UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
“FAS-L PROMUEVE MUERTE CELULAR EN CELULAS LINFOIDES VÍA LIBERACIÓN DE ATP Y ACTIVACIÓN DE RECEPTORES
P2X7”.
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica por:
ADAM AGUIRRE DUCLER
Directores de Tesis:
Dr. Andrew Quest
Dr. Mauricio Henríquez
SANTIAGO- CHILE 2011
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato:
ADAM AGUIRRE DUCLER
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Doctor en Bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día 6 de Junio de 2011 Directores de Tesis: Dr. Andrew Quest. ___________________________ Dr. Mauricio Henríquez. ___________________________ Comisión Informante de Tesis: Dr. Jorge Martínez (Presidente). ___________________________ Dr. Juan Carlos Sáez. ___________________________ Dr. Sergio Lavanderos. ___________________________ Dr. Claudio Acuña. ___________________________
A mis hijas, Natalia y Catalina
A mi esposa Irene
A mis padres
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Comunicaciones Celulares. Centro de
Estudios Moleculares de la Célula (CEMC). Facultad de Medicina. Universidad de
Chile. Con el financiamiento de los Proyectos FONDAP 1510006 y FONDECYT
1090071.
Agradecimientos
A mi Director de Tesis, el Dr. Andrew Quest, por darme la oportunidad de realizar
mi Tesis en su laboratorio, por la disposición para aclarar dudas y discutir
experimentos y sobre todo por contribuir en gran medida a mi formación científica
durante estos años.
A mi co-director de tesis, el Dr. Mauricio Henríquez por su buena disposición para
revisar y discutir resultados, a la Dra Lisette Leyton por contribuir en la discusión de
los resultados.
A la comisión revisora integrada por el Dr. Juan Carlos Saéz, Dr. Jorge Martínez, Dr
Sergio Lavanderos y el Dr. Claudio Acuña, por sus críticas y sugerencias que
ayudaron a mejorar mi trabajo.
A todos mis compañeros de laboratorio, especialmente a Carlos, Sergio y Álvaro. Por
la amistad y el compañerismo durante mi estadía en el laboratorio. A Lilian Corona,
por su buena disposición para ayudarme cuando lo necesité.
A mi esposa Irene, por su apoyo y paciencia durante estos años.
Los resultados y conocimientos generados de la presente Tesis dieron origen total o
parcialmente a las siguientes publicaciones y presentaciones a congresos.
Publicaciones:
Aguirre A, Henríquez M, Shoji K, Saez JC, Quest AFG. 2011. “FasL-induced death
of Jurkat cells requires caspase 8- mediated cross-talk between the two receptors Fas
and P2X7”. (En Preparación para Cell Death and Differentiation).
Marcelain K, Armisen R, Aguirre A, Ueki N, Toro J, Colmenares C, Hayman M.
2011. Chromosomal instability in mouse embryonic fibroblasts null for the
transcriptional co-repressor Ski. J Cell Physiol. 2011 Mar 16. doi:
10.1002/jcp.22733.
Presentaciones a congresos nacionales:
Aguirre A, Henríquez M, Leyton L, Quest AFG. Cross-talk between death receptors:
FasL-induced death of Jurkat T cells requires caspase-dependent liberation of ATP
and subsequent engagement of P2X7 receptors. XXIV Reunión Anual de la Sociedad
de Biología Celular de Chile. Pucón, Chile. 01 al 05 de Noviembre de 2010.
i
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL i
ÍNDICE DE FIGURAS iii
ÍNDICE DE TABLAS vii
ABREVIATURAS viii
RESUMEN ix
SUMMARY xi
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1 Receptores de muerte celular 2
1.2 El receptor Fas (CD95) 6
1.3 Apoptosis y ROS 9
1.4 ATP y el receptor P2X7 como mediador de muerte celular 10
1.5 Moduladores farmacológicos de P2X7 14
1.6 Liberación de ATP y panexinas 18
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS 24
2.1 Hipótesis 24
2.2 Objetivo general 24
2.3 Objetivos específicos 25
3. MATERIALES Y MÉTODOS 26
3.0.1 Reactivos 26
3.0.2 Expresión del receptor Fas (CD95) en la superficie celular 27
3.0.3 Extracción de RNA y RT-PCR para P2X7 humano y ratón 27
3.0.4 Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43 28
3.1 Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis
en células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida
por FasL 29
3.1.1 Cultivos celulares 29
3.1.2 Ensayos de muerte celular 29
3.1.3 Medición de ATP extracelular en células tratadas con inhibidores de
caspasas 30
3.1.4 Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) 30
3.2 Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la
salida de ATP mediada por la activación del receptor Fas en células
Jurkat 31
3.2.1 Ensayo de captación de bromuro de etidio 31
3.2.2 Medición de ATP extracelular 32
3.2.3 Ensayos de muerte celular 32
3.2.4 Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43 a distintos tiempos
ii
de estimulación con FasL 32
3.2.5 Microscopía confocal para panexina-1 y receptor Fas 32
3.2.6 Identificación de balsas lipídicas y proteínas asociadas 33
3.3 Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa
apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20 34
3.3.1 Ensayos de muerte celular 34
3.3.2 Determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante
citometría de flujo. 35
3.3.3 Análisis estadístico 35
4. RESULTADOS 37
4.1 Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis
en células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida
por FasL 45
4.2 Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en
la salida de ATP mediada por la activación del receptor Fas en células
Jurkat 57
4.3 Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa
apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20 70
5 DISCUSIÓN 102
6 CONCLUSIONES 119
7 BIBLIOGRAFÍA 121
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca 5
Figura 2. Estructura de las caspasas 8
Figura 3. Niveles de expresión del receptor Fas en la superficie de células
Jurkat, Raji, Ramos, A20 y A20R 40
Figura 4. Expresión del receptor P2X7 en células linfoides analizadas
mediante PCR 42
Figura 5. Detección de panexina-1 y conexina-43 en células linfoides
analizadas mediante análisis de western blot 43
Figura 6. Viabilidad y muerte celular en las células Jurkat y A20
estimuladas con FasL 49
Figura 7. Muerte inducida por FasL en las células Ramos, Raji y A20R 51
Figura 8. Curso temporal de los cambios de viabilidad y muerte celular en
células Jurkat tratadas con FasL 52
Figura 9. Curso temporal de la viabilidad y muerte celular en células A20
tratadas con FasL 53
Figura 10. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por FasL
en células linfoides 54
Figura 11. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por
FasL en células Jurkat. 55
Figura 12. Efecto de los inhibidores de caspasas zVAD, zIETD y zDEVD
en los niveles extracelulares de ATP y viabilidad celular 56
Figura 13. Ensayo de incorporación de bromuro de etidio 61
Figura 14. Carbenoxolona (Cbx), un inhibidor de hemicanales formados por
panexina reduce los niveles de ATP extracelular. 63
Figura 15. Efecto de los inhibidores de panexina (probenecid) y
conexinas (heptanol y lantano) sobre los niveles extracelulares de ATP
iv
y viabilidad celular 64
Figura 16. Detección y colocalización de la panexina-1 y el receptor Fas
a distintos tiempos de estimulación con FasL 65
Figura 17. Detección de panexina-1 en células Jurkat a distintos tiempos
de estimulación con FasL 66
Figura 18. Detección de la conexina-43 en células Jurkat a distintos tiempos
de estimulación con FasL 67
Figura 19. Ensayos de fraccionamiento subcelular de células Jurkat
tratadas con beta-metilciclodestrina ( MCD) 68
Figura 20. Ensayos de muerte celular en presencia de -metilciclodextrina 69
Figura 21. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad
y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 78
Figura 22. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor P2X7
en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 79
Figura 23. Efecto de Miriocina, un inhibidor de la vía de novo de la
producción de ceramidas, en la muerte celular por apoptosis y necrosis 80
Figura 24. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida,
en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat
estimuladas con FasL. 81
Figura 25. Efecto de GW4869, un inhibidor específico de la esfingomielinasa
neutra, en la viabilidad y la muerte celular por apoptosis y necrosis en las
células Jurkat estimuladas con FasL 82
Figura 26. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por
apoptosis y necrosis en células Jurkat estimuladas con FasL 83
Figura 27. Cuantificación de ROS en células Jurkat estimuladas con FasL 84
Figura 28. Efecto de NAD+, un agonista de P2X7, en la viabilidad y muerte
celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 85
Figura 29. Efecto de BzATP, un agonista de P2X7, en la viabilidad y
muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 86
v
Figura 30. Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7,
y FasL en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células
Jurkat 87
Figura 31. Efecto de concentraciones bajas BzATP, un agonista de P2X7,
y FasL en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en
células Jurkat 88
Figura 32. Efecto del inhibidor de P2X7, Cu2+, en la viabilidad y muerte
celular por apoptosis y necrosis 89
Figura 33. Efecto del inhibidor de caspasa 9, z-LEHD, en la viabilidad y muerte
celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 90
Figura 34. Ensayos de muerte celular en linfocitos T CD3+ tratados con FasL 91
Figura 35. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad
y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 92
Figura 36. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor
P2X7 en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en
células A20 93
Figura 37. Efecto de suramina, un inhibidor de receptores P2, en las
células A20 estimuladas con FasL 94
Figura 38. Curso temporal del efecto de suramina en la viabilidad y muerte
celular por apoptosis y necrosis en las células A20 estimuladas con FasL 95
Figura 39. Efecto de los inhibidores de la vía de novo de la producción de
ceramidas en la viabilidad y en la muerte celular por apoptosis y necrosis 96
Figura 40. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida,
en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20
estimuladas con FasL 97
Figura 41. Efecto de GW4869, un inhibidor específico de la esfingomielinasa
neutra, en la muerte celular por apoptosis y necrosis en las células A20
estimuladas con FasL 98
Figura 42. Curso temporal de GW4869, un inhibidor de la esfingomielinasa
neutra en la muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20
vi
estimuladas con FasL 99
Figura 43. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por
apoptosis y necrosis en células A20 estimuladas con FasL 100
Figura 44. Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7 y
FasL en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 101
Figura 45. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las
células Jurkat 117
Figura 46. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las
células A20 118
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Subtipos de receptores P2X 13
Tabla 2. La familia de las panexinas humanas 19
Tabla 3. Análisis de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del receptor
P2X7 de ratón y humano 41
Tabla 4. Resumen de la expresión de Fas, P2X7, panexina-1 y conexina-43 44
viii
ABREVIATURAS
ASM Esfingomielinasa ácida.
BBG Brilliant Blue G.
BzATP 4-benzoilbenzoil-ATP.
Cbx Carbenoxolona.
CARD Dominio de reclutamiento de caspasas.
Caspasa Proteasa cisteína-aspartato.
cFLIP Proteína celular inhibitoria FLICE.
CFTR Regulador de conductancia de transmembrana en
fibrosis quística.
Cx43 Conexina-43.
DD Dominio de muerte.
DED Dominio efector de muerte.
DISCs Complejos de señalización intracelular inductores
de muerte.
FADD Dominio de muerte asociado a el receptor Fas.
FasL Ligando de receptor Fas.
FITC Isotiocianato de Flurosceína.
GSH Glutatión reducido.
IL- Interleuquina (ej. IL-2).
LDH Láctato deshidrogenasa.
LPS Lipopolisacárido bacteriano.
NAC N-acetil cisteína.
oATP oxidado-ATP
PARP Poli ADP ribosa polimerasa.
PBS Phosphate Buffered Saline.
PE Ficoeritrina.
PI Ioduro de propidio.
Pnx Panexina.
ROS Especies reactivas del oxígeno.
TCR Receptor de células T.
TNF Factor de Necrosis Tumoral.
VRAC Canal aniónico regulado por volumen.
XIAP Proteína inhibitoria de la apoptosis ligada a X.
z-DEVD Inhibidor de caspasa-3.
z-IETD Inhibidor de caspasa-8.
z-LEHD Inhibidor de caspasa-9
z-VAD Inhibidor general de caspasas.
ix
RESUMEN
Entre los receptores de muerte celular, se describe al receptor Fas en células
linfoides como un receptor que activa tanto apoptosis como necrosis. Recientemente se
ha asociado la inducción de apoptosis con la salida de ATP vía hemicanales formados
por panexina-1 en linfocitos. Por otra parte, muchas evidencias señalan al ATP
extracelular como mediador de muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis,
identificándose al receptor purinérgico P2X7 como receptor de muerte, el que tiene como
único ligando biológico al ATP. En este contexto, en esta Tesis, se determinó que las
células A20 (derivadas de linfocitos B de ratón) y Jurkat (derivadas de linfocitos T
humanos), pero no Ramos, Raji (derivadas de linfocitos B humanos) y A20R (derivadas
de linfocitos B de ratón) son sensibles a FasL. En células Jurkat el tipo de muerte celular
que predominó fue la apoptosis, en cambio en A20 fue la necrosis. Solo las células
Jurkat liberaron ATP en forma significativa de manera tiempo dependiente en respuesta
a estimulación con FasL y no se obtuvo evidencia de daño en la membrana plasmática.
En estas células la liberación de ATP fue inhibida por zVAD (inhibidor general de
caspasas) y z-IETD (inhibidor de caspasa 8), pero no por zDEVD (inhibidor de caspasa
3). Además, la pre-incubación con inhibidores de hemicanales formados por panexinas
(carbenoxolona y probenecid), pero no de hemicanales formados por conexinas
(heptanol) también inhibió la liberación de ATP en respuesta a FasL. Por otra parte, en
las células Jurkat los inhibidores de los receptores P2X7, oATP y BBG, inhibieron la
muerte celular por apoptosis, en cambio los inhibidores de esfingomielinasas (miriocina,
imipramina y GW4869) no protegieron a estas células al estimularlas con FasL. En
células A20, oATP y el inhibidor de esfingomielinasa neutra (GW4869) mostraron un
efecto protector al inhibir la muerte por necrosis inducida por FasL. Además, se apreció
un efecto protector en la muerte por apoptosis al pre-tratar estas células con suramina.
En ambos tipos celulares el tratamiento con N-acetilcisteína bloqueó la generación de
especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por FasL. Estos resultados representan la
primera evidencia de que se produce una cooperación entre dos receptores de muerte
x
celular, Fas y P2X7, en la ejecución de la muerte celular en células linfoides. Frente al
mismo estímulo en células A20 y Jurkat, el tipo de muerte celular y los mecanismos
involucrados son en parte distintos. En células A20, FasL gatilla muerte celular por
necrosis, que podría involucrar la participación de otros receptores P2X distintos a
P2X7. En cambio, en las células Jurkat la activación del receptor Fas por FasL lleva,
por una parte a la activación de caspasa-8 y posteriormente, a la activación de la
caspasa-3. Por otro lado, la liberación de ATP activada por caspasa-8 sería mediada por
hemicanales formados por panexina-1. Esto a su vez llevaría a la activación del receptor
P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un mecanismo que podría
involucrar la participación de ROS. Esto es un hallazgo importante, ya que en las células
Jurkat, que son células tipo II, además de tBID, liberan ATP vía hemicanales formados
por panexina-1 lo que también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la
apoptosis mediante la activación del receptor P2X7.
xi
SUMMARY
Fas has been described in lymphoid cells as a death receptor capable of inducing
both apoptosis and necrosis. More recently, the induction of lymphocyte apoptosis has
been associated with the release of ATP via pannexin-1. Additionally, ATP is implicated
as a mediator of cell death by both necrosis and apoptosis, via the purinergic receptor
P2X7 whose only know biological ligand is ATP. To date no evidence is available
indicating that FasL-induced cell death requires activation of P2X7 via liberation of
ATP. In this Thesis, we determined that A20 and Jurkat but not Ramos, Raji and A20R
cells were sensitive to FasL. In Jurkat cells death by apoptosis predominated, whereas in
A20 necrosis was more prevalent. Only for Jurkat cells did we observe ATP release in a
time-dependent manner in response to FasL without any evidence of damage to the
plasma membrane as assessed by measuring LDH release. In these cells, ATP release
was inhibited by zVAD (general caspase inhibitor) and z-IETD (inhibitor of caspase 8),
but not zDEVD (inhibitor of caspase 3). Furthermore, pre-incubation with inhibitors of
pannexin (carbenoxolone and probenecid), but not connexin (heptanol), also inhibited
ATP release in response to FasL. Moreover, in Jurkat cells the P2X7 inhibitors oATP
and BBG inhibited cell death by apoptosis, whereas inhibitors of sphingomyelinases
(miriocina, imipramine and GW4869) did not protect these cells. In A20 cells, oATP
and to a lesser extent the neutral sphingomyelinase inhibitor (GW4869) protected
against FasL-induced necrosis. Pre-treating these cells with suramin also reduced death
in both cell types (Jurkat, A20). Also, N-acetylcysteine protected efficiently against
FasL-induced death by blocking the generation of reactive oxygen species (ROS). These
results represent the first evidence indicating that the two death receptors, Fas and P2X7,
collaborate to promote cell death in lymphoid cells. In A20 and Jurkat cells, the type of
cell death and the mechanisms involved were somewhat different.
In A20 cells, FasL triggers cell death mainly by necrosis, which may involve the
participation of P2X receptors other than P2X7.
xii
In contrast, in Jurkat cells the activation of Fas by FasL leads to the activation of
caspase-8 and subsequently caspase-3. Additionally, caspase-8 promotes release of
ATP- through pannexin-1 channels. This in turn is suggested to lead to the activation of
P2X7, which triggers cell death by apoptosis via a mechanism that may involve ROS.
Jurkat cells are type II cells where caspase-8 dependent cleavage of BID to tBID and
activation of the intrinsic mitochondrial branch is required for successful execution of
apoptotic cell death. Thus the relevance of our finding resides in uncovering a new
connection downstream of caspase-8 to the intrinsic pathway involving pannexin-1
mediated ATP release and P2X7 activation.
1
1. INTRODUCCIÓN.
Los tres tipos de muerte celular programada (PCD) descritos son: apoptosis
(PCD I), autofagia (PCD II) y necrosis (PCD III), siendo la autofagia un proceso
descrito más recientemente que se relaciona con el fenómeno de sobrevivencia celular
frente a situaciones de estrés (Mizushima, 2007). Sin embargo, la diferencia entre los
tres tipos de muerte celular no es absoluta y se ha afirmado que existe un espectro de
formas de muerte celular que están interconectadas entre ellas. Los estudios en nuestro
laboratorio se enfocan en el análisis de las conexiones existentes entre dos de estas
formas, la apoptosis y necrosis. La apoptosis se caracteriza por la condensación de la
cromatina, fragmentación del DNA, dependencia de caspasas, exposición de
fosfatidilserina (PS), el “blebbing” (formaciones tipo ampollas en la membrana
plasmática) y la formación de cuerpos apoptóticos. En el otro extremo del espectro se
encuentra la necrosis que es caspasa-independiente, carece de condensación de la
cromatina y exposición de PS antes de la ruptura de la membrana. Por otro lado,
cambios en el volumen celular en las dos vías fundamentales son opuestos, la muerte
celular por apoptosis y en las formas parecidas a la apoptosis se asocian con disminución
del tamaño celular, mientras la necrosis se caracteriza por el hinchamiento de la célula
(Zong y Thompson, 2006).
La apoptosis puede ser ejecutada por dos vías diferentes, la vía extrínseca
(mediada por receptores de muerte) y a la vía intrínseca (endógena). En el primer caso,
la activación es dependiente de ligandos de los receptores de muerte, por ejemplo
CD95/Fas, y ocurre en la superficie de la célula. Por otra parte, la vía intrínseca es
activada en respuesta al daño que ocurre en los compartimientos intracelulares. Se
produce una señal que se transmite a la mitocondria generando cambios en el potencial
eléctrico y la permeabilidad de la membrana mitocondrial que culminan en la liberación
de moléculas al citosol. Como consecuencia se produce el ensamblaje de un complejo
multiproteíco llamado apoptosoma, el cual es necesario para la activación de las
caspasas, que finalmente llevarán a la muerte de la célula por apoptosis. En cuanto a la
2
necrosis, en el pasado fue considerada principalmente como un tipo de muerte
accidental, pero recientemente un gran número de reportes se refieren a la necrosis como
un proceso que la célula puede controlar, siendo por lo tanto un proceso activo. Es así,
como la inhibición de otras vías de muerte celular pueden llevar a la necrosis (Henríquez
et al., 2008).
En condiciones fisiológicas y patológicas las células muestran un alto grado de
flexibilidad en cuanto al tipo de muerte celular que pueden presentar, lo que da cuenta
de la existencia de una variedad de mecanismos, entre los que se incluyen la muerte
celular de tipo apoptótico, la necrosis accidental, la autofagia, o la muerte celular con
características similares a una necrosis. El tipo de muerte celular es importante en el
desencadenamiento de la respuesta inmune, ya que va a determinar el tipo de respuesta
frente a diversos antígenos, es así como la muerte celular por apoptosis participa en la
generación de mecanismos de tolerancia periférica frente, por ejemplo, antígenos
propios por lo cual este es un mecanismo activo que mantiene la homeostasis
inmunológica evitando el desarrollo de respuesta inmune activa a autoantígenos que
podría gatillar finalmente una enfermedad autoinmune. En cambio, la muerte celular por
necrosis, debido a su naturaleza inflamatoria gatilla una respuesta inmune efectora,
principalmente dada para antígenos extraños y que es la base de la repuesta inmune
adaptativa.
1.1. Receptores de muerte celular.
Los receptores de muerte son una familia de proteínas de transmembrana tipo I
caracterizada por la presencia de múltiples repeticiones ricas en cisteína en el dominio
extracelular y el módulo de interacción proteína–proteína conocido como dominio de
muerte (DD) en las colas citoplasmáticas. La función de los receptores de muerte como
sensores de superficie celular es detectar señales de peligro extracelular mediante la
unión a ligandos. Los miembros de la familia de receptores de muerte incluyen al
receptor tipo 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1; también conocido como DR1,
CD120a, p55 y p60), receptor Fas (DR2, APO-1 y CD95), DR3 (APO-3, LARD,
3
TRAMP y WSL1), receptor de TNF1 relacionado con el ligando inductor de apoptosis
(TRAILR1; DR4 y APO-2), TRAILR2 (DR5, KILLER y TRICK2), DR6, receptor de
ectodisplasina A (EDAR) y el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja
afinidad (NGFp75) (Lavrik et al., 2005). Es así como la interacción con sus respectivos
ligandos, conduce a la formación de complejos de señalización intracelular inductores de
muerte (DISCs), que pueden incluir múltiples moléculas adaptadoras. Para receptores
Fas y TRAIL, el dominio de muerte asociado a Fas (FADD) es reclutado por DISC a
través de su DD C-terminal, el que interactúa a través de su dominio efector de muerte
(DED) N- terminal con el dominio efector de muerte de la pro-caspasa-8. El
reclutamiento y oligomerización de pro-caspasa-8 en el DISC resulta en su activación
autocatalítica y es crítico para la iniciación de la muerte celular (Juo et al., 1998). En
ciertos tipos celulares, conocidos como células tipo I, la activación de caspasa-8 por el
DISC puede ser suficiente para inducir la activación de caspasas efectoras río abajo,
como la caspasa-3 y la caspasa-7, y de esta manera completar la ejecución de la
apoptosis (Scaffidi et al., 1998).
En contraste, las células tipo II requieren la liberación de citocromo c
mitocondrial y la activación de la caspasa-9 para inducir apoptosis (Curtin y Cotter,
2003; Li y Yuan, 2008). En esas células la caspasa-8 y la caspasa-3 son principalmente
activadas rio abajo de la mitocondria, y la formación de DISC lleva solo a una limitada
activación de la caspasa-8 (Scaffidi et al., 1998). La caspasa-8 corta la proteína pro-
apoptótica Bid, lo que da origen a un fragmento (Bid truncado-tBid), que en la
mitocondria fomenta la liberación de citocromo c (Li et al., 1998; Luo et al., 1998; Gross
et al., 1999). Entonces, se piensa que la cantidad de caspasa-8 activa generada en el
DISC determina si la apoptosis procede por una vía que es en gran medida
independiente de alteraciones en la mitocondria (extrínseca en células tipo I) o por una
vía que es dependiente de la mitocondria (vía intrínseca en células tipo II) (Scaffidi et
al., 1998). Al evitar el daño mitochondrial en células tipo II se bloquea la activación de
las caspasas rio abajo y por lo tanto se previene la apoptosis (Scaffidi et al., 1998). Las
células tipo I evitan la mitochondria, ya que activan suficiente caspasa-8 en el DISC, por
4
lo que activan a la caspasa-3 en forma independiente de cualquier alteración
mitocondrial (Scaffidi et al., 1998). La definición original de vía intrínseca y extrínseca
de la vía apoptótica está basada en el análisis de la señalización del receptor Fas en
cuatro diferentes líneas celulares, dos tipo I (H9 y SKW6.4) y dos tipo II (Jurkat y CEM)
(Scaffidi et al., 1998). Sólo en las células tipo II, la sobreexpresión de Bcl-2 o Bcl-xL
previene la activación de caspasa-8 y caspasa-3, como también el fenotipo apoptótico
(Scaffidi et al., 1998). En las células Jurkat, que son tipo II, se ha demostrado que la
activación del receptor Fas produce la liberación del citocromo c como resultado de la
inducción de la transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT) (Tafani et al., 2002).
