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PROGRAMA DE BECAS “CONVOCATORIA ABIERTA
2011
VICENTE APOLONIO DELGADO RODRIGUEZ
UNIVERSIDAD DE LA HABANA
FACULTAD DE QUÍMICA
Máster en Química
Desarrollo de un procedimiento analítico para cuantificar trazas de plaguicidas
órganoclorados en muestras de hortalizas en Ecuador.
La Habana 2014
DEDICATORIA
A mi Esposa Margoth y a mi hija Lucia Micaela por apoyarme, por estar en mí ser cada día,
compartiendo desde el primer minuto de este proceso todas las experiencias.
Agradecimiento
Agradezco al Presidente Constitucional de la República del Ecuador, Rafael Correa Delgado y a la
SENESCYT por otorgar por concurso becas de postgrado a los profesionales y docentes para
mejorar el nivel Académico de la educación superior.
Dejo constancia de mi gratitud a la Universidad de la Habana, Alma Mater de la educación cubana,
Al Sr. Decano y profesores de la Facultad de Química, también a los compañeros de la Maestría V
Edición.
Agradezco a mis tutores Dra. Yoanna María Álvarez Ginarte, Dr. Mario Basterrechea Rey ,
MSc. Paulina Valeria Guevara García por confiar en mi persona, por la paciencia en la dirección de
la Tesis y por sus acertadas correcciones en todo el proceso de elaboración, quienes durante este
arduo trabajo teórico practico estuvieron orientándome, gracias por su tiempo invertido, por su
cordialidad y su apoyo.
Gracias al Dr. Gonzalo Dierksmeier Corcuera, Director del Instituto de Investigaciónes de Sanidad Vegetal de Cuba, a la Lic. Lissette Orta Arrazcaeta, Jefe del Laboratorio de esta Institución.
Mi agradecimiento al Sr. General Carlos Rodríguez Arrieta, Rector de la Universidad de las
Fuerzas Armadas ESPE.
Al Sr. Director del Departamento de Ciencias de la Tierra y La Construcción, Coronel Rodolfo
Salazar.
A los compañeros docentes por el apoyo.
A mis hermanos y amigos que me acompañaron en esta jornada científica que significó la maestría
y que de forma incondicional, entendieron mi ausencia. A mis padres, que están en el cielo.
A pesar del Espacio-Tiempo, siempre estuvieron en mi corazón y atentos para saber cómo se
desarrolla el proceso desde un principio hasta el día de hoy que siguen dándome ánimo para
concluir los estudios.
No eres el Último, más bien eres el Primero A ti DIOS… manifestación Universal.
Gracias.
GLOSARIO DE ACRONIMOS ABREVIATURAS
ASTM: Sociedad Americana para Ensayos de Materiales µg: micro gramo µL: micro litro Ataxia: Signo clínico que se caracteriza por provocar la descoordinación Avicida: plaguicida utilizada para eliminar pájaros BAF: Factor de Bio Acumulación BHC: Hexacloruro de benceno °C: Grados Celsius CAE: Corporación Aduanera Ecuatoriana CAS: Servicio de resúmenes de química (Chemestry Abstracts Service) CFP: Consentimiento Fundamentado Previo (Convenio de Rotterdam) CGP: Cromatografía de permeación sobre gel CIPAC: Colaboración Analítica Internacional del consejo de plaguicidas Clúster: conjunto , "grupo" COP: Compuestos Orgánicos Persistentes CV: Coeficiente De Variación DMFS: Dispersión de Matriz en Fase Sólida ECD: Detector de Captura de Electrones EEG: Electroencefalograma EFS: Extracción en Fase Sólida EPA: Environmental Protection Agency, Agencia de Protección Ambiental ESBM: Extracción en fase sólida sobre barras magnéticas ESPE: Escuela Superior Politécnica del Ejercito FAO: Organización de Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación FBA: Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer g : Gramos GC: Cromatografía de gases h : horas ha : Hectáreas HCH: hexaclorociclohexano IARC: Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer IASA Instituto Agropecuario Superior Andino ICH : Conferencia Internacional de Armonización INIAP: Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias Kg: Kilogramo LMA: Laboratorio de Medio Ambiente LMR: Límite Máximo de Residuo LMRP: Límites Máximos de Residuos de Plaguicidas LOC: Límite de Cuantificación LOD: Límite de Detección MEFS: Micro Extracción en Fase Sólida min: minuto mL: mililitro
ng: nano gramo NOEL : Level without observed effect, Nivel sin efecto observable OAE: Organismo de Acreditación Ecuatoriano OMS: Organización Mundial de la Salud POCL: Plaguicidas órganoclorados ppm: Partes por millón RD: Real Decreto RSD: Desviación estándar relativa SNEM: Servicio Nacional de Erradicación de la Malaria T.C.A. : Tasa de Crecimiento promedio Anual TCNAV: Total Chrom Navigator t: Tonelada métrica UFAE ESPE Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador ESPE USP : Farmacopea Americana
SÍNTESIS
El uso intensivo de plaguicidas órganoclorados ha generado un gran impacto medioambiental en la
producción agrícola. La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador y sus huertos aledaños
disponen de extensas áreas de cultivos de hortalizas y no están exentos a estos problemas
medioambientales. En este trabajo se aplicaron métodos de extracción líquido-líquido y de
purificación con fase sólida utilizando una columna pre empacada con florisil que permitió separar
concentrar y recuperar los plaguicidas órganoclorados (Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y
pp’DDT) de las muestras de hortalizas (tomate, col, brócoli, zanahoria y espinaca). Se desarrolló
además, un procedimiento por cromatografía de gases capaz de separar, identificar y cuantificar
estos plaguicidas empleando para ello una columna Elite de última generación con un mayor
contenido de metil-fenil polisiloxano con la que se obtiene una buena resolución en las señales
cromatográficas. El procedimiento de análisis fue validado y adecuado a las condiciones del
Laboratorio de Medio Ambiente de la Universidad. La innovación y aplicación de este
procedimiento permitirá auto gestionar recursos económicos a través de la prestación de servicios
a la comunidad y a las asociaciones de productores de hortalizas, contribuyendo a la seguridad y a
la calidad alimentaria en Ecuador.
Palabras claves: plaguicidas órganoclorados, extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida,
cromatografía de gases, validación
ÍNDICE
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 1
CAPÍTULO 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5
2.1. Generalidades de plaguicidas 5
2.1.2 Propiedades y aspectos toxicológicos de los plaguicidas órganoclorados 7
Lindano (CAS: 58-89-9) 7
Aldrín (CAS: 309-00-2) 8
Dieldrín (CAS: 60-57-1) 9
Isodrín (CAS: 465-73-6) 10
Endrin (CAS: 72-20-8) 11
Dicloro Difenil Tricloroetano, DDT (CAS: 50-29-3) 12
2.2 Métodos de extracción para plaguicidas 13
2.3 Cromatografía de gases 16
2.4 Validación de la metodología de determinación analítica 18
CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS 25
3.1. Reactivos, materiales y equipos de laboratorio 25
3.2. Métodos 27
3.2.1. Muestreo de las hortalizas 27
3.2.2. Técnica de extracción de los residuos de plaguicidas órganoclorados 27
3.2.3. Optimización de los parámetros cromatográficos 28
3.2.4. Procedimiento de dopaje a las muestras de hortalizas certificadas 30
3.2.5. Estimación de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico 31
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35
4.1. Optimización de las condiciones cromatográficas 36
4.2. Estudio de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico 40
Linealidad 40
Precisión 45
Exactitud 48
Especificidad 50
Límite de detección y cuantificación 52
4.3. Aplicación del procedimiento propuesto en muestras de hortalizas en Ecuador 54
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES 59
CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES 60
CAPÍTULO 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
Introducción
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1
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
En los últimos 20 años, el uso intensivo de agroquímicos ha generado un gran impacto ambiental en
las producciones agrícolas de Ecuador1. Desde su aparición en los años 40, los plaguicidas han
sido ampliamente usados en la agricultura, la veterinaria y la salud pública en muchos países.
Además son resultado del antiguo anhelo del ser humano por librarse de plagas que invaden su
modo de vida. En la actualidad es conocido que estos compuestos son venenos peligrosos para la
salud y para el medio ambiente.
Siendo conscientes del perjuicio que causan los agroquímicos en los sistemas bióticos es apropiado
proponer soluciones a este problema, con la finalidad de tomar conciencia para sustituir, disminuir y
controlar el consumo de productos químicos sin reducir la productividad y la calidad de los productos
agropecuarios. La agricultura orgánica propone reducir la incidencia de agroquímicos, que actúan
inhibiendo, repeliendo, disuadiendo o eliminando plagas y enfermedades de distintos tipos2, sin
embargo, sigue siendo un grave problema los residuos que aún quedan en la tierra o el agua
después de su aplicación.
El uso de los agroquímicos en los cultivos se inicia desde el tratamiento del suelo hasta el empacado
para su libre comercialización. Para prevenir y controlar la propagación de enfermedades y plagas
que amenazan la productividad agrícola, se requiere utilizar un promedio de 80 clases de
compuestos químicos, entre fungicidas, insecticidas, herbicidas, fertilizantes, etc. El uso repetido de
estos productos origina formas de dependencia y alteración en el equilibrio biológico3.
El empleo de los plaguicidas órganoclorados ha despertado una gran preocupación ya que estas
sustancias poseen las características de ser muy resistentes al agua, a las altas temperaturas y al
tiempo, además su proceso de degradación en muchas ocasiones desencadena otros metabolitos
que también resultan perjudiciales, por lo que es de vital importancia la cuantificación de los residuos
peligrosos en los productos agrícolas para el consumo humano. Es por esto que se ha establecido la
estricta observación en el cumplimiento de los Límites Máximos de Residuos de Plaguicidas
(LMRP), parámetro que es exigido internacionalmente por la comisión del Codex Alimentarius 4 del
Introducción
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2
programa conjunto de la Organización de Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y la
Organización Mundial de la Salud (FAO/OMS) y establece las normas que los regulan 5.
La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE) y sus huertos aledaños disponen
de extensas áreas de cultivos tanto de hortalizas como de frutales y no están exentos a estos
problemas medioambientales, ocasionados por el uso indiscriminado de plaguicidas órganoclorados.
Por todo lo anterior, se plantea el siguiente problema científico:
La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE) y los huertos aledaños, disponen
de extensas áreas de cultivos de hortalizas para el consumo local y la exportación. Por lo que es
necesario disponer de un procedimiento analítico que en las condiciones de trabajo del Laboratorio
de Medio Ambiente (LME) de la UFA ESPE, permita cuantificar en las muestras de hortalizas, el
contenido de residuos de los siguientes plaguicidas órganoclorados: Lindano (CAS, Chemestry
Abstracts Service: 58-89-9), Aldrin (CAS: 309-00-2), Isodrin (CAS: 465-73-6), Endrin (CAS: 72-20-8),
pp'DDT (CAS: 50-29-3), Dieldrin (CAS: 60-57-1) para que los productores puedan vender y exportar
productos seguros para el consumo humano y garantizar la calidad alimentaria en sus
consumidores.
Como método o procedimiento para solucionar el anterior problema científico se formula la siguiente
hipótesis:
Es posible identificar y cuantificar la concentración de plaguicidas órganoclorados en las hortalizas
cosechadas en la UFA de Ecuador y sus huertos aledaños, aplicando un procedimiento interno de
validación por cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD).
Para demostrar la anterior hipótesis y dar respuesta al problema científico planteado, se propone el
siguiente objetivo general:
Desarrollar y validar un procedimiento de análisis para cuantificar residuos de plaguicidas
órganoclorados (Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y pp’ DDT) en hortalizas ecuatorianas
empleando cromatografía de gases.
Introducción
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Objetivos específicos:
1. Separar y concentrar analitos órganoclorados de una matriz de hortalizas utilizando el método de
extracción líquido –líquido y la purificación con fase sólida.
2. Desarrollar un procedimiento cromatográfico capaz de separar, identificar y cuantificar el analito
aplicando la cromatografía de gases.
3. Validar el procedimiento de cromatografía de gases para la cuantificación de plaguicidas
órganoclorados en hortalizas, adecuándolo a las condiciones específicas del Laboratorio de Medio
Ambiente (LMA) de la Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE).
