas en este estudio
3.1.8.3 Riesgo potencial del estudio.
El estudio fue in vitro no tuvo ningún riesgo potencial sin embargo los microorganismos y
sustancias utilizadas serán desechadas siguiendo el protocolo de manejo de desechos de la
Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador
Idoneidad ética y experiencia del investigador Para este trabajo realizado por mi persona y
tutorado por el Dr. Alejandro Farfán quien tiene estudios y experiencia en el campo de
Odontología y Laboratorios.
26
3.1.8.4 Declaración de conflicto de intereses
Al realizar este trabajo no se obtuvo ningún beneficio personal ni económico.
3.1.8.5 Confidencialidad
Los datos obtenidos forman parte de la investigación y fueron utilizados únicamente en el
presente trabajo de investigación. No se utilizaron muestras de seres humanos y todas las
sustancias a utilizar serán manejadas por personal capacitado y con experiencia, siguiendo una
metodología establecida y una recolección de datos únicamente para el uso de la investigación.
27
3.1.9 METODO DE RECOLECCION DE LA INFORMACION:
Realizados los procesos administrativos en la Facultad de Odontología de la Universidad
Central del Ecuador(anexos 1,2 ,3), y acorde a la solicitud enviada a la Facultad de Ciencias
Químicas se llevó a cabo la investigación in-vitro.
Posterior a la aprobación del Comité de bioética de la Facultad de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador. Se procede a evaluar 4 antisépticos los cuales son ácido
hipocloroso 500ppm-0.05%, ácido hipocloroso 125ppm-0,025%, hipoclorito de sodio al
1,85% y peróxido de hidrogeno al 3,18%. Utilizando como muestra negativa el agua destilada.
Contra cepas liofilizadas de microorganismos los cuales son Streptococcus mutans y
Staphylococcus aureus.
PROTOCOLO
1. Siembras de microorganismos:
Realizamos siembras o inoculaciones microbiológicas en una cámara de flujo laminar para no
permitir ningún tipo de contaminación y con todas las normas de Bioseguridad.
Activación de las cepas microbianas las cuales se encontraron en un medio totalmente estéril
y en refrigeración a 5ºC.
IMAGEN1y 2
28
Realizada y tomada por Erick Paredes
2. Preparación de las cajas petri con agar sangre previo a la colocación del cultivo de
microorganismos.
IMAGEN 3 Y 4
Realizada y tomada por Erick Paredes
29
Primeramente verificamos la sustancia con los microorganismos a investigar y se observó que
tan turbia se encuentra con ayuda de la prueba de turbidez 0,5 McFarland con suspensión
bacteriana, esta debe estar exactamente igual a la sustancia base. El objetivo fue determinar la
cantidad de bacterias que se encuentran por ml de fluido y posteriormente se procede a
sembrar los microorganismos en agar sangre.
IMAGEN 5,6 Y 7
Realizada y tomada por Erick Paredes
30
3. Siembra: con la técnica de siembra con hisopos se procedió a cargar con
microorganismos en el hisopo realizando frotes longitudinales alrededor del medio de
cultivo y posterior mente nuevas estrías perpendiculares a las anteriores y se repite el
procedimiento hasta agotar la muestra.
IMAGEN 8 Y 9
Realizada y tomada por Erick Paredes
31
4. La siembra se realizó en 5 cajas con Streptococcus mutans ATCC 25175 y 5 cajas con
Staphylococcus aureus ATCC 6538 , en las cuales se procedió a depositar los discos
conforme la técnica de difusión en agar con disco según SANTAMBROSIO.
IMAGEN 10 Y 11
Realizada y tomada por Erick Paredes
32
5. Colocación de los discos empapados con las sustancias a investigar, ácido hipocloroso
elaborado en la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador
en concentraciones de 500ppm-0,05% y 125ppm-0,025%, hipoclorito de sodio al
1,85% y peróxido de hidrógeno al 3,18%. y en la parte central agua destilada como
prueba negativa.
