La Célula como una bolsa de La Célula como una bolsa de reaccionesreacciones
Rutas o redes metabólicas: pueden ser descritas por ecuaciones diferenciales parciales, donde las concentraciones cambian en el tiempo siguiendo un modelo de reacción y difusión.
Cuando la célula no es una Cuando la célula no es una bolsa de reaccionesbolsa de reacciones
•Compartametalización•No existe una difusión ideal: concentraciones locales.•Limitaciones técnicas en la determinación de constantes cinéticas.•Efectos de fuerzas, tensiones y torques presentes en la célula pero ausentes en el tubo de ensayo.
Trabajo coordinado de muchas Trabajo coordinado de muchas máquinasmáquinas Hasta los biólogos más serios Hasta los biólogos más serios
antropomorfizan la maquinaria celularantropomorfizan la maquinaria celular
Cuando la célula no es una Cuando la célula no es una bolsa de reaccionesbolsa de reacciones
El DNA está compactado, pero necesitamos que sea organizado y dinámico!
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• MANIPULARMANIPULAR
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VisualizaciónVisualización Cristalografía Cristalografía NMRNMR Microscopía electrónicaMicroscopía electrónica Microscopía de fuerza Microscopía de fuerza
atómicaatómica
Deposición en mica
nf número de moléculas en superficie
n0 número de moléculas en solución
D Coeficiente de difusión
t tiempo
CONDICIONES:
•La adsorción es irreversible.
•No hay corrientes convectivas que influyan en el transporte de las moléculas.
•La cantidad de moléculas en solución no llega a ser limitante y la superficie no se satura.
• ManipulaciónManipulación
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Manipulación con pinzas láserManipulación con pinzas láser Principio de la detección de fuerza.Principio de la detección de fuerza.
La aplicación de una fuerza externa provocará un desplazamiento fuera La aplicación de una fuerza externa provocará un desplazamiento fuera del centro de la trampa. del centro de la trampa.
La desviación del rayo difractado es medida por un fotodetector y usada La desviación del rayo difractado es medida por un fotodetector y usada para calcular el valor de la fuerza aplicada sobre la microesfera atrapada.para calcular el valor de la fuerza aplicada sobre la microesfera atrapada.
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La longitud de extremo a extremo (R2) depende de la longitud de contornocontorno (L) y la longitud de persistencia persistencia (P)(P)
P, longitud con la que decae la orientación inicial de un polímero. Es una medida de rigidez.
WLC, modelo de la cadena vermiforme
DNA LENGTH (bp)
N° molecules Theoretical Contour
length (nm)
Experimental Contour
Length (nm)
Standard deviation
Theorical R2
Experimental R2
278 64 94 83.6 6.2 5533 4312
731 101 247.1 213.5 23.2 26110 24727
1450 110 490.1 397.2 36.4 63010 67332
Se reproduce comportamiento WLC.
rLc
Medición de ángulos
Para un polímero al que se le introduce un ángulo β en cualquier parte de su longitud, la longitud R2 está dada por:
Casetes de AAAAAA como estándar de ángulos y curvaturas introducidas
J Mol Biol. 1998 Jul 3;280(1):4159.Polymer chain statistics and
conformational analysis of DNA molecules with bends or sections of different
flexibility.Rivetti C, Walker C, Bustamante C.
Enzima esencialLas bacterias poseen
una única versión de esta enzima.
RNAp transcribe todos los genes
RibosomalesARNtMensajeros
Heat shock
Stationary Phase
Extreme Temperature
Nitrogen regulation
Flagellar genes
Iron Transport
Housekeeping
Escerichia coli: 7 factores sigma
INICIACION
Son diferentes, p <0.0001 Compactamiento de 32 nm
CL (nm) N° of molecules
Free DNA 444 ± 22 110
DNA:RNAp 412 ± 18 54
El enrollamiento es asimétrico
Theoretical S/L arm ratio
Experimental S/L ratio
0.422 0.383 ± 0.022
Short to Long arms ratio compared to the theoretical ratio. The theoretical S/L ratio is calculated with respect to the site of initiation of transcription as in figure 1: 430nm / 1020 nm.
Total cell fractions of recombinant Eco bearing plamids for the expression of Mtb RNAP subunits: α , β ’, σ and β ; M, molecular weight marker: 200, 110, 97, 66, 45, 31 KD; n, noninduced culture; +1, aliquot from a 1ml of induced miniculture; +50, concentrated aliquot from a 50 ml induced culture
Two mutants selected with a point mutation in the TL (Gloop). G1136S (Fast) : Renders fast, irresponsive to pause signals, error prone, resistant to termination I1134V (Slow) : Renders slow, overresponsive to pauses, greater fidelity, more efficient in termination
FAST Mutant
n= 17
SLOW Mutant
n= 12
Pausefree velocity = 17.6 ± 1 nt/s Pausefree velocity = 7.7 ± 1.6
Velocity
Estudiando actividad catalítica de RNAp
Bulk assays
Pause Frequency
Pause Length
Backtracking
Processivity
Stall Force
Instantaneous vel.
RNAP + DNA
Optical Tweezers
Enzyme Dynamics
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Average velocity
ELONGATION
ICo Stability
Bulk assays
Pause Frequency
Pause Length
Backtracking
Processivity
Stall Force
Instantaneous vel.
RNAP + DNA
RNAP mutations
Optical Tweezers
Enzyme Dynamics
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Average velocity
ELONGATION
ICo Stability
Bulk assays
Pause Frequency
Pause Length
Backtracking
Processivity
Stall Force
Instantaneous vel.
RNAP + DNA
RNAP mutations
Optical Tweezers
Enzyme Dynamics
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Average velocity
ELONGATION
AFM
Angles
Lengths
Sigma Release
ICo Stability
Structure:Function
INITIATION
AFM
Bulk assays
Angles
Lengths
Sigma Release
Pause Frequency
Pause Length
Backtracking
Processivity
Stall Force
Instantaneous vel.
RNAP + DNA
Constitutive Promoters
Stringentcontrolled Promoters
RNAP mutations
ppGpp
Optical Tweezers
ICo Stability
Structure:Function
Enzyme Dynamics
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Average velocity
INITIATION
ELONGATION
AFM
Bulk assays
Angles
Lengths
Sigma Release
Pause Frequency
Pause Length
Backtracking
Processivity
Stall Force
Instantaneous vel.
RNAP + DNA
Constitutive Promoters
Stringentcontrolled Promoters
RNAP mutations
ppGpp
Optical Tweezers
ICo Stability
Structure:Function
Enzyme Dynamics
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Average velocity
INITIATION
ELONGATION
Promoter mutations