Post on 27-Sep-2018
IDENTIFICACIÓN Y AUTENTIFICACIÓN DE ESPECIES PESQUERAS
Carmen Glez Sotelo
Instituto de Investigaciones Marinas
• ORIGEN: PESCA BAJURAPESCA ALTURAACUICULTURAPESCADO IMPORTACIÓN
• PESCADO AGUAS COSTERAS NO SATISFACE LA DEMANDA DE PESCADO
• POR QUÉ SE DESARROLLA EL COMERCIO PESQUERO
DESARROLLO DE PESQUERIAS: BUQUES Y ARTES DE PESCAMEJORA DE LOS PROCESOS DE CONSERVACIÓN: CONGELACIÓNDESARROLLO DE LA INDUSTRIA PESQUERA EN TERCEROS PAISESDESARROLLO DE LOS MEDIOS DE TRANSPORTE Y GLOBALIZACIÓN
• INCREMENTO DEL NÚMERO DE ESPECIES EN LOS MERCADOS
AUTENTIFICACIÓN DE ESPECIES: JUSTIFICACIÓN
• CONSUMO DE NUEVAS ESPECIESCONSUMO DE NUEVAS ESPECIES• INCREMENTO EN LAS CAPTURAS MUNDIALESINCREMENTO EN LAS CAPTURAS MUNDIALES• INCREMENTO EN EL NINCREMENTO EN EL NÚÚMERO DE ESPECIES CON VALOR COMERCIALMERO DE ESPECIES CON VALOR COMERCIAL• DESCENSO DE LA CAPTURAS DE ESPECIES CON ELEVADO VALOR COMERCIALDESCENSO DE LA CAPTURAS DE ESPECIES CON ELEVADO VALOR COMERCIAL
AUTENTIFICACIÓN DE ESPECIES: JUSTIFICACIÓN
• CAMBIOS EN LOS HCAMBIOS EN LOS HÁÁBITOS DE CONSUMO: DE PESCADO ENTERO Y FRESCO A PLATOS PREPARADOSBITOS DE CONSUMO: DE PESCADO ENTERO Y FRESCO A PLATOS PREPARADOS O O PRECOCINADOSPRECOCINADOS
• PROCESAMIENTO DE PESCADO: INDUSTRPROCESAMIENTO DE PESCADO: INDUSTRÍÍAS EN TERCEROS PAAS EN TERCEROS PAÍÍSESSES
•• MATERIA PRIMA: ESPECIES CONOCIDAS O COMPLETAMENTE DESCONOCIDASMATERIA PRIMA: ESPECIES CONOCIDAS O COMPLETAMENTE DESCONOCIDAS
• PROCESAMIENTO: ELIMINACIPROCESAMIENTO: ELIMINACIÓÓN DE CARACTERES TAXONN DE CARACTERES TAXONÓÓMICOS MORFOLMICOS MORFOLÓÓGICOSGICOS
AUTENTIFICACIÓN DE ESPECIES: JUSTIFICACIÓN
MERCADOSLONJAS INDUSTRIAPESCA CONSUMIDORES
INTERCAMBIOS COMERCIALES: PRECIOINTERCAMBIOS COMERCIALES: PRECIO
COMPRADORES NECESITANCOMPRADORES NECESITANSABER CON CERTEZASABER CON CERTEZA
EL PRODUCTO QUEEL PRODUCTO QUEADQUIERENADQUIEREN
••CALIDADCALIDAD••ESPECIESESPECIES••AREA DE CAPTURAAREA DE CAPTURA••FECHA DE CAPTURAFECHA DE CAPTURA••EXTRACTIVA /ACUICULTURAEXTRACTIVA /ACUICULTURA••ESTACIESTACIÓÓNN
ADMINISTRACIADMINISTRACIÓÓN N DEBE GARANTIZAR LA DEBE GARANTIZAR LA
VERACIDAD DE LAS VERACIDAD DE LAS ETIQUETASETIQUETAS
AUTENTIFICACIÓN DE ESPECIES: JUSTIFICACIÓN
MORFOLMORFOLÓÓGICOSGICOS
BIOQUBIOQUÍÍMICOSMICOS
ADN
PROTEINAS
Solea solea Glyptocepahalus cynoglossus
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: PROTEÍNAS