IMAGEN 12 Y 13
33
Realizada y tomada por Erick Paredes
IMAGEN 14,15,16,17,18
34
Realizada y tomada por Erick Paredes
Colocación de los discos de inhibición con las sustancias a analizar.
IMAGEN 19 Y 20
Realizada y tomada por Erick Paredes
35
IMAGEN 21
Realizada y tomada por Erick Paredes
6. Incubación: Para la incubación se procedió a introducir las cajas en la jarra para
anaerobiosis junto con una vela la cual va a permitir eliminar el oxígeno dentro de la
jarra permitiendo una anaerobiosis adecuada de las bacterias. Inmediatamente se
incubaron a una temperatura de 31 a 37ºc por 24, 48 y 72 horas, para que se
produzcan los halos de inhibición.
36
IMAGEN 22,23 Y 24
Realizada y tomada por Erick Paredes
7. Medición de los halos.
Los halos de inhibición de crecimiento de las bacterias alrededor de cada disco fueron
registrados en mm .
37
IMAGEN 25,26 Y 27
Realizada y tomada por Erick Paredes
IMAGEN 28
Realizada y tomada por Erick Paredes
38
8. Procesamiento de datos:
Los datos obtenidos del análisis microbiológico se organizó en una hoja de registro en
Excel(ANEXO12), conos resultados se elaboró una base de datos gracias al cual se estimo la
medida del halo de inhibición con el fin de desarrollar la prueba estadística Kruskall Wallis.
3.1.10 ANALISIS ESTADISTICO.
Con los resultados obtenidos se elaboró una base de datos, gracias a este análisis se obtiene la
media del halo de inhibición, con el fin de desarrollar la prueba estadística Kruskal Wallis con
la prueba de normalidad Shapiro-Wilk
39
4. CAPITULO 4
4.1 RESULTADOS
Prueba de Normalidad
Ho: Las muestras provienen de poblaciones con distribución Normal
Ha: Las muestras NO provienen de poblaciones con distribución Normal
En la prueba de Normalidad de Shapiro-Wilk la mayoría de los valores del nivel de
significación (Sig.) son inferiores a 0,05 (95% de confiabilidad), por tanto se acepta Ha, esto
es las muestras NO provienen de poblaciones con distribución Normal, entonces para la
comparación de grupos se utiliza pruebas no para métricas: Kruskal Wallis.
Streptococcus mutans
Advertencias
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025%, 24 horas, es constante.
AGUA DESTILADA, 24 horas, es constante.
AGUA DESTILADA, 48 horas, es constante.
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Estadístic
o gl Sig.
Estadístic
o gl Sig.
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%, 24
horas 0,231 5 0,200 0,881 5 0,314
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%, 24 horas 0,231 5 0,200 0,881 5 0,314
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%, 24 horas 0,473 5 0,001 0,552 5 0,000
40
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025%, 48
horas 0,473 5 0,001 0,552 5 0,000
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%, 48
horas 0,243 5 0,200 0,894 5 0,377
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%, 48 horas 0,367 5 0,026 0,684 5 0,006
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%, 48 horas 0,367 5 0,026 0,684 5 0,006
Staphylococcus aureus
Advertencias
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025%, 24 horas, es
constante.
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%, 24 horas, es
constante.
AGUA DESTILADA, 24 horas, es constante.
AGUA DESTILADA, 48 horas, es constante.
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Estadístic
o gl Sig.
Estadístic
o gl Sig.
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%,
24 horas 0,231 5 0,200 0,881 5 0,314
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%, 24 horas 0,367 5 0,026 0,684 5 0,006
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025%,
48 horas 0,367 5 0,026 0,684 5 0,006
41
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%,
48 horas 0,254 5 0,200 0,914 5 0,492
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%, 48 horas 0,349 5 0,046 0,771 5 0,046
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%, 48 horas 0,473 5 0,001 0,552 5 0,000
En la prueba de Normalidad de Shapiro-Wilk la mayoría de los valores del nivel de
significación (Sig.) son inferiores a 0,05 (95% de confiabilidad), por tanto se acepta Ha, esto
es las muestras NO provienen de poblaciones con distribución Normal, entonces para la
comparación de grupos se utiliza pruebas no para métricas: Kruskal Wallis.
