Post on 26-Jan-2016
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INVESTIGACION APLICADADiana C.CharajaRosmery Cardenas UrtadoDalia Chacon Sanchez
INTRODUCCIONActinomicetos
bacterias filamentosas parecidas superficialmente a los hongos.
El crecimiento es un micelio ramificado que tiende a fragmentarse en elementos bacterianos
Tiene un rol en la descomposición de materia orgánica: la celulosa y quitina.
Renuevan las reservas de nutrientes en la tierra y son fundamentales en la formación de humus.
Estreptograminas:
Producidas por diversas especies de streptomyces
Constituyen un amplio conjunto de péptidos cíclicos
Grupo de antibióticos formados por 2 componentes: estreptogramina A y estreptogramina B
Ambas inhiben la síntesis proteica bacteriana,
Actuando sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal
La mayoría son seres aerobios estrictos, que crecen bien a temperaturas del orden de los 25ºC, son microorganismos mesófilos; y a pH alcalino (pH ≈ 9).
Producen vitaminas (principalmente del grupo B), antibióticos y pigmentos de gran interés industrial.
D/Q – MECANISMO DE ACCIÓN
Inhiben la síntesis de proteínas al unirse a la subunidad ribosomal 50S. Un derivado, la quinupristina, inhibe la elongación de la cadena polipéctidica y la dalfopristina interfiere directamente con la peptidil transferasa.Ejercen su actividad a nivel del ribosoma bacteriano.
El componente A se une al peptidil tRNA y bloquea la unión de nuevos aa.
El componente B impide la elongación de la cadena peptídica.
El componente A aumenta la afinidad del componente B por la subunidad 50S
La combinación de A+B es bactericida
•En 1953, fue aislado un nuevo Streptomyces
(graminofaciens) capaz de producir un grupo de sustancias
antibióticas
estreptograminas
• estreptograminas:
• Micamicina,• pristinamicina,.
vernamicina virginamicina
• En los últimos años se desarrolló una investigación
sobre un derivado semisintético de esta familia
quinupristina-dalfopristina
El orden Actinomycetales se reconoce en la industria farmacéutica. existen una amplio número que inhibe microorganismos blanco sensibles a esos antibióticos (patógenas humanas, animales o vegetales). Los Streptomyces son los mas comunes. La estreptomicina es un antibiótico aminoglucósido producido por Streptomyces griseus.
Las especies de Streptomyces hidrolizan la quitina, también y otras la celulosa y las hemicelulosas. Nocardia oxida hidrocarburos del tipo de las parafinas, fenoles, esteroides, con la posibilidad de emplearlos en biorremediación
Aplicaciones industriales y ambientales
La mayoria de antibioticos son
sustancias producidas por
Streptomycetos
• Se han utilizado con éxito en la agricultura,industria alimentaria, y en la medicina
VERNAMICINA • Pertenece al grupo depsipeptidos • Es activo contra gram +y gram- • PM: 422,38 g/mol• Formula empirica C20H25O5N2• Espectro absorcion 230-270 nm
Vernamicina inhibe la union de fmet-tRNA a
los ribosomas 70 S en la sub unidad 50S
• Este antibiotico probablemente inhibe la formacion de enlaces peptidicos mediante la inhibicion de union ARNt al ribosoma
ResumenSe aislaron 75 cepas de
actinomycetos denominadas AZ-SH-29 de diferentes muestras de suelo de diferentes localidades de Egipto
Estas bacterias producen un agente
antimicrobiano amplio espectro
Tiene similitud con genero Streptomyces
Morfologia,fisiologia,caract. Bioquimicos.
Durante la formación agente antimicrobiano Parámetros de control:
pH,Temp,periodo de incubacion y diferentes
fuente de carbono y nitrogeno
Para extaer metabolito activo se uso ACETATO DE ETILO (1:1 a pH7)
Para separar y purificar el ingrediente activo se uso Cromatografia en
columna (CC)
• Este analisis indica la formula empirica C20H25N2O5
• Se determino las concentraciones minimas de inhibicion (CMI)
• El agente antimicrobiano purificado pertenece a depsipeptidos (MICAMICINA) del grupo Vernamicina producido po S. ramulosus.
