Post on 15-Jul-2022
MODELACIÓN DEL CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Y PATÓGENAS ASOCIADAS A
ALIMENTOS
CATALINA AGUILAR RIVERA
Trabajo de grado para optar el título de Magíster en Ciencias Biológicas con énfasis en Microbiología
Universidad de Los Andes
Facultad de Ciencias Biológicas Bogotá D.C.
2007
MODELACIÓN DEL CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Y PATÓGENAS ASOCIADAS A
ALIMENTOS
CATALINA AGUILAR RIVERA
BERNADETTE KLOTZ CEBERIO
Director, Ph.D
MARÍA CONSUELO VANEGAS LÓPEZ
Co- Director, M.Sc
Universidad de Los Andes Facultad de Ciencias Biológicas
Bogotá D.C. 2007
DEDICATORIA Cada experiencia es un paso más hacia el éxito; es un sueño que no se hubiera hecho realidad
sin la presencia de Dios, el apoyo de mi familia y el de todas las personas que creyeron en mí.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de La Sabana por apoyar y f inanciar este proyecto y a su Facultad de
Ingenier ía por facilitarme los laboratorios. Al Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos
de la Universidad de Los Andes y al Laboratorio de Investigación de la Facultad de Ingeniería
de la Universidad de La Sabana por la donación de las cepas.
A la Dra. Bernadette Klotz por su entrega incondicional y por ser un modelo a seguir. A la Dra.
Consuelo Vanegas por todos sus aportes y sugerencias. Al Dr. Francisco Zimmerman por sus
valiosas orientaciones. Al Ing. Francisco Garcés por su apoyo y colaboración. A Pilar Gómez
por su ayuda incalculable. A todos los auxiliares de laboratorio y al personal administrativo de
la Universidad de La Sabana por su eficiente gestión. Y a todas las personas que directa e
indirectamente hicieron parte de este proceso haciendo realidad este proyecto.
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 4 2.1. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE CRUDA 4 2.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS 6 2.2.1 Lactobacillus plantarum 8 2.2.2 Lactobacillus paracasei 8 2.2.3 FERMENTA CIÓN ÁCIDO LÁCTICA 9 2.3 Escherichia coli 11 2.4 Listeria monocytogenes 12 2.5 MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA 13 2.5.1 INTRODUCCIÓN A LOS MODELOS PREDICTIVOS 16 2.5.2 TIPOS DE MODELOS 20 2.5.3 DESARROLLO DE MODELOS 20 2.5.4 MODELOS PRIMARIOS DE CRECIMIENTO 26 2.5.5 AJUSTE Y SELECCIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 29 2.5.6 VALIDA CIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 29 3. JUSTIFICACIÓN 31 4. OBJETIVOS 33 4.1 OBJETIVO GENERAL 33 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 33
5. MATERIALES Y MÉTODOS 34 5.1 FASES EXPERIMENTALES 34 5.2 METODOLOGÍA 35 5.2.1 SELECCIÓN DE BAL PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS MIXTOS CON PA TÓGENOS ASOCIA DOS A ALIMENTOS: Escherichia coli y L. monocytogenes 35 5.2.2 MEDIOS DE CULTIVO 37 5.2.3 MANTENIMIENTO DE LAS CEPA S 38 5.2.4 MÉTODOS ESTADÍSTICOS 38 5.2.5 RECUENTO DE BACTERIAS 39 5.2.6 DESA RROLLO DE CULTIVOS SINCRONIZADOS 42 5.2.7 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO INDIVIDUAL EN MEDIO ESTÁ NDAR 47 5.2.8 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO/INA CTIVACIÓN BACTERIA NAS MIXTAS EN MEDIO ESTÁ NDA R 49 5.2.9 DESA RROLLO DE MODELOS PRIMA RIOS 49 5.2.10 MODELOS PRIMA RIOS SELECCIONA DOS 49 5.2.10.1 Ecuación de Gompertz modif icada 49 5.2.10.2 Ecuación de Baranyi 50 5.2.11 EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO Y LA BONDA D DE AJUSTE DE LOS MODELOS PRIMA RIOS 50 5.2.11.1 Error cuadrado medio 50 5.2.11.2 Error estándar 51 5.2.11.3 Análisis de residuos 51 5.2.11.4 Coeficiente de determinación 51 5.2.11.5 Análisis de los parámetros cinéticos estimados 51 5.2.12 VALIDACIÓN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS 51 5.2.12.1 MÉTODO GRÁFICO 52 5.2.12.2 MÉTODO MATEMÁ TICO 52
5.2.12.2.1 Factores de exactitud y bias 52 5.2.12.2.2 Porcentaje de Discrepancia y porcentaje de Sesgo o Bias 52 5.2.12.2.3 Prueba del Ji cuadrado 53 5.2.13 GENERA CIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EXTENDIDAS Y SU MODELACIÓN PRELIMINA R 53 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 54 6.1 GENERA CIÓN Y MODELA DO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIA NO EN CULTIVO INDIV IDUAL EN CALDO MRS 54 6.1.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL 54 6.1.2 SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 54 6.1.3 DESA RROLLO DE LOS MODELOS PRIMA RIOS 58 6.2 GENERA CIÓN Y MODELA DO DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIA NO EN CULTIVO MIXTO EN CALDO MRS 61 6.2.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO 61 6.2.2 DESA RROLLO DE LOS MODELOS PRIMA RIOS 63 6.3 DETERMINACIÓN DEL PÉRFIL DE pH DURA NTE EL CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL Y MIXTO DE LAS CEPAS BA CTERIA NAS 69
6.4 VALIDACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 72
6.4.1 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO INDIVIDUAL EN LECHE ENTERA UHT. 72 6.4.2 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO MIXTO EN LECHE ENTERA UHT. 74 6.4.3 VALIDA CIÓN DE LOS MODELOS DE CRECIMIENTO PREDICTIVOS DESARROLLADOS EN MRS. 77 6.4.3.1 Validación del modelo de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. 78 6.4.3.2 Validación del modelo de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. 82 6.4.3.3 Validación del modelo de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. 86