La novedad científica de esta investigación es la implementación, adecuado a las condiciones del
laboratorio de medio ambiente de la Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador, de un
procedimiento analítico interno que permitió cuantificar residuos de plaguicidas órganoclorados en
hortalizas ecuatorianas. Durante la etapa de purificación de los analitos se utilizaron cartuchos de
florisil para realizar el tratamiento simultáneo de varias muestras. Además durante la separación por
cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD), se empleó por vez primera
una columna capilar (Elite) de última generación con un mayor contenido de metil-fenil polisiloxano
que permitió una mejor resolución en las señales cromatográficas. Ambos resultados permitieron
disminuir el tiempo de análisis para los plaguicidas objetos de estudio, comparando el procedimiento
descrito con el método 1 de referencia implementado por el Instituto de Investigaciones de Sanidad
Vegetal, La Habana, Cuba. El procedimiento analítico propuesto además fue validado según los
requerimientos de la norma ISO/IEC 17025:2005 6.
Impacto económico y medio ambiental
Con esta investigación la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE a través del Laboratorio de
Medio Ambiente podrá disponer de un procedimiento analítico para cuantificar el contenido de trazas
de plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas. La innovación y aplicación de este
procedimiento contribuirá a la seguridad y a la calidad alimentaria en Ecuador. Además se dispondrá
de información confiable sobre los niveles de residuos de plaguicidas en productos agrícolas y los
impactos que pueden tener en la salud humana. Esta metodología analítica permitirá a la
Universidad auto gestionar recursos económicos a través de la prestación de servicios a la
Introducción
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comunidad y a las asociaciones de productores de hortalizas, lo cual contribuirá a comercializar los
productos agrícolas, según lo establecido en las regulaciones sanitarias y que la producción sea
segura para el consumo de la población. En caso contrario originaría pérdidas económicas
considerables, así como daños a la salud y al medio ambiente en Ecuador.
CAPÍTULO 2
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Revisión Bibliográfica
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5
CAPÍTULO 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Generalidades de plaguicidas
Los plaguicidas o agroquímicos son sustancias químicas o mezclas de sustancias, destinadas a matar,
repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas (Cualquier
especie, raza o biotipo vegetal o animal o agente patógeno dañino para las plantas o productos
vegetales)7.
Según el diccionario de la Real Academia de la Lengua Española, el término pesticida es un adjetivo
(usado también como sustantivo) cuyo significado es "que se destina a combatir plagas". Por tanto, en
español, el término "pesticida" se refiere a una modalidad de "plaguicida". El término plaguicida está
más ampliamente difundido que el nombre genérico exacto: biocida (literalmente: matador de la vida).
Los plaguicidas pueden ahorrar dinero a los agricultores al prevenir las pérdidas de cosechas por
insectos y otras plagas. En un estudio se calculó que los agricultores en los Estados Unidos ahorraron
el equivalente de cuatro veces el costo de los plaguicidas. Otro estudio demostró que el no usar
plaguicidas resultaba en una pérdida del 10% del valor de las cosechas. Estudio realizado en 1999
encontró que una prohibición de plaguicidas en los Estados Unidos puede resultar en un aumento del
coste de los alimentos, pérdidas de empleos y aumento del hambre mundial.
El uso de plaguicidas crea una serie de problemas para el medio ambiente. Más del 98% de los
insecticidas fumigados y del 95% de los herbicidas llegan a un destino diferente del buscado,
incluyendo especies vegetales y animales, aire, agua, sedimentos de ríos, mares y alimentos. La deriva
de plaguicidas ocurre cuando las partículas de plaguicidas suspendidas en el aire son llevadas por el
viento a otras áreas, pudiendo llegar a contaminarlas. Los plaguicidas son una de las causas principales
de la contaminación del agua y ciertos plaguicidas son contaminantes orgánicos persistentes que
contribuyen a la contaminación atmosférica.
Revisión Bibliográfica
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En adición, el uso de plaguicida reduce la biodiversidad, reduce la fijación de nitrógeno, contribuye al
declive de polinizadores (reducción de los polinizadores en muchos ecosistemas, desde finales del siglo
20), destruye hábitats (especialmente para aves), y amenaza a especies en peligro de extinción.
Los plaguicidas representan un gran riesgo para los obreros que manufacturan las sustancias, para el
personal que transporta, para los consumidores que aplican el producto como para el público en
general. Por estas razones la Asociación Médica de Estados Unidos recomienda limitar la exposición a
los seres humanos a los plaguicidas y el uso de alternativas menos peligrosas.
Existe incertidumbre acerca de los efectos de la exposición prolongada de dosis bajas de plaguicidas.
Los sistemas de supervisión actuales son inadecuados para definir los riesgos potenciales relacionados
con el uso de plaguicidas y con enfermedades relacionadas. Teniendo en cuenta esta falta de datos, es
prudente limitar la exposición a plaguicidas y usar los menos tóxicos o recurrir a alternativas no
químicas.
Hay alternativas al uso de plaguicidas que incluyen métodos de cultivo usando controles biológicos,
tales como feromonas y plaguicidas microbianos, ingeniería genética, métodos de disrupción de la
reproducción de insectos. Estos métodos están ganando popularidad por ser más saludables y a veces
también más efectivos.
Según su acción específica los plaguicidas pueden clasificarse como: insecticida, acaricida fungicidas,
desinfectante, bactericida, herbicida, fitorregulador y productos afines, entre otros.
Según su grado de peligrosidad para las personas, los plaguicidas se clasifican:
De baja peligrosidad: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea no entrañan
riesgos apreciables.
Tóxicos: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos de
gravedad limitada.
Nocivos: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos
graves, agudos o crónicos, e incluso la muerte.
Revisión Bibliográfica
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7
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Muy tóxicos: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos
extremadamente graves, agudos o crónicos y la muerte.
La clasificación toxicológica8 de los plaguicidas en las categorías de baja peligrosidad, nocivos, tóxicos
o muy tóxicos se realiza atendiendo básicamente a su toxicidad aguda, expresada en DL50 (dosis letal al
50 %) por vía oral o dérmica para la rata, o en CL50 (concentración letal al 50 %) por vía respiratoria
para la rata, de acuerdo con una serie de criterios que se especifican en las normas y leyes
competentes, atendiendo principalmente a las vías de acción más importantes de cada compuesto.
Atendiendo a su naturaleza química se clasifican como9: órganoclorados, órganofosforados,
carbamatos, piretroides, órganomercuriales, quinonas, anilinas, bencimidazoles, triazinas, entre otros.
En el presente trabajo de tesis se estudiaran específicamente seis plaguicidas órganoclorados: Lindano
(CAS, Chemestry Abstracts Service: 58-89-9), Aldrin (CAS: 309-00-2), Isodrin (CAS: 465-73-6), Endrin
(CAS: 72-20-8), pp'DDT (CAS: 50-29-3), Dieldrin (CAS: 60-57-1).
2.1.2 Propiedades y aspectos toxicológicos de los plaguicidas órganoclorados
Lindano (CAS: 58-89-9)
Fue excluido de la lista de sustancias activas autorizadas para el uso en
productos de protección de plantas en 1991 bajo la Ley para protección de
plantas contra plagas y pestes en muchos países10.
Este plaguicida está designado como un producto químico CFP (Consentimiento Fundamentado Previo
del Convenio de Rotterdam) y está permitida su importación y uso como producto químico para la
investigación o propósitos de laboratorio en cantidades menores de 10 kg.11.
Por sus características, una vez liberado, persiste por muchos años en el ambiente, se transporta a
largas distancias y se bioacumula fácilmente en la cadena de la alimentación por su elevada
liposolubilidad o capacidad de disolverse en grasas. Se bioconcentra en forma muy rápida en
microorganismos, invertebrados, peces, aves y mamíferos, contaminando los alimentos y la leche
materna. De esta manera los seres humanos y los animales se ven expuestos al lindano tal como lo
demuestran los niveles detectables en sangre, tejido adiposo y leche materna humanos. En particular
Revisión Bibliográfica
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8
es preocupante la exposición en niños y mujeres embarazadas. Por lo que es un plaguicida prohibido
en todas sus formulaciones en el medio ambiente12. La siguiente tabla muestra las propiedades
químicas y físicas del Lindano.
Tabla 1. Propiedades físicas y químicas del Lindano11, 13.
Nombre químico: 1α,2α,3β,4α,5α,6β-hexaclorociclohexano
Sinónimos y nombres comerciales: Gamma Hexacloruro de benceno; Isómero Gamma del hexacloruro de benceno; BHC; Gamma-BHC; Ciclohexano, entre otros.
Fórmula y Peso molecular (PM): C 6H 6Cl6; PM = 290, 83 g/mol
Presión de vapor: 4,4 mPA (24°C)
Densidad g/mL 20°C: 1,88
Solubilidad g/L: 8,52 (25°C) en agua, mayor que 200 (25°C) en acetona, (10-14) (25°C) en n-heptano.
Estabilidad: Estable a la luz, al aire, a temperaturas superiores a 180°C y a los ácidos, en álcalis sufre deshidroclorinación.
Aldrín (CAS: 309-00-2)
Es un producto químico de síntesis14 utilizado como insecticida. Se
relaciona con otros compuestos similares químicamente como el
Endrin, Dieldrin e Isodrin, que se encuentran prohibidos en la Unión
Europea. Es un compuesto orgánico persistente (COP) en el medio
ambiente y puede acumularse en los organismos vivos.
Es también altamente tóxico para la mayoría de formas de vida existentes. Esta sustancia se incorpora
al medio ambiente como resultado de su uso como plaguicida en las cosechas y en el suelo. A nivel
global, se pueden encontrar concentraciones significativas de Aldrín a grandes distancias respecto al
punto donde se aplicó, debido a que este compuesto es extremadamente volátil, por lo que se evapora
y se incorpora rápidamente a la atmósfera. El Aldrín se encuentra principalmente adherido a
determinadas cosechas, lo que provoca el envenenamiento de las aves acuáticas, como consecuencia
de la ingesta de la flora autóctona o de animales de la cadena trófica que estén contaminados. Esta
sustancia puede absorberse a través de la piel y por ingestión, provocando alteraciones del sistema
nervioso central si la exposición es de corta duración. Si el intervalo de exposición es prolongado puede
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9
provocar daños sustanciales en el cerebro, el hígado y el plasma sanguíneo15. Los umbrales de emisión
establecidos por el Real Decreto (RD) 508/2012 (kg/año)16, son los siguientes: umbral de emisión a la
atmósfera: 1 kg/año, umbral de emisión al agua: 1 kg/año, umbral de emisión al suelo: 1 kg/año. La
siguiente tabla muestra las propiedades químicas y físicas del Aldrín.
Tabla 2. Propiedades físicas y químicas del Aldrín.
Nombre químico: 1,2,3,4,10,10-hexacloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-1,4:5,8-dimetanonaftaleno
Sinónimos y nombres comerciales:
Aldrine, Aldrec, Aldrex, Aldrex 30, Aldrite, Aldrosol, Altox, Bangald, Compuesto 118, Drinox, ENT 15949,HHDN, Octalene, Rasayaldrin, Seedrin, OMS 194.
Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8Cl 6; PM = 364.92 g/mol
Presión de vapor: 8,6 mP (20°C)
Densidad g/mL 20°C: 1,6
Solubilidad g/L 27°C: 0,027mg/L en agua, mayor que 600 en Acetona, Benceno y Xileno.
Estabilidad: Estable hasta 200°C reacciona con ácidos concentrados y fenoles, en presencia de agentes oxidantes da dieldrin
Dieldrín (CAS: 60-57-1)
El Aldrín se transforma en Dieldrín cuando entra al ambiente.
Es un polvo blanco cuando está puro, mientras que en calidad
técnica es un polvo de color canela. En comparación con el
Aldrín, se evapora más lentamente al aire.
Se puede encontrar también, en el suelo, el agua o en viviendas donde se usaron estos compuestos
para matar termitas (insectos pequeños que se alimentan de la madera). La Agencia Internacional de
Investigación sobre el Cáncer (IARC) indica que sólo existe una evidencia muy limitada para la
carcinogenicidad del dieldrin en animales (IARC, 1987). En el ser humano produce hiperexcitabilidad,
hiperactividad y convulsiones, acompañados de náuseas, vómitos y dolor de cabeza17. La intoxicación
crónica puede causar desmayos, espasmos musculares, temblores y pérdidas de peso18.
Revisión Bibliográfica
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Tabla 3. Propiedades físicas y químicas del Dieldrín.
Nombre químico: (IR,4S,5S,8R)-1,2,3,4,10,10-hexacloro-6,7,-epoxi-1,4,4,5,6,7,8,8-
octahidro-endo-1,4-exo-5,8-dimetanonaftaleno
Sinónimos y nombres comerciales: Alvit, D-31, Dieldrite, Dieldrix, ENT 16,225, Heod, Octalox
Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8 OCl 6; PM = 380,92 g/mol
Presión de vapor: 0,4 mP (20°C)
Densidad g/mL 20°C: 1,62
Solubilidad g/L 20°C: 0,186mg/L en agua, soluble solventes orgánicos
Estabilidad: Estable en medio alcalino, moderadamente estable en medio ácido y a la luz.
