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8/19/2019 Biosensor luminoso detector de plomo
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Informe #3 Taller de Proyecto "Biotecnología"
Diseño de microorganismos luminosos medianteherramientas de biología sintética
Integrantes: Sebastián Correa
Daniela Lasso
Josué Simanca
Catalina Vicencio
Grupo número: 4
Ayudante: Jean Franco Castro
Docentes: Juan A. Asenjo
Barbara Andrews
Junio, año 2015
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Resumen
Uno de los grandes problemas a nivel mundial, es la contaminación del agua potable con metales
pesados. Uno de los más peligrosos en pequeñas cantidades es el Plomo.
Se plantea como solución la creación de un kit práctico que detecte la presencia y cantidad de este
metal en alguna muestra de agua que se desee analizar, para así determinar su riesgo de consumo y
prevenir futuros incidentes; la funcionalidad del kit se basa en la presencia de un biosensor
bacteriano que emite señales lumínicas en presencia del Plomo.
La distribución y venta de este kit, será principalmente a las empresas que otorgan el agua a las
comunidades y/o alguna institución o empresa de ventas que desee ofrecer el producto.
Finalmente se concluye con que el proyecto posee múltiples beneficios por sobre los métodos
actuales en la detección del plomo, y que concede tanto a productores como a compradores (y al lasociedad en general), provechos en ámbitos económicos, prácticos y para beneficio de la salud.
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Introducción
Ante la problemática de los niveles de plomo en el agua, metal muy tóxico en pequeñas cantidades,
se ha propuesto la producción de un kit que permita detectar los niveles de este nocivo metal. Las
acciones tóxicas del plomo se atribuyen a su afinidad por los sitios de acción molecular del calcio,
como la adhesión que tiene a los huesos. Podemos encontrar este metal en el agua potable, muchas
veces debido a las tuberías que se utilizan para la llegada del agua a nuestras casas.
La epidemiología de los casos de intoxicación por niveles de plomo (recordar que los de intoxicación
por niveles en el agua potable es solo una de las fuentes que conlleva a una acumulación de plomo en
el cuerpo y posterior intoxicación) muestra numerosos casos al año, principalmente afectando a los
niños. Se estima que a causa de la exposición al plomo, hay 600.000 nuevos casos de discapacidad
intelectual en los niños, esto debido a que el plomo puede afectar gran parte del sistema nervioso, y
los menores son más vulnerables a estos daños. Se estima que alrededor de 143.000 personas muerenal año debido a la exposición al plomo, registrándose las tasas de mortalidad más altas en las regiones
en desarrollo. La mitad de los casos de mortalidad se atribuyen a Asia Sudoriental, en tanto las
regiones del Pacífico Occidental y Mediterránea Oriental poseen una quinta parte de los casos, según
datos de la OMS. i
No existe un nivel de exposición al plomo que pueda considerarse seguro, pero la intoxicación por
este metal es totalmente prevenible, lo cual se intentará con nuestro kit, prevenir que la comulación
de plomo en el cuerpo sea mayor. Se ha confirmado que cuanto mayor es el nivel de exposición a este
metal, mayor es la diversidad, gravedad de los síntomas y efectos secundarios asociados al plomo.
Incluso concentraciones en la sangre que no superan 5 ug/dl (nivel hasta hace poco considerado
seguro) puede entrañar una disminución de la inteligencia del niño, así como problemas decomportamiento y dificultades de aprendizaje.
La creación de un biosensor que permita analizar los niveles de agua es imprescindible para este kit.
Se necesitan dos componentes para este biosensor, uno que identifique la presencia de plomo y otro
que de la señal de la presencia. Para la emisión de la señal se extraerá el gen de la bacteria Vibrio
fischery , específicamente los operones lux, que sintetizarán componentes necesarios para una
emisión de luz en presencia del metal. Como el mecanismo de expresión de los operones lux es a
través del mecanismo de Quorum Sensing (a mayor cantidad de plomo, mayor es la señal emitida),
nos permitirá medir los niveles del metal ii. Para poder identificar la presencia del plomo se extraerá
de la bacteria Ralstonia metallidurans los operones pbr (ubicados en el plásmido pMOL30 de la
bacteria), que se encargan de la producción de sustancias capaces de autorregular la expresión de sus
genes y hacerla resistente a concentraciones elevadas de plomo.
Se utilizará la bacteria Escherichia coli DH5α, la cual ya posee un plásmido con la resistencia a un
antibiótico (vector pBR322). Para insertar en el plásmido deseado, se romperá el enlace fosfodiéster
que mantiene unidas las bases nitrogenadas, utilizando la enzima de restricción Bam HI, reconocerá
el lugar del gen de la tetraciclina, donde se comenzará la inserción de los operones. Primero el gen de
reconocimiento pbr y luego el de la señal lux. Utilizando la técnica de PCR, se pretende obtener
numerosas copias del vector de interés. La ligación se realiza por la ligasa ADN T4 y ATP.