Materiales y Metodos
Aislamiento actinomiceto
AZ-SH-29
Detección actividad antimicrobiana
Estudio de caracterización del
actinomiceto aislado
Se aislo apartir de muestras de
sueloSe purifico utilizando tecnica
Dilucion en placa
Morfologicas: hifas aereas, masa de
esporas, superficie de esporas,color micelios
aereosY el sustratoFisiologicas y bioqquimicas:
Se detecto
Lecitinasa----medio yema de
huevoLipasa
ProteasaPectinasaA amilasa
Pruebas bioquimicas
Prueba catalasaReduccion nitratoProduccion H2S
(utilizand diferentes fuentes de carbono
y nitrogeno
Parámetros de control en la biosíntesis del agente
antimicrobiano
Incluyen: Tamaño inoculo
Periodo incubacionValores Ph
T° incubacionFuentes carbono
y nitrogeno(glucosa , nitrato
de sodio
Micrografia electronica de barrido del actinomiceto
aisladoCrecio en un (medio de agar
+ almidon+nitrato)
FermentacionExtraccion
PrecipitacionPurificacion
Bioautografia del agente antimicrobiano
Analizaron las propiedades fisico-
quimicas del agente antimicrobiano
Analisis elemental C,H,ON, SAnalisis
espectroscopico(IR,UV,espectro
de masas y espectro RMN)
Se evaluo reaccion del
agente antimicrobiano con siguientes
pruebas:Rx MolishRx FehlingNihidrina
NitroprusiatoCloruro ferrico
Rx Mayer
Se determino su actividad biologica
Con la prueba de CMI
20 ul de compuesto purificado fue
cargado en tiras de papel de
cromatografiaSe secaron al aire y
colocaron e placas de agar sembradas
con-. Micrococcus, S.aureus,B.SubtilisE.Coli, Klebsiella y candida albicans
Como cepas bacterianas de
prueba
Resultados
1.La detección de las actividades antimicrobianas
• Bacterias Gram positivas
• Bacterias Gram negativas
• Hongos unicelulares
2.Caracterizaciones del actinomiceto aislado, AZ-SH-29
2.1Características morfológicas• Espiral• Gris rosa• Lisa• Micelio marrón amarillento• Pigmento difusible marrón
2.2 Pared celular hidrolizada: contiene acido diaminopimelico
3.Características fisiológicas y bioquímicas
Hidroliza proteínas, almidón, pectina de lípidos, lecitina, y celulosa
La prueba de catalasa y el pigmento melanina es negativo
La degradación de la xantina, esculina, la producción de H2S y la reducción de nitrato son positivos
Descomposición de la urea; y la utilización de citrato son negativos.
El aislado AZ-SH-29 utiliza D-manosa, D-glucosa, Ramnosa, manitol, L-arabinosa, Rafinosa , maltosa, L-Cycteine, L-fenilalanina, L-Arginina, y citrato de sodio
D- galactosa, sacarosa, meso-inositol, lactosa, L-Valina, y L-histidina son negativosCrecimiento en presencia de hasta (10%) de NaCl
El crecimiento no se inhibe en presencia de azida de sodio y fenol
El aislado de actinomicetos no es resistente a la amoxicilina, Augmentina, carbenicilina, Cefadroxilo, Gentamicina, Cephardine, Ceptrine, Chloramphinicol, Cloxacillina, doxiciclina, eritromicina, Keflex, y Noroxin.
3.1.Características de color y cultivo• El aislado AZ-SH-29 exhibió un buen crecimiento en el medio agar de almidón-nitrato , el micelio aéreo es gris medio, micelio de sustrato es de color marrón amarillento claro, y pigmento difusible es marrón amarillento moderado
• No hay crecimiento en el medio de caldo de extracto de triptona-levadura (ISP-1)• un buen crecimiento en el medio agar de extracto de malta-levadura (ISP-2) , el micelio aéreo es marrón amarillento claro y el pigmento difusible es de color marrón amarillento moderado.