6.4.3.4 Validación del modelo de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. 87 6.5 MODELACIÓN PRELIMINAR DE CURVAS EXTENSAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO 93 6.5.1 CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS 93 6.5.1.1 Generación de curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en MRS 93 6.5.1.2 Determinación del perf il de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las cepas bacterianas en MRS 95 6.5.1.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cult ivo mixto en MRS 97 6.5.2 GENERA CIÓN DE CURVAS EXTENSAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO EN LECHE ENTERA UHT 103 6.5.2.1 Obtención de las curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT 103 6.5.2.2 Determinación del perf il de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las cepas bacterianas en leche entera UHT 105 6.5.2.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cult ivo mixto en leche entera UHT 105 6.6 DISCUSIÓN FINAL 112 6.6.1 ANÁLISIS COMPA RATIVO DEL COMPORTA MIENTO DE LOS PA RÁMETROS CINÉTICOS ENTRE LOS MODELOS EN MRS Y EN LECHE ENTERA UHT PARA CULTIVOS INDIVIDUALES Y MIXTOS 112 6.6.2 EVALUACIÓN DE LOS PA RÁMETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIV IDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN MRS 115 6.6.2.1 Tasas de crecimiento 116 6.6.2.2 Fase Lag 118 6.6.2.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada 119 6.6.3 EVALUACIÓN DE LOS PA RÁMETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN LECHE ENTERA UHT 122 6.6.3.1 Tasas de crecimiento 122
6.6.3.2 Fase Lag 124 6.6.3.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada 126 6.6.4 ANÁLISIS COMPA RATIVO DEL pH ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS Y EN LECHE ENTERA UHT A 37°C 129 6.6.5 A PROXIMA CIÓN AL MECA NISMO INHIBITORIO DE LAS BAL FRENTE A LAS PA TÓGENAS ESTUDIADAS 131 CONCLUSIONES 140 RECOMENDACIONES 142 REFERENCIAS 143 ANEXOS 152
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Características de algunos microorganismos y grupos de microorganismos relacionados con leche y derivados lácteos. 5 Tabla 2. Productos fermentados artesanalmente con BAL. 9 Tabla 3 Diferenciación de los principales géneros de BAL. 10 Tabla 4. Sincronización de cultivos para la generación de curvas de crecimiento con una extensión de 34 horas y 18 puntos de muestreo. 42 Tabla 5. Puntos de muestreo en cultivos sincronizados a 13 horas de desfase. 47 Tabla 6. Bondad de ajuste de los modelos predictivos para curvas de crecimiento en cultivo individual. 56 Tabla 7. Evaluación de la bondad de ajuste de los modelos predictivos. 57 Tabla 8. Bondad de ajuste del Modelo de Baranyi para curvas de crecimiento en cult ivo individual. 59 Tabla 9. Comparación del Modelo de Baranyi para el crecimiento en cult ivo mixto de L. plantarum y E. coli, L. plantarum y L. monocytogenes, L. paracasei y E. coli, y L. paracasei y L. monocytogenes. 64 Tabla 10. Parámetros cinéticos predichos por el modelo de Baranyi generado en MRS a 37°C para curvas de crecimiento en cult ivo individual y mixto. 78 Tabla 11. Validación del Modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. plantarum en cult ivo individual y mixto. 79 Tabla 12. Validación del Modelo en leche UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo mixto e individual. 83 Tabla 13. Validación del Modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de Crecimiento de E. coli en cultivo mixto e individual. 86 Tabla 14. Validación del Modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de Crecimiento de L. monocytogenes en cult ivo mixto e individual. 90 Tabla 15. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 98 Tabla 16. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultivos mixtos en leche UHT a 37°C. 107
Tabla 17. Comparación de parámetros cinéticos y pH obtenidos en caldo MRS versus los obtenidos en leche entera UHT. 112 Tabla 18. Coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cult ivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 116 Tabla 19. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 118 Tabla 20. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 120 Tabla 21. Coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cult ivos mixtos en leche entera UHT a 37°C. 123 Tabla 22. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en leche entera UHT a 37°C. 125 Tabla 23. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en leche entera UHT a 37°C. 126 Tabla 24. Evaluación del crecimiento de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS con diferentes valores de pH a 37°C por 24 horas. 132 Tabla 25. Verif icación de BLIS a partir de sobrenadantes de cult ivos mixtos de las BAL y las cepas patógenas estudiadas en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C por 24 horas. 135 Tabla 26. Resultados de verif icación de la producción de BLIS en MRS a 37°C 156 Tabla 27. Resultados de verif icación de la producción de BLIS en leche Entera UHT a 37°C 157 Tabla 28. Validación estadística del método modif icado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar). 160 Tabla 29. Estandarización de inóculos para la sincronización de cultivos paralelos. 163 Tabla 30 Resultado de los recuentos en placa para la validación estadística de las curvas de crecimiento bacteriano a partir de cultivos sincronizados. 165