Para la inserción del plásmido en las bacterias se utilizará el método de transformación mediada por
Ca2+ . Para cultivar las bacterias genéticamente modificadas se aislarán en agar, donde solamente las
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bacterias con el plásmido que contiene el gen que expresa la resistencia a ese antibiótico sobrevivirán
y proliferarán.
Este kit requiere de un luxómetro, para que pueda entregar los datos numéricos de los niveles de
plomo de una muestra de agua. Contará con placas de petri portadores de un cultivo de E.coli
modificadas que contengan el plásmido creado y expresen la bioluminiscencia en presencia de plomo.Además contará con pipetas que servirán para obtener muestras de agua que deseen ser analizadas.
Por último, este kit incorpora un manual del usuario indicando paso por paso el uso del kit.
Detección de Plomo en la Actualidad y
Beneficios del Proyecto
La determinación de las concentraciones de plomo en agua con métodos actuales suele ser difícil y
costosa debido a sus bajas concentraciones en las que se encuentra, por lo que requiere un trabajo
muy minucioso y con maquinaria capacitada para tal acción. Unos de los métodos actuales que seutilizan son la espectrometría de la emisión atómica asociada al plasma acoplado inductivamente y
la espectrofotometría en fase sólida, esta última sin requerir demasiada maquinaria y mejor
sensibilidad a volúmenes grandesiii.
Un método que está al alcance de las personas que se sienten en riesgo de consumir agua
contaminada es el análisis de esta, enviando muestras desde sus hogares a ciertas empresas que se
encargan del análisis y reenvío de resultados al pasar unos días. El costo promedio de este servicio
varía entre los 80 y 120 dólares aproximadamente.
Se pretende que el producto sea vendido a las empresas que proporcionan el abastecimiento de
agua potable en los hogares o bien a alguna institución pública y/o privada que desee contar coneste equipamiento. En primer lugar el kit constará de lo necesario para hacer un solo análisis y será
desechable, por lo que cabe recalcar que el luxómetro que se necesita para extraer los datos de la
muestra se venderá por separado, así se disminuirán costos del kit y no se desecha el luxómetro
usado una única vez (no son desechables).
Lo que favorece a este proyecto es que el análisis no se lleva a un laboratorio, si no que se puede
hacer desde el mismo lugar de donde se extrae la muestra. Es de fácil utilización y está destinado a
la manipulación de cualquier adulto, con los respectivos cuidados que requiere.
Financiamiento y Capital inicial
Este proyecto requiere de un fondo inicial considerable y no tan sencillo de conseguir, sin embargo
con la originalidad, relevancia y beneficios que puede traer este proyecto; se cree que son
suficientes para obtener el capital inicial.
Existen distintas formas de financiar proyectos innovadores emergentes que busquen un fin
beneficioso para la sociedad. De parte de Corfo por ejemplo, existen fondos destinados a
microempresarios emergentes, proyectos emprendedores, innovadores sociales, etc iv. A estos
fondos se puede llegar de manera sencilla postulando con el proyecto a través de la página web de
Corfo.
Otras maneras de comenzar el proyecto, son por ejemplo solicitar un crédito de apoyo emprendedoral gobierno, obtener un subsidio de alguna empresa contratista que quiera especializarse en la venta
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del producto, entre otras maneras que son capaces de cubrir el capital que se requiere para
comenzar el proyecto.
Cabe resaltar que una vez obtenida la maquinaria no es necesario seguir comprando más, pues la
producción es factible y puede continuar con estos recursos. Solo es necesario ir reponiendo la
despensa de las materias primas utilizadas en la elaboración del kit (bacterias, enzimas, soluciones,etc).
Estudios previos
La conformación de la empresa dedicada a la producción del kit para detectar niveles de plomo en
agua requiere de estudios iniciales para poder confirmar ciertos datos a la hora de emprender el
rumbo. Primeramente se iniciaría con un estudio que pretendería despejar dudas en el
funcionamiento del biosensor, por ejemplo: saber el rango de concentración de plomo en el que
puede actuar la bacteria genéticamente modificada; a su vez saber cuanta luz(medido en lux)v emite
según los niveles de plomo a los que se ha expuesto; a cuantas concentraciones de plomo resiste lanueva bacteria; cual es la vida útil de los microorganismos y en qué condiciones se conservan mejor.
Son datos que son necesarios a la hora de configurar el kit. El luxómetro necesario para la
determinación de la intensidad lumínica debe ser comprado según el rango de intensidad en el cual
actúa el biosensor.