Streptococcus mutans: Comparación entre sustancias (24 Horas y 48 Horas)
Ho: (hipótesis nula) Las muestras proceden de poblaciones con la misma distribución de
probabilidad (Medias, medianas similares)
Ha: (hipótesis alternativa) Existen diferencias respecto a la tendencia central de las
poblaciones.
Descriptivos
N Media
Desviació
n estándar
Error
estándar
Mínim
o Máximo
Est
repto
cocc
usm
uta
ns2
4H
ora
s ÁCIDO HIPOCLOROSO,
125PPM-0,025% 5 6,000 0,000 0,000 6 6
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05% 5 8,200 0,837 0,374 7 9
HIPOCLORITO DE SODIO
1.85% 5 6,800 0,837 0,374 6 8
42
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
3% 5 7,200 0,447 0,200 7 8
AGUA DESTILADA 5 6,000 0,000 0,000 6 6
Total 25 6,840 0,987 0,197 6 9
Est
repto
cocc
usm
uta
ns4
8H
ora
s
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
125PPM-0,025% 5 6,200 0,447 0,200 6 7
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05% 5 16,200 1,789 0,800 14 18
HIPOCLORITO DE SODIO
1.85% 5 12,600 0,548 0,245 12 13
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
3% 5 6,400 0,548 0,245 6 7
AGUA DESTILADA 5 6,000 0,000 0,000 6 6
Total 25 9,480 4,341 0,868 6 18
43
En la grafica se observa dos comportamientos diferentes a las 24 horas y 48 horas, a las 24
horas existen pequeñas diferencias entre las sustancias, a las 48 horas el ÁCIDO
HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05% aumenta notablemente de valor con una media de 16,2mm,
también crece en valor el HIPOCLORITO DE SODIO 1.85% con una media de 12,6 mm.
Para determinar si estas diferencias son significativas se realiza la prueba No para métrica de
Kruskal Wallis:
6,08,2
6,8 7,26,0 6,2
16,2
12,6
6,4 6,0
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
,1
25P
PM
-0,0
25
%
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
,5
00P
PM
-0,0
5%
HIP
OC
LOR
ITO
DE
SOD
IO1
.85
%
PER
ÓX
IDO
DE
HID
RÓ
GEN
O3
%
AG
UA
DES
TILA
DA
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
,1
25P
PM
-0,0
25
%
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
,5
00P
PM
-0,0
5%
HIP
OC
LOR
ITO
DE
SOD
IO1
.85
%
PER
ÓX
IDO
DE
HID
RÓ
GEN
O3
%
AG
UA
DES
TILA
DA
Estreptococcus mutans 24 Horas Estreptococcus mutans 48 Horas
RELACION DE MEDIAS ENTRE SUSTANCIAS
44
24 HORAS
De la Prueba de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica (prueba
bilateral) = 0,001) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego se acepta Ha, esto es,
existen diferencias respecto a la tendencia central de las poblaciones. No todas las medias de
las muestras son similares.
Para determinar cuáles son similares o diferentes se hace la prueba dos a dos:
45
46
De la prueba dos a dos
Son similares (Sig. mayores a 0,05)
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% es similar a AGUA DESTILADA
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% es similar a HIPOCLORITO DE SODIO
1.85%
AGUA DESTILADA es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85% es similar a PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85% es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-
0,05%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3% es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-
0,05%
No son similares (Sig. menores a 0,05)
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO 3%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a ÁCIDO
HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
AGUA DESTILADA no es similar a PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%
AGUA DESTILADA no es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
47
48 HORAS
De la Prueba de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica (prueba
bilateral) = 0,000) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego se acepta Ha, esto es,
existen diferencias respecto a la tendencia central de las poblaciones. No todas las medias de
las muestras son similares.