• No hay crecimiento en medio de agar de avena (ISP-3).• Se detectó un crecimiento moderado en medio de agar de sales inorgánicas-almidón (ISP-4) el micelio aéreo es de color rosa grisáceo, micelio sustrato es amarillo naranja pálido y el pigmento difusible es brillante amarillo-naranja.
• No hay crecimiento en el medio de agar glicerol - asparragina (ISP-5).• Buen crecimiento fue detectado en medio de agar de extracto de levadura y peptona (ISP-6), el micelio aéreo del medio es gris medio; micelio de sustrato es marrón amarillento claro y pigmento difusible marrón moderado.
• Se detectó buen crecimiento en medio de agar tirosina (ISP-7), el micelio aéreo es gris claro, micelio sustrato es marrón claro y pigmento difusible es marrón amarillento moderado
• AZ-SH-29 es sugerente de relacionarse con Streptomyces ramulosus
4. Identificación del actinomiceto aislado, AZ-SH-29
• Periodo de incubación: 5 días• Valor de pH: pH 7• La temperatura de incubación: 25 °C• Fuente de carbono: Glucosa 2.5 mg/100ml• Fuente de nitrógeno: nitrato de sodio 0.25 mg/100 ml
5. Parámetros que controlan la biosíntesis del agente antimicrobiano
6. Fermentación y aislamiento del agente microbiano
•El proceso de fermentación se realizó durante cinco días a 30°C
•Filtración•Centrifugación a 5000 rpm durante 15 min
•Los filtrados transparentes fueron ajustados a pH 7,0
•acetato de etilo al nivel de 1: 1 (v / v)
•La fase orgánica se recogió, y se evaporó bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio
•La fase orgánica se recogió, y se evaporó bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio
•El material residual se disolvió en la menor cantidad de DMSO y filtrado
•El agente antimicrobiano se precipitó por el éter de petróleo (pe 60-80? C) y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 min donde un precipitado en polvo de color marrón podría ser obtenido
•El proceso de purificación a través de cromatografía con gel de sílice
7. Bioautografía del Agente(s) antimicrobiano purificado
• El agente antimicrobiano purificado produce olor característico, su punto de fusión es de 195° C.
• El compuesto es soluble en cloroformo, acetato de etilo, Demso, n-butanol, y dietil éter, pero insoluble en agua, éter de petróleo, y hexano.
8. Características físico-químicas del agente
antimicrobiano
• Los datos analíticos elementales del agente antimicrobiano (s) revelo lo siguiente:. C = 63,54, H = 6.67, N = 7,29 y O = 21.7 Este análisis indica una fórmula empírica sugerida de C20H25N2O5.
8.1. Análisis elemental
La RMN- espectro
Reacción bioquímica del agente antimicrobiano
Las actividades biológicas del agente antimicrobiano
Identificación del agente antimicrobiano
4. Discusión
AZ-SH-29 se aisló de una muestra del suelo (medio almidón nitrato)
optimización de la biosíntesis se estudiaron diferentes condiciones culturales tales como el pH, la temperatura y período de incubación, efecto de fuente carbono y fuentes de nitrógeno.
La biosíntesis máximo se alcanzó al final de un periodo de incubación de cinco días para la producción de agente antimicrobiano.
rendimiento máximo del agente antimicrobiano se produjo al final de una temperatura de incubación de 30 ° C
efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno en la producción del agente antimicrobiano indicaron que Streptomyces ramulosus- AZ-SH-29 requieren glucosa y nitrato de sodio a concentraciones 2.5.0 g / 100 ml; 0,25 g / 100, respectivamente
metabolitos activos fueron extraídos por acetato de etilo a pH 7.
Conclusiones:
características físico-químicas del antibiótico purificada revelaron que, su punto de fusión es 195 ° C.
soluble en cloroformo, acetato de etilo, Denso, n-butanol y éter dietilio pero insoluble en agua, éter de petróleo, y hexano. estudio del análisis elemental del agente antibacteriano conduce a una fórmula imperica de: C 20 H 25 O 5 N 2