Otro estudio necesario para el emprendimiento de la empresa es un estudio de mercado que nos
pueda presentar la situación en la sociedad que estaría dispuesta a adquirir el producto que se desea
producir. Con este estudio, se puede saber alrededor de la cantidad a producir, cuales serán los
plazos para obtenerlos y en qué sitios, instituciones y/o empresas es conveniente ofrecer el
producto.
Costos
Para la instalación de la empresa tendremos que tener en cuenta varios costos irrecuperables como
la maquinaria necesaria para la producción. Se requiere de un termociclador, que se utilizará para el
proceso de PCR. Un shaker, para el cultivo. Cámaras de electroforesis, para la separación de
proteínas y ácidos nucleicos. Además para la correcta proliferación de las bacterias por un periodo
prolongado de tiempo, se piensa aplicar el método de la liofilización a las células ya listasvi, por lo
que se requiere de un liofilizador para bacterias. Finalmente un set de micropipetasvii.
Tabla1.- Costos de maquinaria necesaria en un laboratorio.*
Producto Valor CLP (aprox)
Mecheros (c/u) 90 mil más iva
Termociclador 2,5 millones más iva
Shaker 2,5 millones más iva
Cámaras de electroforesis 1,25 millones más iva
Tubos Eppendorf 1,5 ml (c/u) 11mil iva incluido
Micropipetas 400 mil más iva
Liofilizador 1,75 millones más iva
TOTAL $8.501.000*Fuente: Elaboración Propia
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También hay que considerar los costos variables en los que se incurrir en forma periódica, como el
arriendo de un local para la instalación de la maquinaria y el equipo de trabajar. Asimismo tener en
cuenta las materias primas a utilizar en el proceso, como las enzimas de restricción, las bacterias y el
medio de cultivo LB para estas.
Tabla2.- Materias primas para creación y mantención de cultivo E. coliviii
Producto Valor CLP (aprox)
Local de trabajo (arriendo) **
Enzimas de Restrición (BamHI) $52.000 (2.500 unidades)
Bacterias (Escherichia Coli) $140.000-180.000(5ml)
Medio de Cultivo LB Agar $195.000 (1Kg)
Ampicilina $1.500 (250 mg)
Peptona de Caseina $50.000 (1 Kg)Agar Bacteriológico $78.000 (1 Kg)
Extracto de Levadura $6.500 (1 Kg)
ClNa $1000 (1 Kg)*Fuente: Elaboración Propia
**El costo del arriendo del local depende de la preferencia y comodidad que desee el empresario. Sin embargo cabe aclarar que no es
necesario un espacio mayor a 15 mts².
Inicialmente se requerirá hacer el plásmido de interés que se querrá insertar en el cultivo. Este
consta del plásmido inicial del cual se comenzará el trabajo, es decir de los operones de interés para
la señal y la detección. Los operones se extraerán de las sepas de bacterias en las que han sido
localizados.
Tabla3.- Precios sepas y plásmidos específicos a utilizar en el proceso de la creación del
microorganismo.
Producto Valor CPL (aprox)
Plámido pBR322 (Escherichia Coli DH5α ) 63 mil (50 µg)
Sepa Ralstonia Metallidurans (operones pbr) 300 mil
Sepa Vibrio Fischery (operones lux) 300 mil*Fuente: Elaboración Propia
El producto que se le entregará al comprador es un kit que contiene una placa de petri con la
bacteria genéticamente modificada, una pipeta para extraer la muestra de agua, guantes para lacorrecta manipulación de las sustancias, un contenedor oscuro en donde se introduzca la placas de
petri con la muestra y las bacterias en ella para ser analizada correctamente por el luxómetro sin
que se vea influenciado por otras fuentes de luz; y dentro un manual que especifica cada paso a
seguir.
Tabla4.- Elementos que componen el kit a entregar.
Producto Valor CPL (aprox)
Luxometro (*) $20.000(**)
Guantes $2.990 (50 pares)ix
Petri desechable $233- $333 (por unidad)Pipeta desechable $10.193(100 unidades)+envío
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Empaque $700(por kit)
Contenedor oscuro(de PVC) $1000(cada uno)Fuente: Elaboración Propia
(*) El luxómetro será vendido aparte del kit para no aumentar el valor del producto, pues se pretende que el luxómetro sea reutilizable.
(**) Los precios varían entre los 14 mil y los 30 mil pesos
Preparación del Cultivo
Para la preparación del cultivo bacteriano se requiere una cantidad específica e indispensable de
sustratos, a continuación se presenta una tabla que los detalla.
Tabla5.- Componentes necesarios para la producción de bacterias para un Kitx.