Para determinar cuáles son similares o diferentes se hace la prueba dos a dos:
48
49
De la prueba dos a dos
Son similares (Sig. mayores a 0,05)
AGUA DESTILADA es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025%
AGUA DESTILADA es similar a PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% es similar a PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO 3%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3% es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85% es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05%
No son similares (Sig. menores a 0,05)
AGUA DESTILADA no es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
AGUA DESTILADA no es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a HIPOCLORITO DE
SODIO 1.85%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a ÁCIDO
HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%no es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05%
Staphylococcus aureus: Comparación entre sustancias (24 Horas y 48
Horas)
Ho: (hipótesis nula) Las muestras proceden de poblaciones con la misma distribución de
probabilidad (Medias, medianas similares)
Ha: (hipótesis alternativa) Existen diferencias respecto a la tendencia central de las
poblaciones.
Descriptivos
50
N Media
Desviació
n estándar
Error
estándar
Mínim
o Máximo
Sta
phylo
cocc
us
aure
us
24 H
ora
s
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
125PPM-0,025% 5 6,00 0,00 0,00 6 6
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05% 5 8,80 0,84 0,37 8 10
HIPOCLORITO DE SODIO
1.85% 5 7,40 0,55 0,25 7 8
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
3% 5 6,00 0,00 0,00 6 6
AGUA DESTILADA 5 6,00 0,00 0,00 6 6
Total 25 6,84 1,21 0,24 6 10
Sta
phylo
cocc
us
aure
us
48 H
ora
s
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
125PPM-0,025% 5 6,40 0,55 0,25 6 7
ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05% 5 17,60 1,52 0,68 16 20
HIPOCLORITO DE SODIO
1.85% 5 14,40 0,89 0,40 13 15
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
3% 5 6,80 0,45 0,20 6 7
AGUA DESTILADA 5 6,00 0,00 0,00 6 6
Total 25 10,24 4,98 1,00 6 20
51
Similar que en cepa anterior, en la gráfica se observa dos comportamientos diferentes a las 24
horas y 48 horas
A las 24 horas existen pequeñas diferencias entre las sustancias, a las 48 horas el ÁCIDO
HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05% aumenta notablemente de valor con una media de 17,6mm,
también crece en valor el HIPOCLORITO DE SODIO 1.85% con una media de 14,4 mm.
Para determinar si estas diferencias son significativas se realiza la prueba No para métrica de
Kruskal Wallis:
6,0
8,87,4
6,0 6,0 6,4
17,6
14,4
6,8 6,0
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
, 12
5P
PM
-0
,02
5%
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
, 50
0P
PM
-0
,05
%
HIP
OC
LOR
ITO
DE
SOD
IO 1
.85
%
PER
ÓX
IDO
DE
HID
RÓ
GEN
O 3
%
AG
UA
DES
TILA
DA
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
, 12
5P
PM
-0
,02
5%
ÁC
IDO
HIP
OC
LOR
OSO
, 50
0P
PM
-0
,05
%
HIP
OC
LOR
ITO
DE
SOD
IO 1
.85
%
PER
ÓX
IDO
DE
HID
RÓ
GEN
O 3
%
AG
UA
DES
TILA
DA
Staphylococcus aureus 24 Horas Staphylococcus aureus 48 Horas
RELACION DE MEDIAS ENTRE SUSTANCIAS
52
24 HORAS
De la Prueba de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica (prueba
bilateral) = 0,000) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego se acepta Ha, esto es,
existen diferencias respecto a la tendencia central de las poblaciones. No todas las medias de
las muestras son similares.