Por otra parte, la apoptosis puede ser bloqueada a distintos niveles por diversos
mecanismos. Es así como la activacion de caspasa 8 por DISC puede ser bloqueada por
c-FLIP. A nivel de mRNA, existen en múltiples variantes de splicing de c-FLIP,
mientras que a nivel de proteínas solo se han descrito 3 isoformas, c-FLIPL (L = Largo),
c-FLIPS (S = corto), y c-FLIPR, (R = Raji) (Krueger et al., 2001; Golks et al., 2005).
Otro grupo de inhibidores de caspasas, corresponde a la proteína inhibitoria de la
apoptosis ligada al cromosoma X (XIAPs) las que bloquean la activación de caspasas
por unión directa a caspasas-3, -7 y -9. Además existen inhibidores de XIAP, como
SMAC, que inhiben la acción de XIAPs y de esta forma promueven la apoptosis. A nivel
mitocondrial, la proporción entre miembros de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos y anti-
apoptóticos definen la muerte o no de las células. La sobreexpresión de miembros anti-
apoptotic de la familia Bcl-2, como Bcl-2 y Bcl-xL bloquean la liberación de citocromo
c desde la mitocondria y, por lo tanto, la formación del apoptosoma y la activación de la
caspasa-9, lo que es requerido para la inducción de la apoptosis (Lavrik, 2010).
La Figura 1 corresponde a un esquema de la vía extrínseca e intrínseca de la
apoptosis, se muestran también en que puntos estas vías pueden ser inhibida ya sea por
cFLIP (proteína celular inhibitoria FLICE) o XIAP (proteína inhibitoria de la apoptosis
ligada al cromosoma X) (Lavrik, 2010).
5
Activadores de la vía
extrínseca: ligandos de muerteLigandos de muerte
Receptores de muerte
Procaspasa-8/10
Caspasa-8/10
Procaspasa-3/6/7
Caspasa-3/6/7
Sustratos de Apoptosis
Apoptosoma
Caspasa-9
Activadores de la vía
intrínseca: radiación,
daño al DNA y otros factores
Apoptosis
Figura 1: Esquema de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca. En la vía
extrínseca, la estimulación con un ligando de muerte (como FasL) sobre su receptor
correspondiente (Fas), conduce a la formación de complejos de señalización intracelular
inductores de muerte (DISCs), donde se lleva a cabo la activación de pro-caspasa-8 y
pro-caspasa-10. El corte de caspasa-8/10 lleva por lo tanto a la activación de las caspasas
efectoras. La activación de procaspasa-8 en el DISC puede ser bloqueado por proteínas
c-FLIP. La activación de las caspasas-3, -7, y -9 en el citosol puede ser bloqueada por
XIAPs. A su vez, la acción XIAP puede ser bloqueada por Smac/DIABLO. La vía
intrínseca se inicia con la liberación del citocromo c de la mitocondria, seguido por la
formación del apoptosoma, activación de caspasa, y corte de los sustratos de caspasas,
que conduce a la destrucción de la célula (Tomado de Lavrik, 2010).
Adicionalmente, en los últimos años, se ha acumulado evidencias que apoyan la
existencia de una vía de muerte celular programada que es independiente de caspasas
(CI-PCD). Esa vía es probable que esté actuando como un sistema de “copia de
seguridad” de muerte celular que asegura la eliminación efectiva de células defectuosas
6
desde el organismo. En forma muy similar a la apoptosis, es decir; muerte celular
programada dependiente de caspasas (CD-PCD), la mitocondria es el principal organelo
que organizan una serie de eventos que son requeridos para la inducción de la CI-PCD.
Además, las proteínas pro-apoptóticas Bax y Bid son participantes claves en la CI-PCD.
Sin embargo, a diferencia de CD-PCD, CI-PCD involucra la participación de ejecutantes
distintos a las caspasas, entre los que se incluyen a las catepsinas, las calpainas y las
serina proteasas. El factor inductor de apoptosis (AIF) puede también jugar un rol
importante en la inducción de CI-PCD (Constantinou et al., 2009). AIF fue descubierto
como la primera proteína que media la muerte celular independiente de caspasas.
Inicialmente se describió como una proteína soluble que reside en el espacio
intermembranoso de la mitocondria, en presencia de un estímulo apoptótico, AIF sufre
proteólisis y transloca al núcleo donde, participar en la fragmentación del DNA y la
condensación de la cromatina en una forma independiente de caspasas. Posteriormente,
se demostró que AIF está anclado por su extremo N-terminal a la membrana interna
mitocondrial desde donde es liberada al citosol. Además de jugar un papel clave en la
ejecución de la muerte celular independiente de caspasas, AIF ha emergido como una
proteína crítica para la sobrevida celular. De hecho, se ha propuesto que la proteína
regula la cadena respiratoria indirectamente a través del ensamblaje y/o estabilización de
los complejos I y III (Norberg et al., 2010).
1.2. El receptor Fas (CD95).
Fas es el miembro mejor caracterizado de la superfamilia de receptores del
factor de necrosis tumoral (TNF). Su principal función y a la vez la mejor entendida es
la inducción de la apoptosis. El receptor Fas se expresa en la superficie de las células
como un homotrímero pre-asociado, que es la estructura también de varios miembros de
superfamilia del receptor de TNF. Esas interacciones son mediadas por un dominio rico
en cisteína en el extremo amino terminal (Kischkel et al, 1995; Peter y Krammer, 2003).
La activación del receptor Fas por el ligando de Fas (FasL) inicia una cascada de
caspasas que culminan en la apoptosis de las células sensibles. Las caspasas son cisteinil
7
aspartato proteinasas (cisteína proteasas que cortan sus sustratos después de un residuo
de Asp), son sintetizadas como zimógenos inactivos que contienen un prodominio, una
región grande, y una región pequeña. La activación de los zimógenos, por corte
proteolítico separa la región grande y pequeña, generando las subunidades p20 y p10,
respectivamente, y remueve el prodominio. Las caspasas reconocen al menos cuatro
aminoácidos contiguos en sus sustratos, P4–P3–P2–P1, y cortan después del residuo C-
terminal (P1), usualmente en un residuo de Asp (Li y Yuan, 2008). La Figura 2
corresponde al esquema de las caspasas donde se muestra su clasificación y estructura
(Lavrik et al., 2005).
Al menos cuatro pasos individuales se han identificado en las células sensibles a
Fas posterior a la activación del receptor de Fas con FasL: (1) Inmediatamente a la
ligación del receptor de Fas con Fas ligando, micro agregados del receptor de Fas se
forman en la superficie celular independiente de la actividad de caspasas. (2)
Posteriormente, ocurre el ensamblaje de DISC en las células tipo I y esto es dependiente
de la reorganización de los filamentos de actina del citoesqueleto. La activación de
caspasa-8 ocurre a continuación de la formación de DISC y regula directamente la
formación de grandes agregados del receptor de Fas en la membrana plasmática de las
células e incrementa la actividad de DISC. (3) El ensamblaje de los componentes del
DISC-Fas es un evento altamente organizado e involucra la agrupación secuencial de
proteínas adaptadoras y efectoras en los agregados del receptor Fas. FADD es reclutado
y se une a los DD intracelulares del receptor Fas en respuesta a la oligomerización del
receptor. (4) Finalmente, esos grandes agregados del receptor de Fas son endocitados y
reciclados. En cambio, en las células tipo II se activa menos caspasa-8 en DISC y la
producción de ceramida es un paso necesario para la generación de grandes agregados
de receptores en los rafts lipídicos (Gloire et al., 2008).
8
Figura 2: Estructura de las caspasas. (A) Existen tres grupos principales de caspasas.
Grupo I: caspasas inflamatorias, grupo II: caspasas iniciadoras de apoptosis; grupo III:
caspasas efectoras de la apoptosis. Se indican el dominio de reclutamiento de caspasas
(CARD), el dominio efector de muerte (DED), la subunidade grande (p20) y pequeña
catalítica (p10). (B) Esquema de la activación de la pro-caspasa. El corte de la pro-
caspasa en las uniones específicas Asp-X conduce a la formación de la caspasa madura,
que comprende los heterotetrámero p202-p102, y la liberación del prodominio. Los
residuos aminoacídicos implicados en la formación del sitio activo se indican con
flechas (Tomado de Lavrik et al., 2005).
9
1.3. Apoptosis y ROS.
La homeostasis de las células T se logra por un equilibrio entre la producción y
proliferación de las células T con la muerte celular por apoptosis. Varios mecanismos
inductores de muerte y señales, como el estrés oxidativo, daño en el DNA, TNF-
alteraciones hormonales (por ejemplo, de los glucocorticoides y), y el aumento en la
expresión de los receptores y ligandos de muerte se han propuesto como implicados en
la apoptosis de linfocitos (Krüger et al., 2009). La activación de células T naive por el
antígeno, en el contexto de las moléculas del complejo mayor de histocompatibildad
(MHC), resulta en la expansión masiva de las células T antígeno-específica y la
producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), siendo las mitocondrias una
importante fuente de ROS. Después de la expansión, la mayoría de las células T mueren
por apoptosis, mientras que un porcentaje bajo de ellos sobreviven y se diferencian en
células T de memoria. Es cada vez más claro que los ROS puede afectar esta decisión
sensibilizando a las células T a la apoptosis. Curiosamente, los ROS afectan tanto la vía
apoptótica intrínseca como la extrínseca, a través de la modulación de la expresión de las
moléculas más importantes de estas vías, Bcl-2 y FasL (Tripathi y Hildeman, 2004).
ROS pueden influir en la apoptosis de los linfocitos en ciertas etapas y en diferentes vías
(Tripathi y Hildeman, 2004) reduciendo el contenido de Bcl-2 celular y directamente
despolarizando la membrana mitocondrial externa (Denning et al., 2002). También se ha
demostrado el entrecruzamiento de ROS con la vía extrínseca de apoptosis por
modulación de la expresión de FasL (Krüger et al., 2009). Altos niveles de ROS
promueven peroxidación lipídica, daño macromolecular y muerte celular por necrosis.
Por otra parte, niveles bajos de ROS promueven cambios en la señalización celular que
conducen a la apoptosis. Así, los niveles intracelulares de ROS pueden dictar el tipo de
muerte que sufrirá la célula, que puede variar entre la necrosis y la apoptosis (Kannan y
Jain, 2000).
Experimentos con N-acetil cisteína (NAC) sugieren la relevancia de la formación
de ROS asociada con la apoptosis de los linfocitos T en tejidos. NAC rápidamente entra
en los linfocitos donde se hidroliza liberando cisteína, el sustrato limitante de la
10
velocidad en la síntesis de glutatión (GSH). El mantenimiento de la concentración de
GSH afecta a la apoptosis inducida por ROS porque GSH es el principal determinante
del potencial redox intracelular (Sen, 1999). Por lo tanto, los antioxidantes pueden
funcionar revirtiendo la disminución en la expresión de Bcl-2 inducida por ROS y de
esta manera evitan la apoptosis. Estos efectos parecen ser consistentes en neuronas
primarias expuestos a los antioxidantes, así como las células T primarias, lo que sugiere
un mecanismo potencialmente conservado (Tripathi y Hildeman, 2004).
En nuestro laboratorio se ha evaluado el efecto protector de NAC en células
Jurkat y A20 tratadas con 100 M de ceramida por 6 h utilizando dihidrorodamina como
indicador de ROS, los que son rápidamente detectados dentro de 30 minutos en
respuesta al tratamiento con ceramida. Este incremento de ROS se reduce
significativamente con los antioxidantes que protegen contra la muerte celular inducida
por la ceramida, como NAC y Tirón, pero no Trolox (Villena et al., 2008).
1.4. ATP y el receptor P2X7 como mediador de muerte celular.
El ATP extracelular (ATPe) es utilizado por las células para la comunicación
célula-célula, como se ha demostrado, por ejemplo, en el sistema inmune donde es
liberado por las células T y juega un papel clave en la señalización del receptor de
células T (TCR) (Schenk et al., 2008). Además, otros estudios demuestran que el ATP
liberado por bacterias comensales dirige la diferenciación de linfocitos T intestinales
hacia un fenotipo conocido como T helper 17 (Th17) (Atarashi et al., 2008).
La concentración intracelulare de ATP en las células en reposo varía entre 3 a 10 mM,
mientras que el ATPe es ~10 nM, que es mantenidó como resultado de la actividad de
ecto-apirasas y ectoadenosina trifosfatasas (ecto-ATPasas), las cuales metabolizan el
ATP en ADP, AMP, y adenosina (Trautmann, 2009). En el caso de la muerte celular, el
ATP sería el mediador tanto de necrosis como apoptosis, identificándose como receptor
de muerte al receptor purinérgico P2X7, cuyo único ligando biológico es ATP (North,
2002).
11
El receptor P2X7 pertenece a una familia de los cuales se han clonado y
caracterizado siete diferentes receptores (P2X1–7). Estos receptores inotrópicos son
estructuralmente relacionados con la familia de ENaC/degenerinas, que son una familia
de genes que codifican para canales de sodio involucrados en varias funciones celulares
en metazoos, incluyendo la necrosis programada (Driscoll y Gerstbrein, 2003).
Predicciones estructurales revelan que contienen dos regiones de transmembrana,
presentan el extremo amino y carboxilo en el lado intracelular de la membrana; poseen
un gran asa extracelular (que comprende cerca de dos tercios de la masa molecular) que
contiene 10 cisteínas conservadas, que son responsables de la formación de los puentes
disúlfuros, sitios putativos de glicosilación y un motivo de unión a ATP. Después de la
unión del agonista, estos receptores oligomerizan formando un canal catiónico no
selectivo. Este canal es permeable a cationes monovalentes como K+, Na
+ o H
+, como
también a cationes divalentes como Ca2+
. El proceso de oligomerización es pobremente
entendido, pero se cree que participarían tres subunidades que forman un canal
funcional. Se pueden formar homo-oligómeros o hetero-oligómeros y, en el último caso,
sólo algunas combinaciones son posibles. Los receptores P2X comparten un 30–50% de
identidad en su secuencia de aminoácidos y el receptor P2X7 es el menos relacionado
con el resto de los receptores (Chow et al., 1997; Virginio et al., 1999). De hecho, el
receptor P2X7, debido a sus propiedades únicas, fue originalmente descrito como subtipo
(P2Z) independiente del resto de los receptores purinérgicos. P2Z se identificó
inicialmente como un receptor expresado en células del sistema immune con la
capacidad de formar un poro permeable a moléculas relativamente grandes (mayores a ∼
900 Da) que media la muerte celular por apoptosis y/o necrosis (Di Virgilio et al., 1998).
Este receptor tiene baja afinidad para ATP y no se desensibiliza rápidamente, lo que no
se relaciona con las características de los receptores de la familia P2X. Entre los
agonistas sintéticos, se describe el análogo de ATP 2´,3´-O-(4-benzoyl-benzoyl) ATP
(BzATP) que es considerablemente más potente que el ATP mismo sobre el receptor
P2X7 (Young et al., 2007), y entre los bloqueadores, se encuentra el ATP oxidado
(oATP) y KN-62 (North, 2002).
12
Sin embargo, el clonamiento posterior de este receptor llevó a su inclusión en la
familia P2X y se le denominó como el receptor P2X7. El receptor P2X7 se expresa en
células hematopoiéticas como los eritrocitos, macrófagos, linfocitos, neutrófilos o
timocitos, pero también es abundante en otros tejidos o tipos celulares, como las
neuronas, fibroblastos, músculo liso, endotelio y células epiteliales (Tabla 1). Como se
mencionó anteriormente, los receptores P2X7 tienen bajo grado de homología estructural
entre los receptores P2X y es muy poco probable que formen heterómeros con otras
subunidades P2X. Este receptor tiene un extremo -COOH considerablemente más grande
que otros miembros de la familia P2X. Esta característica estructural está relacionada
estrechamente con su capacidad de formar un poro e inducir la muerte celular: los
receptores P2X7 expresados heterologamente y que carecen del gran extremo -COOH
retienen la función de canal pero no forman el poro ni gatillan la apoptosis y/o necrosis o
el “blebbing” de membrana (Garcia-Marcos et al, 2006).
13
Subtipo de Ligando Fisiológico Distribución en células
receptor P2 inmunes
P2X1 ATP (EC50: 0.05–1 μM) neutrófilos, monocitos,
macrófagos, células
dendríticas,
linfocitos T, células NK.
P2X2 ATP (EC50: 1–30 μM)
P2X3 ATP (EC50: 0.3–1 μM)
P2X4 ATP (EC50: 1–10 μM) neutrófilos, monocitos
macrófagos, células
dendríticas,
linfocitos T, células NK.
P2X5 ATP (EC50: 1–10 μM) neutrófilos, monocitos
macrófagos, células
dendríticas,
linfocitos T.
P2X6 ATP (EC50: 1–12 μM)
P2X7 ATP (EC50: 100–780 μM) neutrófilos, monocitos
macrófagos, células
dendríticas,
linfocitos T, linfocitos B,
células NK.
Tabla 1. Subtipos de receptores P2X. Se indica la afinidad estimada para sus ligandos
fisiológicos y su distribución en células del sistema immune (Modificado de Bours et
al., 2006).
Se ha identificado, en la membrana plasmática de glándula submandibular de
rata, la existencia de dos poblaciones de receptores purinérgicos P2X7. Una población
que migra en gradientes de sacarosa junto con dominios de membrana ricos en colesterol
denominados balsas lipídicas (“rafts”); la segunda población migra con la mayoría de las
proteínas de las fracciones más densas, además esta distribución de los receptores P2X7
se afecta claramente por la ruptura de los “rafts” con -metilciclodextrina ( MCD), que
remueve el colesterol de la membrana. Esto es consistente con los reportes de otros
14
autores, que sugieren que los receptores P2X7 se distribuyen entre los dominios “raft” y
no “raft” de la membrana plasmática. En relación a ésto, al estimular los receptores
P2X7 con ATP, se observa un incremento en el contenido celular de ceramida, pero solo
ocurre en las fracciones “raft”, y no en las fracciones no “raft”. De hecho, el ATP
incrementa selectivamente la actividad de la esfingomielinasa neutra (N-SMasa), una
enzima localizada en “rafts” (Veldman et al., 2001). Por lo tanto, en la glándula salival
de rata, los receptores presentes en los microdominios no “raft” estarían involucrados en
la formación de un canal catiónico no selectivo que es independiente de la hidrólisis de
esfingomielina y la activación de fosfolipasa A2 (PLA2). Los receptores presentes en
“rafts” regulan la actividad de N-SMasa, iniciando una cascada que lleva a la activación
de PLA2 (Garcia-Marcos et al., 2006).
Dependiendo del tipo celular, la activación del receptor P2X7 media procesos
biológicos como la liberación de citoquinas y la muerte de bacterias patogénas. También
se ha propuesto que el receptor P2X7 juega un rol relevante en la muerte celular gatillada
por ATP, ya sea por necrosis y/o apoptosis en varios tipos celulares, incluyendo células
mieloides, células dendríticas, timocitos, y macrófagos. La estimulación de los
receptores P2X7 por ATP extracelular desencadena varios eventos de señalización
intracelular, entre los cuales se encuentra la activación de proteínas kinasas activadas por
estrés, kinasas reguladas extracelularmente 1/2 (ERK 1,2), caspasas y fosfolipasa D. Sin
embargo, las vías de señalización que llevan a la muerte celular necrótica inducida por
ATP no son del todo entendidas (Raymond y Le Stunff, 2006).
1.5. Moduladores fisiológicos y farmacológicos del receptor P2X7.
Los receptores P2X7 son distintos de otros receptores P2X, ya que son
potentemente inhibidos por concentraciones micromolares de Zn2+
y Cu2+
. Las bases
moleculares de esta inhibición no son claras, y se ha propuesto que ocurre una
interacción directa con Zn2+
y Cu2+
en algunos residuos de ectodominio del receptor
P2X7 (Virginio et al., 1999). Se describen catorce posibles residuos de interacción en
todos los receptores P2X7 de mamíferos, ninguno de los cuales es homólogo a los sitios
15
previamente identificados en otros receptores P2X. Las sustituciones de alanina en His62
o Asp197
disminuyen el efecto inhibitorio de Zn2+
y Cu2+
y el doble mutante
[H62A/D197A] es prácticamente insensible al efecto inhibitorio del Zn2+
y Cu2+
. Por lo
tanto, esta se debe a una interacción directa de estos cationes divalentes con los residuos
del ectodominio del receptor P2X7 (Acuña-Castillo, 2007; Liu et al., 2008).
La inhibición de los receptores P2X7 por Zn2+
y Cu2+
tiene una importancia
fisiológica significativa. Por ejemplo, los receptores P2X7 se expresan en los astrocitos y
células gliales de cerebro en el que son cada vez más conocidos en participar en
procesos de señalización, tales como la liberación de neurotransmisores (Duan y Neary,
2006). Las concentraciones locales de Zn2+
y Cu2+
que se libera desde las terminaciones
nerviosas se encuentran en el rango de 10 a 100 M (Kardos et al, 1989; Li et al., 2001)
y pueden llegar a los astrocitos y células gliales, localizados en las cercanías y por lo
tanto pueden inhibir los receptores P2X7. Los receptores P2X7 se expresan también en
las células inmunes y son importantes para la fisiología y la patología de estas células.
En condiciones de infección y/o inflamación, el Cu2+
se encuentra en concentraciones
micromolares y es esencial para la proliferación de células T y para que neutrófilos
generen superóxido para poder eliminar los microorganismos ingeridos (Percival, 1998).
En resumen, existen pruebas directas que demuestran que el efecto inhibitorio de
Zn2+
y Cu2+
se debe a una interacción directa con los residuos en el ectodominio del
receptor P2X7, principalmente relativa a la interacción combinada con His62
y Asp197
, y
que este mecanismo de regulación podría ser fisiológicamente relevante.
Por otra parte, el control eficaz de la población y la función de las células Treg,
es necesario para garantizar un equilibrio entre la tolerancia y la respuesta inmune.
Nucleótidos extracelulares pueden desempeñar un papel central en este proceso. En
particular, el ATP y la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) liberado por lisis
celular o bien por mecanismos no líticos (Bruzzone et al., 2001; Contreras et al., 2002)
pueden activar los receptores P2X7 e inducir la muerte de las células T (Seman et al.,
2003; Scheuplein et al., 2009). La mono-ADP-ribosiltransferasa (ART) ART2.2 cataliza
la transferencia covalente del grupo ADP-ribosa del NAD+ a los residuos de arginina
125
16
de P2X7 y otras proteínas de superficie en las células T (Seman et al., 2003; Adriouch et
al., 2005).