Componente Precio
80 µg de célula competente Escherichia Coli
$2560
1-2 µg de plásmido que se desea insertar $1260
10g de Peptona de Caseina $500
5g ClNa $5
5g Extracto de Levadura $33
30 g de agar $2340
100 mg de ampicilina $600
TOTAL $7298*Fuente: http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-
resultados (26/07/2015)
Preparación del Kit
Para la preparación de un kit se requiere una cantidad específica de elementos, a continuación se
presenta una tabla que los detalla.
Tabla6.- Productos necesarios para la producción del kit:
Producto Precio
3 Par de Guantes $180
3 Capsulas de Petri $999
1 Pipeta $102
Bacterias Generadas $7298xi
1 Contenedor oscuro $1000
Empaque $700
1 Instructivo $25
TOTAL $10304*Fuente: Elaboración Propia
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultadoshttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultadoshttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultadoshttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultados
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Precauciones
Es necesario resaltar la importancia de un estudio de los riesgos que puedan traer los
microorganismos y que tan inofensivos son en distintas circunstancias. Se debe tener en
consideración que son bacterias alteradas genéticamente, por ende que su exposición y liberación
puede traer fuertes repercusiones ambientales.
Las bacterias, una vez finalizada su función deben ser depositadas en cloro para asegurar que no se
efectúe una contaminación al ambiente ni que existan percances con los residuos. Y las cápsulas que
no se ocupen en el momento deberán estar conservadas a la temperatura indicada en el producto.
Es importante destacar este tema, pues es necesario obtener el certificado de la Autoridad Sanitaria,
el cual se obtiene en el Departamento de Obras Municipales, y además pedir la Calificación Técnica a
la SEREMI de Saludxii (en caso que el producto sea de venta en el propio país).
Se sugiere que tanto en el envoltorio y empaque del kit, como dentro las instrucciones se aclaren las
contraindicaciones del producto. Además tiene que destacar con claridad un teléfono de
emergencias que traten los casos referentes a estas bacterias.
Todos las advertencias (obtenidas de los estudios previos) y sus respectivas instrucciones de uso,
serán mencionadas en el instructivo.
Discusión y Conclusiones
El tratamiento y análisis de aguas en la actualidad es un proceso fundamental y de gran importancia
para la obtención y un correcto control de la salubridad del agua potable que llega a los hogares de
las personas. Sin embargo el análisis de metales pesados, como lo es el plomo, el cual en muy bajas
concentraciones ya se cataloga como peligroso, es un proceso de mayor complejidad, donde serequiere una maquinaria capacitada y en varias ocasiones costosa. Para los hogares que deseen este
análisis existe una opción(aclarar que no está presente en todos los sectores) que consta en enviar
una muestra un laboratorio de análisis y luego de unos días recibir de vuelta los resultados de este.
El costo de este servicio, suele encontrarse entre los 80 y los 120 dólares ($52000 y $78000 pesos
chilenos respectivamente).
El proyecto presente ofrece una alternativa eficiente y práctica para el análisis del agua en la
identificación del plomo. Gracias a la especificidad de las bacterias y su emisión proporcional de luz
respecto a las concentraciones de plomo en el agua, es posible identificar las cantidades del metal
incluso en bajas concentraciones. Además, el kit permitirá una manipulación sencilla para todo
adulto, y de fácil comprensión al momento del análisis de datos. La rápida acción de las bacterias
ofrecerá al usuario obtener en el instante los resultados del estudio sin tener que esperar mucho
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tiempo para poder adoptar las medidas necesarias en caso que el agua no se encuentre en
condiciones bebestibles.
Los costos del análisis para el cliente se verán reducidos drásticamente, pues con el kit a un precio
de $40 dólares ($26.000 CLP aprox.) y un luxómetro que solo es necesario comprarlo una vez en el
caso que se deseen hacer más estudios, se alcanza una mejor opción para el comprador máseconómica. Cabe mencionar que el kit permitirá realizar tres análisis, los cuales beneficiarán de una
manera importante a los usuarios.
El costo de producción de cada kit es de $10.304 CLP, lo cual lleva al productor de este bien obtener
sobre un 100% de ganancia a la hora venderlo. Pudiendo recuperar (dependiendo del éxito de
venta), el capital inicial en el caso que se desee recuperar y no haya sido un beneficio otorgado por
el estado o alguna otra institución.
El proyecto puede mejorar y ser mejor aprovechado si se realizan más estudios, tanto para la
compra y venta del producto, como también del diseño y cultivo de las bacterias; lo que puede llevar
al productor de este proyecto de innovación a maximizar aún más sus beneficios. También
favorecerá de una manera más eficiente y accesible , práctica y cómoda, a la sociedad en busca de
una mejor calidad de vida. Por todo lo anterior se considera este proyecto como una alternativa
factible para implementar.
Bibliografía
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