53
Para determinar cuáles son similares o diferentes se hace la prueba dos a dos:
De la prueba dos a dos
54
Son similares (Sig. mayores a 0,05)
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% es similar a PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO 3%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% es similar agua DESTILADA
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3% es similar a AGUA DESTILADA
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%es similar acido HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
No son similares (Sig. menores a 0,05)
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a HIPOCLORITO DE
SODIO 1.85%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a ÁCIDO
HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%no es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3% no es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05%
AGUA DESTILADA no es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
AGUA DESTILADA no es similar acido HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
55
48 HORAS
De la Prueba de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig. asintótica (prueba
bilateral) = 0,000) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego se acepta Ha, esto es,
existen diferencias respecto a la tendencia central de las poblaciones. No todas las medias de
las muestras son similares.
56
Para determinar cuáles son similares o diferentes se hace la prueba dos a dos:
57
De la prueba dos a dos
Son similares (Sig. mayores a 0,05)
AGUA DESTILADA es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025%
AGUA DESTILADA es similar a PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% es similar a PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO 3%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3% es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
HIPOCLORITO DE SODIO 1.85% es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05%
No son similares (Sig. menores a 0,05)
AGUA DESTILADA no es similar a HIPOCLORITO DE SODIO 1.85%
AGUA DESTILADA no es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a HIPOCLORITO DE
SODIO 1.85%
ÁCIDO HIPOCLOROSO, 125PPM-0,025% no es similar a ÁCIDO
HIPOCLOROSO, 500PPM-0,05%
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3%no es similar a ÁCIDO HIPOCLOROSO,
500PPM-0,05%.
58
5. CAPITULO 5
5.1 Discusión.
De la capacidad de inhibición microbiana de las sustancias antisépticas Acido hipocloroso,
hipoclorito de sodio y peróxido de hidrógeno segúneste estudio in-vitro se concluye que es el
acido hipocloroso el mejor antibacteriano analizado en esta investigación, evaluando las
propiedades del ácido hipocloroso y según estudios realizados por Escobedo(38), Gray(36) y
Calderón(33), este agente podría ser utilizado como sustancia antimicrobiana en cavidad oral
debido a su capacidad inhibitoria superior al hipoclorito de sodio al 1,85% tal cual lo
menciona Calderón(37) en su investigación del ácido hipocloroso concuerda con este estudio
que tiene una capacidad inhibitoria sumamente potencial contra microorganismos.
Calderón(33) explica que durante la Práctica Odontológica tanto en el sector Salud Pública y en
consulta privada, se están utilizando diversos antisépticos., sin embargo a pesar de que existe
información sobre estos, ésta no ha sido clara ni explícita sobre la concentración a la cual
surten el mejor efecto antibacteriano. Por lo que la efectividad de éstos debe ser más estudiada
y de manera periódica ya que hoy por hoy las bacterias se están volviendo tolerantes y/o
resistentes a diversas sustancias químicas a las que antes eran susceptibles.(36). Esta
investigación reciente de sustancias antibacterianas y acorde a los resultados obtenidos en esta
investigación debemos tomar en cuenta que los antibacterianos como Hipoclorito de sodio y
Ácido Hipocloroso son sumamente eficientes contra bacterias comunes en cavidad oral.
Recientemente, se desarrollaron soluciones de HOCl a 250 y 500 ppm a un pH de 5,8 para ser
utilizado en investigación para uso odontológico. Actualmente, se están realizando pruebas
microbiológicas del efecto antiplaca que sustenten su uso en cavidad oral como agente
antimicrobiano y en cicatrización de heridas lo que concuerda con esta investigación que
posee un alto potencial antimicrobiano y gran capacidad de inhibición del Ácido hipocloroso
en concentraciones de 500ppm
59
Sánchez (41)describe que el peróxido de hidrógeno debe alternarse con otro antiséptico para
tener efectos satisfactorios, pero también se menciona que la acción solvente del agua
oxigenada en tejidos orgánicos es mucho menor que el hipoclorito de sodio lo que concuerda
con el presente estudio ya que no se obtuvo ningún resultado antimicrobiano del peróxido de
hidrógeno pero si una gran capacidad de inhibición del hipoclorito de sodio.