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Formación de lactato por bacterias homofermentativas. 10 Figura 2. Fermentación de glucosa por bacterias heterofermentativas. 11 Figura 3. Curva de crecimiento típica para una población bacteriana en un sistema cerrado. 18 Figura 4. Modelo primario de crecimiento e identif icación de los parámetros más relevantes. 21 Figura 5. Modelo secundario de superficie de respuesta. 22 Figura 6. Interfase Pathogen Modelling Program. 23 Figura 7. Interfase Grow th Predictor. 23 Figura 8. Interfase ComBase Predictor. 24 Figura 9. Interfase Perfringens Predictor. 24 Figura 10. Criterios de búsqueda y resultados del ComBase Internet brow ser 25 Figura 11. Representación matemática de algunos modelos de crecimiento primarios. 26 Figura 12. Representación gráfica de algunos modelos de crecimiento primario. 27 Figura 13. Diagrama de f lujo del ensayo de verif icación de la producción de BLIS (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances) en BAL. 36 Figura 14. Diagrama de f lujo del ensayo de validación del método modif icado de recuento en placa (siembra en cuartos de placa). 41 Figura 15. Diagrama de f lujo del procedimiento 1 para la estandarización de inóculos. 44 Figura 16. Diagrama de f lujo del procedimiento 2 para la estandarización de inóculos. 45 Figura 17. Diagrama de f lujo del procedimiento 3 para la estandarización de inóculos. 46 Figura 18. Curvas de crecimiento en cultivo individual. 55
Figura 19. Ajuste a las curvas de crecimiento individual en caldo MRS a 37°C por el Modelo de Baranyi. 58 Figura 20. Curvas de crecimiento en cultivo mixto en caldo MRS a 37°C. 62 Figura 21. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cult ivo mixto de L. plantarum en caldo MRS a 37°C. 63 Figura 22. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cult ivo mixto de L. paracasei en caldo MRS a 37°C. 64 Figura 23. Curvas de crecimiento en cultivo mixto normalizadas en caldo MRS a 37°C. 68 Figura 24. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual y mixto en caldo MRS a 37°C. 70 Figura 25. Curvas de crecimiento en cultivo individual en leche entera UHT a 37°C. 73 Figura 26. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual generadas en leche entera UHT a 37°C. 74 Figura 27. Curvas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C. 75 Figura 28. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C. 77 Figura 29. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. 80 Figura 30. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. 81 Figura 31. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. 84 Figura 32. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. 85 Figura 33. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. 88 Figura 34. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. 89
Figura 35. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. 91 Figura 36. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. 92 Figura 37. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en caldo MRS a 37°C. 94 Figura 38. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en caldo MRS a 37°C con el comportamiento del pH. 96 Figura 39. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. plantarum durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 99 Figura 40. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. paracasei durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 100 Figura 41. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 101 Figura 42. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 102 Figura 43. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C. 104 Figura 44. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C con el comportamiento del pH. 106 Figura 45. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. plantarum durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 108 Figura 46. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. paracasei durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 109 Figura 47. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 110 Figura 48. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cult ivos mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 111
Figura 49. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C. 114 Figura 50. Modelos de crecimiento para cult ivos mixtos de L. plantarum y L. paracasei en asocio con L. monocytogenes en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C. 114 Figura 51. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de cepas patógenas en caldo MRS a 37°C. 121 Figura 52. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de BAL en caldo MRS a 37°C. 122 Figura 53. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de cepas patógenas en leche entera UHT 37°C. 128 Figura 54. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de BAL en leche entera UHT a 37°C. 128 Figura 55. Comportamiento del pH en cult ivos individuales y mixtos de las BAL en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. 129 Figura 56. Comportamiento del pH en cult ivos individuales y mixtos de las bacterias patógenas en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. 130 Figura 57. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultivos individuales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas. 133 Figura 58. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cultivos individuales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas. 134 Figura 59. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultivos individuales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas. 138 Figura 60. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cult ivos individuales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas. 139 Figura 61. Fotografía de los resultados de verif icación de la producción de BLIS. 154 Figura 62. Fotografías del método modif icado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar). 160 Figura 63. Relación entre el recuento celular y la densidad óptica (OD540) de cultivos de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en MRS a 37°C. 164