PROTEOMA DE PECES: CONJUNTO DE PROTEINAS EXPRESADASPROTEOMA DE PECES: CONJUNTO DE PROTEINAS EXPRESADASTOTALTOTALFRACCIONES ESPECFRACCIONES ESPECÍÍFICASFICAS
••TRIPSINATRIPSINA
••PEPSINAPEPSINA
••CNBrCNBr
••IEFIEF••PAGEPAGE••CECE
SECUENCIACISECUENCIACIÓÓNN
HIDRHIDRÓÓLISISLISIS
TTÉÉCNICAS ELECTROFORCNICAS ELECTROFORÉÉTICASTICAS
ELISAELISA
CARACTERIZACICARACTERIZACIÓÓN DE PROTEINASN DE PROTEINASSECUENCIA AMINOACIDICASECUENCIA AMINOACIDICAPESO MOLECULARPESO MOLECULARPUNTO ISOELECTRICOPUNTO ISOELECTRICOANTIGENICIDADANTIGENICIDAD
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: PRODUCTOS
TRATAMIENTO TTRATAMIENTO TÉÉRMICO EXHAUSTIVORMICO EXHAUSTIVO
DESNATURALIZACIDESNATURALIZACIÓÓN DE PROTEN DE PROTEÍÍNAS SEVERANAS SEVERA
LA IDENTIFICACILA IDENTIFICACIÓÓN DE ESPECIES NO ES POSIBLE UTILIZANDO PROTEINASN DE ESPECIES NO ES POSIBLE UTILIZANDO PROTEINAS
ADN SE DEGRADA PERO TODAVADN SE DEGRADA PERO TODAVÍÍA ESTAN PRESENTES FRAGMENTOS CORTOS CON A ESTAN PRESENTES FRAGMENTOS CORTOS CON CAPACIDAD DIAGNCAPACIDAD DIAGNÓÓSTICASTICA
CONSERVASFRESCO
ESTERILIZACIESTERILIZACIÓÓNN
ADNADN
ADN COMO MARCADOR DE ESPECIES
INFORMACIINFORMACIÓÓN: ADN GENN: ADN GENÓÓMICO DE PECES 0.3MICO DE PECES 0.3--0.4 BILLONES DE 0.4 BILLONES DE
PARES DE BASES (1% CODIFICAN PROTEINAS)PARES DE BASES (1% CODIFICAN PROTEINAS)
ADN NO SUFRE VARIACIONES DEPENDIENDO DEL TIPO DE TEJIDOADN NO SUFRE VARIACIONES DEPENDIENDO DEL TIPO DE TEJIDO
ADN TIENE REGIONES CON DIFERENTES TASAS DE MUTACIADN TIENE REGIONES CON DIFERENTES TASAS DE MUTACIÓÓN: N:
DIFERENTES NIVELES DE RESOLUCIDIFERENTES NIVELES DE RESOLUCIÓÓNN
SELECCIÓN DE FRAGMENTOS DIAGNÓSTICO
ADN DE PRODUCTOS PESQUEROSADN DE PRODUCTOS PESQUEROS
•• DEGRADADO (FRAGMENTADO)DEGRADADO (FRAGMENTADO)
SELECCISELECCIÓÓN Y ENSAYO DE SECUENCIAS DE ADNN Y ENSAYO DE SECUENCIAS DE ADN
•• CITOCROMO BCITOCROMO B
•• REGION CONTROLREGION CONTROL
•• rRNArRNA
•• CITOCROMO OXIDASA IIICITOCROMO OXIDASA III
REQUERIMIENTOS DE LAS SECUENCIASREQUERIMIENTOS DE LAS SECUENCIAS
•• BAJA VARIABILIDAD INTRAESPECIFICABAJA VARIABILIDAD INTRAESPECIFICA•• ALTA VARIABILIDAD INTERESPECIFICAALTA VARIABILIDAD INTERESPECIFICA
•• PERMITIR EL DISEPERMITIR EL DISEÑÑO DE CEBADORESO DE CEBADORES•• FRAGMENTOS CORTOSFRAGMENTOS CORTOS
•• PRODUCTOS DE PCR EN TODAS LAS ESPECIESPRODUCTOS DE PCR EN TODAS LAS ESPECIES
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: ADN
•• METODOS QUE NO REQUIEREN EL CONOCIMIENTO PREVIO DE LA SECUENCIA METODOS QUE NO REQUIEREN EL CONOCIMIENTO PREVIO DE LA SECUENCIA DE ADNDE ADNRAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