En consecuencia, el NAD+ liberado durante la inflamación participa en la
regulación de la homeostasis de las células T in vivo a través de un mecanismo
dependiente de ART2.2 y mediado por el receptor P2X7 en un proceso que ahora se
conoce como muerte celular inducida por NAD+ (NICD) (Seman et al., 2003; Adriouch
et al., 2005). NICD es controlada en parte por la NAD-CD38 glicohidrolasa, lo que
limita la disponibilidad de sustrato para ART2.2 debido a la hidrólisis extracelular de
NAD+ (Krebs et al., 2005). Se ha demostrado que el NAD
+ endógeno controla el pool de
células T Foxp3+ por un proceso dependiente de ART2/P2X7 ya que el NAD
+ liberado
durante la preparación de linfocitos primarios afecta profundamente el fenotipo y
función de las células Treg. Además, esto sugiere que es posible manipular las células
Treg in vivo a través de la vía ART2- P2X7: es así como el anticuerpo ART2.2, que
bloquea el dominio único (SDAB), se puede utilizar para proteger a las células Treg de
la muerte celular inducida por NAD+, mientras que por el contrario, el NAD
+ se puede
utilizar para disminuir la función de las células Treg y promover respuestas
antitumorales (Hubert et al., 2010)
En cuanto a los inhibidores farmacológicos, la breve activación con agonistas
(<10 s) de receptores P2X7 resulta en la apertura rápida y reversible del canal que es
permeable a Na+, K
+ y Ca
2+. La activación aguda de P2X7 también gatilla una serie de
respuestas celulares, como la activación de caspasas, liberación de citoquinas,
proliferación celular y apoptosis (North, 2002; Kahlenberg y Dubyak; 2004). A
diferencia de otros miembros de superfamilia de receptores P2, los receptores P2X7
homoméricos son activados por altas concentraciones de ATP and 2´,3´-O-(4-
benzoilbenzoil)-ATP (BzATP), el cual tiene significativamente más potencia (EC50=20
M) que ATP (EC50>100 M) (Jacobson et al., 2002). Aunque BzATP es el más potente
agonista del receptor P2X7, no es un agonista selectivo para este receptor. BzATP es
100–1000 veces más potente como agonista para P2X1 y P2X3 que para P2X7 (Bianchi
et al., 1999).
17
Dentro de los antagonistas no selectivos de los receptores P2X se encuentra la
suramina y el piridoxalfosfato-6-azofeni-2´,4´-disulfonato (PPADS), ambos bloquean
receptores P2X7 con baja afinidad y muestran típicamente un antagonismo no
competitivo (Jacobson et al., 2002). Por otra parte, ATP 2´,3´-dialdehido (oxidized-ATP,
oATP) es un inhibidor irreversible de receptores P2X7 que requiere entre 1 a 2 h de
incubación para inhibir activación funcional de receptores P2X7 (Di Virgilio, 2003), sin
embargo, es importante destacar que oATP tiene muchas otras acciones farmacológicas
que incluyen el bloqueo de P2X1 y P2X2 como también la inhibición del factor nuclear
B (NF- B) y la liberación de citoquinas (Ferrari et al., 2006).
Otro inhibidor de los receptores P2X7 es Brilliant Blue G (BBG), el cual es un
potente y selectivo antagonista. Su selectividad es 30 a 50 veces más por el receptor
P2X7 de rata que de humano (Jiang et al., 2000). La baja toxicidad y la alta selectividad
hacen de este compuesto sea un candidato ideal para bloquear los efectos adversos de la
activación de los receptores P2X7 en las regiones peritraumáticas después de daño
espinal agudo (Peng et al., 2009). La perspectiva de la administración de una droga
neuroprotectiva que no tiene efectos adversos conocidos es particularmente atractiva en
la terapia de daño agudo por trauma, considerando que no hay tratamientos efectivos
para el daño medular agudo, además del uso de esteroides. En el modelo de rata de daño
espinal agudo, el tratamiento temprano con BBG significativamente mejora la
recuperación funcional y reduce la respuesta inflamatoria post-traumática y la pérdida de
tejido. La administración endovenosa (EV) de BBG significativamente reduce la
severidad del daño de la médula espinal sin evidencia de toxicidad, es importante
remarcar que BBG deriva de un aditivo ampliamente utilizado en comidas y presenta
ventajas con respecto a oATP, además de ser más específico atraviesa la barrera
hematoencefálica (Peng et al., 2009).
Entre los mecanismos de modulación de la inflamación e inmunidad in vivo está
la expresión de CD39 en diversos tipos celulares. CD39 es una ecto-nucleotidasa con
actividad ADPasa y ATPasa, que se encuentra en la superficie de células endoteliales,
linfocitos normales, células de Langerhans, entre otros tipos celulares (Marcus et al.,
18
2003). CD39 se expresa en linfocitos B periféricos y débilmente en linfocitos B de la
zona marginal, pero no en linfocitos B de los centros germinales (Ingvarsson et al.,
1999). Su principal función en la superficie de las células endoteliales es disminuir la
activación de plaquetas y el reclutamiento celular. En leucocitos, la enzima tiene una
variedad de otros efectos, incluyendo la modulación de expresión de citoquinas y la
respuesta inflamatoria como también la adhesión célula-célula (Langston et al., 2003).
CD39 rápidamente metaboliza el ADP producido por el metabolismo de ATP. La
enzima es usualmente más eficiente en metabolizar ADP que ATP (Gayle et al., 1998).
1.6. Liberación de ATP y panexinas.
Los mecanismos descritos de liberación de ATP al espacio extracelular son
variados. Entre ellos, diferentes canales han sido implicados en este proceso, incluyendo
CFTR (regulador de conductancia de transmembrana en fibrosis quística), hemicanales
formados por conexina-43 (Cx43), un canal aniónico regulado por volumen (VRAC) y
el receptor purinérgico P2X7. Recientemente se ha documentado, en base a sus
propiedades biofísicas y su patrón de expresión, la participación de las panexinas en este
proceso (Maroto y Hamill, 2001; Bal-Price et al., 2002; Parpura et al., 2004). Las
panexinas (panx) son una familia de glicoproteínas compuestas por tres miembros
(panx1, panx2, panx3) que tienen baja homología en secuencia pero estructuralmente
son muy similares con una familia de glicoproteínas de invertebrados, las inexinas, las
cuales forman uniones en hendidura (“gap junctions”) en tejidos de invertebrados
(Locovei et al., 2006a; Scemes et al., 2009) (Tabla 2). La panexina-1 se expresa en la
mayoría de las células y tejidos examinados, en cambio la panexina-2 se expresa solo en
cerebro y panexina-3 se expresa en forma predominante en piel y tejido conectivo
(Pelegrin y Surprenant, 2006).
19
Gen Panexina peso molecular (kDa) Cromosoma
de la glicoproteína
PNX1 Pnx1 48 11q21
PNX2 Pnx2 73 22q13
PNX3 Pnx3 45 11q24
Tabla 2. La familia de las panexinas humanas (Modificado de Scemes et al., 2009).
El patrón de expresión de la panexina-1 en la mayoría de los tejidos y tipos
celulares sugiere que los hemicanales formados por panexina-1 pueden corresponder a
una de las vías más ampliamente usadas para la salida de ATP en respuesta a
señalización paracrina y autocrina (Dubyak, 2009). Varios estímulos intra y
extracelulares inducen la liberación de ATP. Sin embargo, el estrés mecánico es un
estímulo primario para la liberación de ATP en muchos tipos celulares, incluyendo a los
eritrocitos y células epiteliales alveolares (Shestopalova y Panchinc, 2008). Un
mecanismo eficiente de liberación debe involucrar un canal que sea mecano sensible y
permeable a ATP y los hemicanales formados por panexina-1 cumplen con esas
especificaciones. También se ha demostrado que panexina-1 forma un complejo con el
receptor purinérgico P2X7 (Pelegrin y Surprenant, 2006). Además, la salida de ATP en
eritrocitos puede ser inhibida por carbenoxolona (un inhibidor de panexinas
ampliamente utilizado). Además carbenoxolona inhibe el ingreso de moléculas
fluorescentes trazadoras de permeabilidad, como la carboxifluoresceina, se da bajo
condiciones de liberación de ATP. Otro inhibidor conocido de hemicanales formados
por la panexina-1 es el probenecid, un compuesto usado por mucho tiempo para el
tratamiento de la gota y que se piensa que actúa inhibiendo transportadores aniónicos de
la membrana plasmática, se ha demostrado recientemente que bloquea hemicanales
formados por panexina-1 sin inhibir a los hemicanales formados por conexinas
(Silverman et al., 2008). Por el contrario, los hemicanales formados por panexina-1 son
insensibles a variaciones en las concentraciones de Ca2+
extracelular (Bruzzone et al.
20
2005; Pelegrin y Surprenant, 2006) y son relativamentes insensibles a La3+
, heptanol y
ácido flufenámico (Bruzzone et al., 2005; Pelegrin y Suprenant, 2006).
Se ha descrito la participación de los hemicanales formados por panexinas en la
liberación de ATP en linfocitos activados. Esta liberación de ATP es a través de
hemicanales formados por panexina-1, que actuaría como una señal coestimuladora
autocrina esencial a través de receptores purinérgicos P2X. Por PCR tiempo real e
inmunohistoquímica se ha descrito que las células Jurkat y los linfocitos T CD4+
humanos expresan receptores P2X7 y su estimulación en células T (TCR) gatilla la
liberación rápida de ATP (<100 M). Esta liberación de ATP se requiere para la entrada
de Ca2+
, activación de NFAT y producción de IL-2 (Yip et al., 2009). La inhibición de
esta vía de señalización in vitro resulta en disminución en la secreción de interleukina-2
(IL-2) y también en disminución de la proliferación de los linfocitos, lo que lleva a
anergia. Debido a que los hemicanales formados por panexina-1 se asocian directamente
con el receptor P2X7, se ha planteado que la liberación de ATP a través de esta vía
puede alcanzar una concentración suficientemente alta en la proximidad del receptor
P2X7, para inducir su activación (Schenk et al, 2008). En relación a ésto, estudios
previos demuestran que la estimulación prolongada del receptor P2X7 con altas
concentraciones de ATP induce apoptosis (Tsukimoto et al., 2006; Yoon et al., 2007),
estimulaciones transitorias de células T con bajas concentraciones de ATP, como las
secretadas en forma autocrina o paracrina, pueden estimular la proliferación de células T
(Adinolfi et al., 2002). En contraste, la apoptosis inducida por activación del receptor
P2X7 en células T CD4+ y CD8+ ocurre solo cuando el ATP extracelular excede los 100
M (Aswad y Dennert, 2006).
Otro mecanismo identificado en linfocitos que está involucrado en la liberación
de ATP corresponde al dependiente de vesículas. Para estudiar dicho fenómeno, se
analizó el efecto de brefeldina A y bafilomicina, encontrándose que la liberación de ATP
durante la activación de linfocitos murinos fue significativamente disminuida por
bafilomycina A y brefeldina A. El tratamiento con esos inhibidores también bloquea la
liberación de ATP en células Jurkat, como también en las células murinas, sugiriendo
21
que la exocitosis vesicular está involucrada en la liberación de ATP tanto en células T
murinas y en células T de linfoma humano (Tokunaga et al., 2010).
Además, en linfocitos la liberación de ATP sería dependiente de la actividad de
caspasas, es así como se ha descrito que la remoción por fagocitosis de células
apoptóticas ocurre eficientemente in vivo en tejidos en los cuales se presenta apoptosis
significativa, como es el caso del timo, pero que a pesar de ésto muy pocas células
apoptóticas son detectadas. Esto se pensó que se debería a la liberación de señales por
parte de las células apoptóticas y que reclutarían células fagocíticas tales como
monocitos, macrófagos y células dendríticas, que removerían rápidamente las células
muertas. Recientemente se han identificado nucleótidos extracelulares como señales
críticas de identificación de células apoptóticas, demostrándose la liberación de ATP y
UTP dependiente de caspasas durante las etapas tempranas de la apoptosis en timocitos
primarios y líneas celulares, como es el caso de células Jurkat en las cuales se induce
apoptosis mediante el receptor Fas y radiación ultravioleta. Además, no se producen
aumentos en la permeabilidad de la membrana plasmática o salida de marcadores
citoplasmáticos cuando se recuperan los sobrenadantes. Por otra parte, sobrenadantes de
células pre-tratadas con el inhibitor general de caspasas zVAD antes de la inducción de
apoptosis no inducen la migración de monocitos, lo que sugiere que la liberación de
quemoatractantes es un proceso regulado y dependiente de caspasas. En un estudio del
curso temporal, la liberación de factores quemoatractantes se correlaciona con el inicio y
la progresión de la apoptosis, evaluado por la unión de anexina-V a la fosfatidilserina
expuesta al exterior en las células apoptóticas, y la actividad caspasa-3/7 (Elliot et al.,
2009).
En nuestro laboratorio se ha demostrando que linfocitos neoplásicos estimulados
con ligando de Fas, también mueren por necrosis lo que involucra la activación de
caspasa-8, sin mediar activación de caspasas efectoras como caspasa-3, asociando a las
ceramidas como mediadoras del proceso. En células Jurkat y A20 (linfocitos B
derivados de linfoma B de ratón) Fas induce muerte celular por apoptosis y necrosis
dependiente de caspasa-8 con externalización de fosfatidilserina y producción retardada
22
de ceramida, respectivamente (Hetz et al., 2002). Sin embargo, las células Raji
(linfocitos B derivados de linfoma B de humanos) carecen de la actividad escramblasa
para lípidos en la membrana plasmática. Por lo tanto, los niveles de ceramida no se
incrementan en respuesta a la activación por Fas y como consecuencia no habría
disponibilidad de sustrato para la producción de ceramidas por las esfingomielinasas
neutras (Tepper et al., 2000). Las células Raji, a diferencia de las células A20 y Jurkat
no presentan necrosis inducida por Fas, lo cual apoya el concepto que la producción
tardía de ceramidas sería la responsable de la necrosis. Consistente con esta
interpretación, el tratamiento con ceramidas permeables y esfingomielinasas bacterianas
gatilla la necrosis en las células Raji (Hetz el al., 2002). Además, se ha identificado a la
mitocondria como uno de los principales blancos de las ceramidas permeables, las que
promueven disfunción mitocondrial, formación de ROS, y muerte celular por necrosis.
Que las ceramidas induzcan muerte celular por apoptosis, vías no apoptóticas o ambas
está determinado por factores complejos, incluyendo el tipo celular y el medio ambiente
que rodea a la célula. Por lo tanto, la depleción de ATP, que sigue a la producción
mitocondrial de ROS inducida por ceramida es la principal causa que induce necrosis
mediada por ceramida en células linfoides. Entonces, mientras la formación de ceramida
se ha asociado frecuentemente con apoptosis, es posible que la producción regulada de
ceramida en o cerca de la mitocondria represente a un mecanismo fisiológico relevante
que promueve la ejecución de formas alternativas de muerte celular, como la necrosis
(Villena et al., 2008).
Basándonos en la discusión bibliográfica presentada y los resultados previos
publicados por nuestro laboratorio, en los que se demuestra que en los linfocitos
neoplásicos estimulados con ligando de Fas se induce muerte celular programada, por
necrosis o por apoptosis; postulamos que esta última forma de muerte celular ocurre en
forma dependiente de la salida de ATP, que sería dependiente de caspasa-8 y que podría
involucrar a hemicanales formados por panexinas, y como consecuencia de esto se
produciría la liberación de ATP, lo que llevaría a la activación del receptor P2X7 y
posteriormente la activación de caspasa-9, que finalmente llevar a la muerte celular por
23
apoptosis. En conjunto, los antecedentes sugieren que existiría una interacción entre los
dos receptores de muerte descritos, Fas y receptores P2X7, lo cual constituye una
descripción novedosa de un mecanismo que lleva a la muerte en células tipo II.
24
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS.
2.1. Hipótesis.
“La activación de caspasa-8 por FasL induce liberación de ATP vía hemicanales
formados por panexinas, lo que activa al receptor P2X7 promoviendo la muerte celular
en linfocitos neoplásicos humanos”.
2.2. Objetivo General.
Caracterizar la relación de receptores P2X7 con el tipo de muerte celular inducida por el
ligando de Fas en linfocitos T (Jurkat) y B neoplásicos (A20).
25
2.3. Objetivos Específicos.
2.3.1. Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis en células
Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida por FasL.
2.3.2. Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la salida de
ATP mediada por la activación del receptor Fas en células Jurkat.
2.3.3. Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa apoptótico
en las células Jurkat o necrótico en las células A20.
26
3. MATERIALES Y METODOS.
3.0.1. Reactivos.
Los anticuerpos policlonales de conejo anti- -actina (A5060) se obtuvieron de
R&D System (Minneapolis, USA), el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fas humano
(11-0959-71) marcado con FITC de eBioscience (San Diego, CA, USA), el anticuerpo
monoclonal de hamster anti-Fas de ratón (554257) marcado con FITC de BD
Pharmingen (USA). El kit de quimioluminiscencia EZ-ECL (20-500-120) se obtuvo de
Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel). El reactivo Trizol (15596-026) se
obtuvo de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Los antibióticos
penicilina/streptomicina (15140) y los medios de cultivo RPMI 1640 (31800-022) y
DMEM High (12800-017) se obtuvieron de Gibco-BRL (Paisley, Scotland, UK). El
suero feral bovino (04-001-1A) era de Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek,
Israel). El FasL recombinante humano (522-020-C005) se obtuvo de Apotech SA
(Geneva, Switzerland). Los inhibidores de caspasa-3 zDEVD (FMK004), caspasa-8
zIETD (FMK007), caspasa-9 z-LEHD (FMK008) y general de caspasas zVAD
(FMK001) se obtuvieron de R&D System (Minneapolis, USA).
Respecto a los inhibidores, N-acetil-L-cisteína (112422) se obtuvo de Merck, el
inhibidor de la esfingomielinasa neutra GW4869 (567715) de Calbiochem, Ebselen
(A4744) de AppliChem (Germany). Carbenoxolona (C4790), probenecid (P8761), La3+
(694908), heptanol (72954), suramina (S2671), y los inhibidores de esfingomielinasas
imipramina (I-7379), fumonisina B1 (F1147) y miriocina (M1177) de Sigma (Saint
Louis, Missouri, USA). Brillant Blue G (AB00325) de American Bioanalytical (Natick,
MA, USA). El CuCl2 (C6641), NAD+ (N7004) y Bz-ATP (B6396) de Sigma (Saint
Louis, Missouri, USA). Los kits Cell Titer Glo (G5421) y CytoTox-ONE (G7890) se
obtuvieron de Promega (Woods Hollow Road, Madison, USA).
Considerando que hay diferencias en la expresión de estos receptores en las distintas
líneas celulares y que explicarían diferencias también en la sensibilidad a FasL. Previo al
27
desarrollo de los Objetivos Específicos, las distintas líneas celulares (Jurkat, Ramos,
Raji, A20 y A20R) fueron caracterizadas en cuanto a la expresión de los receptores Fas,
además del receptor P2X7, panexina 1 y conexina-43.
3.0.2. Expresión del receptor Fas (CD95) en la superficie celular.
Mediante citometría de flujo las distintas líneas celulares fueron caracterizadas
fenotípicamente en cuanto a la expresión de Fas en la superficie celular, para ello se
utilizaron anticuerpos monoclonales (mAb) anti-Fas humano (eBioscience, San Diego,
CA, USA) y de ratón (BD Pharmingen, USA) conjugado con isotiocianato de
fluoresceina (FITC). Brevemente, 2x105 células fueron centrifugadas a 150g por 5 min a
4ºC, lavadas con PBS e incubadas con el anticuerpo anti-Fas-FITC por 30 min a 4ºC.
Finalmente, las células fueron lavadas 3 veces con PBS y fijadas con 1,0 % (v/v)
paraformaldehido en PBS y analizadas en el citómetro de flujo FACScanto
(FACSCalibur, Becton Dickinson, USA). El análisis de los datos se realizó mediante el
programa FCS express.
3.0.3. Extracción de RNA y RT-PCR para P2X7 humano y ratón.
En primer lugar se realizó un análisis de secuencias de nucleótidos y
aminoácidos del receptor P2X7 de ratón y humano utilizando el programa Clustalw2.
El RNA de las células (A20, A20R, Jurkat, Raji y Ramos) se extrajo utilizando el
reactivo comercial Trizol (Invitrogen, USA) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. Se utilizó 1 ml de reactivo para cada placa de 6 cm de diámetro. La
concentración de RNA se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y se confirmó su
integridad mediante su migración electroforética en geles de agarosa al 2% con bromuro
de etidio. Posteriormente, se realizó la reacción de transcriptasa reversa en un volumen
total de 20 l: RNA total 1 g, 2 l de partidores al azar (50 ng/ml) y agua nanopura
hasta completar un volumen de 11 l. Luego se incubó a 70ºC durante 5 min y
posteriormente en hielo por 10 min. Después se agregó la siguiente mezcla: dNTPs 10
28
mM, tampón (Tris HCl 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM) y 10
U/ml de transcriptasa inversa AMV (Promega, USA).
Los cDNA de las distintas líneas celulares fueron amplificados usando los
partidores específicos para el receptor P2X7 de humano (sense:
TCCGAGAAACAGGCGATAA; y antisense: ACTCGCACTTCTTCCTGTA) y ratón
(sense: GCTTTGCTTTGGTGAGCGAT; y antisense:
TGCACTTGGCCTTCTGACTT), con productos de amplificado de 456 y 223 pb,
respectivamente. Todos los productos de reacción fueron analizados después de 25-30
ciclos de amplificación. Cada ciclo estuvo dado por pasos consecutivos de 1 min a 94ºC,
56ºC (Tm) y 72ºC. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2%.
3.0.4. Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43.
Las distintas líneas celulares (Jurkat, Raji, Ramos, A20 y A20R) fueron
resuspendidas en una solución que contenía una mezcla de M-PER y el coctel de
inhibidores de proteasa Halt (Thermo Scientific). La cuantificación de proteínas se
realizó mediante el método Bradford (Bio-Rad, USA). Un total 100 µg de proteínas de
cada muestra se resuspendió en tampón Laemmli y se almacenó -80°C. Posteriormente,
las alicuotas de 100 g de las distintas líneas celulares fueron analizadas mediante un gel
de SDS-polyacrilamida al 10%. Solo las muestras para conexinas se hierven por 3 min.
Para inmunoblots, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa
(Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA), la unión proteíca no específica se bloqueó por
3 h en PBS/5% leche. Posteriormente, se incubó con anticuerpos policlonales anti-
panexina 1 (Pnx1) o anti conexina-43 toda la noche a 4 ºC. Después, las membranas se
lavaron 4 veces con PBS por 15 min cada vez y se incubaron por 1 h a temperatura
ambiente con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con HRP
(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, U.K.). La detección se realizó mediante el
kit SuperSignal, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL).
29
3.1. Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis en
células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida por FasL.
3.1.1. Cultivos celulares.
Las células A20 (linfocitos B derivados de linfoma B de ratón) y A20R
(linfocitos B derivados de linfoma B de ratón) se cultivaron en DMEM (4,5 g glucosa/lt)
suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 10.000 U/ml de penicilina, 10
μg/ml de estreptomicina y 50 μM de -mercaptoetanol a 37°C y 5% CO2. Las células
Jurkat (linfocitos T derivados de leucemia aguda de humano), Raji (linfocitos B
derivados de linfoma B de humano) y Ramos (linfocitos B derivados de linfoma B de
humano) se cultivaron en RPMI (1,8 g/lt de glucosa) suplementado con 10% de suero
fetal bovino (SFB), 10.000 U/ml penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina.
3.1.2. Ensayos de muerte celular.
Para los ensayos de muerte celular, las células A20, A20R, Jurkat, Raji y Ramos
se cultivaron en placas de 96 pocillos fondo plano a una concentración de 50.000
células/pocillo en 100 l de medio suplementado con 10% SFB. Las células fueron
estimuladas con FasL (0-80 ng/ml) (Alexis Biochemicals, Switzerland) por 16 h a 37°C.
Se incluyó también células Jurkat tratadas con el inhibidor genérico de caspasas (z-
VAD) (20 M) y los inhibidores específicos de caspasa-8 (z-IETD) (20 y 50 M),
caspasa-3 (z-DEVD) (20 y 50 M) y caspasa-9 z-LEHD (20 y 50 M) (R&D System,
USA), y posteriormente fueron estimuladas con FasL. Además, en el caso de las células
Jurkat y A20 se realizó una cinética cada 3 h hasta 12 h con 20 y 40 ng/ml de FasL,
respectivamente. Se incluyó la cuantificación de fosfatidilserina mediante detección con
Anexina V (Becton Dickinson, USA) mediante citometría de flujo en las células Jurkat.
Las células se recuperaron y lavaron con 200 l de tampón FACS Flow (Becton
Dickinson, USA), se centrifugaron a 150g por 5 min y posteriormente se agregó yoduro
de propidio (PI) (10 g/ml) (Sigma, USA). Las células se analizaron en el citómetro de
flujo (FACScanto, Becton Dickinson, USA). Las células impermeables a PI (PI
30
negativo) fueron consideradas viables y las dos poblaciones de células muertas
permeables a PI (PI positiva) fueron diferenciadas en base a la intensidad de
fluorescencia, correspondiendo a células apoptóticas o necróticas (Hetz et al., 2002). Los
resultados se analizaron mediante el programa FCS Express.