Isodrín (CAS: 465-73-6)
Es un plaguicida órganoclorado prohibido y descontinuado,
estructuralmente, está estrechamente relacionado con el Aldrin.
En el pasado, fue utilizado como insecticida. Es inestable y
puede reaccionar con la luz o ácidos.19
El Isodrín puede sufrir una transformación microbiana muy lenta a Endrin, es persistente en el medio
ambiente y se adsorbe fuertemente a los sólidos en suspensión y en los sedimentos. Se acumula en el
tejido adiposo del cuerpo y biomagnifica particularmente en los organismos acuáticos. El Isodrín todavía
no ha sido clasificado de acuerdo a su capacidad cancerígena por la Agencia de Protección Ambiental
(EPA). Aunque otros plaguicidas órganoclorados si han sido identificados como disruptores endocrinos
y estudios recientes mostraron que los plaguicidas órganoclorados son factores importantes en la causa
de los cambios patológicos y fracasos reproductivos, así como la supresión de la inmunidad y los
cambios en la estabilidad del desarrollo en muchos mamíferos marinos. Este compuesto es también,
extremadamente sensible al estímulo, causa sensación de picadura al contacto con la piel, dolor de
cabeza, vértigo, náuseas, vómitos, incoordinación del movimiento, temblor, confusión mental y estado
híper excitabilidad20. En casos severos: produce convulsiones, estado de coma y depresión
respiratoria21. Los umbrales de emisión establecidos en kg/año son: umbral de emisión a la atmósfera 1
kg/año, umbral de emisión al agua 1 kg/año, umbral de emisión al suelo 1 kg/año. La siguiente tabla
muestra las propiedades químicas y físicas del Isodrín.
Revisión Bibliográfica
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Tabla 4. Propiedades físicas y químicas del Isodrín.
Nombre químico: (1R,4S,5R,8S)-1,2,3,4,10,10-hexachloro-1,4,4,5,8,8-hexahidro-
1,4:5,8-dimetanonaftaleno
Sinónimos y nombres comerciales:
ENT19,244, Experimental Insecticide 711, OMS 198, SD-3418.
Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8Cl 6 ; PM=364.92 g/mol
Presión de vapor: 5,8 mP (25°C)
Densidad g/mL 20°C: 1,87
Solubilidad g/L 20°C: Insoluble en agua, es muy liposoluble.
Estabilidad: Alta estabilidad química.
Endrin (CAS: 72-20-8)
Es un insecticida ciclodieno, proveniente del endrino,
actualmente su uso es prohibido por el Convenio de Rotterdam.
La mayor parte de su uso (80 %) era en aerosol para el control
de plagas de insectos en las producciones de algodón.
También se usó en el cultivo del arroz y la caña de azúcar, así como en granos y remolacha22. Este
plaguicida puede ser adsorbido por los sedimentos del agua y bioacumularse en los tejidos de los
organismos vivientes en este medio. Por lo tanto, es muy tóxico para los organismos acuáticos como:
peces, invertebrados y el fitoplancton. Los alimentos contaminados con Endrin causan severos daños
por envenenamiento en la vida silvestre. Este compuesto es rápidamente absorbido y tóxico por la
boca, por contacto con la piel y por inhalación. Actúa como un estimulante del sistema nervioso central.
Se ha reportado que una dosis oral de 0,25 mg/kg peso corpóreo, causa convulsiones en los seres
humanos. Los síntomas pueden aparecer entre 20 min. y 12 h sucesivamente a la ingestión accidental o
exagerada sobre exposición y pueden incluir dolor de cabeza, mareo, náusea, vómito, debilidad en las
piernas y convulsiones, conduciendo a veces a la muerte23. Algunas estimaciones indican que su vida
media en el suelo es de más de 10 años y puede haber lixiviación a las aguas subterráneas bajo ciertas
condiciones. Pueden volatilizarse pequeñas cantidades del suelo y/o terminar en el aire con partículas
de polvo. La siguiente tabla muestra las propiedades químicas y físicas del Endrin.
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Tabla 5. Propiedades físicas y químicas del Endrin.
Nombre químico: 1,2,3,4,10,10-Hexacloro-6,7-epoxy-1,4,4,5,6,7,8,8-octahidro- endo-5,8-dimetanonaftaleno
Sinónimos y nombres comerciales: Endrex, Endricol, Hexadrin, Mendrin, Isodrin Epoxide, Nendrin
Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8Cl 6O; PM = 380.92 g/mol
Presión de vapor: 2x10 -5 mP (20°C)
Densidad g/mL 20°C: 1,64
Solubilidad g/L 27°C: Escasa solubilidad en agua,moderadamente soluble en acetona,benceno; poco soluble en alcoholes e hidrocarburos del petróleo.
Estabilidad: El producto técnico se descompone a temperaturas mayores de 200°C.
Dicloro Difenil Tricloroetano, DDT (CAS: 50-29-3)
Es un sólido blanco cristalino sin olor o sabor. Es un plaguicida
que ha sido usado extensamente en el pasado para controlar
insectos en la agricultura e insectos que transmiten
enfermedades como la malaria24.
Su usó en los EE.UU, se prohibió en 1972 por el daño causado a la vida silvestre. El 15 de septiembre
de 2006 la Organización Mundial de la Salud (OMS) anunció que el plaguicida vuelve a ser parte de su
programa para erradicar la malaria y se aplicará en la fumigación en el interior de las residencias para
matar a los mosquitos que transmiten esta enfermedad. Debido a que estudios científicos25 mostraron
que su utilización para este fin no representa peligro para la vida. El Gobierno realizó la última
importación de pp’ DDT en 1994. El Servicio Nacional de Erradicación de la Malaria (SNEM) fue el
responsable de su aplicación 2 veces por año, habiéndose utilizado en su totalidad hasta el año 1999.
Su aplicación programada fue de 534 g de DDT por casa en 150 000 casas26. Los efectos adversos
para la salud de los animales del DDT incluyen fallos en la reproducción y en el desarrollo, posibles
efectos en el sistema inmunitario y muertes difundidas de aves salvajes después de rociar el DDT. Los
peces marinos parecieron ser muy sensibles al DDT: su dosis letal (DL50, dosis que causa la muerte en
el 50 % de la población) a 96 horas varía de 0,4 a 0,89 microgramos/L para muchos teleósteos. Los
moluscos bivalvos, concentran plaguicidas órganoclorados, sin llegar a ser un peligro para ellos tienen
una DL50 a 96 horas mayor de 10 mg/L. Debido a su transporte atmosférico el DDT ha sido detectado
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en el aire, la tierra, el hielo, la nieve y virtualmente en todos los niveles de la cadena alimentaria del
Ártico.
Muchos estudios indican que los sedimentos del fondo en lagos y ríos actúan como reservas para el
DDT y sus metabolitos. Estudios en ratones mostraron que el Level without observed effect (NOEL,
Nivel sin efecto observable) es 0,25 mg/kg/día27. La siguiente tabla muestra las propiedades químicas y
físicas del DDT.
Tabla 6. Propiedades físicas y químicas del DDT.
Nombre químico: 1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etano
Sinónimos y nombres comerciales: DDT, Agritan, Anofex, Arkotine, Azotox, Bosan Supra, Bovidermol,
entre otros.
Fórmula y Peso molecular (PM): C 14H 9Cl 5; PM = 354,49 g/mol
Presión de vapor: 0,025 mP (20°C;pp´DDT)
Densidad g/mL 15°C: 1,56
Solubilidad g/L 27°C: Soluble en la mayor parte de los disolventes orgánicos.
Estabilidad: Es altamente persistente en el suelo: 50% desaparece entre los 2 a 15 años. Es un contaminante de aguas superficiales.
2.2 Métodos de extracción para plaguicidas
Cuando se va a aplicar una técnica o procedimiento analítico, es imprescindible discernir claramente
cuál es la muestra, cuales son las características de su matriz y cuál es el analito. Usualmente, el
procedimiento de preparación de la muestra aparece descrito en normas que regulan e indican cómo
debe realizarse esta sub-etapa en función de las características de la matriz.
La extracción es la primera etapa de una técnica analítica. El objetivo es aislar el analito de la matriz de
la forma más completa posible evitando la presencia de interferencias. Por lo tanto, hay que evaluar la
naturaleza no sólo del analito sino también de la matriz, para que esta etapa sea lo más eficiente
posible.
Existen diferentes tipos de extracción atendiendo a las características de la muestra en estudio. En el
caso de muestras sólidas se lleva a cabo la extracción sólido-líquido en la que los analitos se
transfieren desde la matriz al solvente seleccionado. La eficiencia de la extracción depende de tres
factores relacionados entre sí como son la solubilidad, la transferencia de masa y el efecto de la matriz.
La solubilidad de un analito depende del tipo de solvente y está influenciada por la temperatura y la
presión. La transferencia de masa depende del tamaño de partícula de la matriz y se ve favorecida por
el uso de solventes de baja viscosidad, la agitación, temperatura, presión elevada y un tamaño de
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partícula pequeño, el efecto matriz se produce, por la influencia de todos los componentes de la
muestra distintos al analito28. En este trabajo se extraen de muestras solidas o semi sólidas y se utiliza
el acetonitrilo como solvente de extracción previa29.
La extracción líquido-líquido se basa en el reparto del analito entre dos líquidos inmiscibles. La
eficiencia del proceso depende de factores como la afinidad del analito por el disolvente y el número de
extracciones sucesivas que se lleven a cabo. Consiste en separar una o varias sustancias disueltas en
un solvente mediante su transferencia a otro solvente inmiscible, o parcialmente inmiscible en el
primero. La transferencia de materia se consigue mediante el contacto directo entre las dos fases
líquidas. Entre los solventes más usados tenemos por ejemplo el n-hexano.
La extracción con disolventes orgánicos y la purificación proporcionan excelentes resultados, aunque es
un proceso largo y tedioso que presenta inconvenientes como, la necesidad de emplear grandes
cantidades de disolventes cuyo costo es muy elevado30,31,31b. En la extracción de los plaguicidas
órganoclorados (POCL) en alimentos se ha empleado un amplio número de disolventes orgánicos.
Existen directrices generales con carácter internacional sobre las características que debe reunir un
método de extracción, permitiendo al analista combinar distintos solventes. Se basan en una primera
homogenización con disolventes miscibles con el agua32,33,34 o en la extracción directa con disolventes
inmiscibles35,36. En la siguiente tabla se muestran las técnicas de extracción que generalmente se
emplean para los plaguicidas.
Tabla 7. Técnicas de extracción de plaguicidas
Técnica de extracción
Disolvente Pasos de limpieza Plaguicidas identificados
QuEChERS Extracción dispersiva en fase sólida
Isocarbofos, Metil isofenfos
Acetonitrilo De 31 a 130 plaguicidas multiclase
Acetato de Etilo Extracción dispersiva en fase sólida
78 plaguicidas multiclase
Sólido - Líquido Extracción dispersiva en fase sólida
151 plaguicidas multiclase
Acetonitrilo 72 plaguicidas multiclase
Endosulfán Metamidofos
Metalaxil
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Diclorometano Plaguicidas órganoclorados
Acetona Clorpirifos
Líquido - Líquido Acetona, éter y diclorometano
Extracción en fase solida
13 plaguicidas multiclase
Fluidos supercríticos C02 Plaguicidas multiclase Asistida por microondas Micro extracción en
fase sólida Bifentrin, acrinatrin, deltametrin y ּג- cihalotrin
Específicamente, para la extracción de plaguicidas órganoclorados existen varios métodos
multirresiduales que se aplican en dependencia del sustrato que se va a analizar o de forma opcional.
El primer método37 es aplicable a la determinación de residuos de los plaguicidas: aldrín, beta-ciflutrina
y metabolitos, captan, clordano, ciflutrina, cipermetrina, pp’ DDT y metabolitos, deltametrina, dicofol,
dieldrín, endosulfán y metabolitos, fenvalerato, lambda-cialotrina, lindano, nitralín, oxadiazón,
permetrina y propanil en diferentes sustratos: muestras frescas (70 % de humedad y menos de 10 % de
grasas), muestras secas, muestras con alto contenido de grasas (más de 10 %), agua, suelo,
sedimento, aire y granos tratados en la etapa de almacenamiento37.
El segundo método es aplicable a la determinación de residuos de: bifenilos policlorados (PCB),
heptacloro, aldrín, DDT, y metabolitos HCB, HCH, lindano, entre otros en muestras de miel de abeja.38
El tercer método se adapta a la determinación de residuos de los plaguicidas Aldrín, Captafol, Captán,
Clordano, Clorotalonilo, DDT y sus metabolitos, Dicofol, Dieldrín, Endrín, Endosulfán, Folpet, entre otros
en materiales no grasos y vegetales38.