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 151
ANEXO 2. COMPOSICIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE ENTERA UHT 153
ANEXO 3. ESTA NDARIZACIÓN DE MÉTODOS - EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BLIS 154
ANEXO 4. ESTA NDARIZACIÓN DE MÉTODOS - VALIDACIÓN ESTA DÍSTICA DEL MÉTODO MODIFICA DO DE RECUENTO EN PLACA 159
ANEXO 5. ESTA NDARIZACIÓN DE MÉTODOS - VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS 162
ANEXO 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO MODIFICA DO DE RECUENTO EN PLA CA 167
ANEXO 7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA ESTA NDA RIZACIÓN DE INÓCULOS 168
ANEXO 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS 169
ANEXO 9. COMPARA CIÓN ESTADÍSTICA DE LA BONDAD DE AJUSTE DEL MODELO DE GOMPERTZ MODIFICA DO VERSUS LA DEL MODELO DE BA RANYI 170
ANEXO 10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE TASAS DE CRECIMIENTO 171
ANEXO 11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE FASES LAG 173
ANEXO 12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CONCENTRA CIÓN INICIAL 175
ANEXO 13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA MÁXIMA CONCENTRACIÓN ALCANZADA 176
ANEXO 14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL pH 177
ANEXO 15. VALIDACIÓN ESTADÍSTICA EN LECHE ENTERA UHT DEL MODELO GENERA DO EN CALDO MRS 178
ANEXO 16. VALIDACIÓN ESTADÍSTICA DE LA ECUACIÓN POLINOMIAL DE TERCER GRADO PA RA MODELACIÓN 179
1
1. INTRODUCCIÓN
La creciente globalización del comercio de alimentos y los cambios tanto en el estilo de vida
como en la alimentación de la población mundial, que conllevan a variaciones en la preparación
y en el procesamiento de los alimentos, han obligado a la agroindustria y a las autoridades en
general, a asumir posiciones más rigurosas frente a la industria alimentaria, pr iorizando en el control de calidad, y la seguridad e inocuidad de los alimentos. Según la Organización Mundial
de la Salud (OMS), la frecuencia de enfermedades por consumo de alimentos mal procesados o
contaminados podr ía ser entre 300 y 350 veces mayor a lo que los informes indican y se
considera que los alimentos son la mayor fuente de exposición a riesgos por presencia de
agentes patógenos en países desarrollados y en vía de desarrollo (FAO, 2006).
La OMS reporta 400 millones de casos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) por
año, con una incidencia signif icativamente mayor en países en desarrollo, siendo la falta de
educación, el mal estado nutricional de un alto porcentaje de sus habitantes (72%), sus
características culturales y las pobres condiciones higiénicas la causa de una mayor presencia
de ETAs en estos países. Sin embargo, las estadísticas de países industrializados muestran
que un 10% de sus pobladores puede padecer anualmente de una ETA, representando
actualmente un grave problema sanitario, económico y hasta político en muchos casos (NHI,
2005).
Aunque el conocimiento científ ico sobre los microorganismos patógenos asociados a alimentos
ha crecido marcadamente en los últ imos 16 años (McEntire, 2004), todav ía se requiere de
muchos estudios que permitan conocer el comportamiento de estos microorganismos dentro de
las operaciones de producción, procesamiento, distribución y almacenamiento de los alimentos
para poder generar estrategias de intervención y garantizar así su inocuidad.
Colombia no es ajena al panorama mundial y tanto Listeria monocytogenes como Escherichia
coli son actualmente un serio problema de salud pública que compete tanto a las autoridades
sanitarias como al sector agroindustrial de nuestro país. Estos dos patógenos ubicuos se han
2
aislado de leche cruda y pasteurizada, derivados lácteos, carnes crudas y procesadas,
vegetales y frutas (SIVIGILA, 2004).
Numerosos autores han propuesto el uso de f lora competitiva para garantizar la inocuidad de
alimentos como extrapolación de la condición observada en productos fermentados
artesanalmente (Gombas, 1989; Holzapfel et al., 1995; Schillinger et al., 1991, Savadogo et al.,
2004).
La interacción de microorganismos benéficos como las bacterias ácido lácticas (BAL), que
hacen parte normal de la microbiota de muchas matrices alimentarias o que son utilizadas como
cultivos iniciadores en productos fermentados y que además poseen propiedades antagónicas
con otras bacterias, pueden ser consideradas como excelente alternativa para inhibir el
crecimiento de patógenos a nivel industrial dentro del contexto de biopreservación o
bioconservación. Sus mecanismos de acción son la acidif icación del medio por producción de
ácido láctico, la producción otras sustancias inhibidoras como ácido acético, peróxido de
hidrógeno, bacteriocinas, acetaldehídos y dióxido de carbono, entre otras (Madigan et al.,1999).