•• METODOS QUE REQUIEREN CONOCIMIENTO DE LA SECUENCIA DE ADNMETODOS QUE REQUIEREN CONOCIMIENTO DE LA SECUENCIA DE ADNFINS: SECUENCIACIFINS: SECUENCIACIÓÓN Y ESTIMACIN Y ESTIMACIÓÓN DE DISTANCIAS GENN DE DISTANCIAS GENÉÉTICASTICASPCRPCR--RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism )RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism )PCR ESPECPCR ESPECÍÍFICAFICASONDAS DE ADNSONDAS DE ADN
PCRPCR--ELISAELISASONDAS Taqman (REAL TIME PCR)SONDAS Taqman (REAL TIME PCR)ARRAYS DE SONDASARRAYS DE SONDAS
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: RAPD
RAPD (RAPD (RRandom andom AAmplification of mplification of PPolymorphic olymorphic DDNA) NA)
•• CEBADORES MUY CORTOS: APROX. 10 nt FRAGMENTOS ENTRE CEBADORES MUY CORTOS: APROX. 10 nt FRAGMENTOS ENTRE 200200--20002000 PBPB
•• AMPLIFICACIAMPLIFICACIÓÓN A BAJA TN A BAJA Tªª DE ANNEALING (DE ANNEALING (3535--4545ººCC))
•• GENERACIGENERACIÓÓN DE PERFILES CARACTERN DE PERFILES CARACTERÍÍSTICOS DE POBLACIONES, ESPECIESSTICOS DE POBLACIONES, ESPECIES
•• REPRODUCIBILIDAD DE PATRONESREPRODUCIBILIDAD DE PATRONES
•• CALIDAD ADNCALIDAD ADN•• TERMOCICLADOR TERMOCICLADOR •• CONDICIONES DE PCR REPRODUCIBLESCONDICIONES DE PCR REPRODUCIBLES•• POLIMERASAPOLIMERASA•• CONDICIONES DE SEPARACICONDICIONES DE SEPARACIÓÓN Y DETECCIN Y DETECCIÓÓNN•• VARIABILIDAD INTRAESPECVARIABILIDAD INTRAESPECÍÍFICAFICA
SSCP (SSCP (SSingle ingle SStrand trand CConformation onformation PPolymorphism)olymorphism)
•• PCR: ENTRE PCR: ENTRE 100100--300300 PBPB
•• DESNATURALIZACIDESNATURALIZACIÓÓN: CADENAS SENCILLASN: CADENAS SENCILLAS
•• DIFERENTE CONFORMACIDIFERENTE CONFORMACIÓÓN DEPENDIENTE DE SECUENCIAN DEPENDIENTE DE SECUENCIA
•• DETECCIDETECCIÓÓN DE DIFERENCIAS INTRAESPECN DE DIFERENCIAS INTRAESPECÍÍFICASFICAS
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: SSCP
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: FINS
FINS (FINS (FForensically IIdentification dentification NNucleotide ucleotide SSequencing)equencing)
•• SECUENCIACISECUENCIACIÓÓN Y ANN Y ANÁÁLISIS DE SECUENCIASLISIS DE SECUENCIAS
5’ttacaaagacctccttggtttcgtgattctgctagtagcactcgcctctctagcactattctctcccaacctcctaggagacccagacaacttcacccctgccaaccccatggttaccccacctca-3’
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: FINS10 20 30 40 50 60
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . .
arochei18 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei28 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei24 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei31 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei25 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei21 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei19 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei10 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCarochei23 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGTCathazard1 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tathazard4 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTACGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis1_ CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis2_ CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis5 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis10 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis11 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT A T TAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis13 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TG GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis12 CAAGAACCT T AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TG GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis9 CAAGAACCT T AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TG GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis7 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TG GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis6 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ANTAAAAA TG GCTAACGACG CACTAGT Tkpelamis3_ CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CCCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Teallettera CAAGAACCGT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tealleterat CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Tealleterat CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalbacares CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalbacares CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalbacares CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalbacares CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA T T GCTAACGACG CACTAGT Ttatlanticu CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT TIIM693-1-L CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttatlanticu CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttatlanticu CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttatlanticu CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttthynnus6 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttthy7 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttthynnus1_ CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttobesus39 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttobesus45 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttobesus40 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttobesus41 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttobesus36 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalalunga5 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttori1 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttori2 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttori3 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalalunga6 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCACT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalalunga4 CCAGCCCCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalalunga1 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT Ttalalunga5 CAAGAACCCT AA TGGCAAGC CTCCGAAAAA CTCACCCGCT ACTAAAAA TC GCTAACGACG CACTAGT T
[ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 ] [ 1] [ 2] 0.01 [ 3] 0.00 0.00 [ 4] 0.00 0.01 0.00 [ 5] 0.11 0.12 0.11 0.11 [ 6] 0.10 0.10 0.11 0.11 0.02 [ 7] 0.12 0.12 0.12 0.12 0.10 0.10 [ 8] 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.08 [ 9] 0.11 0.11 0.10 0.11 0.12 0.10 0.08 0.00 [10] 0.13 0.14 0.13 0.14 0.13 0.13 0.13 0.11 0.11 [11] 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.11 0.12 0.00 [12] 0.13 0.14 0.13 0.14 0.13 0.13 0.13 0.11 0.11 0.00 0.00 [13] 0.12 0.13 0.12 0.13 0.14 0.13 0.12 0.12 0.12 0.08 0.08 0.08 [14] 0.11 0.11 0.12 0.11 0.12 0.12 0.11 0.12 0.12 0.07 0.07 0.07 0.03 [15] 0.11 0.11 0.11 0.11 0.12 0.11 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.08 0.07 [16] 0.11 0.11 0.11 0.11 0.12 0.11 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.08 0.07 0.00 [17] 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 0.08 0.07 0.00 0.00 [18] 0.14 0.15 0.14 0.14 0.12 0.11 0.10 0.10 0.10 0.09 0.10 0.09 0.09 0.09 0.05 0.05 0.05 [19] 0.14 0.15 0.14 0.15 0.12 0.11 0.10 0.10 0.10 0.09 0.10 0.09 0.09 0.09 0.05 0.05 0.05 0.00 [20] 0.14 0.15 0.15 0.15 0.12 0.12 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.09 0.09 0.05 0.05 0.05 0.01 0.01 [21] 0.25 0.27 0.25 0.25 0.26 0.26 0.25 0.24 0.24 0.27 0.27 0.27 0.28 0.28 0.24 0.24 0.24 0.25 0.26 0.26 [22] 0.24 0.24 0.24 0.24 0.25 0.25 0.24 0.23 0.23 0.26 0.26 0.26 0.28 0.27 0.23 0.23 0.23 0.24 0.24 0.24 0.01 [23] 0.24 0.26 0.25 0.25 0.24 0.23 0.25 0.25 0.24 0.26 0.26 0.26 0.25 0.25 0.24 0.24 0.25 0.26 0.26 0.26 0.13 0.12 [24] 0.26 0.27 0.27 0.26 0.25 0.24 0.26 0.26 0.26 0.27 0.27 0.27 0.26 0.26 0.25 0.25 0.26 0.27 0.28 0.27 0.14 0.13 0.01 [25] 0.21 0.22 0.21 0.21 0.24 0.25 0.25 0.25 0.25 0.27 0.27 0.27 0.24 0.26 0.26 0.26 0.27 0.28 0.28 0.28 0.21 0.21 0.20 0.21 [26] 0.21 0.22 0.21 0.21 0.23 0.24 0.24 0.25 0.25 0.27 0.27 0.27 0.24 0.26 0.26 0.26 0.27 0.27 0.28 0.28 0.20 0.21 0.20 0.21 0.00 [27] 0.24 0.25 0.24 0.23 0.22 0.24 0.24 0.23 0.23 0.27 0.27 0.27 0.26 0.27 0.26 0.26 0.26 0.26 0.26 0.26 0.20 0.22 0.20 0.21 0.12 0.12 [28] 0.23 0.24 0.23 0.22 0.21 0.22 0.23 0.22 0.22 0.26 0.26 0.26 0.25 0.25 0.24 0.24 0.24 0.24 0.25 0.25 0.20 0.20 0.19 0.20 0.11 0.11 0.02 [29] 0.25 0.25 0.25 0.24 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.31 0.32 0.31 0.28 0.30 0.29 0.29 0.29 0.30 0.30 0.30 0.32 0.33 0.28 0.29 0.27 0.27 0.28 0.27 [30] 0.25 0.25 0.25 0.24 0.28 0.28 0.27 0.28 0.27 0.31 0.32 0.31 0.28 0.30 0.29 0.29 0.30 0.30 0.30 0.30 0.32 0.32 0.28 0.29 0.27 0.27 0.29 0.27 0.01 [31] 0.31 0.31 0.30 0.31 0.31 0.31 0.33 0.31 0.31 0.32 0.32 0.32 0.33 0.35 0.31 0.31 0.31 0.32 0.32 0.33 0.40 0.39 0.34 0.35 0.34 0.34 0.34 0.33 0.25 0.26 [32] 0.27 0.28 0.27 