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GENES, GENOMAS Y TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA...
... CON UN TOQUE DE BIOINFORMÁTICA
CÓDIGO GENÉTICO
DNADobleHélice
mRNA
Proteína
5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3'
3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5'
Hebracodificadora
Hebra no codificadora
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3'
(NH2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)
Retrotranscripción
GENES
Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos. Un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica. Por ejemplo: Proteínas, ARNm, ARN ribosómico, ARN de transferencia y ARN pequeños.
GEN PROCARIOTA
mRNA POLICISTRÓNICOS
GEN EUCARIOTA
GENOMAS
El genoma es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular.
EUCARIOTAS
CLOROPLASTOS
MITOCONDRIAS
CROMOSOMA
GENOMA HUMANO 3200 MB
Organismo Tamaño Genoma(pares de bases)Fago λ 5×104
Escherichia coli 4×106
Levadura 2×107
Caenorhabditis elegans 8×107
Drosophila melanogaster 2×108
Humano 3×109
Amphibians109–1011
Psilotum nudum2.5 x 1011
C-value enigma ó C-value paradox
El C-value enigma ó C-value paradox es un término usado para describir la variación en los tamaños de genomas nucleares entre las especies eucariotas. El objeto de estudio del C-value enigma es la observación de que el tamaño del genome no se correlaciona con la complejidad del organismo.
EJERCICIO Hacer un programa que a partir del archivo
MTtabaco.gbk que contiene el genoma mitocondrial de tabaco extraer el gen que pida el usuario con 1000nts upstream y 1000nts downstream y guardarlo en formato fasta.
Especificaciones del formato Genbank. http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FT_definitions/feature_table.html
Especificaciones del formato Fasta. http://www.bioperl.org/wiki/FASTA_sequence_format
LOCUS BA000042 430597 bp DNA circular PLN 02-MAY-2006DEFINITION Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete genome.ACCESSION BA000042 AP006340 AP006341VERSION BA000042.1 GI:56806513KEYWORDS .SOURCE mitochondrion Nicotiana tabacum (common tobacco) ORGANISM Nicotiana tabacum Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; lamiids; Solanales; Solanaceae; Nicotianoideae; Nicotianeae; Nicotiana.REFERENCE 1 AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y., Nagase,M., Makita,N., Yagura,S., Hirai,A. and Sugiura,M. TITLE The complete nucleotide sequence and multipartite organization of the tobacco mitochondrial genome: comparative analysis of mitochondrial genomes in higher plants JOURNAL Mol. Genet. Genomics 272 (6), 603-615 (2005) PUBMED 15583938REFERENCE 2 (bases 1 to 430597) AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y. and Nagase,M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University, Center for Gene Research; Chikusa-ku, Furo-cho, Nagoya, Aichi 464-8602, Japan (E-mail:ysugiya@gene.nagoya-u.ac.jp, Tel:81-52-789-5943, Fax:81-52-789-4526)FEATURES Location/Qualifiers
/db_xref="GI:56806523" /translation="MDLYSIRNQRISPQKREEFPLLSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVSCSLSCALN TKLGQRCEGL" gene complement(24579..25766) /gene="atp6" CDS complement(24579..25766) /gene="atp6" /note="CDS is reported in Acc# X06595" /codon_start=1 /product="ATP synthase F0 subunit 6" /protein_id="BAD83425.1" /db_xref="GI:56806524" /translation="MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLKSSDTQGSS SGIFTDHPGLNPCSERIVELQYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAFLE YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLIPMKIGNLYFSFTNPSLFM LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLSGNVKQKFS PRISVTFTFSLFCNPQGMIPYSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAGHSSVKILSGFAWTMLCMN DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQSASFFIIEQ KRV" gene complement(31411..31743)
Formato Genbank
ORIGIN 1 attcacagtg ctcttcgcaa tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc 61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg gcaactacac cgtcgactcc 121 acaagaactc caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctccctc cgatcttgtc 181 ccatctcggc ttccacgcgc gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg 241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt tataacacag agtcagcgcg 301 aagaaaggca gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga ttttcatttc 361 tagttagagg agcagaccac tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc 421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc tccaactcgt actttgctac 481 aacgatcttt gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat agggcaattc 541 gtaatgctct cttcctgtcc tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc 601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt tgcatccttg tctggcagtt 661 agctaagcga gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctcta ctctactagt 721 cctagtacta gatactagat agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct 781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag tcatatgcgg aacacatgca 841 agtccagatt gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa
Formato Fasta
>gi|142864|gb|M10040.1|BACDNAE B.subtilis dnaE gene encoding DNA primase, complete cdsGTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAATTGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGCAGATATCGTTGAAGTCATAGGTGATTATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGTCCTTTTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATTTTTCATTGCTTTGGCTGCGGAGCGGGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAAGGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTCTCACCTTGCTGACAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCCGGCCAGAGTCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCTGAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAAATACAAAAGAAGGTCAAGAGGCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGAATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTCCTTGTAAAGAGGGGATTTAGTGAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCCTGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCAGAAACCGTGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAGGCAGGGCTCTTGG
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Las técnicas más importantes:
- Clivado del ADN en sitios específicos por enzimas de restricción.