3.1.3. Medición de ATP extracelular en células tratadas con inhibidores de caspasas.
El contenido extracelular de ATP se cuantificó utilizando un ensayo de
luminescencia (Cell-Titer Glo Kit, Promega). Para estos ensayos, las células A20, A20R,
Jurkat, Raji y Ramos se cultivaron en una placa de 96 pocillos fondo plano a una
concentración de 50.000 células/pocillo en 100 l de medio sin suero fetal bovino para
evitar la acción de ectonucleotidasas que degradan el ATP. Además, se agregó el
inhibidor de nucleotidasas Epselen (30 M) (AppliChem, USA) 10 min antes del
estímulo. Las células se trataron con los inhibidores de caspasas zVAD (20 M), zIETD
(20 M) y zDEVD (20 M) (R&D System, USA), y posteriormente fueron estimuladas
con FasL (80 ng/ml) por 5 h (a intervalos de 1 h) a 37°C. Posterior a la incubación de las
células, se recuperó el sobrenadante al cual se agregó a tubos eppendorf, se
centrifugaron a 150g por 5 min a 4ºC. Posteriormente, se recuperó el sobrenadante el
cual se colocó en una placa opaca de 96 pocillos y se diluyeron con igual volumen de
CellTiter-Glo. La luminescencia final fue cuantificada en un contador de microplacas
(Biotek, Instrument, Inc) y los resultados se expresaron como nM de ATP, debido a que
se utilizó una curva estándar con concentraciones conocidas de ATP. Se comprobó la
viabilidad mediante ensayos descritos en 3.1.2, bajo las condiciones de inhibición
mencionadas anteriormente.
3.1.4. Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
La liberación de LDH se cuantificó en el sobrenadante de cultivo mediante el kit
CytoTox-OneTM
. Las células A20 y Jurkat fueron incubadas con FasL (80 ng/ml) por 5 h
(a intervalos de 1 h) a 37°C. Después de los tiempos de incubación, se agregó un
volumen igual del reactivo CytoTox-ONE™ al volumen presente en cada pocillo.
31
Además, como control de liberación de máxima de LDH se agregó en algunos pocillos
la solución de lisis (Tritón 9%), para generar un máximo de liberación de LDH
(expresado como 100%), de tal forma de presentar los resultados como porcentaje de
liberación de LDH (%).
3.2. Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la salida de
ATP mediada por la activación del receptor Fas en células Jurkat.
3.2.1. Ensayo de captación de bromuro de etidio.
La primera aproximación para determinar la participación de hemicanales
formados por panexina-1 o conexinas en la liberación de ATP fue mediante el ensayo de
captación de etidio. Para ello las células Jurkat y A20 se cultivaron en cubre objetos de
vidrio tratados con poli-L-lisina (0,01%) por 1 h, posteriormente se lavaron con solución
de registro (HANKS-HEPES: 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM
MgCl2, 5 mM D-glucosa y 10 mM HEPES, pH 7,4). Las células fueron incubadas en
solución de registro con 5 µM de etidio y la fluorescencia fue registrada con un
microscopio de inmersión Olympus BX51WI (Melville, NY). Las imagenes fueron
capturadas con una cámara digital monocromática modelo Q Imaging Retiga 13001 (12-
bit; Qimaging, BC, Canada) cada 5 min (tiempo de exposición = 30 ms, ganancia =
0,5). El software Metafluor (versión 6.2R5; Universal Imaging, Downingtown, PA) fue
utilizado para el análisis de las imágenes y la cuantificación de fluorescencia. Se midió 3
intensidades de fluorescencia basales cada vez (BF, expresadas como unidades
arbitrarias o AU) las cuales fueron promediadas y restadas a la intensidades de
fluorescencia de cada células a cada uno de los intervalos de tiempo (CF). Resultados de
este cálculo (CF-BF) en cada intervalo de tiempo de las células analizadas (20 como
mínimo) durante 3 h. La entrada de etidio se calculó utilizando el software Microsoft
Excel (Redmond, WA) y expresado como unidades arbitrarias. Células que presentaban
altas intensidades de fluorescencia antes de la estimulación fueron excluidas del análisis.
Las células Jurkat fueron tratadas con FasL (80 ng/ml), o pre-tratadas con probenecid (1
32
mM) o La3+
(200 M) 10 min antes de estimular las células con FasL, como control se
utilizó células tratadas con PBS. Las células A20 fueron tratadas con FasL (80 ng/ml) y
PBS también por 3 h.
3.2.2. Medición de ATP extracelular.
El contenido extracelular de ATP se cuantificó utilizando un ensayo de
luminescencia descrito en 3.1.3, en las células pre-tratadas con carbenoxolona (10 μM),
probenecid (1 mM), La3+
(200 M) o heptanol (500 M) 10 min antes de ser
estimuladas con FasL (80 ng/ml), por 5 h (a intervalos de 1 h) a 37°C.
3.2.3. Ensayos de muerte celular.
Para los ensayos de muerte celular se utilizó el método descrito en 3.1.2 en
células pre-tratadas con o sin carbenoxolona (10 μM), probenecid (1 mM) y La3+
(200
M) los cuales se agregaron 10 min antes de estimular las células con FasL (0-80 ng/ml)
por 16 h a 37°C.
3.2.4. Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43 a distintos tiempos de
estimulación con FasL.
Como parte de la caracterización de los hemicanales responsables de la salida de
ATP se realizó una cinética en células Jurkat estimuladas por 0, 1, 3 y 5 h.
Posteriormente se recuperaron las células y se realizó un western blot para panexina-1 y
conexina-43 como el descrito en Materiales y Métodos.
3.2.5. Microscopía confocal para panexina-1 y receptor Fas.
Las células Jurkat se cultivaron en cubre objetos de vidrio y se fijaron con
formaldehido al 4% por 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se
permeabilizaron y bloquearon los sitios reactivos inespecíficos con una solución de
PBS/BSA 1% (libre de IgG)/50 mM de NH4Cl/ 0,05% Triton X-100. Además, para
bloquear los receptores Fc se utilizó una solución Fc-Block (1:100) por 45 min a
33
temperatura ambiente. Después, las muestras fueron lavadas 2 veces con PBS y se
incubaron con fragmentos F(ab´)2 anti-panexina 1 (Px1) por 12 h en solución bloqueante
a 4°C. Posteriormente, las muestras se lavaron 3 veces con solución bloqueante y se
incubaron con fragmentos F(ab´)2 de cabra anti- IgG de conejo conjugado con Cy2
(1:300) por 30 min a temperatura ambiente y se montaron con fluoromount G (Electron
Microscopy Sciences, Washington, PA), también se realizó una tinción con anticuerpos
monoclonales anti-hFas marcados con FITC (hFas-FITC). Se realizó estudios de curso
temporal en las células Jurkat estimulándolas con FasL (80 ng/ml) por 1, 3 y 5 h. Las
imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal (Olympus, Fluoview FV1000,
Tokio, Japan). El análisis de co-localizaciones se realizó con los programas ImageJ
(NIMH, Bethesda, MD, USA) e ImageJ JACop plugin (Bolte y Cordelieres, 2006).
3.2.6. Identificación de balsas lipídicas y proteínas asociadas.
Debido a la composición lipídica del microdominio “raft”, el colesterol se utiliza
como marcador de dichos dominios. Por lo tanto, las células Jurkat fueron marcadas con
14C-Colesterol de acuerdo a protocolos previamente descritos con algunas
modificaciones (Oram, 1986). Brevemente, 0,4 µCi de 14
C-Colesterol fue resuspendido
en RPMI 10% SFB e incubado entre 6-12 h a 37ºC. El medio marcado fue añadido a las
células que están en un 20-25% de confluencia y cultivadas durante 48 h. Pasado ese
tiempo se cambió el medio por uno fresco sin marca radioactiva por 12 h (para eliminar
el 14
C-Colesterol que no es incorporado). A fin de determinar una asociación entre los
receptores Fas y P2X7 se procedió a tratar las células Jurkat con distintas
concentraciones de beta-metilciclodextrina ( MCD) (0, 5 10 y 20 mM) por 30 min y
luego se dejaron por 16 h a fin de extrar colesterol desde la membrana plasmática.
Además se evaluó la viabilidad celular mediante ensayos de MTS. Posteriormente, las
células se someten a la purificación de las fracciones livianas de membrana mediante
extracción con Tritón X-100 en gradiente de sacarosa. Para ello, se siguió un protocolo
previamente desarrollado en nuestro laboratorio, con algunas modificaciones (Bender et
al., 2002) para aislar glicoesfingolípidos insolubles en detergente (DIGs). Todos los
34
pasos fueron hechos a 4ºC en hielo, las células Jurkat se recuperaron y se lavaron dos
veces con PBS frío. Luego se añadió 2 ml de Tampón de lisis y se procedió a remover
las células a un tubo eppendorf de 1,5 ml a 4ºC por 20 min. El lisado de células fue
transferido a un homogenizador Dounce tipo B de 15 ml, previamente enfriado, y se
homogenizó cuidadosamente 10 veces por 10 segundos (cuidando de no formar
espuma). En los tubos de propileno se agregó 0,75 ml de una solución de sacarosa 90%
en MNE pH 6,5 (MNE: 25 mM MES, 150 mM de NaCl, 2 mM EDTA). A continuación
se agregó el mismo volumen de homogenizado y se mezcló con un vortex suavemente
hasta que la solución quedó homogénea. Luego se agregó cuidadosamente, sin mezclar
fases, 1,5 ml de una solución de sacarosa 35% en MNE pH 6,5 y después 1,5 ml de una
solución de sacarosa 5% en MNE pH 6,5, formando así un gradiente discontinuo. A
continuación se colocaron los tubos dentro de los capachos de la centrífuga y se
procedió a la centrifugación en el rotor de swinging bucket (H650) por 20 h a 200.000x
g a 4ºC. Al cabo de ese tiempo se recolectaron 13 fracciones en total, 12 fracciones
(0,375 ml/tubo) y la fracción 13 correspondiente al pellet el cual fue disuelto en tampón
de lisis y sonicado. La medición del 14
C-Colesterol se realizó en viales de centelleo, a los
cuales se agregó 3 ml de solución de centelleo y 250 l de cada fracción. La
radioactividad se midió en el contador de centelleo.
3.3. Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa
apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20.
3.3.1. Ensayos de muerte celular.
Previo al estímulo con FasL se trató las células con distintos inhibidores,
incluyendo inhibidores de la via de novo de la síntesis de ceramida (Fumonisina B1 y
Miriocina), el inhibidor de la esfingomielinasa ácida (Imipramina) o el inhibidor de la
esfingomielinasa neutra (GW4869). También se realizaron ensayos de muerte celular
pre-tratando las células por 1 h con los inhibidores de receptores P2X7 oATP (600 M)
ó BBG (50 M) o el inhibidor de receptores P2 (P2X y P2Y) suramina (200 M) 30 min
35
antes de estimular con FasL. Además, las células se pre-trataron con N-acetil cisteína 45
min antes de estimularlas; células A20 (20 mM) y Jurkat (10 mM). Posteriormente, las
células fueron estimuladas con FasL (0-80 ng/ml) y las células se incubaron por 16 h a
37°C. Se realizaron cursos temporales en el caso de células A20 tratadas con GW4869 o
suramina por 12 h estimulando cada 3 h con FasL (40 ng/ml). Adicionalmente, se
trataron las células con agonistas de receptores P2X7, NAD+ (0-200 M) por 16 y 24 h,
y BzATP (0-600 M) por 16 h ya sea en ausencia o en presencia de FasL (0-80 ng/ml).
Además se utilizó como antagonista CuCl2 (0, 5 y 10 M), el cual se agregó 10 min
antes de agregar FasL (0-80 ng/ml) por 16 h. La muerte celular fue evaluada de acuerdo
a la metodología descrita en el punto 3.1.2.
3.3.2. Determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante citometría de
flujo.
Para determinar cambios en la producción de ROS en las células Jurkat, estas se
sembraron (50.000 células/ pocillo) en placas de 96 pocillos fondo plano. Fueron
estimuladas con FasL (20 ng/ml) por 6 h (a intervalos de 1 h). Posteriormente, las
células se recuperaron y se centrifugaron a 150g por por 5 min, luego se lavaron 2 veces
con PBS y posteriormente se cargaron con la sonda Dihidrorodamina 123 (DHR,
Invitrogen) (1,4 μg/ml) en 100 l de medio RPMI 1640 sin suero. Esta sonda es
excitable a 488 nm y emite a 515 nm. Las células se incubaron con la sonda por 30 min
a 37ºC. Luego del tiempo de incubación, las células se colocaron en hielo para detener la
reacción, se lavaron 2 veces con PBS y fueron resuspendidas en 250 μl de solución
isotónica para citómetro de flujo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo
en un FACSCanto (Becton Dickinson, USA).
3.3.3. Análisis Estadístico.
Los datos obtenidos se analizaron utilizando el test no paramétrico de Kruskall-
Wallis, análisis de t-Student y un análisis de ANOVA con un post test de Dunns. Las
36
diferencias entre los valores experimentales obtenidos se considerarán significativas con
un valor de p ≤ 0,05.
37
4. RESULTADOS.
Las distintas líneas celulares con las cuales se trabajó muestran una sensibilidad
distinta al ser estimuladas con FasL, es así como hay líneas celulares sensibles (células
A20 y Jurkat) y resistentes a dicho estímulo (Raji, Ramos y A20R). Por lo tanto, la
primera aproximación fue caracterizar en estas líneas la expresión del receptor Fas. Para
ello se utilizó anticuerpos monoclonales anti-Fas humano y de ratón marcados con FITC
(anti-hFas y anti-mFas-FITC) y mediante citometría de flujo se determinó el porcentaje
de las células que expresan dicho receptor. En la Figura 3, se muestran histogramas
representativos de cada una de las líneas celulares, Jurkat (A), Raji (B), Ramos (C), A20
(D) y A20R (E), en los cuales el color negro representa células en ausencia del
anticuerpo anti-Fas, y el color gris representa células incubadas en presencia del
anticuerpo. En las células Jurtat cerca del 80% de las células expresaron el receptor, en
las células Raji cerca del 100% de las células lo expresaron y en las células Ramos cerca
del 66% de las células expresa este receptor (Figura 3F). Las diferencias en el porcentaje
de expresión de Fas son estadísticamente significativas entre las células Raji y Ramos (p
< 0,001), no así entre Jurkat y Raji . En las células de ratón, se observa una diferencia en
cuanto a la expresión de Fas, un mayor porcentaje de las células A20 (99%) expresan
Fas en la superficie celular en comparación con las células A20R donde solo el 29% de
las células lo expresan.
Posteriormente, a partir de la secuencia de RNA mensajero, se realizó un análisis
de secuencias de nucleótidos que codifican el receptor P2X7 de ratón y humano, que
corresponde al origen de las distintas líneas celulares que utilizamos en los experimentos
que se describen (Tabla 3). Para el receptor P2X7 de ratón se describen 4 isoformas (a-d)
que difieren en el número de nucleótidos, siendo la isoforma (a) la que posee mayor
número de bases (4931 pb) y la isoforma (d) la más pequeña (824 pb) (Tabla 3A).
Mediante el programa ClustalW2 se analizó la homología a nivel de nucleótidos de la
secuencia que codifica para el receptor P2X7 de ratón y humano. Se consideró esto para
el diseño de los partidores que posteriormente se ocupó, ya que la secuencia amplificada
38
corresponde a un segmento de 223 pb que se obtiene en las 4 isoformas. Cabe destacar
que la mayor homología se da en el extremo 5´ en el caso de la secuencia nucleotídica.
También se analizó la secuencia de aminoácidos entre los receptores P2X7, encontrando
que la mayor homología es entre las distintas isoformas del receptor P2X7 de ratón. Al
comparar la secuencia del receptor P2X7 de ratón con el de humano, esta alcanza un
80% (Tabla 3B).
A partir del análisis anterior se diseñó los partidores para el receptor P2X7 de
ratón y humano. Para caracterizar las líneas celulares en cuanto a la expresión del
receptor P2X7 se realizó una reacción de PCR con partidores específicos para el receptor
P2X7 humano (Jurkat, Raji, Ramos) y de ratón (A20, A20R). La Figura 4A corresponde
a un gel de agarosa con productos de PCR generados con partidores para el receptor
P2X7 humano. Se observa la presencia de un fragmento de aproximadamente 456 pb,
que corresponde al tamaño de fragmento esperado, en las células Jurkat y Raji, no así en
las células Ramos y en las células de origen murino (A20 y A20R). La corresponde a un
gel de agarosa con productos de PCR generados con partidores para P2X7 de ratón. Se
obtuvo un producto de PCR de aproximadamente 223 pb, que corresponde al tamaño de
fragmento esperado, en las células A20 y A20R, no así en las células Jurkat, Raji,
Ramos (Figura 4B).
En cuanto a la expresión de panexina-1 y conexina-43 en los extractos celulares,
mediante análisis de western blot se detectó la presencia de estas proteínas. En el caso de
panexina-1 se detectaron distintas formas de 90, 70, 45 y 39 kDa que corresponden a
dímeros, monómeros y proteínas glicosiladas en todas las líneas celulares analizadas.
Además se incluyó un control positivo que corresponde a estracto de cerebro de rata
(Figura 5A). En cambio para conexina-43 solo se detectó una banda de 43 kDa en las
células A20 y A20R, la que no se detectó en la células Jurkat, Raji y Ramos (Figura 5B).
En resumen, se aprecian diferencias en cuanto a la expresión de Fas, receptor
P2X7 y panexina-1 en las distintas líneas celulares estudiadas. Es así como en las células
de ratón existe una mayor diferencia en cuanto a la expresión del receptor Fas en la
superficie celular siendo las células A20 las que lo expresan en mayor proporción en
39
comparación a las células A20R, lo cual no es tan marcado entre las células linfoides de
origen humano (Jurkat, Raji y Ramos). En cuanto a los receptores P2X7, solo en las
células Ramos no se detectó la presencia del mRNA del receptor P2X7. Con respecto a
la expresión de panexina-1, todas las células analizadas expresan esta proteína no
observándose una diferencia marcada entre las distintas líneas celulares. Por último, se
observó diferencias significativas en la expresión de conexina-43, ya que solo se detectó
en células B de ratón (A20, A20R) y no en células Jurkat, Ramos y Raji (Tabla 4).
40
A. B. C. D. E.
100
101
102
103
104
0
13
25
38
50
100
101
102
103
104
0
13
25
38
50
100
101
102
103
104
0
13
25
38
50
(-) anti-FasR
(+) anti-FasR
100
101
102
103
104
0
13
25
38
50
100
101
102
103
104
0
13
25
38
50
F.
Figura 3: Niveles de expresión del receptor Fas en la superficie de células Jurkat,
Raji, Ramos, A20 y A20R. Mediante citometría de flujo se detectó la expresión de Fas
en la superficie celular. Para ello las células fueron incubada con el anticuerpo
monoclonal anti-Fas humano (hFas) (Jurkat, Raji, Ramos) y anti-Fas de ratón (mFas)
(A20, A20R). Se muestran histogramas representativos para las distintas líneas celulares
(A-E), donde el color negro representa células en ausencia del anticuerpo anti-Fas y el
de color gris representa a las células incubadas en presencia del anticuerpo. La Figura
(F) corresponde al resumen de los datos donde se muestra el porcentaje de células que
expresa Fas en la superficie celular. Los resultados corresponden a tres experimentos
realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas con un p < 0,001 (***).
Jurkat Raji Ramos A20 A20R0
25
50
75
100
*** ***
Exp
resió
n d
e F
as (
%)
Count
anti-FasR
41
A.
Sec Especie Largo (nt) Sec Nombre Largo (nt) Homología(%)
============================================================================
1 m (a) 4931 2 m (b) 1633 89
1 m (a) 4931 3 m (c 2563 56
1 m (a) 4931 4 m (d) 824 64
1 m (a) 4931 6 h 3155 48
2 m (b) 1633 3 m (c) 2563 88
2 m (b) 1633 4 m (d) 824 64
2 m (b) 1633 6 h 3155 69
3 m (c) 2563 4 m (d) 824 64
3 m (c) 2563 6 h 3155 44
4 m (d) 824 6 h 3155 46
============================================================================
B.
Sec Especie Largo(aa) Sec Nombre Largo(aa) Homología(%)
============================================================================
1 m (a) 595 2 m (b) 442 97
1 m (a) 595 3 m (c) 431 99
1 m (a) 595 4 m (d) 153 79
1 m (a) 595 6 h 595 80
2 m (b) 442 3 m (c) 431 99
2 m (b) 442 4 m (d) 153 79
2 m (b) 442 6 h 595 79
3 m (c) 431 4 m (d) 153 79
3 m (c) 431 6 h 595 81
4 m (d) 153 6 h 595 67
============================================================================
Tabla 3. Análisis de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del receptor
P2X7 de ratón y humano. Mediante el programa ClustalW2 se analizó la homología a
nivel de nucleótidos (nt) (A) y secuencia de aminoácidos (aa) (B) entre los P2X7 de
ratón (m), y humano (h). Para ratón se describen 4 isoformas (a-d) que difieren entre sí
en el largo y en sus secuencias.
42
A.
A20 A20R Jurkat Raji Ramos
hP2X7
actina
B.
mP2X7
actina
A20 A20R Jurkat Raji Ramos
Figura 4. Expresión del receptor P2X7 en células linfoides analizadas mediante
PCR. Se analizó el cDNA obtenido a partir de células de origen humano (Jurkat, Raji,
Ramos) y de ratón (A20 y A20R). La Figura (A) corresponde a un gel de agarosa con
productos de PCR generados con partidores para P2X7 humano (hP2X7) donde se
observa la presencia de un fragmento de aproximadamente 456 pb, que corresponde al
tamaño de fragmento esperado, en las células Jurkat, Raji, no así en las células Ramos y
en las células de origen murino (A20 y A20R). (B) corresponde a un gel de agarosa con
productos de PCR generados con partidores para P2X7 de ratón (mP2X7), se observa la
presencia de un fragmento de aproximadamente 223 pb en las células A20, A20R, no así
en las células Jurkat, Raji y Ramos. En ambos geles se incluye el control de carga con la
detección de -actina en las distintas líneas celulares.
500 pb
300 pb
-actina
-actina
43
A.
A20 A20R Jurkat Raji Ramos C+
Tubulina
90 kDa
45 kDa
70 kDa
39 kDa
B.
A20 A20 R Jurkat Raji Ramos
43 kDa
Tubulina
Figura 5: Detección de panexina-1 y conexina-43 en células linfoides analizadas
mediante análisis de western blot. Se analizaron las proteínas obtenidas a partir de
células de origen humano (Jurkat, Raji, Ramos) y de ratón (A20 y A20R). La Figura (A)
corresponde a un inmunoblot de proteínas en el cual se detecta panexina-1, se observa la
presencia de dímeros (70 kDa), monómeros (39 kDa) y proteínas glicosiladas (45 y 90
kDa), como control positivo (C+) se uso extracto de cerebro de rata. La Figura (B)
corresponde a un inmunoblot de proteínas en el cual se detecta conexina-43 (Cx43),
observándose la presencia de una banda de aproximadamente 43 kDa. En ambos blots se
incluye el control de carga con la detección de tubulina en las distintas líneas celulares.
►
►
►
►
►
►
►
44
Línea celular Origen Tipo Celular Fas P2X7 Panexina-1 Conexina-43
Jurkat Humano LT + + + -
Raji Humano LB + + + -
Ramos Humano LB + - + -
A20 Ratón LB + + + +
A20R Ratón LB + + + +
Tabla 4. Resumen de la expresión de Fas, P2X7, panexina-1 y conexina-43. En las
líneas celulares estudiadas se analizó la presencia de cada una de las moléculas de
interés. LT (linfocito T) y LB (linfocito B).
45
4.1. Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis en
células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida por FasL.