El cuarto método es aplicable a la determinación de residuos de: Bifenilos Policlorados (PCB),
Heptacloro, Aldrin, DDT y metabolitos, Lindano, Dieldrín, Endrin, entre otros, en muestras de suelo y
sedimentos utilizando el procedimiento de extracción por Soxhlet38.
El quinto método es aplicable a la determinación de residuos de: PCB, Heptacloro, Aldrín, DDT y
metabolitos, Lindano, Dieldrín, Endrin, Endosulfan, entre otros, en muestras de biota por el método de
extracción por Soxhlet38.
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En nuestro trabajo realizaremos la extracción de los siguientes plaguicidas órganoclorados: Lindano,
Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y DDT en muestras de hortalizas (zanahoria, tomate, col, brócoli y
espinaca), por lo que el primer método de extracción será el utilizado38
La extracción en fase sólida convencional (EFS) es también una técnica muy utilizada para la
purificación de plaguicidas órganoclorados (POCL), pues evita los inconvenientes asociados a la
extracción con disolventes con elevado consumo de los mismos, separación incompleta de las fases, e
interferencias de la matriz, y se obtienen ventajas como reducción de la cantidad de muestra y de
tiempo de extracción38.
El Florisil suele emplearse para la purificación de extractos que contienen plaguicidas, es una forma
activada del silicato de magnesio. Tiene un carácter más ácido que la alúmina y el gel de sílice pero aún
puede considerarse como fase de carácter anfótero es un adsorbente más suave que el gel de sílice y
la alúmina en relación a la descomposición de los compuestos. La extracción en fase sólida
convencional consiste en extraer los POCL disueltos inicialmente en una matriz acuosa, luego se
reparte en n-hexano, al atravesar un soporte sólido de florisil quedan retenidos y posteriormente se
eluyen con una cantidad mínima de disolvente. Como fase de adsorción se usan cartuchos de Florisil.
Luego se eluyen los plaguicidas empleando hexano /éter etílico. La elección de la fase sólida depende
de la polaridad de los plaguicidas y del tipo de matriz utilizada38.
2.3 Cromatografía de gases
La cromatografía de gases (CG) es un procedimiento analítico para la separación de compuestos
volátiles, que fluyen en una corriente gaseosa a través de una fase estacionaria. El Gas Portador (GP)
es la fase móvil en CG. Su misión es la de llevar la mezcla de los solutos desde que se introduce en el
sistema cromatográfico hasta la salida del detector, pasando a través de la columna donde se produce
la separación. El GP es inerte, como ejemplo tenemos: el nitrógeno, el helio, el hidrógeno y el argón39.
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La cromatografía de gases es muy utilizada en la separación de plaguicidas que se vaporizan
fácilmente sin degradarse, con puntos de ebullición por debajo de los 250°C y polaridades bajas o
intermedias40.
Las partes esenciales de un cromatógrafo de gases son representadas en la Figura 1:
Figura 1. Partes del cromatógrafo de gases.
1. Fuente de gas portador
2. Sistema de inyección de las muestras
3. Columna cromatográfica
4. Sistema de detección
5. Sistema de registro de datos
El sistema de introducción de muestra, cuya configuración varía según el estado físico de la misma y el
tipo y capacidad de la columna utilizada. Este sistema pone en contacto a la muestra con la corriente de
gas portador. Para la inyección de la muestra se utiliza un inyector de tipo Split con un sistema de
división de flujo el cual se emplea con frecuencia para introducir muestras concentradas y evitar la
saturación de la columna capilar. En tanto que en una inyeccion Splitless la totalidad de la muestra es
inyectada a la columna.
La columna es la parte esencial del equipo cromatográfico y de la que depende el fracaso o el éxito del
análisis. Las columnas más utilizadas son las capilares porque presentan mayor flexibilidad, durabilidad,
sensibilidad y resolución de las señales cromatográficas.
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El sistema de termostatación, también denominado horno, controla la temperatura del sistema de
introducción de la muestra y de la columna, ya que ésta es una variable decisiva para conseguir una
separación y reproducibilidad adecuadas.
El detector de captura de electrones ha llegado a ser uno de los detectores más utilizado para el
análisis de muestras medioambientales, debido a su selectividad para detectar compuestos que
contienen halógenos, tal es el caso de los plaguicidas y de los bifenilos policlorados.
La separación, la identificación y la cuantificación de los plaguicidas órganoclorados objetos de estudio
en este trabajo, se realiza por un método de cromatografía de gases con detector de captura de
electrones acoplado al equipo.
2.4 Validación de la metodología de determinación analítica
El procedimiento de validación es una metodología en la determinación analítica consiste para el
establecimiento de una evidencia documentada que demuestre alto grado de probabilidad, que el
método de control es lo suficientemente fiable para reproducir el resultado previsto dentro de los
intervalos definidos41. Para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto la NTC-ISO/IEC
17025:2005 propone requisitos técnicos para las normas de ensayo de calibración, validación y el
aseguramiento de la calidad de los resultados42.
Para llevar a cabo la validación de un método se hace necesario tener en cuenta una serie de parámetros
de desempeño que proporcionan, en gran medida, llegar a conclusiones significativas sobre el
comportamiento del todo.
Cada uno de los parámetros a considerar en la validación, variarán de acuerdo a las exigencias legales
y del método seleccionado. Por tanto, en dependencia de la categoría del ensayo, los requisitos necesarios,
son los correspondientes a la categoría II43, por lo que abordamos los siguientes parámetros: linealidad,
precisión, exactitud, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, rango.44.
La linealidad es la capacidad de un método analítico de obtener resultados proporcionales a la
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concentración del analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado. Su determinación se
realiza a través de una curva de calibración45 que relaciona la respuesta con la concentración o
cantidad del analito, esta varía en un rango, dependiente de la muestra analizada, si se trata de materia
prima, se evalúa entre 80-120%, empleando de tres a cinco concentraciones y si es producto terminado,
de un 50-150%, utilizando de 5-7 concentraciones, haciendo cada análisis por duplicado como mínimo.
La determinación de los parámetros de la recta de regresión se determina por medio de un programa de
cálculo estadístico (Stat graphics plus 5.0)46.
Al determinar la linealidad se demuestra la proporcionalidad entre la respuesta analítica y la
concentración del analito. Se realiza una curva de calibración que comprende las concentraciones en
los intervalos:
0,005; 0,008; 0,01; 0,015; 0,020 µg/mL para Lindano e Isodrin,
0,025; 0,04; 0,05; 0,075; 0,1 µg/mL para Aldrin, Dieldrin, Endrin,
0,1; 0,16; 0,2; 0,3; 0,4 µg/mL para pp’ DDT.
Se prepararan muestras con diferentes concentraciones de plaguicidas órganoclorados y representan
el 50, 80, 100, 150 y 200 % de la concentración teórica del analito activo. Se determinará la ecuación
de la recta, el coeficiente de correlación r, superior o igual a 0,998, el coeficiente de determinación (r2) y
el coeficiente de variación de los factores de respuesta inferior o igual al 5%
Para el análisis de linealidad se define entonces y = mx + b
donde x es la concentración teórica, y es respuesta del equipo, m el valor de la pendiente y b es la
intersección con el eje y o término independiente.
La pendiente (m) está asociada a la sensibilidad del método, mayor pendiente significa mayor
sensibilidad, por otro lado el término independiente (b) está relacionado con el error sistemático del
método, su significancia debe ser evaluada para determinar si el error sistemático es representativo.
El coeficiente de correlación (r) nos indica el grado de relación entre la concentración y la respuesta,
además es un estimado indirecto de la dispersión de los datos con relación a la estimación lineal.
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Cuando este parámetro se acerca a un valor de 1, indica una alta relación lineal entre ambas variables.
Se recomienda un valor del coeficiente de correlación mayor a 0,99, aunque en el caso de impurezas
este podría ser mayor a 0,990. El coeficiente de determinación (r2) aporta una mayor significancia
estadística ya que este expresa como tal la variación total del modelo lineal.
La precisión expresa el grado de dispersión de los resultados obtenidos a partir de múltiples muestras
provenientes de una muestra homogénea47. La precisión puede ser una medida del grado de
repetibilidad en condiciones intermedias y de reproducibilidad del método analítico bajo condiciones
operacionales normales, esta puede expresarse en varios niveles:
La repetibilidad es la medida de la precisión de un método en las mismas condiciones de operación
en un intervalo de tiempo corto, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos
aparatos y reactivos.
La reproducibilidad expresa la precisión entre laboratorios, resultados obtenidos a través de estudios
colaborativos buscando la estandarización de una técnica.
La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de mediciones, pero no brinda ninguna
idea de lo cerca o lejos que están del valor verdadero.
Para comprobar la precisión intermedia del método, se aplicaron las pruebas de Fisher y de la t Student
para determinar si existen diferencias significativas entre los resultados al variar las condiciones de
análisis. Además expresa la variación que ocurre en el laboratorio al realizar las determinaciones en
diferentes días, diferentes analistas, diferentes equipos, etc.
La exactitud conocida también como veracidad indica la capacidad del método analítico de ofrecer
resultados lo más próximos posibles al valor verdadero. Se recomienda que la exactitud se calcule
después de que la precisión, linealidad y especifidad hayan sido establecidas. Existen dos
procedimientos en general para determinar la exactitud de un método. El primero y más común es
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realizar la comparación contra un material de referencia, que puede ser un estándar trazable, un
placebo o una muestra con una cantidad de analito conocida.
El segundo método es comparar los resultados con otra técnica aún más exacta o que por consenso
común es referencia, este caso se usa cuando no existen materiales de referencia certificados o
trazables.
Homogeneidad de las varianzas: después de verificar la homoscedasticidad, es necesario corroborar
la homogeneidad de las varianzas aplicando un método estadístico. La prueba más usada es la
propuesta por Cochran que indicará si el factor de concentración tiene alguna influencia en la
variabilidad de las respuestas.
El valor del estadístico experimental se calcula de la siguiente forma:
GExp = S2 max (1)
Donde:
GEXP, es el estadístico de Cochran,
S 2 max es la máxima varianza de todos los conjuntos de datos,
Si2 son las varianzas calculadas para cada conjunto de datos (réplicas de una misma concentración).
El valor crítico del estadístico de Cochran G lo determinan:
G= G (k,v,α) (2)
Dónde:
k es el número de grupos de datos o grupo de réplicas,
v el grado de libertad definido como n max – 1 , donde n max es el mayor de los tamaños demuestra.
α es el nivel de significancia, usualmente 0,05.
La especificidad es la capacidad del método analítico para evaluar inequívocamente al analito en
presencia de otros compuestos que puedan estar presentes en la matriz, sin interferencias en las
respuestas. La especificidad o selectividad es una condición esencial para conseguir una buena exactitud.
Revisión Bibliográfica
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La falta de especificidad de un método analítico puede compensarse por otro método auxiliar que pruebe
la ausencia de las sustancias interferentes.
De modo general se determina, comparando el resultado obtenido con una cantidad conocida del analito
solo, con el resultado obtenido al analizar muestras del analito más los posibles compuestos interferentes.
Se presentaran las pruebas que indiquen que los posibles compuestos interferentes no afectan la
determinación como por ejemplo, cromatogramas, donde cada señal este bien identificada.
En ocasiones se emplea el término selectividad como sinónimo de especificidad.
La diferencia entre estos términos, desde el punto de vista operativo es casi inapreciable no obstante,
selectividad es la capacidad del método de medir el analito sin interferencias de impurezas, productos de
degradación, metabolitos excipientes, o compuestos químicos relacionados. Para demostrar el
cumplimiento de este parámetro lo más frecuente es: la demostración de no interferencias de la matriz con
el analito.
El límite de detección representa la mínima concentración de analito que se puede detectar siguiendo
el proceso completo del método con un nivel aceptable de confianza la cual produce una señal con el
99% de probabilidad de ser diferente y cuya concentración es mayor que el blanco47. Esto se verifica
realizando réplicas, las cuales deben tener una media por arriba de 3.14 S, donde “S” es la desviación
estándar de las réplicas48.
El límite de cuantificación es la concentración mínima de analito que puede determinarse con un nivel
aceptable de exactitud y precisión. Se establece utilizando una muestra o material de referencia
apropiado. Normalmente corresponde al punto inferior de la curva de calibración (excluido el blanco).
Los métodos utilizados para determinar están basado en la relación señal ruido mediante la
comparación de las señales obtenidas con la muestra de blancos. Se considera aceptable una relación
señal ruido correspondiente es 10 veces la cantidad mínima del analito confiablemente cuantificada.