Se reconoce que derivados lácteos fermentados artesanalmente garantizan su inocuidad por la
presencia de BAL. En Colombia, el Suero Costeño de alto consumo en la Costa Atlántica,
representa un ejemplo de interacción y competit ividad entre bacterias patógenas asociadas a la
leche y las BAL. Este derivado lácteo que se produce pr incipalmente a nivel artesanal, sin
buenas prácticas de manufactura, goza del aprecio de los consumidores por los beneficios que
aporta a su salud y nutrición (Rodr íguez, 1988).
Son varias las referencias que existen a nivel de inhibición de patógenos por BAL o sus
productos a través de experimentos reto. Por ejemplo, Kalalou et al. (2004) establecieron que
las BAL extendieron la vida útil de carne de camello picada a 22ºC. Lactobacillus acidophilus
inhibió el crecimiento de E. coli O157:H7 y Staphylococcus aureus en medio de cult ivo estándar
(Reilly y Gilliland, 1996). Murry et al. (2004) reportaron la inhibición en el crecimiento de E. coli,
Salmonella spp. y Clostridium spp. por la presencia de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus
salivarius. Sin embargo, son pocos los artículos existentes que estudian la dinámica de
poblaciones y la modelación de las interacciones en cultivos mixtos. Breidt y Fleming (1998)
modelaron el crecimiento competit ivo de L. monocytogenes y Lactococcus lactis en caldo de
vegetales. Leroy y De Vuyst (1999, 2003, 2004 y 2005) y Foegeding et al. (1992) modelaron la
interacción y reportaron la inhibición de crecimiento entre un cult ivo iniciador productor de
3
bacteriocinas en salchichón y su efecto sobre Listeria innocua y L. monocytogenes
respectivamente.
Pero no solo la bioconservación es tendencia mundial como alternativa al uso de compuestos
químicos para garantizar la seguridad e inocuidad de los alimentos. Especialmente en la última
década ha incursionado fuertemente la microbiología predictiva, que comprende el estudio
cuantitativo del comportamiento microbiano en alimentos y utiliza modelos matemáticos para
describirlo. Actualmente la microbiología predictiva, unida al Análisis de Riesgos y Puntos Cr íticos de Control (HACCP) y a la Evaluación Cuantitativa de Riesgo Microbiano (ECRM), hace
parte de este enfoque proactivo para asegurar la inocuidad alimentaria.
Del conjunto de modelos predictivos existentes, son muy pocos los que se enfocan en describir
el crecimiento simultáneo de cepas bacterianas en cultivos mixtos. Por lo tanto, la obtención de
más datos cuantitativos y el desarrollo de los modelos matemáticos que se proponen en este
trabajo, permit irán predecir el comportamiento microbiano en una matriz alimentaria (que para
este caso será leche entera UHT). De esta manera se podrá establecer el t ipo de interacción
entre BAL, reconocidas por sus propiedades biocontroladoras, y bacterias patógenas de origen
alimentario, reconociendo también, que los modelos predictivos, inicialmente empíricos, podrán
evolucionar hacia modelos explicativos en la medida que se identif iquen los factores que
determinen la predominancia de las bacterias biocontroladoras sobre las patógenas (Baranyi,
2004).
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE CRUDA
La leche por su pH, su actividad de agua y sus propiedades nutricionales constituye un alimento
completo para la dieta humana y al mismo tiempo permite el crecimiento de gran variedad de
microorganismos. La leche de vaca contiene agua (87%), grasa (3.9%), proteína (3.3%), lactosa
(4.5%) y minerales (0.9%) y es por lo tanto un excelente sustrato para bacterias y hongos (FAO,
2006). Asociados a este sustrato se encuentran microorganismos beneficiosos, como grupos
definidos de BAL y algunos hongos, que son útiles por su capacidad de generar derivados
lácteos con nuevas características organolépticas y f isicoquímicas. Sin embargo, existen
bacterias psicrótrofas y otras de tipo coliforme, que pueden deteriorar la calidad de la leche,
alterando su presentación y su contenido nutr icional. Adicionalmente, algunos microorganismos
pueden ser agentes causales de enfermedades en los consumidores como lo son E. coli,
Salmonella spp., Yersinia enterolitica, L. monocytogenes, S. aureus, Campylobacter jejuni,
Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis entre otros (Pelczar, 1999).
Teóricamente la leche deber ía salir estéril de la ubre, pero generalmente contiene de 100 a
10.000 bacterias/mL en buenas condiciones de operación. Estas bacterias pueden seguir
multiplicándose en la leche si no se aplican adecuadas prácticas de almacenamiento y
conservación (FAO, 2006). Las bacterias patógenas contaminan la leche por dos vías
principales: la vía externa (factores ambientales) y la v ía mamaria, en la que las bacterias se
adhieren a la piel de la ubre, ingresan por el canal del pezón o llegan a la leche directamente
por el torrente sanguíneo. Estas bacterias son: S. aureus, Streptococcus spp., coliformes como
E. coli y Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Clostridium spp., Bacillus spp. Por vía
descendente o hematógena lo hacen bacterias asociadas a enfermedades sistémicas del
animal (Salmonella spp., Brucella spp., Mycobacterium tuberculosis), las cuales tienen la
propiedad de movilizarse en la sangre y a través de los capilares mamar ios infectan la ubre
(Pelczar, 1999). En la Tabla 1 se presentan las principales características de los
microorganismos más relevantes asociados con mayor frecuencia en lácteos.