En primer lugar se realizaron ensayos de muerte celular con FasL a fin de
determinar la sensibilidad de cada una de las líneas celulares y el tipo de muerte que
predomina en las células sensibles. Para ello se cuantificó la incorporación de yoduro de
propidio (PI) mediante citometría de flujo. Las distintas líneas celulares se estimularon
por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0-80 ng/ml). En la Figura 6A se muestra
un dot plot del análisis realizado en el cual se grafican las tres poblaciones celulares,
viables (V) apoptóticas (A) y necróticas (N). Al analizar las poblaciones celulares,
células Jurkat, Raji, Ramos, A20 y A20R (Figura 6B), se observa que existen células
resistentes al efecto de FasL a las distintas concentraciones utilizadas, estas células
corresponden a las células Raji, Ramos y A20R. En cambio las células Jurkat y A20
mostraron sensibilidad al efecto de FasL, observándose en ambos casos una disminución
de la viabilidad en forma concentración dependiente, especialmente a concentraciones
menores a 20 ng/ml, ya que a concentraciones mayores si bien se aprecia una pequeña
disminución de la viabilidad esta no fue significativa. Al analizar las distintas curvas de
viabilidad, se aprecian diferencias estadísticamente significativas (p < 0,001) entre las
células Jurkat y A20 al compararlas con las curvas de viabilidad obtenidas con las
células A20R, Raji y Ramos.
Para caracterizar las células sensibles a FasL, se usó también el ensayo de
incorporación de PI con el cual se puede discriminar si la muerte celular fue por necrosis
o apoptosis. En la Figura 6C, se observa que en las células Jurkat el principal tipo de
muerte corresponde a la apoptosis alcanzando aproximadamente un 75%, y en menor
porcentaje la necrosis (20%). Existen diferencias estadísticamente significativas entre
estos dos tipos de muerte celular al analizar las distintas concentraciones de FasL (80,
40, 20 y 5 ng/ml), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p <0,001 (***), como se describe en el
gráfico. En cambio en las células A20 (Figura 6D) esta proporción se invierte,
alcanzando la necrosis de aproximadamente un 75% y la apoptosis un 20%. En este
mismo ensayo también se caracterizó el tipo de muerte celular (Figura 7) en las células
46
Ramos (Figura 7A), Raji (Figura 7B) y A20R (Figura 7C). Estas líneas fueron
resistentes al efecto de FasL, ya que no se observó un incremento significativo (p > 0,05)
en alguno de los tipos de muerte celular a medida que aumenta la concentración de FasL
(p > 0,05).
En las células Jurkat, sensibles a FasL, se realizó un curso temporal con una
concentración fija de FasL (20 ng/ml). Se observa que a partir de las 6 h disminuye la
viabilidad (Figura 8A) y aumenta la apoptosis alcanzando el máximo a las 9 h. Además
este ensayo se comparó con la exposición de fosfatidilserina, detectada mediante
Anexina V, que es un evento característico de la apoptosis. También se observó un
incremento a partir de las 6 h alcanzando un máximo a las 9 h (Figura 8B). Por otra
parte, y tal como se demostró en la Figura 6B, en las células Jurkat la necrosis representa
un porcentaje bajo, aproximadamente un 20% (Figura 8C). El mismo curso temporal se
realizó en las células A20 (Figura 9), observándose que la viabilidad disminuyó a partir
de las 9 h, alcanzando aproximadamente a un 25% (Figura 9A). La apoptosis aumentó
sobre un 25% a las 9 h (Figura 9B) y la necrosis, que es el tipo de muerte que predomina
en estas células alcanzó a cerca del 50% a las 12 h (Figura 9C).
Según nuestra hipótesis, los linfocitos al ser estimulados con FasL liberan ATP al
medio extracelular a través de un mecanismo que podría involucrar a caspasa-8. Para
demostrar la liberación de ATP inducida por FasL se realizó ensayos de luminiscencia
de alta sensibilidad (Figura 10). Es así como en las células A20 (Figura 10A), A20R
(Figura 10B), Raji (Figura 10C) y Ramos (Figura 10D) no se observan diferencia entre
las células tratadas con FasL y PBS. En cambio, en las células Jurkat en el medio
extracelular la concentración de ATP se incrementó con el tiempo de estimulación con
FasL, alcanzando un máximo a las 5 h que fue estadísticamente significativa con
respecto a las células tratadas con PBS a las 3, 4 y 5 h (Figura 11A). Esta correlación
entre la concentración de ATP extracelular y el tiempo de estímulo con FasL no es
producto de pérdida de viabilidad y por lo tanto pérdida de la integridad de la membrana
plasmática que podría explicar la salida de ATP. Esto se demostró mediante un ensayo
de liberación de LDH, en el cual se observó que no existen diferencias entre las células
47
tratadas con PBS y las células tratadas con FasL a los distintos tiempos estudiados (0-5
h) (Figura 11B).
A continuación, teniendo en cuenta que postulamos que la caspasa-8 participaría
en la liberación de ATP en respuesta al estímulo con FasL, realizamos el mismo ensayo
para determinar niveles de ATP en el sobrenadante de células Jurkat, pero en este caso
en presencia del inhibidor general de caspasas (zVAD) (20 M), el inhibidor de caspasa-
8 (zIETD) (20 M) y el inhibidor de caspasa-3 (zDEVD) (20 M), los cuales se
agregaron en forma simultánea al estímulo con FasL (80 ng/ml). La concentración de
ATP extracelular se midió a intervalos de 1 h hasta un máximo de 5 h (Figura 12A). En
el medio de las células tratadas con FasL y zVAD o zIETD prácticamente no se detectó
cambios con el de las células no tratadas con FasL. Esto fue más evidente a las 3, 4 y 5 h
de cultivo. Además se observó que el inhibidor de caspasa 3 (zDEVD) no afectó la
concentración de ATP extracelular en células tratadas con FasL.
En paralelo se realizó un ensayo de muerte celular (Figura 12B) tratando las
células con FasL (0-80 ng/ml) solo o junto a zVAD (20 M), o zIETD (20 y 50 M) o
zDEVD (20 y 50 M) por 16 h. Posteriormente, mediante citometría de flujo se evaluó
la viabilidad celular, observándose que esta disminuyó cuando las células fueron
tratadas con FasL. Sin embargo, cuando las células fueron tratadas en forma simultánea
con zVAD (20 M) prácticamente no ocurrió pérdida de viabilidad. Además, se observó
mayor viabilidad en las células tratadas con zIETD y zDEVD (20 M), lo cual es
estadísticamente significativo a concentraciones de 20, 10 y 5 ng/ml de FasL. A
concentraciones mayores (50 M), tanto zIETD como zDEVD evitan la pérdida de
viabilidad inducida por FasL siendo estas diferencias estadísticamente significativas en
todas las concentraciones de FasL.
Por lo tanto, en los ensayos de muerte celular inducido por FasL en las distintas
líneas estudiadas hubieron células sensibles (Jurkat y A20) y resistentes (A20R, Raji y
Ramos). De las líneas sensibles, solo en las células Jurkat se detectó aumento en la
concentración extracelular de ATP dependiente de FasL en forma tiempo dependiente y
que no correspondería a pérdida de la integridad de la membrana, como se demostró en
48
el ensayo de liberación de LDH. Además, la liberación de ATP fue dependiente de la
actividad de caspasa-8, ya que al agregar un inhibidor específico (zIETD) la salida de
ATP fue comparable a la obtenida en las células tratadas con PBS. En cambio al tratar
las células con un inhibidor de caspasa 3 (zDEVD) no se observó ese efecto ya que la
concentración de ATP extracelular fue comparable a la obtenida en las células
estimuladas solo con FasL.
49
A.
PE-H
FS
C-H
100
101
102
103
104
0
256
512
768
1024
NAV
PI
B.
C. (Jurkat)
D.
(A20)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100Ramos
Raji
A20R
A20
Jurkat
*** *** *** *** ***
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100 Apoptosis
Necrosis* **
FasL (ng/ml)
Mu
ert
e c
elu
lar
(%)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100 Apoptosis
Necrosis *** *** *** **
FasL (ng/ml)
Mu
ert
e c
elu
lar
(%)
50
Figura 6. Viabilidad y muerte celular en las células Jurkat y A20 estimuladas con
FasL. En (A) se muestra un dot plot representativo del análisis de las células teñidas con
yoduro de propidio (PI). Se distingue una población negativa a PI que corresponde a las
células vivas (V) y dos poblaciones de células positivas a PI, una población hipodiploide
que corresponde a las células apoptóticas (A) y una población normoploide que
corresponde a las células necróticas (N). Las células fueron estimuladas por 16 h con
concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml). Posteriormente, las células se
marcaron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la
viabilidad celular (B) y la muerte celular por apoptosis (■) o necrosis (○) (C y D). Esto
se realizó en las células Jurkat (▲), A20 (◊), Ramos (♦), Raji (▼) y A20R (■). Los
resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).
Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*), p <
0,01 (**) o p < 0,001 (***).
51
A.
(Ramos)
B.
(Raji)
C.
(A20R)
Figura 7. Muerte inducida por FasL en las células Ramos, Raji y A20R. Las células
fueron tratadas por 16 h con concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml). Posterior
al estímulo, las células se tiñeron con yoduro de propidio y la cuantificación del tipo de
muerte celular se realizó mediante citometría de flujo, distinguiendo muerte celular por
apoptosis (○) y necrosis (●). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados
en forma independiente (n=3), no observándose diferencias estadísticamente
significativas entre los dos tipos de muerte celular a las distintas concentraciones de
FasL (p > 0,05).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100Apoptosis
Necrosis
FasL (ng/ml)
Mu
ert
e c
elu
lar
(%)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100Apoptosis
Necrosis
FasL (ng/ml)
Mu
ert
e c
elu
lar
(%)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
Apoptosis
Necrosis
FasL (ng/ml)
Mu
ert
e c
elu
lar
(%)
52
A.
B.
C.
Figura 8. Curso temporal de los cambios de viabilidad y muerte celular en células
Jurkat tratadas con FasL. Células Jurkat se trataron con FasL (20 ng/ml) por 12 h a
distintos tiempos (0, 3, 6, 9, 12 h). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de
propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular
por apoptosis (B) y necrosis (C). En el caso de la apoptosis esta se correlacionó con la
tinción con yoduro de propidio (PI+) con la detección de fosfatidilserina mediante
anexina V (AV). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma
independiente (n=3).
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
Via
bil
idad
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
AV+
PI+
Ap
op
tosis
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
FasL (20 ng/ml)
Necro
sis
(%
)
53
A.
B.
C.
Figura 9. Curso temporal de la viabilidad y muerte celular en células A20 tratadas
con FasL. Células A20 se trataron con FasL (40 ng/ml) por 12 h a distintos tiempos (0,
3, 6, 9, 12 h). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante
citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular por apoptosis (B) y
necrosis (C). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma
independiente (n=3).
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
Via
bil
idad
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
Ap
op
tosis
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
FasL (40 ng/ml)
Necro
sis
(%
)
54
A. (A20) B. (A20R)
C. (Raji) D. (Ramos)
Figura 10. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por FasL en
células linfoides. Mediante ensayos de luminiscencia, se cuantificó los niveles de ATP
extracelular en las células (A), A20 (B), A20R (C), Raji (D) y Ramos (E) tratadas con
FasL (80 ng/ml) (■) y PBS (□) a distintos tiempos (0-5 h). Todas las células se pre-
trataron con Ebselen (30 M) 10 min antes de estimularlas. Los resultados corresponden
a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).
0 1 2 3 4 50
40
80
120
160
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
0 1 2 3 4 5
0
40
80
120
160
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
0 1 2 3 4 5
0
40
80
120
160
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
0 1 2 3 4 5
0
40
80
120
160
Tiempo (h)
PBS
FasL (80ng/ml)
AT
P (
nM
)
55
B.
Figura 11. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por FasL en
células Jurkat. Mediante ensayos de luminiscencia, se cuantificó los niveles de ATP
extracelular en las células Jurkat (A), tratadas con FasL (80 ng/ml) (■) y PBS (□) a
distintos tiempos (0-5 h). Las células se pre-trataron con Ebselen (30 M) 10 min antes
de estimularlas. Mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (F),
se analizó la integridad de la membrana plasmática entre las 0-5 h de tratamiento con
FasL, como control se utilizó células tratadas con PBS. Los resultados corresponden a
tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se
consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 1 2 3 4 50
40
80
120
160
*
**
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
0 1 2 3 4 5 PBS0
25
50
75
100
Tiempo (h)
Lib
era
ció
n d
e L
DH
(%
)
56
A.
B.
Figura 12. Efecto de los inhibidores de caspasas zVAD, zIETD y zDEVD en los
niveles extracelulares de ATP y viabilidad celular. Mediante ensayos de
luminiscencia (A), se cuantificó el ATP extracelular en células Jurkat tratadas a
intervalos de 1 h hasta un máximo de 5 h ya sea con FasL (80 ng/ml) (■), o con los
inhibidores de caspasas zVAD (20 M) (▲), zIETD (20 M) (▼) y zDEVD (20 M)
(○), en forma simultánea con FasL. Como control se utilizó células tratadas con PBS
(□) a los mismos tiempos. También se midió por citometría de flujo la viabilidad celular
en ausencia (◊) o presencia de zVAD (20 M) (▲), zIETD (20 M) (▼), zIETD (50
M) (Δ), zDEVD (20 M) (○) y zDEVD (50 M) (●) (B). Los resultados corresponden
a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se
consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100sin inhibidores
zIETD (20 M)
zVAD (20 M)
zDEVD (20 M)
zIETD (50 M)
zDEVD (50 M)
* * ** *
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 1 2 3 4 50
50
100
150
200FasL (80 ng/ml)
zVAD (20 M) + FasL
zIETD (20 M) + FasL
zDEVD (20 M) + FasL
PBS
*
*
*
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
57
4.2. Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la salida de
ATP mediada por la activación del receptor Fas en células Jurkat.
En este objetivo se pretende determinar la vía de salida de ATP en linfocitos T,
en este caso en células Jurkat, las posibles vías de salida son a través de hemicanales
formados por panexina-1 o conexinas. Evidencias recientes involucran a las panexinas
en los mecanismos de liberación de ATP en linfocitos, por lo tanto al ser estimulados
con FasL podrían liberar ATP al medio extracelular (Schenk et al., 2008). La primera
aproximación fue realizar ensayos de incorporación de etidio en células Jurkat, de
manera de discriminar si la salida de ATP en respuesta a FasL es por panexina-1 o
conexinas (Figura 13). Para ello, las células fueron sembradas en cubre objetos pre-
tratados con polilisina en presencia de solución de registro HANKS con 5 M de etidio.
El registro de la fluorescencia asociada a la incorporación de etidio se realizó durante 3
h. Para ello las células Jurkat se pretrataron con 1 mM de Probenecid (inhibidor de
hemicanales formados por panexina-1) o con 200 M de La3+
(inhibidor de hemicanales
formados por conexinas) 10 minutos antes de estimular las células con FasL (80 ng/ml).
Se muestran imágenes representativas de las distintas condiciones: (A) corresponde a las
células Jurkat no tratadas a tiempo 0 y a los 180 min de incubación (B), (C) corresponde
a las células Jurkat tratadas con FasL (80 ng/ml) al tiempo 0 y a los 180 min (D).
En las células Jurkat no tratadas con FasL se observó una incorporación basal
similar al de las células pre-tratadas con probenecid y posteriormente con FasL. Por otra
parte, la mayor incorporación ocurrió en las células tratadas con FasL y las pre-tratadas
con La3+
(Figura 13E). Existen diferencias estadísticamente significativas desde los 120
min entre las células tratadas con FasL y las células tratadas con Probenecid y PBS. Lo
mismo se observó para las células pre-tratadas con La3+
y las células tratadas con
probenecid y PBS. No existen diferencias estadísticamente significativas entre las
células tratadas con FasL y pre-tratadas con lantano y posteriormente con FasL. Como
control se utilizaron células A20 que son sensibles a FasL pero en las cuales no fue
posible detectar aumentos en la concentración de ATP extracelular en respuesta a FasL
58
(Figura 10A), no observándose diferencias en la incorporación de etidio entre las células
no tratadas y tratadas con FasL (Figura 13B).
Posteriormente, se cuantificó concentración de ATP extracelular en el medio de
células tratadas con carbenoxolona (10 μM), un inhibidor de hemicanales formados por
panexinas (Figura 14). Se observó que en el medio de las células Jurkat pre-tratadas con
carbenoloxona 10 min antes de agregar FasL, la concentración de ATP fue menor que en
el sobrenadante de cultivo de las células tratadas solo con FasL. Esto fue más evidente a
las 4 y 5 h de cultivo, siendo esto estadísticamente significativo (p < 0,05) (Figura 14A).
Además, se realizaron ensayos de muerte celular, con distintas concentraciones de FasL
(0-80 ng/ml) en presencia de carbenoxolona (10 M) por 16 h, mediante citometría de
flujo se evaluó la viabilidad, no observándose protección por carbenoloxona en relación
a la muerte celular inducida con FasL (Figura 14B).
Se realizaron nuevamente ensayos de luminiscencia para detectar cambios en la
concentración extracelular de ATP en forma similar a lo realizado para cuantificar la
incorporación de etidio (Figura 13). Para ello las células Jurkat se pretrataron con
probenecid (1 mM), La3+
(200 M) o heptanol (500 M) 10 min antes de estimular las
células con FasL. Como control se utilizó células tratadas con PBS. Se observó que la
concentración de ATP extracelular en cultivos de células Jurkat pre-tratadas con
probenecid 10 min antes de agregar FasL, fue menor que en el de las células tratadas
solo con FasL. Esto fue más evidente a las 2, 3, 4 y 5 h de cultivo, siendo
estadísticamente significativo (p < 0,05). En las células pre-tratadas con La3+
se detectó
una concentración de ATP levemente superior a la detectada en el medio de células
tratadas con probenecid o PBS, lo cual podría deberse a un problema en la detección de
ATP y no por un efecto sobre los hemicanales formados por conexinas. Por esta razón,
se incluyó el heptanol como inhibidor de hemicanales formados por conexinas,
observándose que la concentración extracelular de ATP permaneció similar a la
detectada en células tratadas solo con FasL y la concentración de ATP en estas células es
mayor que el detectado en las células pre-tratadas con probenecid y PBS, lo cual fue
estadísticamente significativo (Figura 15A). Además se realizaron ensayos de muerte
59
celular en cultivos tratados con distintas concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) en
presencia de probenecid (1 mM) y La3+
(200 M) por 16 h. Mediante citometría de flujo
se evaluó la viabilidad, no observándose protección por parte de La3+
y probenecid en
relación a la muerte celular inducida con FasL (Figura 15B).
Mediante microscopía confocal se detectó Fas y panexina-1 en células Jurkat
tratadas con FasL (80 ng/ml) por 1, 3 y 5 h (Figura 16). En el caso de panexina-1 se
detectó un aumento a las 3 h de estímulo respecto a las células no tratadas (Control).
Mediante un análisis de fluorescencia se determinó que este aumento es estadísticamente
significativo. Por el contrario, no se observaron cambios en el caso de Fas a los distintos
tiempos estudiados.
A partir del resultado anterior se realizó un curso temporal para evaluar mediante
análisis de western blot cambios en los niveles de panexina-1 y conexina-43 en las
células Jurkat no tratadas (control) y las tratadas por 0, 1, 3 y 5 h con FasL (80 ng/ml).
Se observó un aumento marcado a partir de la primera hora en la expresión de panexina-
1 en las células tratadas con FasL (80 ng/ml), llegando a una mayor expresión a las 5 h
de tratamiento (Figura 17), en cambio no se observaron diferencias en los niveles de
conexina-43 en los tiempos de tratamiento descritos con FasL para panexina-1 (Figura
18).
Los resultados microscopía confocal (Figura 16) y de análisis de western blot
(Figura 17) sugieren que existe una asociación entre los receptores Fas y P2X7 posterior
al estímulo con FasL, lo que podría ocurrir en los dominios raft de la membrana
plasmática. La siguiente aproximación experimental entonces fue tratar las células con
un agente que remueve colesterol y que por lo tanto afecta los dominios raft, en este caso
se utilizó -metilciclodextrina ( MCD). La aproximación fue tratar las células con
distintas concentraciones de MCD (0, 5, 10 y 20 mM) por 30 min, y mediante ensayos
de MTS se determinó que la viabilidad se afecta notoriamente cuando se utilizan 20 mM
de MCD (Figura 19A). Luego se determinó la distribución del colesterol en las
distintas fracciones de la membrana plasmática. Para ello, las células se marcaron con
colesterol radiactivo (C14
) por 48 h y posteriormente se realizó fraccionamiento
60
subcelular y mediante un contador de centelleo se determinó que la mayor proporción se
encuentra entre las fracciones 4 a la 6, donde se encuentran las balsas lipídicas (Figura
19B).
A partir de los resultados anteriores, el siguiente experimento fue realizar
ensayos de muerte celular en células Jurkat pre-tratadas con 5 mM de MCD por 30
min. Posteriormente, las célula se estimularon con FasL (0-10 ng/ml) por 16 h y la
viabilidad y muerte celular se determinó mediante citometría de flujo. Al igual que lo
descrito anteriormente, la viabilidad celular disminuyó cuando las células se trataron con
concentraciones crecientes de FasL, predominando la apoptosis como tipo de muerte
celular, en cambio las células pre-tratatadas con MCD tienen un mayor porcentaje de
células vivas con una disminución marcada de la apoptosis (Figura 20).
61
A. B.
C. D.
E.
(Jurkat)
F.
(A20)
0 30 60 90 120 150 1800
30
60
90
120
150
180
FasL (0 ng/ml)
FasL (80 ng/ml)
Tiempo (min)
Inte
nsid
ad
de f
luo
rescen
cia
cap
tació
n d
e E
tid
io (
UA
)
0 30 60 90 120 150 1800
30
60
90
120
150
180
FasL (0 ng/ml)
FasL (80 ng/ml)
Probenecid (1 mM) + FasL
La3+
(200 M) + FasL
* *
**
**
***
***
Tiempo (min)
Inte
nsid
ad
de f
luo
rescen
cia
cap
tació
n d
e E
tid
io (
UA
)
62
Figura 13. Ensayo de incorporación de bromuro de etidio. Mediante microscopía de
inmersión se cuantifico la intensidad de fluorescencia asociada a la incorporación de
etidio en células Jurkat y A20. Se muestran imágenes representativas de las distintas
condiciones (A-D). (A) Corresponde a las células Jurkat no tratadas a tiempo 0 y a los
180 min (B), (C) células Jurkat tratadas con FasL (80 ng/ml) al tiempo 0 y a los 180 m
(D). (E) Incorporación de etidio en las células Jurkat no tratadas (□), tratadas con FasL
(●), y pretratadas con probenecid (1 mM) (♦) o La3+
(200 M) (○) 10 min antes de tratar
las células con FasL por 180 min. También se analizaron células A20 tratadas con (●) y
sin (□) FasL (80 ng/ml) por 180 min (F). Los resultados corresponden a tres
experimentos realizados en forma independiente (n=3), donde se analizaron un mínimo
de 20 células en cada una de los ensayos. Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
63
A.
B.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100 Cbx (0 M)
Cbx (10 M)
FasL (ng/ml)
Via
bli
lid
ad
(%
)
Figura 14. Carbenoxolona (Cbx), un inhibidor de hemicanales formados por
panexina reduce los niveles de ATP extracelular. Mediante ensayos de luminiscencia
(A), se cuantificó el ATP extracelular en células Jurkat tratadas a intervalos de 1 h hasta
un máximo de 5 h ya sea con FasL (80 ng/ml) (■), o carbenoloxona (Cbx) (10 M) (♦)
el cual se agregó 10 min antes de estimular las células con FasL. Como control se utilizó
células tratadas con PBS (●) a los mismos tiempos. Además, se realizaron ensayos de
muerte celular (B) tratando las células con FasL (□) y Cbx 10 minutos antes de tratar las
células con FasL (○) por 16 h. Posterior al estímulo, las células se marcaron con yoduro
de propidio y la viabilidad se cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados
corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 1 2 3 4 50
50
100
150FasL (80 ng/ml)
Cbx (10 M) + FasL
PBS
**
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
64
A.
B.
Figura 15. Efecto de los inhibidores de panexina (probenecid) y conexinas
(heptanol y lantano) sobre los niveles extracelulares de ATP y viabilidad celular.
Mediante ensayos de luminiscencia (A), se cuantificó niveles de ATP en el sobrenadante
de células Jurkat tratadas a intervalos de 1 h hasta un máximo de 5 h ya sea con FasL (80
ng/ml) (■), La3+
(200 M) (○), heptanol (500 M) (●), probenecid (1 mM) (▼), los
cuales se agregaron 10 min antes de estimular las células con FasL. Como control se
utilizó células tratadas con PBS (□) a los mismos tiempos. Además, se realizaron
ensayos de muerte celular (B) tratando las células con FasL (♦) y probenecid (1 mM) (*)
o La3+
(200 M) (◊) 10 minutos antes de tratar las células con FasL (□) por 16 h.