Otro método es basado en la desviación estándar de respuesta y la sensibilidad, este criterio es válido
si la desviación estándar del blanco es mucho mayor que las desviaciones estándar de los parámetros
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de la recta. La desviación estándar y el promedio de respuesta de un blanco pueden estimarse a través
del análisis repetido del blanco de la muestra y por la extrapolación a cero de una curva de calibración a
bajas concentraciones.
El intervalo analítico de aplicación (rango) se define como el mínimo y el máximo valor de
plaguicida que se puede cuantificar con la precisión y exactitud, cuyo valor se encuentra dentro de
lo especificado en los criterios de aceptación.
Si el intervalo de trabajo del método es muy amplio, es razonable esperar que las desviaciones
estándar(s) sean significativamente diferentes para cada punto de la función de respuesta del método,
lo que obligaría a tomar decisiones relativas a la definición de su uso por tramos. (En algunos casos
podría ser conveniente tratar de establecer si existe alguna relación funcional entre los respectivos
niveles de ensayo).
Para evaluar el intervalo analítico de aplicación se procede de igual forma que en el análisis de
linealidad, se calcula, la precisión y la recuperación en cada nivel de concentración. Para el cálculo de
rango de trabajo se recomienda usar el definido por el mínimo valor y el máximo valor aportados por los
análisis usuales que se realicen dentro del laboratorio y efectuar el ensayo en el rango donde los
valores de precisión y exactitud están dentro de lo especificado en los criterios de aceptación.
Aunque algunos materiales incluyen la robustez dentro de la precisión del método en la USP 23 y en la
ICH (International Conference on Harmonization)41 la sitúan como un parámetro aparte de la validación.
En el estudio de robustez aporta con la influencia de pequeños cambios en las condiciones analíticas
sobre la fiabilidad del método analítico. Una consecuencia de la evaluación de la robustez es que la
validación de la técnica se mantiene aunque se introduzcan cambios en las condiciones antes
evaluados.
Los criterios de aceptación de los parámetros de validación del método se resumen en la Tabla 8.
Revisión Bibliográfica
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Tabla 8. Criterios de aceptación para los ensayos de validación de residuos (guias técnicas)*
Parámetro Límites de aceptación.
Linealidad
r >0,99, R2 >0,98, intercepto no significativo pendiente significativo,
cumplimiento del test, de proporcionalidad.
Precisión
a) Repetibilidad
b)Precisión
Intermedia
CV ≤ 5% para determinación de residuos en muestras de alimentos y
ambientales.
Exactitud No existen diferencias significativas entre las medias de los resultados
obtenidos y el valor real adicionado.
Recobrados entre CV total ≤ 5%
Límite de
cuantificación
CV debe ser < 1,5%
Especificidad Posibilidad de cuantificar única y exclusivamente los compuestos
órganoclorados del residuo presente en la matriz, sin interferencia del
resto de los componentes presentes en la muestra
Recobrado 70 % ≥Recobrado ≤110 %
*Sección Metrología Ambiental y de Alimentos, Departamento de Salud Ambiental, Santiago, Chile ,2010
*Secretaria de Salud, Comisión de Control Analítico, Criterios para la validación de Metodos Físico-Quimicos
Mexico ,2011
CAPÍTULO 3
PARTE EXPERIMENTAL
Parte Experimental
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CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Reactivos, materiales y equipos de laboratorio
Reactivos
n- hexano Merck 1.043744000
Acetonitrilo JT Baker 9012-03
Éter etílico MercK 1.009215000
Sodio Sulfato Anhidro Merck 106639
Sodio Cloruro Merck 1.06406, Solución saturada
Florisil, Strata (SPE) FL-PR Florisil (170 µm, 80 Å) 500 mg / 3 mL, 8B-S013-HBJ
Nitrógeno gas 99, 99 % de pureza
Estándares primarios
Lindano 99, 0 % +/- 0,5% Sigma Aldrich, USA
Aldrin 99, 5 % +/- 0,5% Supelco, USA
pp’DDT 99,0 % +/- 0,5% Sigma Aldrich, USA
Endrin 99, 5 % +/- 0,5% Supelco, USA
Isodrin 101, 4 % +/- 0,5% Sigma Aldrich, USA
Dieldrin 99, 2% +/- 0,5% Supelco, USA
Todos los reactivos empleados fueron de pureza analítica o superior. Se trabajó siempre con agua
desionizada con conductividad menor que 0,05 S.
Materiales
Pipetas automáticas de volumen variable (100μl a 10 ml)
Pipetas automáticas de volumen variable (10μl a 1ml)
Matraces aforados con tapa de 10, 50, 100, 250 ml
Vasos de precipitación de 25, 50, 100, 250 ml
Papel filtro cualitativo Whatman 125mm diámetro
Embudos de vidrio de 60º
Parte Experimental
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Embudo de separación de 500 mL
Tubos de ensayo 20 mL
Probetas de vidrio de 10, 25, 250, 500 ml
Varillas de agitación
Viales para cromatografía color ámbar de 2 ml
Cuchillo con mango de plástico
Frascos con tapa para muestras 500 mL -1000 mL
Material para rotular
Papel absorbente
Equipos
Cromatógrafo de gas (GC), Perkin-Elmer, Auto sistem. - Clarus 500 que incluye:
Pantalla
Control electrónico de presión (PPC)
Sistema de detección DCE
Auto inyector
Inyector de columnas capilares con control electrónico de presión split/splitless
Columna cromatográfica Elite (35% Fenil – Metilpolisiloxano)
Software Total Chrom Navigator
Rota evaporador BUCHI R-210 con temperaturas de 20 °C hasta 180°C
Balanza analítica de apreciación: 0,1 mg
Estufa con control de temperatura
Licuadora de cinco velocidades
Manifold de vidrio para cartuchos con fase solida
Bomba de vacío
Cortador para vegetales
Congelador -10°C
Refrigerador
Parte Experimental
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3.2. Métodos
3.2.1. Muestreo de las hortalizas
Las hortalizas empleadas en este estudio fueron: zanahoria (Daucus carota), tomate (Lycopersicon
lycopersicum), col (Brassica oleracea), brócoli (Brassica oleracea var. italica)) y espinaca (Talinum
triangulare). El muestreo fue realizado de manera aleatoria no probabilística. Las muestras fueron
colectadas en el almacén de venta en la UFA ESPE, IASA 1, Sangolquí- Rumiñahui –Ecuador.
Las muestras se colocan en fundas plásticas selladas, se rotulan y se someten a congelación durante
24 horas. Seguidamente, las muestras se cortan por separado en un cortador de vegetales a 600 rpm y
se dividen en porciones de 50 gramos para su posterior análisis37.
3.2.2. Técnica de extracción de los residuos de plaguicidas órganoclorados
El procedimiento analítico (método 1) que se usa en el Laboratorio de Análisis de Residuos de
Plaguicidas y Contaminación Ambiental del Instituto de Investigaciónes de Sanidad Vegetal (ISV) de la
Habana, Cuba38 sirvió como referencia y fue adecuado a las condiciones del LMA en la UFA ESPE para
desarrollar un procedimiento de extracción de los plaguicidas órganoclorados objetos de estudio en
nuestro trabajo.
Procedimiento general de trabajo 38.
A una muestra de 50 g de hortaliza previamente triturada, se le adicionó 150 mL de acetonitrilo. Luego
se mantuvo con agitación a alta velocidad durante 2 minutos en una licuadora. Seguidamente se
separó el residuo acuoso por decantación y se colocó en una probeta una alícuota equivalente a 10 g
de muestra (43 mL para una muestra de sustrato con 70% de humedad). A continuación se trasvasó a
un embudo de separación de 500 mL y se le adicionó 100 mL de n-hexano. Se agitó manualmente por
2 minutos y luego se le adicionó 3mL de solución saturada de cloruro de sodio y 120 mL de agua lavada
con n-hexano. Se continúa agitando manualmente por un minuto y se desechó la fase acuosa. A la
fase orgánica se le adicionó 100 mL de agua lavada con n hexano y se desecha la fase acuosa. El
solvente orgánico se filtró a través de papel filtro que contiene sodio sulfato anhidro. Se recogió la
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
28
solución en un balón de evaporación de 500 mL. Se lavó el sodio sulfato anhidro con 15 mL de n-
hexano y los restos del lavado se adicionaron al balón de evaporación. Se concentró en un rota
evaporador a 40 °C hasta 2 mL. El extracto obtenido fue sometido a un proceso de purificación.
Procedimiento de purificación por elución 38 ,10
1. Se ubicó en el manifold (colector de fracciones) una columna de Florisil (500 mg/3 ml, 8B-S)13-
HBJ) de 180 mm de diámetro interno (d.i)
2. Se desactivo el Florisil utilizando 0,5 mL de una mezcla de n-hexano-agua al 1%.
3. Se añadió sulfato de sodio anhidro sobre el adsorbente, hasta una altura de 1cm.
4. Se le adicionaron 3mL de n-hexano al Florisil hasta una altura de 1 cm.
5. Se drenó el disolvente hasta el borde superior del adsorbente.
6. Se adicionó la muestra a la columna y se drena a una velocidad de flujo de 5 mL/min.
7. El recipiente que contiene el extracto se lavó con 20 mL de n-hexano en porciones de 5 mL y se
pasan los lavados a través de la columna.
8. Se eluyeron con 10 mL de una mezcla de n-hexano-éter etílico (94:6).
9. Se concentró hasta 2 mL, en un rota evaporador en un balón de 100 mL a 40 °C.
10. Se lavó el recipiente con dos porciones de 3 mL de n-hexano y se adicionó en un Erlenmeyer
de 25 mL.
11. Se evaporó el disolvente en corriente de nitrógeno hasta sequedad.
12. Se adicionó 2 mL de n-hexano al residuo, se transfirió a un vial y se selló.
3.2.3. Optimización de los parámetros cromatográficos
Selección de la fase estacionaria de la columna cromatográfica
Se realizó un estudio bibliográfico sobre las diferentes columnas cromatográficas, se analizaron las
características físicas como espesor, longitud, diámetro, temperatura y químicas como polaridad con la
finalidad de escoger la columna más adecuada.
Parte Experimental
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29
Selección de la columna:
El primer método38 propone para la determinación de los plaguicidas órganoclorados objeto de estudio
en nuestro trabajo el empleo de una columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0,53 mm d.i recubierta
con una composición 5% Fenil y 95% Dimetilpolisiloxano (DB-5). El LMA de la UFA ESPE no dispone
de este tipo de columna por lo que fue necesario probar las corridas en dos tipos de columnas: una Elite
de composición 35 % Fenil – Metilpolisiloxano (35 MS) de 30 m x 0,32 mm d.i., 0,25 µm de espesor de
película y otra DB-608 de 30 m x 0,53 mm d.i., DF 0,83 µm de espesor de película. Para lo cual se
inyectó 1 μL de cada una de las soluciones de los patrones analíticos de plaguicidas y posteriormente
se analiza la corrida cromatográfica.
Determinación de la velocidad de flujo
En la columna seleccionada, se programaron dos velocidades de flujo, (1,0 y 1,5 mL/min,
respectivamente). Se inyectó 1 μL de la mezcla de los patrones analíticos de plaguicidas y se registran
los cromatogramas.
Programación de la temperatura del horno
Con los parámetros cromatográficos encontrados, se diseñó un grupo de programas de temperatura
con diferentes gradientes e isotermas como se presenta en la siguiente tabla.
Tabla 9. Diseño de programa de temperaturas para el estudio de optimización. Programa Rampa 1 Rampa 2 Rampa 3
Isoterma minutos
Gradiente °C/minuto
Isoterma minutos
Gradiente °C/minuto
Isoterma minutos
1 6.0 (150°C) 5 5 (280°C) 2 5 (250°C)
2 7.0 (150°C) 5 5 (200°C) 2 5 (270°C)
3 5.50 (150°C) 5 5 (190°C) 2 3 (270°C)
4 5.50 (150°C) 5 5 (190°C) 2 9 (255°C)
5 5.50 (150°C) 5 5 (190°C) 2 5.5 (258°C)
Procedimiento cromatográfico
Fundamentado en los ensayos cromatográficos para la optimización de los parámetros se presenta en
la siguiente tabla las mejores condiciones seleccionada para el ensayo de los plaguicidas
órganoclorados en el LMA de la UFA ESPE.
Parte Experimental
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30
Tabla 10. Condiciones cromatográficas para la determinación de los plaguicidas órganoclorados por cromatografía de gases. Columna Elite 35-MS, 30m de longitud, DI 0,32 mm, DF 0,25 µm composición Fenil –
metilpolisiloxano.