0.27 0.26 0.26 0.28 0.26 0.26 0.31 0.31 0.31 0.30 0.28 0.27 0.27 0.25 0.26 0.26 0.26 0.26 0.26 0.27 0.28 0.24 0.24 0.28 0.27 0.21 0.21 0.22 [33] 0.27 0.28 0.27 0.27 0.26 0.26 0.28 0.26 0.26 0.31 0.31 0.31 0.30 0.28 0.27 0.27 0.25 0.26 0.26 0.26 0.26 0.26 0.27 0.28 0.24 0.24 0.28 0.27 0.21 0.21 0.22 0.00 [34] 0.27 0.28 0.27 0.27 0.26 0.26 0.28 0.26 0.26 0.31 0.31 0.31 0.29 0.28 0.26 0.26 0.25 0.25 0.26 0.25 0.26 0.26 0.26 0.28 0.24 0.24 0.28 0.27 0.20 0.21 0.22 0.00 0.00 [35] 0.27 0.27 0.27 0.27 0.26 0.26 0.27 0.25 0.25 0.31 0.31 0.31 0.28 0.28 0.26 0.26 0.26 0.26 0.26 0.25 0.25 0.24 0.25 0.27 0.23 0.22 0.27 0.26 0.20 0.20 0.18 0.00 0.00 0.00 [36] 0.31 0.31 0.30 0.31 0.31 0.31 0.32 0.30 0.30 0.32 0.32 0.32 0.32 0.34 0.31 0.31 0.31 0.32 0.32 0.32 0.40 0.39 0.34 0.34 0.34 0.33 0.34 0.32 0.25 0.25 0.00 0.22 0.22 0.22 0.18 [37] 0.32 0.32 0.32 0.32 0.31 0.31 0.30 0.29 0.29 0.34 0.34 0.34 0.33 0.33 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.31 0.34 0.33 0.32 0.33 0.30 0.30 0.33 0.32 0.27 0.27 0.21 0.18 0.18 0.18 0.14 0.21 [38] 0.28 0.28 0.29 0.28 0.29 0.30 0.31 0.27 0.27 0.32 0.32 0.32 0.29 0.30 0.28 0.28 0.28 0.29 0.29 0.28 0.31 0.30 0.30 0.31 0.30 0.29 0.32 0.30 0.26 0.26 0.18 0.15 0.15 0.15 0.12 0.18 0.18 [39] 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.32 0.32 0.29 0.29 0.32 0.32 0.32 0.31 0.33 0.30 0.30 0.30 0.28 0.28 0.29 0.33 0.32 0.32 0.33 0.32 0.31 0.29 0.28 0.21 0.22 0.19 0.26 0.26 0.26 0.22 0.19 0.22 0.21 [40] 0.26 0.26 0.26 0.26 0.29 0.29 0.30 0.29 0.29 0.33 0.33 0.33 0.30 0.32 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.32 0.35 0.34 0.31 0.32 0.30 0.30 0.30 0.29 0.04 0.04 0.20 0.23 0.23 0.23 0.20 0.20 0.22 0.20 0.16 [41] 0.32 0.32 0.32 0.32 0.34 0.33 0.34 0.31 0.31 0.34 0.34 0.34 0.35 0.35 0.32 0.32 0.32 0.31 0.31 0.31 0.35 0.34 0.35 0.36 0.33 0.33 0.33 0.31 0.22 0.23 0.24 0.29 0.29 0.29 0.25 0.23 0.22 0.21 0.17 0.17 [42] 0.29 0.29 0.30 0.29 0.29 0.30 0.35 0.32 0.32 0.32 0.32 0.32 0.34 0.34 0.29 0.29 0.29 0.31 0.31 0.31 0.41 0.39 0.35 0.37 0.36 0.36 0.33 0.32 0.29 0.30 0.20 0.29 0.29 0.29 0.25 0.19 0.28 0.23 0.23 0.24 0.22
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: FINS
0,05
Platichthys flesusPlatichthys flesusPleuronectes platessaPleuronectes platessa
Hippoglossoides spp.Hippoglossoides spp.Limanda spp.Limanda spp.
Reinhardtius hippoglossoidesReinhardtius hippoglossoidesMicrostomus kittMicrostomus kittGlyptocephalus cynoglossusGlyptocephalus cynoglossus
Lepidorhombus bosciiLepidorhombus bosciiL. wiffiagonisL. wiffiagonisScophthalmus rhombusScophthalmus rhombusScophthalmus maximusScophthalmus maximus
Dicologoglosa cuneataDicologoglosa cuneataMonochirus spp.Monochirus spp.Solea imparSolea impar
Solea senegalensis+S. kleiniSolea senegalensis+S. kleiniSolea soleaSolea solea
SOLEID
AE
SOLEID
AE
SCO
PHTH
ALM
IDA
ESC
OPH
THA
LMID
AE
PLEUR
ON
ECTID
AE
PLEUR
ON
ECTID
AE
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: FINS
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: FINS
Thunnus obesus (Patudo)Thunnus obesus (Patudo)
•• DISTANCIAS GENDISTANCIAS GENÉÉTICAS Y ARBOL FILOGENTICAS Y ARBOL FILOGENÉÉTICO TICO A1
A2
A3
A6
L1
L2
L3
L6
P4
P8
P10
RB1
RB2
RO2
RO7
RO9
RO13
S2
UNKNOWN