Posterior al estímulo, las células se marcaron con yoduro de propidio y la viabilidad se
cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados corresponden a tres experimentos
realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100sin inhibidor
La3+
(200 M) + FasL
Probenecid (1 mM) + FasL
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 1 2 3 4 50
50
100
150
200
250FasL (80 ng/ml)
La3+
(200 M) + FasL
Probenecid (1 mM) + FasL
PBS
Heptanol (500 M) + FasL
*
*
*
*
Tiempo (h)
AT
P (
nM
)
65
1 3
5
Control 1 3 50
50
100
150
200
250
Tiempo (h)
Px1
***
Inte
nsid
ad
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Basal 1 3 50
50
100
150
Tiempo (h)
Fas
Inte
nsid
ad
de f
luo
rescen
cia
(U
A)
Figura 16: Detección y colocalización de la panexina-1 y el receptor Fas a distintos
tiempos de estimulación con FasL. En células Jurkat se realizó un curso temporal de
los cambios de inmunoreactividad para cuantificar la expresión de panexina-1 (rojo) y
Fas (verde) frente al estímulo con FasL (80 ng/ml) por 1, 3 y 5 h, el control corresponde
a células no estimuladas. Se muestran las tinciones específicas para cada molécula y las
tinciones dobles en cada condición. Los gráficos representan el análisis fluorescencia del
promedio de la fluorescencia relativa de 120 células en cada condición. Las diferencias
se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,001 (***).
66
90
70
45 39
55
FasL
kDa Ctrl 1 3 5 (h)
-actina
0 1 3 50
1
2
3
*
Tiempo (h)
Den
sid
ad
rela
tiva
Figura 17. Detección de panexina-1 en células Jurkat a distintos tiempos de
estimulación con FasL. En células Jurkat se realizó un curso temporal de los niveles de
expresión de panexina-1 luego del estímulo con FasL (80 ng/ml) a 0 (Ctlr-no
estimuladas), 1, 3 y 5 h. En (B) se muestra la cuantificación de todas las bandas con
respecto a -actina expresada en densidad relativa con respecto a las células no
estimuladas (Ctlr). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma
independiente (n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un
p < 0,05 (*).
►
►
►
►
►
67
43
FasL
kDa Ctrl 1 3 5 (h) +
Ponceau
0 1 3 50.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Tiempo (h)
Den
sid
ad
Rela
tiva
Figura 18. Detección de la conexina-43 en células Jurkat a distintos tiempos de
estimulación con FasL. En células Jurkat se realizó una cinética para cuantificar la
expresión de conexina-43 frente al estímulo con FasL (80 ng/ml) a 0 (Ctlr-no
estimuladas), 1, 3 y 5 h, como control positivo (+) se utilizó extractos de corazón de rata
(A). En (B) se muestra la cuantificación con respecto a las proteínas teñidas con rojo
Ponceau expresada en densidad relativa con respecto a las células no estimuladas (Ctlr).
Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente
(n=3).
►
68
A.
B.
Figura 19. Ensayos de fraccionamiento subcelular de células Jurkat tratadas con
beta-metilciclodestrina ( MCD). Las células Jurkat fueron tratadas con diferentes
concentraciones de MCD (0-20 mM) por 30 min y después de 16 h se determinó la
viabilidad mediante ensayos de MTS (A). Además, previo al tratamiento con MCD, las
células se marcaron con colesterol radiactivo (C14
) y se determinó la presencia en las
distintas fracciones (B).
0 1 5 10 200.00
0.25
0.50
0.75
1.00
-metilciclodextrina (mM)
OD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130
1000
2000
3000
4000
Tritón (1%)
Fracción de membrana
cp
m
69
Figura 20. Ensayos de muerte celular en presencia de -metilciclodextrina. Células
Jurkat fueron pre-tratadas con -metilciclodextrina (5 mM) por 30 min. Posteriormente
se trataron con FasL (0-10 ng/ml) por 16 h. Después, las células se marcaron con
yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad celular (V)
y la muerte celular por apoptosis (A) o necrosis (N). Los resultados corresponden a dos
experimentos realizados en forma independiente (n=2).
0 1,25 2,5 5 10 0 1,25 2,5 5 100
20
40
60
80
100
V
A
N
FasL (ng/ml) 5mM MCD + FasL (ng/ml)
célu
las (
%)
70
4.3. Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa
apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20.
FasL aumenta la concentración extracelular de ATP en el medio de las células
Jurkat (Figura 11) y según nuestra hipótesis este ATP podría activar a P2X7 potenciando
la respuesta de muerte celular apoptótica. Por lo tanto, las células Jurkat se trataron con
distintas concentraciones de FasL durante 16 h, con o sin pre-incubación por 1 h con
oATP (un inhibidor de receptores P2X7). Después del tiempo de estímulo, las células se
tiñeron con yoduro de propidio y la viabilidad y el tipo de muerte celular se cuantificó
mediante citometría de flujo. Después de las 16 h de incubación, las células Jurkat
mostraron una disminución de la viabilidad dependiente de la concentración de FasL.
Sin embargo, hubo reducción de la muerte celular cuando estas células fueron pre-
incubadas con oATP, observándose una mayor viabilidad que fue estadísticamente
significativa (p<0,001 y p<0,05) (Figura 21A). Paralelo a esto, determinamos el efecto
de oATP sobre la muerte celular apoptótica y necrótica. Las células Jurkat estimuladas
con FasL murieron principalmente por apoptosis, lo que aumentó en forma
concentración dependiente. Ahora, esta respuesta fue prevenida al pre-tratar las células
con oATP (Figura 21B), observándose diferencias estadísticamente significativas entre
las células estimuladas con FasL y las pre-tratadas con oATP (p < 0,05 y p < 0,01).
Además, un porcentaje bajo de células murió por necrosis que aumentó levemente a
medida que aumentó la concentración de FasL, pero al pre-tratarlas con oATP este
porcentaje de células necróticas se mantuvo constante (Figura 21C). Otro inhibidor
descrito recientemente para los receptores P2X7 es el Brillant Blue G (BBG). Por lo
tanto, se realizó en células Jurkat ensayos de muerte celular tratando las células también
por 16 h con FasL (0-80 ng/ml), o bien se pre-trató con BBG (50 M) 1 h antes de
estimularlas con FasL. Después del tiempo de estímulo, las células se tiñeron con yoduro
de propidio y la viabilidad y el tipo de muerte celular se cuantificó mediante citometría
de flujo (Figura 22). El pre-tratamiento con BBG aumentó la viabilidad en las células
Jurkat que se trataron posteriormente con FasL (Figura 22A), observándose además una
disminución marcada de la apoptosis (Figura 22B), que en ambos casos es
71
estadísticamente significativo. En cuanto a la necrosis, no se observó diferencias entre
las células tratadas con FasL y las pre-tratadas con BBG (Figura 22C).
Existen evidencias que apoyan el concepto que al estimular el receptor P2X7 se
produce formación de ceramidas mediante un incremento en la actividad de la
esfingomielinasa neutra, lo que gatillaría la muerte celular por apoptosis o necrosis
(Veldman at al., 2001; Garcia-Marcos et al., 2006). Por lo tanto, la siguiente
aproximación fue realizar los mismos ensayos de muerte celular pre-incubando 45 min
antes con los inhibidores de las distintas vías de producción de ceramidas: Miriocina (via
de novo), Imipramina (esfingomielinasa ácida) y GW4869 (esfingomielinasa neutra). En
las células Jurkat, la viabilidad celular disminuyó en forma dosis dependiente al tratar
las células con FasL y no es revertida por Miriocina (Figura 23A). Derivado de los
anterior, el tipo de muerte celular, ya sea la apoptosis (Figura 23B) o la necrosis (Figura
23C) no disminuye al pre-tratar las células con estos inhibidores. Un comportamiento
similar se observa al pre-tratar las células con el inhibidor de esfingomielinasa ácida
(Imipramina) (Figura 24), observándose disminución de la viabilidad celular que no es
revertido por el inhibidor (Figura 24A). Además se ve que el pre-tratamiento no tiene
efecto protectivo sobre la apoptosis (Figura 24B) ni la necrosis (Figura 24C). Al utilizar
GW4869 (Figura 25), se observa que al pre-tratar las células con este inhibidor no hay
mayor viabilidad (Figura 25A), ni hay efecto protectivo sobre la apoptosis (Figura 25B)
y sobre la necrosis (Figura 25C).
Por otra parte, se evaluó la capacidad protectora del antioxidante N-acetilcisteína
(NAC), ya que existen antecedentes previos del laboratorio en los cuales NAC tiene un
efecto protector en células Jurkat tratadas con ceramida (Villena et al., 2008). Por lo
tanto, las células Jurkat, fueron pre-tratadas 45 min con NAC (10 mM) antes de
agregarles FasL (0-80 ng/ml), despúes del tiempo de incubación se observó una mayor
viabilidad celular (Figura 26A) y una menor apoptosis que es estadísticamente
significativa (Figura 26B), pero no sobre la necrosis (Figura 26C).
Derivado de lo anterior es que se realizó un curso temporal para cuantificar
especies reactivas de oxígeno (ROS). Para ello, mediante citometría de flujo, se
72
cuantificó la generación de ROS mediante la sonda DHR123. Las células Jurkat se
trataron por hasta 6 h (a intervalos de 1h) con FasL (20 ng/ml) y posteriormente se
cargaron con la sonda Dihidrorodamina123 (1.4 μg/ml). Se analizó mediante citometría
de flujo, observándose un aumento en la razón células sin estímulo/células estimuladas
con FasL. A las 6 h la diferencia era estadísticamente significativa (Figura 27).
La siguiente aproximación experimental fue tratar las células Jurkat con
agonistas de P2X7, para ello se utilizó NAD+ y BzATP. En el caso de NAD
+ se ha
descrito que puede activar los receptores P2X7 e inducir la muerte de las células T
mediante un mecanismo dependiente de ART2.2. Por lo tanto, se trató las células Jurkat
con concentraciones crecientes de NAD+ (Figura 28). Se realizó ensayos de muerte
celular por 16 h con distintas concentraciones de NAD (0-20 M) y mediante citometria
de flujo se evaluó la viabilidad (V) y la muerte celular por apoptosis (A) y necrosis (N)
(Figura 28A). Se observa que no existe efecto de NAD+ sobre la viabilidad celular y
derivado de esto sobre el tipo de muerte celular. Se realizó otro experimento similar pero
utilizando mayores concentraciones de NAD+ (0-200 M) esta vez por 24 h. Pero
tampoco se ve efecto de NAD+ sobre las células Jurkat, ya que no se observó efecto
sobre la viabilidad ni el tipo de muerte celular (Figura 28B).
El siguiente experimento fue realizar ensayos de muerte celular con otro agonista
de P2X7, para ello células Jurkat y A20 se incubaron con concentraciones crecientes de
BzATP (0-600 M) por 16 h y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad
(V) y la muerte celular ya sea por apoptosis (A) o necrosis (N). No se observó inducción
de muerte celular en las células Jurkat (Figura 29), por lo que a continuación se utilizó
las mismas concentraciones de BzATP (100, 300 y 600 M) pero en presencia de FasL
(0-80 ng/ml) en células Jurkat (Figura 30). Se observa que estas concentraciones altas de
BzATP tienen un efecto protector aumentando la viabilidad (Figura 30A) y
disminuyendo la apoptosis cuando es incubado en presencia de 20 y 40 ng/ml de FasL
(Figura 30B), pero sin efecto sobre la necrosis (Figura 30C).
A fin de clarificar el efecto observado en el experimento anterior, realizamos
nuevamente ensayos de muerte celular con FasL (0-80 ng/ml) pero en presencia de
73
concentraciones más bajas de BzATP (25 y 50 M) por 16 h. Después del tiempo de
incubación cuantificamos la viabilidad y muerte celular mediante citometria de flujo
(Figura 31). En este caso no observamos efecto protector de BzATP ya que no se
aprecian cambios en la viabilidad (Figura 31A), ni en la muerte celular por apoptosis
(Figura 31B) y necrosis (Figura 31C)
Considerando que obtuvimos efecto protector sobre la muerte celular inducida
por FasL en células Jurkat, solo con los antagonistas de P2X7 (oATP y BBG) pero no
con los agonistas (BzATP y NAD+), cabe pensar que podrían estar participando otros
receptores P2X distintos a P2X7. Por lo tanto, para descartar esto la siguiente
aproximación fue utilizar otro antagonista del receptor P2X7. Se ha descrito que los
receptores P2X7 son potentemente inhibidos por concentraciones micromolares de Cu2+
,
caracterizándose sitios de unión en el dominio extracelular del receptor P2X7. Por lo
tanto, se realizó ensayos de muerte celular utilizando citometría de flujo en células
Jurkat pre-tratadas por 10 min con Cu2+
(5 y 10 M) antes de incubarlas con
concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml) (Figura 32). Se observa un efecto
protector del Cu2+
, ya que existe una mayor viabilidad de las células Jurkat pre-tratadas
en comparación con las células tratadas solo con FasL (Figura 32A), lo que se traduce en
una menor apoptosis (Figura 32B) sin afectar la necrosis (Figura 32C).
Derivado de los resultados obtenidos con los inhibidores del receptor P2X7,
observamos que en las células Jurkat BBG, oATP y Cu2+
tienen efecto protector ya que
estas células presentan una menor apoptosis cuando se estimulan en conjunto con FasL.
Es importante señalar que en las células Jurkat predomina la apoptosis tipo II, por lo
tanto un componente importante que podría amplificar la apoptosis es la activación de
caspasa-9 como consecuencia de la salida de ATP por panexina-1 y la activación del
receptor P2X7 por el ATP. Por lo tanto, realizamos ensayos de muerte celular en células
Jurkat tratadas con el inhibidor de caspasa-9 (z-LEHD) (20 y 50 M) y con
concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml). Mediante citometría de flujo se
determinó la viabilidad y el tipo de muerte celular (Figura 33). Se aprecia que en las
células tratadas con z-LEHD existe una mayor viabilidad (Figura 33A) y una menor
74
apoptosis (Figura 33B) en comparación con las células tratadas solo con FasL, y como
era de esperar no se observó cambios en la muerte celular por necrosis (Figura 33C).
Por último, quisimos reproducir los resultados obtenidos en células Jurkat en
linfocitos T normales. Para ello mediante microbeads acopladas a anticuerpos anti-CD3
humano realizamos la purificación de estas células a partir de concentrados leucocitarios
obtenidos de individuos sanos. La purificación se evaluó mediante citometría de flujo
obteniéndose un 99% de células CD3+ (Figura 34A). Estas células se estimularon por 48
hrs con IL-2 (50 U/ml) de acuerdo a protocolos descritos previamente (Alderson et al.,
1995; Holler et al., 2000; Paulsen et al., 2009; Fang et al., 2010). Sin embargo, no se
pudo inducir muerte en los linfocitos normales al estimularlos con FasL (Figura 34B).
En resumen, en las células Jurkat la muerte celular por apoptosis depende en
parte de la salida de ATP, el cual estimularía a P2X7 generando ROS y de esta manera
gatillaría apoptosis. Esto se demuestra al inhibir la apoptosis ya sea con los inhibidores
de P2X7 oATP y BBG, y la generación de ROS con NAC. En este caso no habría
participación de ceramidas ya que ninguno de los inhibidores de las distintas vías de
generación de ceramidas protege a las células cuando se estimulan con FasL.
Lo siguiente, fue realizar los ensayos descritos en células Jurkat en la otra línea
celular sensible a FasL, que corresponde a las células A20, en las cuales el principal tipo
de muerte en respuesta a FasL es la necrosis. Para ello la primera aproximación fue
utilizar el inhibidor de P2X7 oATP. Las células A20 se incubaron con distintas
concentraciones de FasL durante 16 h, con o sin incubación previa por 1 h con oATP
(600 M). Es así como después de 16 h de incubación con FasL, se observó una
disminución de la viabilidad dependiente de la concentración de FasL, que se revierte
cuando las células son pre-incubadas por 1 h con oATP (Figura 35A), siendo este efecto
estadísticamente significativo (p > 0,05). En cambio, en las células A20 se observó un
porcentaje bajo de células que mueren por apoptosis (Figura 35B), que al pre-tratarlas
con oATP, se mantiene constante. El tipo de muerte celular que predomina al
estimularlas con FasL es la necrosis, que aumenta en forma dosis dependiente, y que a
75
su vez es revertido al pre-tratar las células con oATP (Figura 35C). En este caso, las
diferencias eran estadísticamente significativas y alcanzan un valor de p < 0,05.
A continuación, se utilizó el otro inhibidor de P2X7, para ello las células A20
fueron pre-tratadas con BBG (50 M) 1 h antes de estimularlas con FasL (0-80 ng/ml).
Después del tiempo de estímulo, las células se tiñeron con yoduro de propidio y la
viabilidad y el tipo de muerte celular se cuantificó mediante citometría de flujo. El pre-
tratamiento con BBG no tiene efecto en la viabilidad celular observándose el mismo
efecto en las células tratadas con FasL y las pre-tratadas con BBG (Figura 36A), además
no se observó efecto sobre la apoptosis (Figura 36B). En cuanto a la necrosis, no se
observó efecto protectivo ya que se observó el mismo efecto de FasL en células con y
sin pre-tratamiento con BBG (Figura 36C).
Derivado de lo anterior, se utilizó suramina, un inhibidor de varios receptores
P2Y (1, 2, 6 y 11) y P2X (1, 2, 3, 5). Se realizó ensayos de muerte celular por 16 h
tratando las células con FasL (0-80 ng/ml) o pre-tratandolas por 30 min con suramina
(200 M), y posteriormente estimuladas con FasL (Figura 37). El pre-tratamiento induce
protección ya que la viabilidad fue mayor con 10, 20 y 40 ng/ml de FasL, lo cual fue
estadísticamente significativo (Figura 37A). Además, se observó una reducción en la
apoptosis en células pre-tratadas con suramina y posteriormente tratadas con FasL, lo
cual fue estadísticamente significativo con 10, 20 y 40 ng/ml de FasL (Figura 37B). En
cambio no se observó cambios en la muerte por necrosis (Figura 37C).
Adicionalmente, se realizó un curso temporal por 12 h (cada 3 h) con 200 M de
suramina agregándolo 30 min antes de la adición de FasL (40 ng/ml) (Figura 38). Se
observó una mayor viabilidad de las A20 entre las 9 y 12 h, lo cual fue estadísticamente
significativo (Figura 38A) y se observó nuevamente un efecto reductor de la apoptosis
entre las 9 y 12 h que también fue estadísticamente significativo (Figura 38B), no
observándose este efecto sobre la necrosis (Figura 38C).
Según el objetivo propuesto, la activación de P2X7 gatillaria la muerte celular por
necrosis en las células A20, lo que podría estar dado por la producción de ceramidas que
sería un componente importante en la muerte celular por necrosis inducida por FasL.
76
Para ello realizamos ensayos de muerte celular, descritos en el Objetivo 1, tratando las
células A20 con distintas concentraciones de FasL por 16 h, pero pre-incubando 45 min
antes con los inhibidores de las distintas vías de producción de ceramidas: Miriocina y
Fumonisina B1 (via de novo), Imipramina (esfingomielinasa ácida) y GW4869
(esfingomielinasa neutra). En las células A20 (Figura 39), la viabilidad celular
disminuyó en forma dosis dependiente al tratar las células con FasL y no aumentó con
ninguno de los 2 inhibidores de la síntesis de novo de ceramidas (Miriocina y
Fumonisina B1) (Figura 39A yB). Estos mismos inhibidores tienen efectos significativos
en células MIN6 al tratarlas con palmitato (resultados no mostrados). Pero en las células
A20 el tipo de muerte celular, ya sea la apoptosis (Figura 39C y D) o necrosis (Figura
39E y F) no disminuyó al pre-tratar las células con estos inhibidores. Un
comportamiento similar se observó al pre-tratar las células con el inhibidor de
esfingomielinasa ácida (Imipramina) (Figura 40), se observó disminución de la
viabilidad celular que no es revertido por el inhibidor (Figura 40A), y no hay efecto
protectivo sobre la apoptosis (Figura 40B) y necrosis (Figura 40C). En el caso de
GW4869 (Figura 41), se observó que al pre-tratar las células con este inhibidor hay una
viabilidad mayor con 10 y 20 ng/ml de FasL (Figura 41A), lo cual es estadísticamente
significativo. No se observó efecto sobre la apoptosis (Figura 41B) y en el caso de la
necrosis solo se observó una tendencia con 20 ng/ml de FasL (Figura 41C).
A fin de clarificar esta observación, realizamos un curso temporal por 12 h
(medido cada 3 h) con este inhibidor, se utilizó 5 y 10 M de GW4869 y se agregó 30
min antes de agregar FasL (40 ng/ml) (Figura 42). La viabilidad es mayor al pre-tratar
con GW4869 (10 M) a las 9 h, y se observó un aumento leve (Figura 42A), lo cual fue
estadísticamente significativo. No se observó efecto sobre la apoptosis a ninguno de los
tiempos (Figura 42B) y sobre la necrosis se ve solo un leve efecto a las 9 h (Figura 42C).
Al igual que en las células Jurkat, se evaluó la capacidad protectora del
antioxidante N-acetilcisteína (NAC), en base a los antecedentes previos del laboratorio
en los cuales NAC tiene un efecto protector en células A20 tratadas con ceramida
(Villena et al., 2008). Por lo tanto, se pre-trató las células con N-acetilcisteína (NAC)
77
(20 mM) antes de inducir muerte celular con FasL (0-80 ng/ml), se observó mayor
viabilidad celular que cuando las células son tratadas con diferentes concentraciones de
FasL (Figura 43A) y se observó una disminución marcada en la necrosis, que es
estadísticamente significativa (Figura 43C), pero no sobre la apoptosis (Figura 43B).
El siguiente experimento fue realizar ensayos de muerte celular con el agonista
de P2X7, para ello células A20 fueron incubadas con concentraciones creciente de
BzATP (0-600 M) por 16 h y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad
(V) y la muerte celular ya sea por apoptosis (A) o necrosis (N). No se observó inducción
de muerte celular en las células A20 (Figura 44).
En resumen, las células A20 al ser estimuladas con FasL mueren por necrosis y
este tipo de muerte celular depende en parte de receptores P2 distintos a P2X7, los cuales
generarían ceramidas y ROS, lo cual se demuestró al utilizar el inhibidor específico de
esfingomielinasa neutra (GW4869) y NAC. Además, la muerte por apoptosis, si bien no
es el principal tipo de muerte celular en estas células, podría depender tanto de
receptores P2Y (1, 2, 6 y 11) como de receptores P2X (1, 2, 3, 5), lo cual se demuestró
al pretratar las células con suramina.
78
A.
B.
C.
Figura 21. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad y
muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. En ensayos de muerte
cellular, las células A20 se estimularon por 16 h con distintas concentraciones de FasL
(0 a 80 ng/ml) (○). Además, en paralelo se preincubaron estas células con oATP (600
M) (●) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL. Después las células se
tiñeron con yoduro de propidio y la viabilidad (A) y muerte celular por apoptosis (B) y
necrosis (C) se cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados corresponden a
tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se
consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*) o p < 0,01 (**).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
oATP (0 M)
oATP (600 M)
Necro
sis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
*
*
***
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
*** *
*
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
79
A.
B.
C.
Figura 22. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor P2X7 en la
viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. En ensayos
de muerte celular, las células Jurkat se estimularon por 16 h con distintas
concentraciones de FasL (0 a 80 ng/ml) (○). Además, en paralelo, se pre-incubaron estas
células con BBG (50 M) (●) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL.
Después del tiempo de incubación, las células se tiñeron con yoduro de propidio y
mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C).
Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente
(n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
**
*
**
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
* * ***
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
BBG (0 M)
BBG (50 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
80
A.
B.
C.
Figura 23. Efecto de Miriocina, un inhibidor de la vía de novo de la producción de
ceramidas, en la muerte celular por apoptosis y necrosis. Células Jurkat se pre-
trataron con el inhibidor de la vía de novo de la producción de ceramidas, Miriocina
(100 nM) (□) 45 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de
FasL (0 a 80 ng/ml) (■). Posteriormente, se tiñeron las células con yoduro de propidio y
mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C).