5
Tabla 1. Características de algunos microorganismos y grupos de microorganismos relacionados con leche y derivados lácteos.
Nombre Fuente Crecimiento
en leche cruda
Patogenicidad Alteración
Bacillus cereus Alimentación, estiércol, suelo, polvo ++ Intoxicación
alimentaria
Coagulación dulce, nata en
leche pasteurizada
Bacillus cereus y B. stearothermophilus
Alimentación, estiércol, suelo, polvo
++ Probablemente no Alteración de la leche esterilizada
Campylobacter jejuni Estiércol, agua + Desórdenes intestinales
No
Clostridium botulinum Suelo, agua contaminada - Botulismo No
Coliformes Heces, utensilios de ordeño, agua contaminada ++
Mastitis, desórdenes intestinales
Alteración de la leche y el queso
Corynebacterium bovis Canal del pezón + No No
Corynebacterium pyogenes
Interior de la ubre, moscas + Mastitis Casi nunca
Lactobacillus spp. Utensilios de ordeño, leche en cántaras, sala de ordeño
++ No Acidif icación de la leche
Lactococcus lactis Utensilios de ordeño, leche en cántaras, sala de ordeño
++ No Acidif icación de la leche
Listeria monocyotgenes Suelo, alimentación + Listeriosis No
Microbacterium lacticum Utensilios de ordeño + No
Crece en productos
pasteurizados
Micrococcus spp. Canal del pezón, piel, sala de ordeño, utensilios de
ordeño + Probablemente no
Crece en productos
pasteurizados
Mohos Polvo, superficies sucias, alimentación +/- Algunos producen
toxinas Alteraciones en
queso, mantequilla
Mycobacterium tuberculosis
Enfermedad de la vaca o del ordeñador - Mastitis,
tuberculosis No
Psicrótrofos (Pseudomonas)
Utensilios de ordeño, leche ref rigerada, agua
contaminada ++ Ocasionalmente
Hidrolizan las proteínas y la
grasa de la leche ref rigerada
Salmonella, Shigella Estiércol, agua contaminada +
Desordenes intestinales,
mastitis No
Staphylococcus aureus
Canal del pezón, interior de la ubre, piel, ordeñador
enf ermo ++
Intoxicación alimentaria,
mastitis, úlceras Casi nunca
Staphylococcus epidermidis
Canal del pezón, piel, sala de ordeño
++ Probablemente no Casi nunca
Streptococcus agalactiae, , S.
pyogenes, S. uberis
Interior de la ubre, sala de ordeño ++ Mastitis Acidif icación
Vibrio cholerae Agua contaminada, ordeñador enfermo
- Cólera No
Virus Vaca, humanos, sala de ordeño
- Muchos si lo son No
Levaduras Polvo, utensilios de ordeño +/- No Alteran el queso, mantequilla, leche
condensada Fuente: Beerens, H., Luquet, F.M. 1990. Guía práctica para el análisis microbiológico de la leche y los productos lácteos. Acribia, Zaragoza.
6
La leche también puede ser contaminada post-ordeño a través del medio externo (aire, agua,
suelo y estiércol, utensilios, equipos, manipuladores, tanques de almacenamiento y transporte)
con patógenos y/o f lora deter iorativa siendo las bacterias más comunes: Micrococcus spp.,
Streptomyces spp., Pseudomonas spp., Alcaligenes spp., Flavobacterium spp.,
Chromabacterium spp., Bacillus spp., Clostridium spp., E. coli, L. monocytogenes, S. aureus,
Streptococcus spp. (Ekici et al., 2004).
2.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Las BAL son generalmente Gram positivas, aerobias facultativas, que requieren de aminoácidos
específ icos, vitaminas del complejo B y de otros factores de crecimiento para un adecuado
desarrollo en medios de cultivo estándar. No utilizan hidratos de carbono complejos y en su
mayor ía no presentan reducción de nitratos ni producción de catalasa (Boone, 2001).
Según el criterio taxonómico y f ilogenético existen reportados 12 géneros de BAL: Lactobacillus,
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Vagococcus,
Aerococcus, Alloicoccus, Tetragenococcus, Carnobacterium y Weisella. Los géneros
Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus y Leuconostoc se utilizan generalmente como
cultivos lácticos iniciadores y el género Enterococcus puede encontrarse en algunos cultivos
iniciadores mixtos por su capacidad para desarrollar aromas, sabor y textura en productos
lácteos (Fox et al., 2000).
Las BAL presentes en diversos sustratos naturales como Lactococcus spp., Lactobacillus spp.,
Leuconostoc spp., Streptococcus spp. y Pediococcus spp., han sido utilizadas desde principios
de la civilización como un método empírico para la conservación de alimentos (Boone, 2001).