64
90
71
100
6356
93
98
52
38
21
78
80
0,02
BASE DE DATOS DE SECUENCIASBASE DE DATOS DE SECUENCIAS•• GRUPOS DE ESPECIES RELACIONADAS FILOGENGRUPOS DE ESPECIES RELACIONADAS FILOGENÉÉTICAMENTETICAMENTE
•• NNºº DE INDIVIDUOS/ESPECIE : VARIABILIDAD INTRAESPECDE INDIVIDUOS/ESPECIE : VARIABILIDAD INTRAESPECÍÍFICAFICA
•• NNºº DE ESPECIES: VARIABILIDAD INTERESPECDE ESPECIES: VARIABILIDAD INTERESPECÍÍFICAFICA
SELECCISELECCIÓÓN DE SECUENCIAS DIAGNN DE SECUENCIAS DIAGNÓÓSTICOSTICO•• SUFICIENTE VARIABILIDAD INTERESPECSUFICIENTE VARIABILIDAD INTERESPECÍÍFICA/ BAJA INTRAESPECFICA/ BAJA INTRAESPECÍÍFICAFICA
•• LONGITUD DEL FRAGMENTO DIAGNLONGITUD DEL FRAGMENTO DIAGNÓÓSTICO: APLICACISTICO: APLICACIÓÓN A DISTINTOS PRODUCTOSN A DISTINTOS PRODUCTOS
VENTAJAS DE FINSVENTAJAS DE FINS•• CLASIFICACICLASIFICACIÓÓN/ IDENTIFICACIN/ IDENTIFICACIÓÓN DE MUESTRAS DESCONOCIDASN DE MUESTRAS DESCONOCIDAS
•• DETECCIDETECCIÓÓN DE NUEVAS ESPECIES QUE APARECEN EN EL MERCADON DE NUEVAS ESPECIES QUE APARECEN EN EL MERCADO
•• PALIAR LOS PROBLEMAS DE LA VARIABILIDAD INTRAESPECPALIAR LOS PROBLEMAS DE LA VARIABILIDAD INTRAESPECÍÍFICA: SECUENCIA ENTERAFICA: SECUENCIA ENTERA
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: FINS
5’- ATTGCTAGTTACTGTATCTTATGCTAGTACGTAAATGATGGCATSTGCTAG-3’5’- ATTGCTAGTTACTGATCCTTATGCTAGTACGTAAATGATGGCATSTGCTAG-3’5’- ATTGCTAGTTACTGATCCTTATGCTAGTACGTAAATGACGGCATSTGCTAG-3’
Mbo I Bcef I
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: PCR-RFLP
RFLP (RFLP (RRestriction FFragment ragment LLength ength PPolymorphism)olymorphism)
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: PCR-RFLP
ELECT. CAPILARELECT. CAPILAR
CHIPCHIP
SEPARACISEPARACIÓÓN N 30 MIN30 MIN
ANANÁÁLISIS RESULTADOSLISIS RESULTADOS
Dooley et al.,2005. J. Agric. Food Chem. 53:3348Dooley et al.,2005. J. Agric. Food Chem. 53:3348--3357.3357.
PCRPCR--RFLP: aplicaciones RFLP: aplicaciones LABLAB--ONON--AA--CHIPCHIP
TAQMAN PROBETAQMAN PROBE
TEMPLATE TEMPLATE
FLU
OR
ES
CE
NC
E
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: RT-PCR
RTRT--PCR (PCR (RReal TTime ime PCRPCR))
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: RT-PCR
PCR TIEMPO REALPCR TIEMPO REAL
0
0,5
1
1,5
2
2,51 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43
Cycles
Rn
10000001000001000100
y = -1,6996Ln(x) + 43,438R2 = 0,9988
0
10
20
30
40
100 1000 10000 100000
Molecules
Ct m
ean
THRESHOLD CYCLE(Ct)THRESHOLD CYCLE(Ct)
Ct a
Ct a
Ct b
Ct b
Ct c
Ct c
Ct d
Ct d
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: RT-PCR
SONDA BACALAO (SONDA BACALAO (Gadus morhuaGadus morhua))
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Cyc
le 1
Cyc
le 3
Cyc
le 5
Cyc
le 7
Cyc
le 9
Cyc
le 1
1
Cyc
le 1
3
Cyc
le 1
5
Cyc
le 1
7
Cyc
le 1
9
Cyc
le 2
1
Cyc
le 2
3
Cyc
le 2
5
Cyc
le 2
7
Cyc
le 2
9
Cyc
le 3
1
Cyc
le 3
3
Cyc
le 3
5
Cyc
le 3
7
Cyc
le 3
9
Ct
Rn
GMACGMACGMACGOGACGOGACGOGACGMORGMORGMORTLUSTLUSTLUSMPOUMPOUMPOUMMOLMMOLMMOLGDENGDENGDENMMERMMERMMERBERTOBERTOBERTOBROTBROTBROTCORUJCORUJCORUJSSOLSSOLSSOLAAASSALSSALSSALNTCNTC
OBJECTIVO: MOBJECTIVO: MÉÉTODOS SIMPLIFICADOSTODOS SIMPLIFICADOSTECNOLOGTECNOLOGÍÍA MICROARRAY A MICROARRAY
MÉTODOS IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES: DNA-ARRAYS