Los resultados corresponden dos experimentos en duplicado.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
Miriocina (0 mM)
Miriocina (100 mM)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
81
A.
B.
C.
Figura 24. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida, en la
viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat estimuladas
con FasL. Células Jurkat se pre-trataron con el inhibidor de la esfingomielinasa ácida
(Imipramina) (20 M) (□), 45 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas
concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con
yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la
muerte celular por apoptosis (B). Los resultados corresponden a tres experimentos
realizados en forma independiente (n=3).
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Imipramina 0 M)
Imipramina 20 M)
Necro
sis
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
82
A.
B.
C.
Figura 25. Efecto de GW4869, un inhibidor específico de la esfingomielinasa
neutra, en la viabilidad y la muerte celular por apoptosis y necrosis en las células
Jurkat estimuladas con FasL. Células Jurkat se pre-trataron con GW4869 (5 M) (□),
30 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0-80
ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante
citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A), la apoptosis (B) y la necrosis (N). Los
resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
GW4869 0 ( M)
GW4869 (5 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
83
A.
B.
C.
Figura 26. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por apoptosis y
necrosis en células Jurkat estimuladas con FasL. Células Jurkat se pre-trataron con
N-acetil cisteína (NAC) (10 mM) (□), 45 min antes de estimularlas por 16 h con
distintas concentraciones de FasL (0- 80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se
tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad
(A) y la muerte celular por apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a
tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se
consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*) y p < 0,01 (**).
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
*
* **
Ap
op
tosis
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
NAC (0 mM)
NAC (10 mM)
Necro
sis
(%
)
84
Figura 27. Cuantificación de ROS en células Jurkat estimuladas con FasL. Células
Jurkat se trataron con FasL (20 ng/ml) (■) por 6 h. Posteriormente, las células se
marcaron con DHR123 por 30 min y luego mediante citometría de flujo se cuantificó la
producción de ROS en relación a las células no estimuladas. Los resultados
corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05.
0 1 2 3 4 5 60.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
FasL (20 ng/ml)
*
Tiempo (h)
DH
R 1
23 (
UA
)
85
A.
B.
Figura 28: Efecto de NAD+, un agonista de P2X7, en la viabilidad y muerte celular
por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células Jurkat se trataron con NAD por 16
(A) y 24 h (B). Posteriormente, las células se marcaron con yoduro de propidio y
mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad celular (V) y la muerte celular
por apoptosis (A) y necrosis (N). Los resultados corresponden a tres experimentos
realizados en forma independiente (n=3).
0 1,25 2,5 5 10 200
20
40
60
80
100
V
A
N
NAD ( M)
célu
las (
%)
0 6,25 12,5 25 50 100 2000
20
40
60
80
100
V
A
N
NAD ( M)
célu
las (
%)
86
Figura 29: Efecto de BzATP, un agonista de P2X7, en la viabilidad y muerte celular
por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células Jurkat (A) y A20 (B) fueron
tratadas con Bz ATP (0-600 M) por 16 h. Posteriormente, las células se marcaron con
yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la viabilidad celular (V)
y la muerte celular por apoptosis (A) y necrosis (N). Los resultados corresponden a tres
experimentos realizados en forma independiente (n=3).
0 3,12 6,25 12,5 25 50 100 6000
20
40
60
80
100
V
A
N
Bz-ATP ( M)
célu
las (
%)
87
A.
B.
C.
Figura 30. Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7, y FasL
en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células
Jurkat fueron pre-tratadas con BzATP (0-600 M) antes de agregarles FasL (0-80 ng/ml)
por 16 h. Posteriormente, las células se marcaron con yoduro de propidio y mediante
citometría de flujo se cuantificó la viabilidad celular (A) y la muerte celular por
apoptosis (B) o necrosis (C). Los resultados corresponden a dos experimentos realizados
en forma independiente (n=2).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
BzATP (0 M)
BzATP (100 M)
BzATP (300 M)
BzATP (600 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
88
A.
B.
C.
Figura 31. Efecto de concentraciones bajas BzATP, un agonista de P2X7, y FasL en
la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células
Jurkat fueron pre-tratadas con concentraciones bajas de BzATP (50 y 25 M) antes de
agregarles FasL (0-80 ng/ml) por 16 h. Posteriormente, las células se marcaron con
yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la viabilidad celular (A)
y la muerte celular por apoptosis (B) o necrosis (C). Los resultados corresponden a dos
experimentos realizados en forma independiente (n=2).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
BzATP ( )
BzATP (50 )
BzATP (25 )
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
89
A.
B.
C.
Figura 32. Efecto del inhibidor de P2X7, Cu2+
, en la viabilidad y muerte celular por
apoptosis y necrosis. En ensayos de muerte celular, las células Jurkat se estimularon por
16 h con distintas concentraciones de FasL (0 a 80 ng/ml) (□). Además, en paralelo, se
pre-incubaron estas células con 10 (●) y 5 M (○) de Cobre (Cu+2
) por 10 min y
posteriormente se estimularon con FasL. Después del tiempo de incubación, las células
se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la
viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a tres
experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
*
**
* * * *
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100* * * *
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
Cu+2
(0 M)
Cu+2
(10 M)
Cu+2
(5 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
90
A.
B.
C.
Figura 33. Efecto del inhibidor de caspasa 9, z-LEHD, en la viabilidad y muerte
celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Las células se trataron con
concentraciones crecientes de FasL (□) o bien se trataron en forma conjunta con 50 M
(●) o 20 M (○) de z-LEHD. La viabilidad (A) y la muerte celular por apoptosis (B) y
necrosis (C) se cuantifico 16 h después del estímulo con FasL mediante citometría de
flujo, marcando las células con yoduro de propidio. Los resultados corresponden a tres
experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
*
* * * *
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
* * * *
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
z-LEHD 0 M)
z-LEHD (50 M)
z-LEHD (20 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
91
A.
CD3_Tube_003.fcs
CD3-PE
FIT
C-H
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
0,55%
0,00%
99,33%0,55%
0,12%0,00%
B.
Figura 34. Ensayos de muerte celular en linfocitos T CD3+ tratados con FasL.
Linfocitos T CD3+ se purificaron a partir de concentrados leucocitarios mediante
microbeads acopladas a anticuerpos anti-CD3 humano. Se muestra un dot plot
representativo de la purificación (A). Las células se cultivaron en presencia de IL-2 (50
U/ml) por 2 días y se estimularon con FasL (0-160 ng/ml) por 16 h. Posteriormente, las
células se marcaron con ioduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó
la viabilidad celular (V) y la muerte celular por apoptosis (A) o necrosis (N) (B). Los
resultados corresponden a dos experimentos realizados en forma independiente (n=2).
0 1,25 2,5 5 10 20 40 80 160 0 1,25 2,5 5 10 20 40 80 1600
20
40
60
80
100
V
A
N
0 U/ml IL-2 50 U/ml IL-2
FasL (ng/ml)
célu
las (
%)
92
A.
B.
C.
Figura 35. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad y
muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20. En ensayos de muerte
cellular, las células A20 (C, D) se estimularon por 16 h con distintas concentraciones de
FasL (0 a 80 ng/ml) (■), además en paralelo se preincubaron estas células con oATP
(600 M) (□) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL. Después del tiempo de
estímulo, las células se tiñeron con yoduro de propidio y la muerte celular por apoptosis
(A y C) y necrosis (B y D) se cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados
corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*) o p < 0,01
(**).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
*
Necro
sis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
*
*
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
93
A.
B.
C.
Figura 36. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor P2X7 en la
viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20. En ensayos de
muerte celular, las células A20 se estimularon por 16 h con distintas concentraciones de
FasL (0 a 80 ng/ml) (○). Además, en paralelo, se pre-incubaron estas células con BBG
(50 M) (●) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL. Después del tiempo de
incubación, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo
se cuantificó la viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden
a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
BBG (0 M)
BBG (50 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
94
A.
B.
C.
Figura 37. Efecto de suramina, un inhibidor de receptores P2, en las células A20
estimuladas con FasL. Células A20 se pre-trataron con suramina (200 M) (□), 30 min
antes de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) (■).
Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de
flujo se cuantificó la viabilidad (A), la apoptosis (B) y la necrosis (N). Los resultados
corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
*
*
*
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
* **
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
Suramina (0 M)
Suramina (200 M)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
95
A.
B.
C.
Figura 38. Curso temporal del efecto de suramina en la viabilidad y muerte celular
por apoptosis y necrosis en las células A20 estimuladas con FasL. Células A20 se
pre-trataron con suramina (200 M) (□), 30 minutos antes de estimularlas por 12 h con
FasL (40 ng/ml). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y
mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular por
apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados
en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente
significativas a un p < 0,05 (*).
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
*
*
Via
bil
idad
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
* *
Ap
op
tosis
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
Suramina (0 M)
Suramina (200 M)
Necro
sis
(%
)
96
A. B.
C. D.
E. F.
Figura 39. Efecto de los inhibidores de la vía de novo de la producción de ceramidas
en la viabilidad y en la muerte celular por apoptosis y necrosis. Células A20 se pre-
trataron con inhibidores de la vía de novo de la producción de ceramidas, Miriocina (100
nM) (▼) y 200 nM (●) y Fumonisina B1 (50 M) (▲) y 100 M (○) 45 minutos antes
de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0 a 80 ng/ml) (■).
Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de
flujo se cuantificó la viabilidad (A y B), apoptosis (C y D) y necrosis (E y F). Los
resultados corresponden a un experimento en duplicado para cada una de las
condiciones.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100sin inhibidores
FB1 (50 M)
Myr (100 nM)
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100 sin inhibidores
FB1 (100 M)
Myr (200 nM)
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
97
A.
B.
C.
Figura 40. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida, en la
viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 estimuladas con
FasL. Células A20 se pre-trataron con el inhibidor de la esfingomielinasa ácida
(Imipramina) (20 M) (□), 45 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas
concentraciones de FasL (0- 80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con
yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la
muerte celular por necrosis (B). Los resultados corresponden a tres experimentos
realizados en forma independiente (n=3).
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Imipramina (0 M)
Imipramina (20 M)
Necro
sis
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
98
A.
B.
C.
Figura 41. Efecto de GW4869, un inhibidor específico de la esfingomielinasa
neutra, en la muerte celular por apoptosis y necrosis en las células A20 estimuladas
con FasL. Células A20 se pre-trataron con GW4869 (5 M) (□), 30 minutos antes de
estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0- 80 ng/ml) (■).
Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de
flujo se cuantificó la viabilidad (A), la apoptosis (B) y la necrosis (N). Los resultados
corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
*
*
FasL (ng/ml)
Via
bil
idad
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 800
25
50
75
100
GW4869 (0 uM)
GW4869 (5 uM)
FasL (ng/ml)
Necro
sis
(%
)
99
A.
B.
C.
Figura 42. Curso temporal de GW4869, un inhibidor de la esfingomielinasa neutra
en la muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 estimuladas con FasL.
Células A20 se pre-trataron con el inhibidor de la esfingomielinasa neutra (GW4869) (5
y 10 M), 30 min antes de estimular las células por 12 h (a intervalos de 3 h) con FasL
(40 ng/ml). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante
citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular por apoptosis (B) y
necrosis (C). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma
independiente (n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un
p < 0,05 (*).
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
*
Via
bil
idad
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
Ap
op
tosis
(%
)
0 3 6 9 120
25
50
75
100
Tiempo (h)
GW4869 (0 M)
GW4869 (5 M)
GW4869 (10 M)
*
Necro
sis
(%
)
100
A.
B.
C.
Figura 43. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por apoptosis y
necrosis en células A20 estimuladas con FasL. Células A20 se pre-trataron con N-
acetil cisteína (NAC) (20 mM) (□), 45 min antes de estimularlas por 16 h con distintas
concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con
yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la
muerte celular por apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a tres
experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***).
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
*
Via
bil
idad
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
Ap
op
tosis
(%
)
0 20 40 800
25
50
75
100
FasL (ng/ml)
*** ** *
NAC (0 mM)
NAC (20 mM)
Necro
sis
(%
)
101
Figura 44: Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7 y FasL
en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20. Células
A20 fueron tratadas con Bz ATP (0-600 M) por 16 h. Posteriormente, las células se
marcaron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la
viabilidad celular (V) y la muerte celular por apoptosis (A) y necrosis (N). Los
resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).
0 3,12 6,25 12,5 25 50 100 6000
20
40
60
80
100
V
A
N
Bz-ATP ( M)
célu
las (
%)
102
5. DISCUSIÓN.
Los resultados obtenidos en linfocitos T derivados de leucemia aguda (células
Jurkat) apoyan el modelo propuesto en el que dos receptores de muerte celular, Fas y
P2X7, se comunican entre sí de tal forma que al estimular las células con FasL se induce
muerte de los linfocitos T neoplásicos principalmente por apoptosis. Se conoce que la
interacción Fas-FasL induce la activación de caspasa-8, lo que posteriormente conduce a
la activación de la caspasa-3 efectora. Un hallazgo importante de esta Tesis, es que la
activación de caspasa-8 conlleva a la liberación de ATP extracelular mediada por
hemicanales formados por panexina-1. La salida de ATP desde la célula a su vez activa
al receptor P2X7, siendo este responsable de potenciar la muerte celular por apoptosis,
en un evento que probablemente involucra la participación de especies reactivas de
oxígeno y en el cual se produciría también activación de caspasa-9 la que finalmente
llevaría a activación de caspasa-3. Esto refuerza el concepto de que las células Jurkat son
células tipo II, y añade un nuevo mecanismo en el cual se necesitaría una señal
dependiente de la activación del receptor P2X7 para completar el proceso apoptótico.
Considerando que las células Jurkat son sensibles a FasL, la primera
aproximación fue determinar, por citometría de flujo, los niveles de expresión del
receptor Fas en la superficie celular (Figura 3). Si bien, presenta niveles inferiores a las
otras líneas celulares humanas esto no explica las diferencias en la sensibilidad a FasL,
como si podría ocurrir con las células Raji que a pesar de que casi el 100% de la
población celular expresa el receptor Fas estás células no son sensibles a FasL lo que
podría deberse a que carecen de actividad escramblasa para lípidos en la membrana
plasmática (Tepper et al., 2001), por lo tanto los niveles de ceramida no se incrementan
en respuesta a la activación por Fas. El otro componente importante es la presencia del
receptor P2X7, que en el caso de las células Jurkat se expresa al igual que la mayoría de
las líneas celulares analizadas (Figura 4).
Al realizar ensayos de muerte celular utilizando FasL, las células Jurkat mueren
principalmente por apoptosis (Figura 6). Esto difiere de lo publicado en nuestro
103
laboratorio, en el sentido que las célula Jurkat presentaba un mayor porcentaje de células
que morían por necrosis (Hetz el al., 2002) frente el estímulo con FasL. Esto podría
deberse a la naturaleza del FasL y la concentración utilizada. En los primeros
experimentos (Hetz el al., 2002) se utilizaban concentraciones que alcanzaban a los 400
ng/ml en cambio en los ensayos descritos en esta Tesis la máxima concentración
utilizada era 80 ng/ml. Otro aspecto no menos importante es el origen de las células
utilizadas. Las células Jurkat son distintas a las utilizadas en esas publicaciones (a
diferencia de las células A20), ya que provienen de laboratorios distintos (Suiza,
España) lo cual junto a la naturaleza del FasL podrían explicar las diferencias
observadas.
En cuanto al origen del ATP, se ha determinado mediante fluorescencia
utilizando un compuesto que se une a nucleótidos llamado quinacrina, que en
poblaciones purificadas de linfocitos CD4+ vírgenes, el ATP se encuentra distribuido en
forma homogénea en el citosol sin evidencias de tinción vesicular ni de gránulos
secretorios. Además una confirmación de la distribución citosólica del ATP viene del
hecho que al realizar fraccionamiento subcelular y determinar la localización del ATP
este se encuentra exclusivamente en el citosol y no en las fracciones que contienen
membranas. Por otra parte, se describe que la estimulación de células T con anticuerpos
anti-CD3 antes del fraccionamiento resultó en una mayor recuperación de ATP en las
fracciones citosólica en comparación a las fracciones citosólica de las células sin tratar.
Estos resultados excluyen un mecanismo en el que la liberación de ATP a partir de las
células T activadas sea vesicular y sugieren que el ATP puede ser liberado a través de
hemicanales de panexina (Schenk et al., 2008).
En relación a la generación de ATP extracelular, hasta la fecha, solo se ha
demostrado recientemente la presencia de la ecto-ATP sintetasa funcional en la
superficie neuronal. Mediante inmunoblot e inmunofluorescencia se ha demostrado la
distribución superficial de las subunidades α, β de la ATP sintetasa F1. Por otra parte,
estas subunidades se encontraron también en fracciones de membrana plasmática y en
las balsas lipídicas aisladas de cerebro de rata. El análisis mediante citometría de flujo
104
demuestra la presencia de subunidades α en la superficie de las células cerebrales. En
ensayos de actividad se ha demostrado la generación de ATP extracelular de cultivos de
neuronas. Por lo tanto, la ATP sintetasa en la superficie de las neuronas pueden estar
implicados en los mecanismos de generación de ATP extracelular (Xing, 2011). Sin
embargo, no se estudió esta posibilidad en ese trabajo.
Por otro lado, los mecanismos de liberación de ATP son variados, según el tipo
celular participan hemicanales de conexina-43 (Cnx-43), el canal aniónico regulado por
volumen (VRAC), el receptor purinérgico P2X7 (Maroto y Hamill, 2001; Bal-Price et
al., 2002; Parpura et al., 2004) e incluso por exocitosis en linfocitos T de ratón activados
mediante con anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 (Tokunaga et el., 2010). Existían
evidencias que daban cuenta de la participación de conexinas en los mecanismos de
liberación de ATP (Anselmi et al., 2008) y otros trabajos más recientes describen la
participación de panexina-1 en la liberación de ATP en linfocitos T, que en este caso
constituiría una señal co-estimuladora que lleva a una activación más eficiente de estas
células (Schenk et al., 2008; Yip et al., 2009). Por lo tanto, otra caracterización fue en
cuanto a los niveles de panexina-1 y conexina-43. Al analizar mediante western blot las
distintas líneas celulares se observa que en todas hay expresión de las distintas isoformas
de panexina-1 (Figura 5A), pero conexina-43 solamente se expresa en células B de ratón
(A20 y A20R) (Figura 5B), aunque al realizar un curso temporal estimulando las células
Jurkat con FasL a distintos tiempos (1-5 h), mediante western blot se aprecia expresión
de conexina-43. La posible explicación de esto es que en el western blot de
caracterización de la expresión de conexina-43 en las distintas líneas utilizadas la
expresión mayor es en los linfocitos B de ratón (A20 y A20R), por lo que la señal más
tenue asociado a una menor expresión de conexina-43 en los linfocitos humanos no haya
sido captada (Figura 18). Además al estimular las células con FasL por 1, 3 y 5 h es
posible apreciar tanto por microscopia confocal (Figura 16) como por western blot
(Figura 17) aumentos en la expresión de panexina-1, no así de conexina-43 (Figura 18).
Este último hallazgo, difiere de lo publicado recientemente, ya que en ensayos de
estimulación con anticuerpos anti-hFas por 4h en células Jurkat se describe degradación
105
de panexina-1 a partir de la segunda hora de estímulo (Chekeni et al., 2010). Todos estos
resultados a su vez refuerzan el concepto que en células Jurkat, panexina-1 es la
responsable de la salida de ATP y que coincide con lo descrito en la literatura para
linfocitos T humanos (Schenk et al, 2008; Chekeni et al., 2010).
Relacionado con esto, postulamos que mediante ATP extracelular habría una
comunicación entre Fas y P2X7. Parte de nuestra hipótesis es que la activación de
caspasa-8 por FasL induciría liberación de ATP por un mecanismo que podría involucrar
a panexina-1. Para demostrar esto, en primer lugar estimulamos a las células Jurkat con
80 ng/ml de FasL por 0-5h, y realizamos ensayos de luminiscencia de alta sensibilidad
para detectar ATP en los sobrenadantes de cultivo (Figura 10). Observamos que solo en
las células Jurkat (Figura 11A) hay liberación de ATP a medida que aumenta el tiempo
de estímulo con FasL, lo que no ocurre en las demás células (Figura 10A-D).
Comprobamos que esta liberación no es por pérdida de integridad de la membrana como
se demuestra en los ensayos de liberación de LDH (Figura 11F), en donde a las 5 h de
estímulo con FasL no se aprecia mayor liberación de LDH al compararlas con células
tratadas con PBS. Además, como se aprecia en los cursos temporales de muerte por
apoptosis (Figura 8B), en los cuales después de las 6 h aumenta la muerte celular en
cambio las mediciones de ATP extracelular son hasta las 5 h, lo cual apoya nuestra
hipótesis de que la liberación de ATP en las primeras horas de estímulo con FasL
dependería de la activación de caspasas y no de la muerte celular. Como se discute más
adelante, al utilizar el inhibidor de caspasa-8 (zIETD) junto con FasL, la liberación de
ATP es similar al valor basal.
Recientemente se ha descrito la participación de caspasas en los mecanismos de
liberación de ATP en células Jurkat (Chekeni et al., 2010). Nosotros también realizamos
los mismos ensayos de liberación de ATP en células Jurkat pero en presencia de un
inhibidor general de caspasas (zVAD), un inhibidor de caspasa-8 (zIETD), o un
inhibidor de caspasa-3 (zDEVD), (Figura 12A), observándose que la liberación de ATP
disminuye en respuesta a FasL cuando las células se tratan con zVAD y zIETD pero no
con zDEVD. Evidencias que apoyan este resultado vienen de trabajos recientes que
106
involucran la liberación de nucleótidos desde las células apoptóticas dependiente de la
actividad de caspasas y que ocurre después de inducir apoptosis de distintas maneras
(daño de DNA, inducción por receptor y esteroides) tanto en timocitos primarios, células
Jurkat y epiteliales (Elliot et al., 2009). Además en ensayos de viabilidad se observa que
zVAD tiene un efecto protector sobre las células tratadas con FasL (Figura 12B) y por el
contrario los inhibidores de caspasa 8 (zIETD) y caspasa 3 (zDEVD) a una
concentración de 20 M no son capaces de evitar la apoptosis inducida por FasL y sólo
se logra a concentraciones mayores (50 M). Por lo tanto, a diferencia de los estudios
mencionados, nuestros experimentos indican que el ATP liberado en las células
apoptóticas constituye una señal que vía P2X7 amplifica la apoptosis en células Jurkat.
En cuanto a las vías involucradas en la liberación de ATP, evidencias más
recientes involucran la participación de las panexinas en la liberación de ATP en
linfocitos activados. Esta liberación de ATP es a través de hemicanales formados por
panexina-1 lo que actuaría como una señal co-estimuladora autocrina esencial a través
de receptores purinergicos P2X (Schenk et al, 2008). Por lo tanto, en base a estos
antecedentes, la primera aproximación fue realizar ensayos de incorporación de etidio en
células Jurkat, de manera de discriminar si la salida de ATP en respuesta a FasL es por
panexina-1 o conexinas (Figura 13). Para ello, las células fueron pre-tratadas con
probenecid (inhibidor de panexina-1) o La3+
(inhibidor de conexinas) antes de
estimularlas con FasL. Se observa en el caso de las células Jurkat que probenecid
disminuye drásticamente la incorporación de etidio logrando que el registro sea similar
al de las células no tratadas, en cambio al tratar las células con La3+
el registro es muy
similar al obtenido solo con FasL (Figura 13E). A pesar de que estos resultados sugieren
que en células Jurkat habría participación de conexinas entre los mecanismos de
liberación de ATP, no se puede descartar del todo ya que en la curva de incorporación de
etidio se aprecia diferencias entre las curvas de probenecid y La3+
, pero que en nuestro
análisis no son estadísticamente significativas.
A partir de este resultado se realizaron ensayos de liberación de ATP, siendo la
primera aproximación el uso de carbenoxolona que es un inhibidor descrito para
107
panexina-1 en la concentraciones que aquí utilizamos (10 M) (Locovei et al., 2006b)
observándose que disminuye la liberación de ATP en forma significativa (Figura 14A),
pero no protege cuando se realizan ensayos de muerte celular con FasL (Figura 14B).