- Hibridación de ácidos nucléicos. Southern blot, Northern blot, hibridación in situ y Western blot.
- Clonado molecular del ADN. Vectores de clonado.
- PCR, reacción en cadena de la polimerasa.
MANIPULACIÓN DEL ADN IN VITROENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Permiten realizar cortes en sitios específicos en el ADN, que permiten aislar y manipular genes individuales.
- Son endonucleasas (cortan enlaces internos de la molécula) de origen bacteriano.
- Reconocen secuencias específicas de ADN de diferente longitud.
- Luego del reconocimiento realizan el corte.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Existen alrededor de 4000 enzimas de restricción conocidas.
- 671 disponibles comercialmente.
- Hay bases de datos de enzimas de restricción y sus sitios de reconocimiento y corte:
REBASE
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html
from Bio import Restrictionfrom Bio import Seqfrom Bio.Alphabet import IUPAC
an=Restriction.Analysis(Restriction.CommOnly, Seq.Seq\(secuencia, IUPAC.unambiguous_dna))an.print_as ("map")
Resultado (output):
7 TspEI Sse9I Tsp509I FokI | | 12 HpyCH4V CviRI | | | | 20 BstF5I BseGI | | | ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG|||||||||||||||||||||||||||TACCCATTAACGTTGCCCCGTAGGTTC1 27
RESTRICCIÓN EN 2 PASOS
HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS
- El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para formar una doble hélice se llama hibridación, dado que puede utilizarse para formar ADN híbrido compuesto por cadenas de diferentes orígenes.- La hibridación permite la formación de complejos DNA:DNA y ADN:ARN usando la complementariedad de bases (A-T, C-G).- El fenómeno de hibridación ocurre bajo condiciones especiales en solución (pH, concentración de sales, T0, etc).
5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3'
5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3'
5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T C T C C C G A T T G C A T -3'
DNACortado por enzimas de
restricción
PROTEÍNARNA
Tranferencia de proteínas, RNA o DNA separados por electroforesis a membranas sintéticas.
Hibridación del DNA o RNA con secuencias marcadas con radiactivo (“sondas”).Revelado por radioautografía.
Detección de Proteínas con anticuerpos marcados.
Southern blot Nouthern blot Western blot
RESULTADOS
REVELADO
TRANSFERENCIA
ELECTROFORESIS
TÉCNICAS BÁSICAS
HIBRIDACIÓN IN SITU
CLONADO MOLECULAR
Introducción en una célula húesped de una mólecula de ADN capaz de replicarse en paralelo con el genoma del húesped en estado episomal, es decir sin integrarse al genoma.
VECTORES DE CLONADO
BACTERIÓFAGO O “FAGO”
PLÁSMIDOS
PCR
TM temperature melting
DNApol de bacterias termofilas
Diseño de primers15-30 nts
MUESTRAS
USOS DE LA PCR
Huella genéticaTest de PaternidadDiagnóstico de enfermedades hereditariasClonación de genesMutagénesisAnálisis de ADN fósilGenotipado de mutaciones específicasIdentificación de especies
http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg
http://www.gbiosciences.com/Image/BE307.jpg
www.biopython.org
http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Genetics/PCR/PCR_Protocol.htm
http://members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/LNPics/Recomb/pcr.gif
Molecular Biology of The Cell. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books
Referencias
Introducción a la Oncología Molecular. Goméz y Alonso. Universidad Nacional de Quilmes, 1998.
Lic. Virginia González
http://www.genomesonline.org/gold_statistics.htm