Volumen de Inyección 1μL
Flujo del Gas Portador 1,0 mL/minuto
Detector Captura Electrónica Temperatura 280 °C, Sensibilidad 1,0 mV
Inyector Temperatura 200 °C, modo splitless.
Horno 150 °C x 5,50 minutos, rampa de calentamiento 5°C/min. hasta 190 °C x 5 min., rampa de calentamiento 2 °C/min. hasta 258 °C x 5,50 minutos.
3.2.4. Procedimiento de dopaje a las muestras de hortalizas certificadas
Con la finalidad de disponer de un material de referencias que no contenga plaguicidas órganoclorados
se recurrió a la adquisición de muestras de zanahoria, tomate, col, brócoli y espinaca del huerto
orgánico y ecológico de la comunidad Agrícola Cotocchoa Sangolquí – Ecuador.
Estas muestras fueron divididas en dos grupos que incluían a las muestras de los blancos sin dopar y
las muestras de los blancos dopados con los patrones analíticos de plaguicidas órganoclorados
(Lindano, Aldrin, Isodrin, pp’ DDT, Endrin y Dieldrin).
Los pasos del procedimiento de dopaje se describe a continuación:
1. Se molieron y luego se pesaron 50 g de muestra de cada hortaliza.
2. Cada muestra se homogenizó por separado en una licuadora durante 2 minutos a alta
velocidad.
3. A cada muestra se le adiciona una mezcla de estándares de plaguicidas órganoclorados en
solución de n-hexano, en tres concentraciones: 0,01; 0,1 y 0,5 μg/mL, respectivamente.
4. Se etiquetó cada muestra con los nombres y la concentración.
5. Se almacenaron las muestras a 4 °C protegidas de la luz.
6. Deben ser analizadas antes de los siete días pues en un tiempo mayor la muestra pierde
estabilidad.
Parte Experimental
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31
3.2.5. Estimación de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico
Se realizó la validación intralaboratorio del procedimiento analítico, desarrollado por cromatografía de
gases, de acuerdo al Procedimiento Normalizado de Trabajo del LMA de la UFA ESPE; el cual está
comprendido dentro del alcance de las normas internacionales de la calidad ISO/IEC 17025:2005 y en
armonía con las tendencias actuales relacionadas con la validación de métodos analíticos.
En este trabajo se estimaron los siguientes parámetros de desempeño: linealidad, precisión, exactitud,
especificidad, límite de cuantificación, límite de detección y rango 49, 50
Linealidad
Se procedió a realizar una curva de calibración con muestras de concentraciones de patrones analíticos
de plaguicidas en un intervalo de (50-200) % de concentración teórica tomando como referencia el
Límite Máximo de Residuos (LMR) establecido por el Codex Alimentarius51 de los plaguicida
órganoclorados. Se realizó el análisis por triplicado para cada nivel de concentración. Para evaluar la
linealidad se utilizó la prueba de falta de ajuste implementada en la aplicación Statgraphics 5.0 52
Precisión
La precisión se evaluó en términos de repetibilidad y precisión intermedia en diferentes días a tres
niveles de concentración. Para ello se llevó a cabo un experimento en donde un analista en tres días no
consecutivos realizó seis determinaciones del contenido de plaguicida en cada nivel de concentración.
Con los resultados de este experimento se utilizó el análisis de la varianza implementado en la
aplicación Statgraphics 5.0 y se obtuvieron los estimados de precisión en condiciones intermedias:
diferente día y en condiciones de repetibilidad. Los detalles relacionados con los cálculos y formulas
necesarios se presentan en el anexo1.
Los niveles de concentración en cada plaguicida se prepararon según el procedimiento descrito en el
epígrafe 3.2.4 y se reportan en la tabla 11.
Parte Experimental
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32
Tabla 11. Concentraciones de los patrones de referencia utilizados en el estudio de repetibilidad.
Patrones analíticos de plaguicidas órganoclorados Niveles de concentración (g/mL)
Lindano 0,05; 0,10; 0,50
Aldrín 0,05; 0,10; 0,50
Isodrín 0,05; 0,10; 0,50
DDT 0,05; 0,10; 0,50
Dieldrín 0,05; 0,10; 0,50
Endrin 0,05; 0,10; 0,50
Exactitud
La exactitud se estimó a tres niveles de concentración añadiendo cantidades conocidas de estándar,
cada muestra se analizan por triplicado.
A las muestras de concentración desconocida se le añadieron alícuotas de concentración conocida y
creciente del compuesto de referencia. La diferencia del resultado muestra y analito menos la muestra
corresponde a la concentración adicionada. Por interpolación en la recta obtenida al graficar el área
versus la concentración de la muestra se obtuvieron los valores experimentales. Seguidamente se
estimaron los parámetros estadísticos: la desviación estándar (S) y el coeficiente de variación (CV). Se
realizó el ensayo de Cochran con vistas a comprobar si la variación de la concentración producía
diferencias significativas en los resultados y la prueba test de Student para determinar si existen
diferencias significativas entre el recobrado y el valor añadido de estándar.
Los niveles de concentración en cada muestra se prepararon según el procedimiento descrito en el epígrafe
3.2.4.
Las ecuaciones para aplicar la prueba de t de Student (test) y la prueba de Cochran (G) se muestran a
continuación:
t exp = (3)
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
33
G exp = (4)
Criterio de aceptación:
Si texperimental es menor que ttabulado (P= 0,05, g/l n-1), no existen diferencias significativas en la
recuperación.
Si Gexperimental es menor que G tabulado (P= 0,05, k=3, n=5-1), las varianzas de las tres
concentraciones son equivalentes o lo que es lo mismo que el factor concentración no influye
en la variabilidad de los resultados.
Especificidad
Para evaluar la especificidad se compararon los cromatogramas obtenidos en las siguientes muestras:
todos los disolventes orgánicos que se utilizan en el método; cada uno de los patrones analíticos de
plaguicidas órganoclorados; mezcla de los patrones analíticos de plaguicidas órganoclorados; muestra
libre de residuos de plaguicidas; muestra dopada con los patrones analíticos de plaguicidas
órganoclorados y muestras desconocidas.
Para que el método cumpla con la especificidad se tomaron como criterios: el tiempo de retención de
cada uno de los patrones de referencia debe ser diferente, el tiempo de retención de los componentes
órganoclorados en las muestras debe coincidir con el estándar de referencia correspondiente en
condiciones normalizadas, en caso de degradación total no deben existir señales que interfiera en el
tiempo de retención determinado previamente para cada analito.
Parte Experimental
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34
Límite de cuantificación
El límite de cuantificación es la concentración mínima de analito que puede determinarse con un nivel
aceptable de exactitud y precisión. Se estableció utilizando los patrones de referencia apropiados y se
correspondió con el punto inferior en cada una de las curvas de calibración (excluido el blanco).
Límite de detección
El límite de detección fue la mínima concentración de analito que se pudo detectar siguiendo el proceso
completo del método con un nivel aceptable de confianza de que dicha concentración es mayor que el
blanco.
El intervalo analítico de aplicación (rango)
Se procede de igual forma que en el análisis de linealidad, a diferencia de este se calcula, la precisión y
la recuperación en cada nivel de concentración. Para el cálculo de rango de trabajo se usa el criterio el
definido por el mínimo valor y el máximo valor aportados por los análisis que se realicen dentro del
laboratorio. Donde los valores de precisión y exactitud están dentro de lo especificado en los criterios de
aceptación.
35
CAPÍTULO 4
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
35
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la literatura se reportan diversos métodos para la determinación de plaguicidas órganoclorados por
cromatografía de gases, empleando diferentes tipos de detectores. En nuestro trabajo tomamos como
referencia el procedimiento analítico de extracción y determinación (primer método) usado en el
Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas y Contaminación Ambiental del Instituto de
Investigaciones de Sanidad Vegetal de la Habana, Cuba. El cual es un procedimiento validado acorde a
las normas internacionales de la calidad ISO/IEC 17025:2005 y en armonía con las tendencias actuales
relacionadas con la validación de métodos analíticos.
La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador, dispone de extensas áreas de cultivos de
hortalizas y frutales por lo que se hace necesario disponer de un método analítico propio que en las
condiciones de trabajo del Laboratorio de Medio Ambiente de esta universidad que permita cuantificar
el contenido de residuos clorados en hortalizas cosechadas tanto en los huertos de la Universidad como
en las cooperativas agrícolas aledañas, para que los productos puedan ser vendidos como productos
agrícolas seguros para el consumo humano, según lo establecido en las regulaciones sanitarias.
En el presente trabajo se desarrolló y validó por vez primera un nuevo método para cuantificar residuos
de plaguicidas órganoclorados (Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y DDT) en muestras de
hortalizas ecuatorianas (zanahoria, tomate, col, brócoli y espinaca), adaptado a las condiciones del
laboratorio de medio ambiente de la UFA ESPE para lo cual se empleó la cromatografía de gases con
detector de captura de electrones.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
36
4.1. Optimización de las condiciones cromatográficas
Resolución de la columna cromatográfica
La columna es la parte esencial del equipo cromatográfico y de ella depende el éxito del análisis; según
la bibliografía consultada si la resolución (RS) es mayor que 1,5 las señales están completamente
separados,53. La tabla 12 muestra el resultado de la prueba de resolución realizada en el LMA de la
UFA ESPE, donde se demostró la capacidad de las columnas cromatográficas (DB-6 y Elite) para
separar a dos solutos con tiempos de retención semejantes.
Tabla 12. Resolución de las columnas cromatográficas.
COLUMNA ELITE
Lindano Aldrín Isodrín DDT Dieldrín Endrin
TIEMPO( minutos) 29,3 40,6 45 52,2 53 56
ANCHO W( mm) 4 3 2 1 2 0,5
RESOLUCIÓN (Rs) 8,7 4,9 8,2 3,6 3,5 COLUMNA DB-608
TIEMPO (minutos) 28 29,3 40 44,9 52,7 54,2
ANCHO W( mm) 2 3 3 2 3 1
RESOLUCIÓN (Rs) 4,3 10,1 5,3 10,8 2,0
El LMA de la UFA ESPE dispone de las columnas cromatográficas DB-608 y Elite (35% Fenil-
Metilpolisiloxano) que según reporta la literatura54 pudieran ser empleadas para separar plaguicidas
órganoclorados debido a su baja polaridad. La columna Elite, de última generación, con un DI 0,32 mm
con DF 0,25 µm tiene en su composición una fase ligada con 35 % de grupos fenilo, que le confieren
una afinidad característica hacia los compuestos con anillos aromáticos, garantiza gran estabilidad
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
37
térmica e inercia química y es a su vez, muy útil en la separación de analitos medioambientales,
compuestos poliaromáticos, plaguicidas órganoclorados, órgano fosforados, disolventes y esencias 54.
Durante el desarrollo cromatográfico al utilizar la columna DB-608, se observaba un solapamiento entre
las señales de lindano y aldrín. Sin embargo este inconveniente se resolvió al utilizar la columna Elite
(Tabla 12, Figuras 1 y 2).
Por lo que la columna Elite fue la seleccionada para el desarrollo del procedimiento analítico.
Las Figuras 1 y 2 muestran los resultados de las corridas cromatográficas de la mezcla de 6 plaguicidas
órganoclorados objetos de estudio, utilizando idénticas condiciones que las empleadas en las muestras.
Figura 1. Corrida cromatográfica empleando la columna Elite.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
38
Figura 2. Corrida cromatográfica empleando la columna DB-608.
En el procedimiento implementado en el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, La Habana,
Cuba 38, tomado como referencia en este estudio, utilizan una columna DB-5 para el análisis de los
plaguicidas órganoclorados, obteniendo resoluciones similares a las reportadas en la Figura 2, para la
columna DB-608. Como se observa no se logra una buena resolución cuando son analizados todos los
plaguicidas en una misma corrida cromatográfica.
Velocidad de flujo
Se estudia la velocidad de flujo en la columna Elite para obtener la mejor separación de los
componentes. Los cromatogramas de las Figuras 3 y 4, corresponden a las velocidades de flujo de 1,0
y 1,5 mL/min, respectivamente. En la Figura 3 se observó, una separación completa de todos los
componentes mientras que en la Figura 4 no se observa una buena separación y se superponen las
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
39
señales de los plaguicidas Endrin y Dieldrín. Por lo que se tomó como velocidad de flujo el valor de 1
mL/mi
Figura 3. Cromatograma con flujo de 1,0 mL/ minuto.