Gray(36)enfatiza que el ácido hipocloroso es el componente activo del hipoclorito de sodio sin
sus efectos adversos, de esta manera, se podría considerar como un potente antiplaca para uso
en cavidad oral ya que se ha demostrado un alto efecto antimicrobiano. Podemos decir que el
ácido hipocloroso si tiene una potencial capacidad inhibitoria de microorganismos por tanto
se puede establecer como el mejor antibacteriano analizado en el presente estudio.
60
6. CAPITULO 6
6.1 CONCLUSIONES
El hipoclorito de sodio al 1,85% presenta potente efecto antimicrobiano contra cepas
de Staphylococcus aureus ATCC6538 y Streptococcus mutans ATCC25175 en un
tiempo de 48 horas.
El peróxido de hidrógeno al 3,18 % no presenta un efecto inhibitorio contra cepas de
microorganismos como Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans
El Antiséptico ácido hipocloroso en concentraciones de 125ppm no mostro efecto
inhibitorio contra cepas de microorganismos como Staphylococcus aureus y
Streptococcus mutans.
El antimicrobiano ácido hipocloroso en concentración de 500ppm posee un efecto
potencialmente alto de inhibición contra cepas de microorganismos como
Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans en un tiempo de 48 horas.
Se puede determinar que el antimicrobiano ácido hipocloroso posee la más alta
capacidad inhibitoria ante los microorganismos Staphylococcus aureus y Streptococcus
mutans frente a hipoclorito de sodio y peróxido de hidrógeno.
61
6.2 RECOMENDACIONES.
El ácido hipocloroso pierde su estabilidad con el paso del tiempo, se lo debe utilizar
máximo 3 semanas antes de cualquier estudio en estado puro a 500ppm sin mezclar
con ninguna otra solución.
Cada cultivo, incubación y colocación de discos de inhibición debe ser con normas de
bioseguridad y en un ambiente de esterilidad para no causar cambios en los
microorganismos ni en los resultados.
Al realizar el estudio con microorganismos liofilizados tener en cuenta la fecha de
elaboración y de caducidad de cada uno.
Efectuar mas investigaciones sobre el ácido hipocloroso y sus diferentes usos en Salud.
62
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Palmer R. Oral bacterial biofilms - history in progress. Microbiology 2009 ;155(Pt
7):2113-4 disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2888113/
2. Slots J, Jorgensen MG. Effective, safe, practical and affordable periodontal
antimicrobial therapy: where are we going, and are we there yet? Periodontol 2000.
2002; 28:298-312. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12013347
3. Mariani, Jaimes, &Fernandez-Da Silva,. Efecto bacteriostático del extracto de semillas
de cacao (Theobroma cacao L.) sobre el crecimiento de Streptococcusmutans in
vitro.Rev. D.cientifica. 2010. Diponible en
:http://servicio.bc.uc.edu.ve/odontologia/revista/vol11-n1/art2.pdf
4. Smith,Jacson,2010. The ecology of Staphylococcus species in the oral cavity. Review
article. Journal Medical Microbiology. 2010. VOL.50 (940-946). Disponibleen:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11699589
5. Graciano. Streptococcus mutans y caries dental en América Latina. Revisión
sistemática de la literatura. Revista Nacional de Odontología. 2012. VOL 8 (14).
Disponible en: https://revistas.ucc.edu.co/index.php/od/article/view/282
6. A.Bascones,.AntisepticosOrales.Revision de la literatura y perspectiva actual. Avances
en Periodoncia 2006 vol.18 no.1 Madrid disponible en:
http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1699-65852006000100004
7. Cabrera EC., Gómez FR., Zúñiga AE.: La resistencia de bacterias a antibióticos,
antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y
adaptación. Colombia Médica. 2007. vol. 39, No.2, págs. 149- 158. disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/cm/v38n2/v38n2a07.pdf
8. (E. Sevillano, E. Eraso.2013.OCW:
https://ocw.ehu.eus/pluginfile.php/7493/mod_resource/content/1/Material_de_estudio/
Tema_1._Introduccion_a_la_microbiologia_oral.pdf)
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67
8. ORGANIZACION Y PLANIFICACION DE LA INVESTIGACION
8.1 Presupuesto
RUBRO CONCEPTO VALOR
TRANSPORTE Movilización a distintos lugares de Quito y
a la ciudad de Pasto(Colombia) para la
Obtención de las cepas microbiológicas y
sustancias a utilizar en la investigación.