Las BAL conocidas como GRAS (“generally regarded as safe”) (NHI, 2005), comunes en la
fermentación de productos de origen animal y vegetal, inhiben el crecimiento de otras bacterias,
entre ellas importantes patógenos asociados a alimentos, sin generar resistencias múltiples
como ocurre con los antibióticos tradicionales. Este mecanismo antagónico por parte de las
BAL, se debe a la producción de una serie de metabolitos, como ácido láctico y acético,
peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, etanol, entre otros, que interf ieren con el metabolismo y el
desarrollo de las bacterias, favoreciendo de esta manera la conservación de los alimentos
(Rabel, 2003). Un ejemplo de esta interacción lo constituyen los productos tradicionales
fermentados, como el Suero Costeño, que aunque son producidos casi siempre bajo pobres
condiciones higiénicas, por la presencia de las BAL garantizan su inocuidad (Rodr íguez, 1988).
7
Debido a sus características fermentativas y antagónicas, las BAL han adquirido recientemente
un fuerte interés por parte de la industria alimentaria, para su aplicación en procesos de
biopreservación, como cultivos biocontroladores de f lora deteriorativa y patógena. Estas
condiciones, además de incrementar la vida comercial y la seguridad microbiológica de los
alimentos, traen beneficios para la salud, por sus propiedades probióticas, ampliamente
reconocidas (Rabel, 2003).
En general las BAL son más resistentes a medios ácidos que la mayoría de las bacterias, creando para sí un entorno favorable en distintas matrices. Por eso, en presencia de BAL la
producción de ácidos orgánicos y de bacteriocinas, así como pH bajos pueden afectar el
crecimiento de otros microorganismos en cultivos mixtos. Las propiedades inhibitorias de los
ácidos orgánicos, como el ácido láctico, están asociadas a las formas protonadas que no están
cargadas eléctricamente y pueden atravesar biomembranas y por tanto, la inhibición resultante
puede deberse a acidif icación del citoplasma y/o acumulación de aniones ácidos dentro de la
célula (Zalán, 2005).
Las bacteriocinas son péptidos de síntesis ribosomal que se caracterizan por tener
generalmente un espectro de inhibición reducido y no generar respuesta de resistencia
microbiana; éstas en comparación con los antibióticos no se utilizan en el tratamiento de
enfermedades (Montville y Chen, 1998). Según Garneu et al. (2002), las bacteriocinas se
clasif ican en cuatro clases: las de la clase I o lantibióticos, contienen aminoácidos poco
comunes como lantionina, b-metil-lantionina y dihidroalanina, que se forman debido a
modif icaciones posteriores al proceso de la traducción. La formación de aminoácidos no
comunes se explica por la deshidratación de los aminoácidos serina y treonina, con la posterior
adición de los átomos de azufre de la cisteína, a los dobles enlaces de los
deshidroaminoácidos. Un ejemplo bien conocido de estas bacteriocinas es la nisina.
La clase II o no lantibióticos de las bacteriocinas, está constituida por pequeños péptidos (<10
kDa) estables al calor, con actividad inhibitoria comprobada contra L. monocytogenes. Dentro
de esta clase, las bacteriocinas más estudiadas son: pediocina, sakacina, mesentericina y
lactacina (Cheng y Hoover, 2003a). La clase III está conformada por péptidos grandes, mayores
a 30 kDa, los cuales, por ser termolábiles, son de poco interés a nivel industrial. Dentro de este
grupo se encuentran principalmente las helveticinas J y V. Existe otro grupo de bacteriocinas
agrupadas en la clase IV, que aunque es poco estudiado, se sabe que se encuentra constituido
por proteínas mixtas asociadas a lípidos o a carbohidratos (Garneu et al., 2002).
8
Se sugiere que las clases I y II de las bacteriocinas son las más efectivas contra patógenos en
alimentos y comparten mecanismos de acción semejantes. Al parecer, los péptidos se unen a la
membrana citoplasmática a través de uniones electrostáticas con los fosfolípidos cargados
negativamente, luego se insertan a la membrana con una reorientación que depende del
potencial de membrana, el cual esta influenciado por el pH y la composición fosfolipídica.
Los monómeros de bacteriocina forman agregados proteicos que resultan en la formación del
poro con la consecuente salida de iones (principalmente potasio y magnesio), pérdida de la fuerza motriz de protones (FMP) , salida de A TP y aminoácidos. La fuerza motriz de protones
juega un papel central en la síntesis de ATP, en el transporte activo y el movimiento bacteriano,
por lo tanto, se inhibe la s íntesis de macromoléculas y la producción de energía dando como
resultado la muerte celular (Cheng y Hoover, 2003b).
2.2.1 Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum es un bacilo alargado, Gram positivo, que presenta bordes
redondeados y generalmente se agrupa en pares o en cadenas cortas. Crece en agar MRS
(Anexo 1) formando colonias redondas, lisas, color crema, con una temperatura óptima de
crecimiento entre 30 y 42ºC y un rango de pH para desarrollo entre 4 y 7. Ha sido aislado de
diferentes ambientes incluyendo suelos, ensilados, productos de consumo diario como lácteos,
vegetales frescos y especias, y también del tracto gastrointestinal de algunos animales (Boone,
2001). Esta bacteria presenta un catabolismo homofermentativo (ver numeral 2.2.3) y muchas
de sus cepas son productoras de bacteriocinas (plantaricinas, lactolinas y pediocinas) con
actividad inhibitoria reconocida frente a L. monocytogenes (Loessner et al., 2003).