Figura 4. Cromatograma con flujo de 1,5 mL/ minuto.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
40
Gradiente de temperatura
Como se sustenta en la bibliografía, la programación de la temperatura por gradiente en el horno del
cromatógrafo de gases con la finalidad de separar los plaguicidas órganoclorados, debe ser capaz de
sostener temperaturas superiores a los 280 °C54 . Además es importante cuidar que la temperatura
límite de la columna no llegue a los 350 °C. Por tal motivo, la programación de la temperatura a régimen
de gradiente fue desde los 150 °C hasta 258 °C, como se explica en las Tabla 9 y 10 en materiales y
métodos.
Las condiciones cromatográficas empleadas para la determinación de los plaguicidas órganoclorados
estudiados se reportaron en la Tabla 10.
4.2. Estudio de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico
Linealidad
Para determinar la proporcionalidad entre la concentración de plaguicida clorado y su respuesta analítica es
necesario determinar la linealidad. Además, conjuntamente se determinó el rango lineal, es decir, el intervalo
comprendido entre la concentración mínima y máxima del analito para el cual el método ha sido probado y
dentro del cual se efectúa el dosaje por interpolación en una curva estándar. Los estimadores estadísticos de
la regresión se evaluaron en un intervalo de confianza de p=0,05.
Las curvas de calibración correspondiente a cada uno de los plaguicidas organoclorados estudiados se
muestran a continuación en las Figuras (5-10), respectivamente.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
41
Figura 5. Curva de Calibración del Lindano.
Figura 6. Curva de Calibración de Aldrín.
Datos experimentales
Regresión lineal
Datos experimentales
Regresión lineal
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
42
Figura 7. Curva de Calibración de Isodrín.
Figura 8. Curva de Calibración de pp’ DDT.
Datos experimentales
Regresión lineal
Datos experimentales
Regresión lineal
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
43
Figura 9. Curva de Calibración de Dieldrín.
Figura 10. Curva de Calibración de Endrin.
Datos experimentales
Regresión lineal
Datos experimentales
Regresión lineal
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
44
Tabla 13. Parámetros estadísticos de linealidad.
Parámetros Criterios: r 0,998; R2 0,98; S<2%; intercepto no significativo.
Plaguicida Lindano Aldrin Isodrin
Ecuación de la recta X= 1E+09x+259320
X=5E+08x-804813
X=3E+07x+6351,5
Coeficiente de correlación (r> 0,99)
0.999 0,999 0,999
Coeficiente de determinación (R2)
0,9986 0,9987 0,998
Coeficiente de variación (CV)
1,9 2,6 1,86
Desviación estándar relativo (S)
1,32 1,71 1,23
Significación del intercepto
No significativo No significativo No significativo
Plaguicida DDT Endrin Dieldrin
Ecuación de la recta X=762601x+1178,4 X=638592x+2494,3 X=2E+06x+4436,5
Coeficiente de correlación (r> 0,99)
0,999 0,999 0,999
Coeficiente de determinación (R2>0,98)
0,9993 0,999 0,9997
Coeficiente de variación < 5%
3,06 4,42 3,08
Desviación estándar relativo <2%
1,85 1.88 1.83
Significación del intercepto
No significativo No significativo No significativo
Se observó que los coeficientes de correlación y determinación obtenidos en la evaluación de la
linealidad del procedimiento, se encuentran entre los valores aceptados, además los interceptos fueron
no son significativos en cada uno de los casos estudiados. Por lo que se infiere que existe una
correlación lineal entre los niveles de concentración de cada uno de los plaguicidas estudiados y las
áreas correspondientes a las señales obtenidas.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
45
Precisión
Se analizó la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central la cual se correspondió al
grado de concordancia entre los ensayos individuales al aplicar el método repetidamente a múltiples
alícuotas de una muestra homogénea.
Los resultados del estudio de precisión en sus dos formas, repetibilidad y precisión intermedia, se
resumen en las Tablas 14 y 15.
Tabla 14. Resultados del estudio de repetibilidad (para n = 6).
Plaguicida LMR mg/Kg Media mg/Kg Varianza CV (%)
Lindano 0,01 0,0088 0,0001 1,6132
Aldrín 0,05 0,0460 0,0003 0,7193
Isodrín 0,01 0,0086 0,0001 1,2518
DDT 0,2 0,1596 0,0024 1,4831
Dieldrín 0,05 0,0424 0,0001 0,3343
Endrin 0,05 0,0406 0,0005 1,1253
CV: coeficiente de variación.
Tabla 15. Resultados del estudio de precisión intermedia. Lindano día 1 Lindano día 2 Lindano día 3
Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5
Media 85.73 84.78 86.50 85.44 85.34 86.10 85.69 85.02 86.22
S 0.51 1.31 0.84 0.34 1.32 0.69 0.82 1.32 0.77
CV 0.60 1.55 0.97 0.40 1.55 0.81 0.96 1.55 0.89
Aldrín día 1 Aldrín día 2 Aldrín día 3
Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5
Media 90.52 90.70 92.12 91.70 90.40 91.02 91.77 91.52 91.28
S 1.53 1.04 1.75 0.75 1.17 1.31 1.10 0.91 1.94
CV 1.69 1.15 1.90 0.82 1.30 1.44 1.20 0.99 1,98
Isodrín día 1 Isodrín día 2 Isodrín día 3
Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5
Media 85.73 84.78 86.50 85.44 85.34 86.10 85.69 85.02 86.24
S 0.51 1.31 0.84 0.34 1.32 0.69 0.82 1.32 0.77
CV 0.60 1.55 0.97 0.40 1.55 0.81 0.96 1.55 0.89
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
46
Tabla 15. Continuación. Resultados del estudio de precisión intermedia. pp’ DDT día 1 pp’DDT día 2 pp’DDT día 3
Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5
Media 78.80 78.76 78.84 78.80 79.35 79.52 78.68 79.03 79.40
S 0.79 0.42 0.75 0.76 0.58 0.23 0.80 0.68 0.81
CV 1.00 0.54 0.95 0.96 0.73 0.29 1.01 0.86 1.02
Dieldrín día 1 Dieldrín día 2 Dieldrín día 3
Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5
Media 87.43 85.99 84.95 85.43 84.28 85.36 84.81 85.33 85.31
S 1.81 0.72 1.50 1.19 1.09 1.23 1.02 0.85 1.53
CV 1,97 0.83 1.76 1.39 1.30 1.44 1.20 0.99 1.80
Endrin día 1 Endrin día 2 Endrin día 3
Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5
Media 79.64 80.41 79.35 80.11 81.38 80.38 80.84 81.89 79.94
S 1.35 1.42 1.53 1.12 1.05 1.16 0.97 0.81 1.44
CV 1.70 1.77 1.93 1.39 1.30 1.44 1.20 0.99 1.80
Como se observa el ensayo de repetibilidad cumple con lo establecido en la estimación de los
parámetros de desempeño de los procedimientos analíticos. En el cual, el CV debe ser menor del 2 %
en todas las sustancias químicas de referencia y en nuestro estudio osciló entre 0,33 para el Dieldrín y
1, 61 para el Lindano.
El ensayo de precisión intermedia mostró, para todos los métodos, que no existen diferencias
significativas entre las precisiones alcanzadas por un analista en tres días diferentes. De la misma
forma no existieron diferencias significativas entre las medias obtenidas. (Tabla 16.)
Tabla 16. Estadígrafos.
Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Lindano
F de Fisher F exp= 0,32 Ftab=2.79 (Para P=0.05)
Fexp < Ftab
No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.
t de Student texp=0,2 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
47
Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Aldrín
F de Fisher F exp= 0,58 Ftab=2.79 (Para P=0.05)
Fexp < Ftab
No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.
t de Student texp=0,6 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.
Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Isodrín
F de Fisher F exp= 0,61 Ftab=2.79 (Para P=0.05)
Fexp < Ftab
No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.
t de Student texp=0,8 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los Valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.
Estadígrafo Plaguicida órganoclorado pp’ DDT
F de Fisher F exp= 0,95 Ftab=2.79 (Para P=0.05)
Fexp < Ftab
No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.
t de Student texp=1,3 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.
Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Dieldrin
F de Fisher F exp= 0,94 Ftab=2.79 (Para P=0.05)
Fexp < Ftab
No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.
t de Student texp=1,1 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
48
Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Endrin
F de Fisher F exp= 0,87 Ftab=2.79 (Para P=0.05)
Fexp < Ftab
No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.
t de Student texp=1,3 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.
Estos resultados permitieron concluir que el procedimiento es preciso y puede emplearse para la
determinación de los plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas.
Exactitud
La exactitud de un método, también conocida como error sistemático o tendencia, corresponde a la
diferencia entre el valor obtenido (media) y el valor verdadero. De hecho la norma NTC-ISO/IEC
17025:2005, al referirse a la exactitud de un método analítico habla de la concordancia entre el valor
medido y el valor aceptado como referencia. De esta manera, es posible independizarse del término
“valor verdadero” usado en estadística cuyo significado es diferente. La exactitud debe ser tan pequeña
como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia. O sea, la recuperación del
analito debe acercarse al 100 %.
Tabla 17. Porcentaje de recuperación de los plaguicida órganoclorados.
LINDANO
CA µg/mL
CR µg/mL
% R S CV
0, 05 0,0393 85,54 0,27 0,32
0, 1 0,082 85,04 1,32 1,55
0, 5 0,407 86,28 0,69 0,80
CA: Concentración añadida, CR: Concentración recobrada, % R: Porcentaje de recuperación, S: desviación estándar.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
49
ALDRÍN
CA µg/mL
CR µg/mL
% R S CV
0, 05 0,0397
91,30 0,904 0,990
0, 1 0,0793
90,87 0,814 0,896
0, 5 0,3982
91,49 1,010 1,103
ISODRÍN
CA µg/mL
CR µg/mL
% R S CV
0, 05 0,039
85,62 0,242 0,282
0, 1 0,082
85,04 1,224 1,467
0, 5 0,407
86,28 0,686 0,795
pp’ DDT
CA µg/mL
CR µg/mL
% R S CV
0, 05 0,030
78,76 0,740 0,939
0, 1 0,061
78,82 0,592 0,753
0, 5 0,303
79,01 0,225 0,285
DIELDRÍN
CA µg/mL
CR µg/mL
% R S CV
0, 05 0,046
85,64 1,059 1,236
0, 1 0,092
85,12 0,316 0,373
0, 5 0,457
85,19 0,747 0,876
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
50
ENDRÍN
CA µg/mL
CR µg/mL
% R S CV
0, 05 0,054
80,08 0,676 0,844
0, 1 0,106
80,92 0,622 0,778
0, 5 0,529
79,78 0,662 0,829
Tabla 18. Resultados de las pruebas de t de Student y de Cochran. Recobrado (%)
(n=15) CVR (%) Gexp < Gtab
(0,05:3:15) texp < ttab (0,05:3)
Lindano 85,62 0,59 0,4026 < 0,546 t exp= 0,86 t tab= 2,35
Aldrín 91,22 0,28 0,4520 < 0,546 t exp= 0,96 t tab= 2,35
Isodrín 85,64 0,59 0,4379 < 0,546 t exp= 0,76 t tab= 2,35
pp’ DDT 78,86 0,13 0,4034 < 0,546 t exp= 0,91 t tab= 2,35
Dieldrin 85,31 0,26 0,4532 < 0,546 t exp= 0,44 t tab= 2,35
Endrin 80,26 0,59 0,4864 < 0,546 t exp= 0,80 t tab= 2,35
CVR: coeficiente de variación del recobrado, Gexp: prueba de Cochran experimental, Gtab: prueba de Cochran tabulado.
Se demostró que para cada plaguicida órganoclorado el recobrado se encontró entre (70-110) %
acorde con lo establecido en la norma ISO/IEC 17025:2005 para este tipo de ensayos; con coeficientes
de variación del recobrado menor que el 2 % en todos los casos. Las pruebas de t de Student (P= 0,05,
g/l n-2) y de Cochran (P=0,05, k=3, n=15) demostraron que no hubo diferencias significativas entre el
recobrado medio y el valor aceptado como referencia. Estos resultados indicaron que el procedimiento
es exacto y se puede emplear para la cuantificación de estos plaguicidas órganoclorados en muestras
de hortalizas.
Especificidad
Este parámetro se refiere a la propiedad del método de producir una señal medible debida solo a la
presencia del analito, libre de interferencias de otros componentes, en la matriz de la muestra. En las
Figura 11, se representan los cromatogramas que resultaron del análisis de las muestras para el estudio
de la especificidad, en el procedimiento analítico para el análisis de los plaguicidas órganoclorados.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
51
En los cromatogramas se observó que no existen señales de interferencias en los tiempos de retención
correspondientes a cada muestra de referencia analizada. Esto nos permitió plantear que el método es
específico para el análisis de estas sustancias.