Posteriormente, realizamos ensayos de liberación de ATP con los inhibidores utilizados
en los ensayos de captación de etidio (Figura 15). Observamos, que probenecid es capaz
de evitar la salida de ATP al estimular las células Jurkat con FasL, logrando niveles
similares a los obtenidos en células tratadas solo con PBS (Figura 15A), lo cual
concuerda con la descripción que se ha hecho en cuanto a que probenecid bloquea
eficientemente los hemicanales de panexina-1 pero no los de conexinas (Silverman et
al., 2008). Al pre-tratar con La3+
se observa una baja liberación de ATP, lo cual podría
deberse a un artefacto que impediría la cuantificación de ATP, por lo que utilizamos otro
inhibidor de conexinas (heptanol), donde esta vez si se observa que liberación de ATP
no se afecta por el bloqueo de conexinas lo que a su vez se correlaciona con los descrito
en los western blot para conexina-43, la cual no se detectan en la células Jurkat (Figura
5B). Se ha descrito que los hemicanales de panexina-1 son relativamente insensibles a
La3+
y heptanol, mientras que los hemicanales de conexinas son efectivamente
bloqueados por esos agentes (Bruzzone et al. 2005; Pelegrin y Suprenant, 2006).
Además, el uso de La3+
requiere la ausencia de aniones extracelulares tales como
fosfatos o sulfatos, debido a que precipitan (Schalper et al., 2008). En los ensayos de
muerte celular con FasL, La3+
ni probenecid impiden las disminución de la viabilidad en
células tratadas con FasL (Figura 15B), tampoco carbenoxolona (Figura 14B) tiene un
efecto protector, lo cual concuerda con lo descrito recientemente en la literatura
(Chekeni et al., 2010).
Evidencias más recientes que apoyan nuestro modelo, caracterizan la
participación de panexinas en el mecanismo de salida de ATP en las células apoptóticas.
Esta caracterización se realizó tanto en forma farmacológica como de inhibición
utilizando siRNA específico para panexina-1, y mediante “patch-clamp” muestran que
panexina-1 es basalmente inactivo, y que la inducción de corrientes de panexina ocurre
sólo durante la apoptosis. Estas observaciones coinciden con nuestros resultados, ya que
108
sin estímulo las células Jurkat no incorporan etidio (Figura 13A) ni liberan ATP (Figura
11), pero sí cuando se tratan con FasL (Figura 11, 14 y 15). Además describen que
panexina-1 presenta sitios de corte específico para caspasa-3 que llevan a la activación
de panexina-1. Nuestros resultados muestran que la estimulación de las células Jurkat
con FasL lleva a un aumento en la expresión de panexina-1, esto lo visualizamos tanto
por microscopia confocal (Figura 16) como por western blot (Figura 17). Por lo tanto, la
liberación de ATP es regulada con una permeabilidad selectiva de la membrana
plasmática durante la apoptosis (Chekeni et al., 2010). Como se mencionó
anteriormente, estos hallazgos coinciden con nuestros resultados, pero nosotros
asociamos la salida de ATP con activación de P2X7 que a su vez llevaría a la muerte
celular por apoptosis.
Los experimentos de colocalización con Fas y panexina-1 (Figura 16) y lo
descrito en la literatura (Veldman et al., 2001; Gloire et al., 2008) sugieren un
acoplamiento funcional en los rafts entre los distintos receptores, Fas, panexinas y P2X7.
La aproximación experimental en células Jurkat fue remover el colesterol de la
membrana plasmática mediante -metilciclodextrina (Figuras 19) y posteriormente
realizar ensayos de muerte celular agregando FasL (0-10 ng/ml) por 16 h (Figura 20).
Observamos un aumento en la viabilidad celular y una disminución de la muerte celular
por apoptosis con un aumento de la necrosis. Una posible explicación es que ocurra
activación de caspasa-8 y salida de ATP independiente de su acoplamiento a “rafts”, no
activándose los receptores P2X7 que estaban en los dominios raft y que estarían
involucrados en la muerte celular por apoptosis. Este ATP activaría al receptor P2X7 que
no está en los dominios raft y que se han asociado a una función más bien de canal no
selectivo (Garcia-Marcos et al., 2006) y que podría ser la explicación por que aumenta la
muerte celular por necrosis.
La siguiente aproximación fue determinar la participación de P2X7 en la muerte
celular, para ello se utilizizaron los inhibidores de P2X7 oATP, Brillant Blue G (BBG) y
Cu2+
. Mediante ensayos de muerte celular con FasL las células Jurkat se pre-incubaron
con oATP 1 h antes de estimularlas con FasL. Observamos un aumento de la viabilidad
109
celular (Figura 21A). Esto se corrobora al analizar el efecto de oATP sobre la muerte
celular, observando que ocurre una clara inhibición de la apoptosis en las células Jurkat
(Figura 21B). A fin de determinar si solamente P2X7 está involucrado en la inducción
de muerte celular, realizamos otros ensayos pero en presencia de un inhibidor más
específico de P2X7 recientemente descrito y que corresponde a Brillant Blue G (BBG) el
cual ya se ha utilizado como antagonista de P2X7 en modelos animales de trauma
medular (Peng et al., 2009). Para comprobar la eficacia de este inhibidor, realizamos los
ensayos de muerte celular en células Jurkat con FasL pre-tratadas con BBG (Figura 22).
En el caso de las células Jurkat se observó un efecto marcado, aumentando la viabilidad
celular (Figura 22A) e inhibiendo la apoptosis (Figura 22B).
Otro bloqueador de P2X7 descrito es el Cu2+
, siendo un potente inhibidor a
concentraciones micromolares, relacionándose esto a una interacción directa con
algunos residuos del ectodominio del receptor P2X7 (Acuña-Castillo et al., 2007; Liu et
al., 2008). Tomando en cuenta que nuestra hipótesis considera a las células Jurkat como
células tipo II, postulamos que caspasa-8 induce liberación de ATP y activación de P2X7
potenciando de esta manera la muerte por apoptosis. Por lo tanto la siguiente
aproximación experimental fue pre-tratar las células Jurkat con Cu2+
(5 y 10 M) y
después estimular las células con FasL (0-80 ng/ml por 16 h y posteriormente mediante
citometría de flujo evaluar la viabilidad y muerte celular (Figura 32). Observamos un
claro efecto inhibitorio, ya que se observa una mayor viabilidad celular (Figura 32A)
con una marcada inhibición de la apoptosis (Figura 32B) sin afectar la necrosis (Figura
32C).
A fin de determinar la participación de P2X7 en la muerte celular por apoptosis,
se utilizan agonistas de P2X7. El primero fue NAD+, que ha sido descrito como un
activador de receptores P2X7 y por lo tanto capaz de inducir la muerte de linfocitos T
por un mecanismo dependiente de ART2.2 (Seman et al., 2003; Scheuplein et al., 2009).
Para ello realizamos ensayos de muerte celular en células Jurkat tratándolas con NAD+
(0-200 M) por 16 (Figura 28A) y 24 h (Figura 28B). No observamos inducción de
muerte en las células Jurkat, a pesar de las altas concentraciones utilizadas (200 M) a
110
tiempos largos. Probablemente esto se deba a que las células Jurkat no expresan
ART2.2, además dentro de los linfocitos normales se aprecia una diferencia en cuanto a
la sensibilidad a NAD+, es así como la subpoblación más sensible corresponde a la de
linfoctos T regulatorios Foxp3+ (Hubert et al., 2010).
El otro agonista utilizado fue BzATP, la primera aproximación fue estimular a
las células Jurkat (Figura 29) con concentraciones crecientes de BzATP (0-600 M) por
16 h y evaluar mediante citometría de flujo la inducción de muerte celular. No
observamos inducción de muerte en las líneas celulares utilizadas. El siguiente paso fue
realizar ensayos de muerte celular coestimulando las células Jurkat con concentraciones
altas de BzATP (100, 300 y 600 M) y posteriormente con FasL (0-80 ng/ml) por 16 h,
se observa una mayor sobrevida de las células (Figura 30A) cuando se co-estimulan con
BzATP y FasL (20 y 40 ng/ml), con una disminución de la apoptosis (Figura 30B). Una
posible explicación viene de experimentos en los cuales análogos de ATP, incluyendo al
BzATP, han funcionado como inhibidores altamente efectivos de los hemicanales de
panexina-1 (Qiu y Dahl, 2009), posiblemente a concentraciones de 100 M se comporte
de esa manera. Derivado del resultado anterior, realizamos nuevamente ensayos de
muerte celular co-estimulando células Jurkat ahora con concentraciones bajas de BzATP
(25 y 50 M) y FasL (0-80 ng/ml) (Figura 31). En este caso no observamos efecto
protector de BzATP sobre la muerte celular (Figura 31B), pero tampoco un efecto
sinérgico.
Finalmente se evaluó la capacidad protectora del antioxidante N-acetilcisteína
(NAC) en las células Jurkat dado por su capacidad de bloquear la generación de especies
reactivas de oxígeno (ROS). Antecedentes previos del laboratorio dan cuenta del efecto
protector de NAC cuando se agrega ceramida a células Jurkat (100 M por 6 h) (Villena
et al., 2008), con un aumento en la viabilidad (Figura 26A) de las células Jurkat y una
disminución de la apoptosis (Figura 26B). Tomando en cuenta este resultado, se
cuantificó en las células Jurkat estimuladas con FasL la generación de ROS,
observándose un aumento en forma significativa a las 6 h (Figura 27), que es también
el tiempo al cual se empieza a gatillar la apoptosis en las célula Jurkat (Figura 8B).
111
El resultado anterior nos llevó a evaluar la actividad de caspasa-9, para ello
utilizamos un inhibidor específico (z-LEHD) (Figura 33). En estos experimentos
tratamos las células Jurkat con z-LEHD (20 y 50 M) y con FasL (0-80 ng/ml) por 16 h.
Al evaluar la viabilidad (Figura 33A) y el tipo de muerte celular observamos un marcado
efecto protector, las células muestran una mayor viabilidad y una menor apoptosis
(Figura 33B), sin afectarse la muerte celular por necrosis (Figura 33C).
La última aproximación fue inducir muerte celular con FasL en linfocitos
humanos CD3+ normales. Para ello se trabajó con una población celular de alta pureza
(99%) (Figura 34A) y se realizaron varias aproximaciones experimentales de acuerdo a
lo publicado (Alderson et al., 1995; Holler et al., 2000; Paulsen et al., 2009; Fang et al.,
2010). Sin embargo, no se pudo inducir muerte de los linfocitos normales, a pesar que
los linfocitos purificados se cultivaron en presencia de IL-2 (50 U/ml) por 2 días (Figura
34B), e incluso cuando se estimularon con FasL se hizo en presencia de IL-2 (no
mostrado). Además se cuantificó mediante citometría de flujo la expresión del receptor
Fas en la superficie celular, no observándose diferencias entre las células estimuladas y
no estimuladas con IL-2 (no mostrado). Se utilizaron concentraciones de FasL
equivalentes al doble de lo utilizado en células Jurkat, pero en las publicaciones citadas
anteriormente se utilizaban concentraciones de FasL por sobre los microgramos junto
con anticuerpos anti-Flag (que va unido a FasL). Por lo tanto, con las condiciones
experimentales utilizadas no pudimos lograr inducir muerte celular en linfocitos
normales.
En cuanto a las células A20, resultados de nuestro laboratorio han demostrado
que FasL induce en estas células principalmente muerte celular por necrosis,
proponiéndose que la elevación retardada de ceramidas endógenas promueve la necrosis
ya que la activación de caspasa-8 no es suficiente para inducir apoptosis (Hetz et al.,
2002). A estos resultados se suman otras observaciones que sugieren que ROS liberado
desde las mitocondrias de células tratadas con ceramidas sería un factor crítico que
conduciría a las células hacia la necrosis (Villena et al., 2008). En estos trabajos, las
ceramidas de cadena corta (C6-ceramida) inducen muerte celular por necrosis de manera
112
específica, pero al pre-tratar las células con un secuestrador de anión superóxido (como
Tiron), la necrosis de las células se reduce a pesar de estar en presencia de ceramida.
Adicionalmente, la transfección de células A20 con un adenovirus para la expresión de
catalasa, protege parcialmente de la muerte por necrosis, inducido por ceramida (Villena
et al., 2008). Las líneas celulares murinas analizadas (A20 y A20R) presentan
diferencias en cuanto a la sensibilidad a FasL. Siendo las células A20 sensibles a FasL
(Figura 6B), y en las cuales el principal mecanismo de muerte celular es la necrosis
(Figura 6D). Se determinó por citometría de flujo, los niveles de expresión de Fas,
observándose diferencias en la expresión de Fas, es así como en las células A20 es
posible detectar aproximadamente un 100% de células positivas a Fas en cambio en las
células A20R solo cerca de un 25% de células expresan Fas en su superficie, lo cual
podría explicar las diferencias de sensibilidad entre las células A20 y A20R (Figura 3).
Al analizar la expresión de P2X7, observamos que tanto las células A20 como
A20R expresan P2X7 (Figura 4). Además, a fin de determinar el posible mecanismo de
salida de ATP, se analizó mediante western blot en estas células la expresión de
panexina-1 y conexina-43 observándose que en las células A20 y A20R expresan las
distintas isoformas de panexina-1 (Figura 5A) y altos niveles de conexina-43 (Figura
5B). Al tratar las células con FasL, y cuantificar los niveles de ATP en el sobrenadante
de cultivo tanto en las A20 como A20R no se observan diferencias entre las células
tratadas o no con FasL (Figura 10), lo que de todas maneras no descarta del todo que en
estas células FasL induzca liberación de ATP. Esto podría sugerir que estas células
liberan ATP por una vía distinta y este ATP se degradaría por ectonucleotidasas y de
esta forma ADP, AMP podrían estimular a sus receptores específicos. En este caso la
liberación de ATP sería por mecanismos que no involucrarían la participación de
hemicanales de panexinas o conexinas, esto queda en evidencia al realizar ensayos de
capatacion de etidio en los cuales al estimular las células con FasL no se produce
incorporación de etidio (Figura 13F)
Otra posibilidad es que en las células A20 el no detectar salida de ATP podría
deberse a la actividad de ectonucleotidasas de superficie (CD39). Se ha descrito en
113
linfocitos B humanos mediante citometría de flujo la expresión de CD39 en más del
90% de los linfocitos B normales y neoplásicos y aproximadamente solo un 8% de los
linfocitos T normales (Pulte et al., 2007). Además, en estas células, si bien el ATP
extracelular en si misma es una molécula de señalización, también puede ser hidrolizado
en adenosina. Estas dos moléculas pueden actuar sobre receptores específicos
purinérgicos (P2 y P1, respectivamente) y funcionar como moléculas de señalización
que controlan la respuesta inmune. Es así como el ATP liberado de la célula B es la
principal fuente de la adenosina periférica, mediado esto por la actividad de ectoenzimas
y la eficiente absorción de adenosina, a través de transportadores de nucleósidos
(Sakowicz-Burkiewicz et al., 2010). Por lo tanto, la activación de los linfocitos B puede
ser mediada además de ATP, por ADP, AMP o adenosina por lo que, el hecho de no
detectar ATP con la metodología que usamos en esta Tesis (Figura 10) no significa que
no ocurra activación de otros receptores purinérgicos.
La siguiente aproximación fue determinar la participación de P2X7 en la muerte
celular, para ello se utilizó los inhibidores oATP y BBG. Mediante ensayos de muerte
celular, las células A20, se pre-incubaron con oATP 1 h antes de estimularlas con FasL.
Observamos un aumento de la viabilidad celular (Figura 35A) que se corrobora al
analizar el efecto de oATP sobre la muerte celular, observamos inhibición de la necrosis
en las células A20 (Figura 35B) no tan evidente como en las células Jurkat (Figura 22B),
por lo que se podría suponer la participación de otros P2X o P2Y. A fin de determinar si
solamente P2X7 está involucrado en la inducción de muerte celular, realizamos otros
ensayos pero en presencia de un inhibidor más específico de P2X7 recientemente
descrito y que corresponde a BBG. Para ello pre-tratamos las células A20 con BBG
(Figura 36A), no observándose modulación de la viabilidad ni de la muerte celular por
necrosis (Figura 36C). Esto nos sugiere que en células A20 podrían participar otros
receptores purinérgicos, por lo cual se utilizó suramina como inhibidor de P2Y (1, 2, 6 y
11) y de otros P2X (1, 2, 3, 5). En ensayos de muerte celular, suramina aumenta la
viabilidad (Figura 37A) y produce disminución de la muerte celular por apoptosis
(Figura 37B) no afectando la necrosis (Figura 37C). Esto se demuestra también en un
114
curso temporal con concentraciones fijas de FasL (40 ng/ml) donde se aprecia el mismo
efecto descrito anteriormente a partir de las 9 h (Figura 38B).
En nuestro modelo la activación de P2X7 sería responsable de la producción de
ceramidas y por lo tanto de la muerte celular por necrosis. Para demostrar esto,
utilizamos inhibidores de las distintas vías de la producción de ceramidas: miriocina y
fumonisina B1 (via de novo), imipramina (esfingomielinasa ácida) y GW4869
(esfingomielinasa neutra). Estos inhibidores se evaluaron en células A20 tratadas con
FasL, observándose que solo hay efecto del inhibidor específico de la esfingomielinasa
neutra (GW4869) con un aumento en la viabilidad, que es estadísticamente significativo
(Figura 41A), y disminución de la necrosis (Figura 41C.) Esto podría dar cuenta de la
participación de ceramidas en la necrosis inducida por FasL en células A20.
Finalmente se evaluó la capacidad protectora del antioxidante N-acetilcisteína
(NAC) en las células A20 dado por su capacidad de bloquear la generación de especies
reactivas de oxígeno (ROS). Antecedentes previos del laboratorio dan cuenta del efecto
protector de NAC, al igual que en las células Jurkat, cuando se agrega ceramida (100
M por 6 h) a las células A20 (Villena et al., 2008). Por lo tanto, células A20 se pre-
trataron con NAC (20 mM) 30 min antes de agregar distintas concentraciones de FasL
(0-80 ng/ml) por 16 h. Al evaluar la viabilidad esta aumenta significativamente (Figura
43A), observándose además una disminución de la necrosis (Figura 43C) que es
estadísticamente significativa, y no afectando la apoptosis (Figura 43B).
Al igual que en células Jurkat, se utilizó BzATP como agonista de P2X7, al
estimular las células A20 (Figura 44) con concentraciones crecientes de BzATP (0-600
M) por 16 h y evaluar mediante citometría de flujo la inducción de muerte celular. No
observamos inducción de muerte
En resumen, frente al mismo estímulo en células Jurkat y A20, el tipo de muerte
celular y los mecanismos involucrados son en parte distintos. En células Jurkat la
activación de Fas por FasL lleva por una parte a la activación de caspasa-8 y
posteriormente a la activación de la caspasa-3. Por otro lado se induce también la
liberación de ATP mediada por caspasa-8 a través de canales de panexina-1, esto a su
115
vez llevaría a la activación de P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un
mecanismo que podría involucrar la participación de ROS. El rol de P2X7 en la
apoptosis queda demostrado al utilizar inhibidores de P2X7 (oATP y BBG) que
disminuyen este tipo de muerte. Esto es un hallazgo importante, ya que en células Jurkat,
que son principalmente células tipo II, además de tBID, el ATP liberado vía panexina-1
también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la apoptosis mediante la
activación de P2X7 (Figura 45).
En cambio en células A20 la muerte celular gatillada por FasL es la necrosis, en
este caso no somos capaces de detectar ATP en respuesta a FasL, lo cual podía deberse a
la expresión de CD39 en la superficie de estas células y que llevaría a una rápida
degradación del ATP, pero la muerte por necrosis podría involucrar la participación de
otros P2, ya que oATP si bien disminuye la muerte por necrosis, un inhibidor más
específico como el BBG no logra revertir el efecto de FasL. Lo interesante es que en
estas células al utilizar otro inhibidor, suramina que afecta a varios P2Y y P2X, se
produce una disminución en la muerte por apoptosis (Figura 46), por lo tanto habría
participación de receptores distintos a P2X7 en la muerte celular por apoptosis y necrosis
en los linfocitos B, que podrían involucrar a adenosina a través receptores P1.
116
Limitaciones del Estudio:
En cuanto a la expresión de los receptores P2, no se evaluó otros receptores en
las células Jurkat ni A20. Se sabe que los linfocitos B humanos expresan P2X7, además
de P2X1, P2X2 y P2X4; pero no P2X3, P2X5 y P2X6 (Sluyter et al., 2001), y en los
linfocitos T se expresa P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5 y P2X6 (Lo Bours et al., 2006).
Otra limitación fue que los agonistas de P2X7 (BzATP y NAD+) no tenemos
efecto en cuanto a gatillar la apoptosis en las células jurkat ni la necrosis en las céluals
A20.
Por lo tanto nuestro modelo coincide con lo decrito en la literatura en cuanto a
que vía panexina saldría ATP, pero debido a que los agonistas (BzATP, NAD+) no
logran activar a P2X7 no podemos descartar que en las células Jurkat el ATP pueda
actuar sobre otros recetores P2.
117
Fas-L
Fas
P2X7
ATP
Caspasa-8
APOPTOSIS
Caspasa-3
Panexinas
?
Caspasa-9
tBidROS
ROSROS
??
?
= raft
Figura 45. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las células
Jurkat. En este modelo se propone que la unión de FasL a Fas gatilla por una parte la
activación de caspasa-8 y -3 y por otro lado la salida de ATP, vía hemicanales de
panexina-1, en forma dependiente de la actividad de caspasa-8. Este ATP llevaría a la
activación de P2X7 que a su vez por mecanismos no muy claros, que podrían involucrar
a la generación de especies reactivas, que llevaría a la activación de caspasa-9 que
finalmente conduciría a la muerte celular por apoptosis, siendo este el principal
mecanismo de muerte celular en estas células. Cabe destacar que la distribución de Fas,
panexina-1 y P2X7 estaría en dominios raft, lo cual podría explicar la asociación
existente entre Fas y P2X7, vía salida de ATP por los hemicanales de panexina-1,
118
P2X7
ROS
↑ Ceramidas
NECROSISROS
ROS
ATP ?Fas-L
Fas
FADD
Caspasa 8ATP
APOPTOSIS
P2X ó
P2Y
ADP ?
?
?
Figura 46. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las células A20.
En este modelo se propone que la unión de FasL a Fas gatilla por una parte la activación
de receptores P2X7 u otros receptores P2, en un mecanismo que podría involucrar la
salida de ATP en forma independiente de hemicanales de panexina-1 o conexina-43.
Este ATP llevará a la activación de receptores P2X7 o podría degradarse por acción de
ectonucleotidasas en ADP o AMP y activar otros receptores P2X e incluso P2Y. La
activación de estos receptores llevaría por una parte al gatillamiento de la muerte celular
por apoptosis y por otra necrosis que podría involucrar la participación de ceramidas,
siendo este el principal tipo de muerte en células A20.
119
6. CONCLUSIONES.
1. El ligando de Fas (FasL) usado en estos estudios induce en células Jurkat
principalmente muerte celular por apoptosis en cambio en células A20 induce necrosis.
2. La salida de ATP es dependiente de la actividad de Fas en células Jurkat.
3. La salida de ATP es dependiente de la actividad de caspasa 8 y no es por daño en la
membrana celular en células Jurkat.
4. La salida de ATP es mediante panexina-1 en células Jurkat.
5. Los inhibidores de P2X7 (oATP, BBG y Cu2+)
inhiben la muerte celular por apoptosis
en células Jurkat tratadas con FasL.
6. En células Jurkat la activación de P2X7 lleva a la muerte celular por apoptosis,
posiblemente por generación de ROS y posteriormente activación de caspasa-9.
7. En células A20 tratadas con FasL, oATP inhibe la muerte celular por necrosis.
8. En células A20 tratadas con FasL, suramina inhibe la muerte celular por apoptosis.
120
PROYECCIONES.
Estudios en células Jurkat de los mecanismos que podrían estar involucrados en
la activación de caspasa-9 por efecto de la activación del receptor P2X7. En las células
A20 se podrían caracterizar los mecanismos que involucran la activación de los
receptores P2X7, P2X u P2Y. Considerando la alta expresión de ectonucleotidasa que
podrían llevar a generación de AMP y ADP los cuales activarían algunos de los
receptores ya mencionados.
Nuestros hallazgos nos hacen pensar en que estos receptores podrían ser blancos
importantes en patologías como enfermedades autoinmunes y enfermedades
inflamatorias del sistema nervioso central.
121
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