$50
EDICIÓN, IMPRESIÓN,
REPRODUCCIÓN Y
PUBLICACIONES
Impresión de proyecto de titulación,
edición y análisis estadístico.
$70
INVESTIGACIONES
PROFESIONALES Y
EXÁMENES DE
LABORATORIO
Estudio microbiológico de muestras de
microorganismos y la preparación de las
sustancias a utilizar
$200
MEDICINAS Y
PRODUCTOS
FARMACEÚ- TICOS
Hipoclorito de sodio, peróxido de
hidrogeno y Acido hipocloroso
$20
MAQUINARIAS Y
EQUIPOS
Utilización de laboratorio de microbiología
de la facultad de Odontología UCE
$0
BIENES BIOLOGICOS Cepas de Staphylococcus aureus y
Streptococcus mutans.
$300
TOTAL $840
68
8.2 Cronograma
CRONOGRAMA
HITO/ACTIVIDAD
DESCRIPCION
RESPONSABLE
OC
TU
BR
E
NO
VIE
MB
RE
DIC
IEM
BR
E
EN
ER
O
FE
BR
ER
O
MA
RZ
O
Aprobación del tema Ingreso del tema a
titulación
Sra.Andrea Badillo X
Revision de la
fundamentaciónteórica
Ingreso a comité de
titulación
Comité de Ética. X
Elaboración del
anteproyecto
Realización de
anteproyecto con guías
establecidas
Erick paredes
Dr.Alejandro Farfán
X
Redacción del marco
teórico
Fundamentación en
libros, revistas y
artículoscientíficos
Erick paredes
Dr. Alejandro
Farfán
X
Aplicación y recopilación
de datos investigados
Aplicación del
experimento in vitro
Erick paredes
Dra.Rachide Acosta
X
Presentación y análisis de
resultados
Análisis de resultados
obtenidos del experimento
Estadístico Ing.
Jaime Reinaldo
Molina
X
Informe final,
conclusiones y
recomendaciones
Presentación de informe
final
Erick paredes
Dr. Alejandro Farfán
X
69
9. ANEXOS
ANEXO 1
Solicitud dirigida al Coordinador de Titulación de la Facultad de Odontología de la Universidad Central
del Ecuador
70
ANEXO 2
Solicitud de aceptación de tutoría de tesis dirigida al Dr. Alejandro Farfan
71
ANEXO 3
Solicitud de aceptación del tema de tesis
72
73
ANEXO 4
Declaracion de conflictos de interes
74
ANEXO 5
Declaracion de derecho de autor
75
ANEXO 6
Carta de confidencialidad
76
ANEXO 7
Solicitud dirigida a la decana de la Facultad de Ciencias Químicas para uso de laboratorios
77
ANEXO 8
Certificado de uso de laboratorio y pruebas bacteriológicas en la Facultad de Ciencias Químicas
78
ANEXO 9
Certificado de Uso de materiales utilizados en el laboratorio
79
ANEXO 10
Autorización de uso de instalaciones de deposito de materiales infecciosos
80
ANEXO 11
Certificado de Protocolo de desechos infecciosos utilizados en el trabajo de investigación.
81
ANEXO 12
Resultados obtenidos en la investigación in-vitro.
ANEXO 13
82
Certificado y Factura de compra de cepas bacterianas Streptococcus Mutans(ATCC25175) y
SthaphylococcusAureus(ATCC6538P)
83
ANEXO 14
ABSTRACT-TRADUCCION
84
ANEXO 15
REPOSITORIO DIGITAL
85
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