Aire
A
n-hexano
B
Lindano
C
Aldrín
D
Figura 11. Cromatogramas del estudio de especificidad correspondiente a las muestras: A (aire), B (n-hexano), C (Lindano), D (Aldrín), E (Isodrín), F (pp’ DDT), G (Dieldrín) y H (Endrin).
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
52
Isodrin
E
pp’DDT
F
Dieldrin
G
Endrin
H
Figura 11. Continuación. Cromatogramas del estudio de especificidad correspondiente a las
muestras: A (aire), B (n-hexano), C (Lindano), D (Aldrín), E (Isodrín), F (pp’ DDT), G (Dieldrín) y H (Endrin).
Límite de detección y cuantificación
Los parámetros a definir al evaluar la sensibilidad de un método son los límites de detección y de
cuantificación.
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
53
Tabla 19. Límite de detección y cuantificación de los plaguicidas órganoclorados de referencia.
PLAGUICIDA
LMR (mg/Kg)4
LD (mg/Kg)
LC (mg/kg)
LINDANO 0,010 0,001 0,005
ALDRIN 0,050 0,010
0,025
ISODRIN 0,010 0,001
0,005
pp’ DDT 0,200 0,010
0,100
DIELDRIN 0,050 0,010
0,025
ENDRIN 0,050 0,020
0,025
LMR: Límite Máximo de Residuo, LD: Límite de Detección, LC: Límite de Cuantificación
Los valores de los límites de detección de todas las sustancias de referencia en el procedimiento
analítico en general oscilan entre 0,001 mg/kg para el Lindano y 0,01 mg/kg para el pp’ DDT, mientras
que los límites de cuantificación fluctuaron entre 0,005 mg/kg para el Lindano y 0,5 mg/kg para el resto
de las sustancias de referencia.
El intervalo analítico de aplicación (rango)
El rango de análisis para el método se presenta en la tabla 20.
Tabla 20. Rango de análisis para residuos órganoclorados en muestras de hortalizas.
PLAGUICIDAS LMR
(mg/Kg) Menor Conc. (mg/Kg) Mayor Conc. (mg/kg)
LINDANO 0,01 0,005 0,500
ALDRIN 0,05 0,025 0,500
ISODRIN 0,01 0,005 0,500
pp’ DDT 0,2 0,1 0,500
DIELDRIN 0,05 0,025 0,500
ENDRIN 0,05 0,025 0,500
LMR: Límite Máximo de Residuo
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
54
4.3. Aplicación del procedimiento propuesto en muestras de hortalizas en Ecuador
Se usó el método validado en muestras de hortalizas (zanahoria, tomate, col, brócoli y espinaca)
colectadas en el almacén de venta en la UFA ESPE, IASA 1, Sangolquí- Rumiñahui –Ecuador y se
cuantificó el contenido de plaguicidas órganoclorados expresando el resultado en mg/ Kg. Los
cromatogramas correspondientes a cada muestra, así como los resultados de la cuantificación de los
plaguicidas órganoclorados se presentan en la Figura 12 y la Tabla 20, respectivamente.
Se pudo observar que en todas las muestras analizadas la concentración de plaguicida órganoclorado
identificado se encuentran por debajo del límite máximo de residuo permitido4.
Figura 12. Cromatogramas correspondiente a la aplicación del procedimiento en las siguientes
muestras de hortalizas: A (zanahoria ), B (col ), C (brocolis), D (tomate ) y E (espinaca ).
A Zanahoria
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
55
B
Col
C
Brócoli
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
56
Tomate
C Espinaca
Figura 12. Continuación. Cromatogramas correspondiente a la aplicación del procedimiento en las
siguientes muestras de hortalizas: A (zanahoria ), B (col ), C (brocolis), D (tomate ) y E (espinaca ).
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
57
Tabla 20. Cuantificación de plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas de la Hacienda el
Prado IASA 1 UFA ESPE.
PLAGUICIDA Zanahoria, mg/Kg Col, mg/Kg Brocoli, mg/Kg Tomate, mg/Kg Espinaca, mg/Kg
LINDANO 9,5 x 10 -6 1,0 x 10 -7
N/D 3,4 x 10 -7
N/D
ALDRIN N/D N/D N/D N/D N/D
ISODRIN N/D 8,2 x 10 -6 N/D N/D N/D
pp’DDT N/D 4,6 x 10 -5 8,5 x 10 -4 N/D N/D
DIELDRIN N/D 1,2 x 10 -4 N/D N/D N/D
ENDRIN N/D N/D N/D N/D 2,5 x 10 -4
N/D = No detectado
Dadas las características de la elevada liposolubilidad, persistencia por muchos años en el ambiente, el
uso indiscriminado por parte de algunos productores agrícolas irresponsables. En casos de intoxicación
u otra afectación a la salud humana y el medio ambiente, el LMA de la UFA ESPE dispone a partir de
los resultados de la presente tesis; de un procedimiento validado para la identificación y cuantificación
de plaguicidas órganoclorados (Lindano, Aldrín, Isodrín, pp’ DDT, Dieldrín y Endrin) en muestras de
hortalizas.
Costos
Se realizó una comparación en relación a los costos entre el método 1 empleado para la determinación
de residuos plaguicidas órganoclorados y el propuesto en este trabajo, los valores estimados en
dólares se presenta en la Tabla 21
Cabe resaltar que el método propuesto presenta ventajas en los costos por análisis, se emplea un
menor tiempo en el ensayo total de seis plaguicidas, esto sustenta el servicio analítico en el laboratorio
disminuyendo el impacto de inversión anual.
El costo promedio por el análisis de plaguicidas en laboratorios acreditados es de $200,00
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
58
Tabla 21. Comparación de los costos al aplicar los métodos 1 y el propuesto para la determinación de
residuos plaguicidas organoclorados en hortalizas.
Indicadores Materiales Método 1
Costo por
ensayo(dólares)
Método
(propuesto)
Costo por
ensayo(dólares)
Cantidad de
muestra
Hortalizas 50g 50 g
Acetonitrilo 150mL 35,4 150mL 35,4
n-hexano 620mL 50,0 200mL 16,0
Cloruro de
Sodio
8g 4,0 8g 4,0
Sulfato de
Sodio anhidro
50g 6,0 25gramos 3,0
Éter-Etílico 6mL 0,90 6 mL 0,90
Florisil 30g 30,0 3gramos 3,0
Tiempo de
ensayo
Salario del
analista
10 horas 75,0 4 horas 30,0
Total - - 201,3 - 92,3
Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________
59
CAPÍTULO 5
CONCLUSIONES
Conclusiones
__________________________________________________________________________________________
59
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES
1. Los métodos de extracción líquido-líquido y de purificación con fase sólida utilizando una
columna empacada con florisil, permitieron separar y concentrar los plaguicidas órganoclorados
(Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y pp’ DDT) de las muestras de hortalizas (tomate, col,
brócoli, zanahoria y espinaca) dopadas y sin dopar; en un período de tiempo menor que el
reportado en el método 1 de referencia, implementado en el Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal, La Habana, Cuba.
2. Se desarrolló un método de cromatografía de gases capaz de separar, identificar y cuantificar
los plaguicidas órganoclorados: Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y pp’DDT, en el que se
utilizó una columna Elite de última generación con un mayor contenido de metil-fenil
polisiloxano y se obtuvo una mejor resolución en las señales cromatográficas al comparar el
procedimiento con el método 1 de referencia.
3. La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE) dispone de un procedimiento
de cromatografía de gases validado (específico, lineal, preciso y exacto) y adecuado a las
condiciones del Laboratorio de Medio Ambiente de la UFA ESPE para la cuantificación de
plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas. Permitiendo a la universidad auto
gestionar recursos económicos a través de la prestación de servicios a la comunidad y a las
asociaciones de productores de hortalizas, contribuyendo a la comercialización de productos
agrícolas seguros para el consumo de la población.
4. El procedimiento analítico desarrollado se aplicó en muestras de hortalizas (zanahoria, tomate,
col, brócoli y espinaca) colectadas en el almacén de venta en la UFA ESPE, IASA 1, Sangolquí-
Rumiñahui –Ecuador para cuantificar el contenido de plaguicidas órganoclorados, obteniendo
en todas las muestras analizadas un valor de concentración de plaguicidas por debajo del límite
máximo de residuo permitido.
CAPÍTULO 6
RECOMENDACIONES
Recomendaciones
__________________________________________________________________________________________
60
CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES
Extender el estudio del método, para la determinación de estos plaguicidas en otras matrices y
contribuir al plan del Programa de Vigilancia y Control de Residuos de Plaguicidas en
Productos Agrícolas para la exportación y el consumo.
Estimar la incertidumbre de la medición.
CAPÍTULO 7
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referencias Bibliográficas
__________________________________________________________________________________________
61
CAPÍTULO 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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45. W.J. Youden,Steiner, E. H.:Statistical Manual of the AOAC–Association of Official
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54. Elmer, P. Catalogo de Productos para Cromatografía de gas.2012.
ANEXOS
ANEXO 1
Fundamentos estadísticos
La desviación estándar es el promedio de desviación de las puntuaciones con respecto a la media. Esta medida es expresada en las unidades originales de medición de la distribución. Se interpreta en relación a la media. Cuanto mayor es la dispersión de los datos alrededor de la media, mayor es la desviación estándar. Se simboliza como: “s” o la letra minúscula griega sigma (σ) y su fórmula esencial es:
La varianza La varianza es la desviación estándar elevada al cuadrado y se simboliza como: S2. Es un concepto estadístico sumamente importante, ya que muchas de las pruebas cuantitativas se fundamentan en él. Diversos métodos estadísticos parten de la descomposición de la varianza. Sin embargo, para fines descriptivos se utiliza preferentemente la desviación estándar.
Regresión lineal Definición: Es un modelo matemático para estimar el efecto de una variable sobre otra. Está asociado con el coeficiente r de Pearson. Hipótesis a probar: Correlacionales y causales. Variables involucradas: Dos. Una se considera como independiente y otra como dependiente. Pero para poder hacerlo debe tenerse un sólido sustento teórico. Nivel de medición de las variables: Intervalos o razón. Procedimiento e interpretación: La regresión lineal se determina en base al diagrama de dispersión. Éste consiste en una gráfica donde se relacionan las puntuaciones de una muestra en dos variables.
Prueba “t” Definición: Es una prueba estadística para evaluar si dos grupos difieren entre sí de manera significativa respecto a sus medias. Se simboliza: t Hipótesis a probar De diferencia entre dos grupos. La hipótesis de investigación propone que los grupos difieren significativamente entre sí y la hipótesis nula propone que los grupos no difieren significativamente. Variable involucrada: La comparación se realiza sobre una variable. Si hay diferentes variables, se efectuarán varias pruebas “t” (una por cada variable). Aunque la razón que motiva la creación de los grupos puede ser una variable independiente. Por ejemplo: un experimento con dos grupos, uno al cual se le aplica el estímulo experimental y el otro grupo el de control. Nivel de medición de la variable: Intervalos o razón.
Interpretación: El valor “t’ se obtiene en muestras grandes mediante la fórmula:
Donde 1 es la media de un grupo, 2 es la media del otro grupo, es la desviación estándar del primer grupo elevada al cuadrado, N1 es el tamaño del primer grupo, es la desviación estándar del segundo grupo elevada al cuadrado y N2 es el tamaño del segundo grupo. En realidad, el denominador es el error estándar de la distribución muestral de la diferencia entre medias. Para saber si el valor “t” es significativo, se aplica la fórmula y se calculan los grados de libertad. Análisis de varianza unidireccional Definición: Es una prueba estadística para analizar si más de dos grupos difieren significativamente entre sí en cuanto a sus medias y varianzas. La prueba “t” es utilizada para dos grupos y el análisis de varianza unidireccional se usa para tres, cuatro o más grupos. Y aunque con dos grupos, el análisis de varianza unidireccional se puede utilizar, no es una práctica común. Hipótesis a probar: De diferencia entre más de dos grupos. La hipótesis de investigación propone que los grupos difieren significativamente entre sí y la hipótesis nula propone que los grupos no difieren significativamente. Variables involucradas: Una variable independiente y una variable dependiente.
FOTOGRAFIAS DEL TRABAJO
Granja de la Universidad de las Fuerzas Armadas - IASA 1 - ( 2013)
Se pesa 50 g de Muestra (la fotografía corresponde a una muestra de zanahoria)
Extracción Líquido -Líquido
Proceso de extracción con n-Hexano
Proceso de separación
Concentración de los extractos de plaguicidas, empleando el rota evaporador
Purificación del Extracto empleando columnas empacadas de fase Solida (Florisil)
Línea base en la cromatografía de gases