En caldo MRS (Anexo 1), L. plantarum crece de forma exponencial por alrededor de 8 horas y
antes de entrar a la fase estacionaria presenta una fase de desaceleración de dos horas
aproximadamente. Hacia la mitad de la fase logar ítmica ocurre la principal acumulación de
ácido láctico y después de 24 horas de cultivo, con una OD570 (densidad óptica) cercana a dos
se puede establecer que esta acumulación es de 1.2% (Vamanu et al., 2005).
2.2.2 Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei es un bacilo alargado Gram positivo, de bordes cuadrados con
tendencia a agruparse en cadenas, que presenta una morfología macroscópica (en agar MRS)
9
muy similar a la de L. plantarum aunque con colonias más transparentes. Su temperatura
óptima de crecimiento se encuentra entre 25 y 37°C, con rangos de pH entre 3.5 y 6.0, siendo
los productos lácteos su principal fuente de aislamiento (Boone, 2001). También hace parte de
las BAL homofermentativas y sus propiedades probióticas son ampliamente reconocidas porque
tiene la capacidad de degradar oligofructosa e inulina de cadena larga, favoreciendo así la
función intestinal (Mackras et al., 2005). Sin embargo, sus propiedades antagónicas han sido
poco estudiadas, pero se han reportado sus efectos inhibitorios frente a cepas de E. coli en
quesos manufacturados artesanalmente (Caridi, 2002).
2.2.3 FERM ENTACIÓN ÁCIDO LÁCTICA
Las BAL obtienen su energía a partir de la fermentación de azúcares y de compuestos
relacionados fermentables, por lo que su crecimiento se limita generalmente a hábitats ricos en
azúcares; y como su capacidad biosintética es reducida, requieren de medios de cultivo
complejos con factores de crecimiento espec íf icos para su óptimo desarrollo (Boone, 2001).
Especialmente en países subdesarrollados son muchos los productos fermentados
artesanalmente por BAL, las cuales son las responsables de su sabor, estabilidad e inocuidad
microbiológica. La Tabla 2 presenta algunos ejemplos de productos artesanales producidos con
BAL alrededor del mundo.
Tabla 2. Productos fermentados artesanalmente con BAL.
Región Productos lácteos Cereales y v egetales fermentados
Carnes fermentadas
Países de occidente Yogurt, queso Sauerkraut, pepinil los, olivas, masa ácidas, encurtidos Salami, jamones
Países del medio oriente
Tofú Encurtidos
Korea Kimchi Russia Kefir
Egipto Laban rayab, laban zeer Kishk
Nigeria Gari África del Sur Magou
Tailandia Nham Filipinas Balao balao México Pulque Pozol, colonche
Colombia Suero Costeño
Fuente: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) 1998. Revista del Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del Consumidor
10
Dentro de las BAL se diferencian dos grupos: el grupo de bacterias homofermentativas que sólo
producen ácido láctico y el grupo de las heterofermentativas que además de ácido láctico
producen otros compuestos, principalmente etanol y dióxido de carbono (Tabla 3). Los géneros
homofermentativos (Figura 1) producen más de 85% de ácido láctico a partir de glucosa (1.8
moles de ácido láctico por mol de glucosa) y los géneros heterofermentativos (Figura 2) solo
alrededor de 50% (1 mol de ácido láctico por mol de glucosa) (Eck, 1990; Stanley, 1998). Las
diferencias observadas en los productos de fermentación están determinadas por la presencia o
ausencia de la enzima aldolasa (enzima clave en la glucólisis), siendo las heterofermentativas las que carecen de aldolasa y su patrón de fermentación está marcado por la fosfocetolasa.
Tabla 3. Diferenciación de los principales géneros de BAL.
Género Forma celular y organización Fermentación Streptococcus spp. Cocos en cadena Homof ermentativ a
Leuconostoc spp. Cocos en cadena Heterof ermentativ a
Pediococcus spp. Cocos en tétradas Homof ermentativ a
Lactobacillus spp. Bacilos normalmente en cadena Homof ermentativ a Heterof ermentativ a
Enterococcus spp. Cocos en cadena Homof ermentativ a
Lactococcus spp. Cocos en cadena Homof ermentativ a
Fuente: Madigan et al., 1999. Brock Biología de los microorganismos. Octava edición rev isada. Prentice Hall Iberia. Madrid.
Figura 1. Formación de lactato por bacterias homofermentativas. La ruta metabólica usada es idéntica a la glucólisis. El producto final es el lactato el cual es excretado por las células al ambiente. Fuente: Paustian, T. 2000. Metabolism and Fermentation. University of Wisconsin - Madison http://dwb.unl.edu.
11
Figura 2. Fermentación de glucosa por bacterias heterofermentativas. En esta ruta metabólica no es util izada la vía de la glucólisis. Sólo un ATP es generado por glucosa fermentada. Fuente: Paustian, T. 2000. Metabolism and Fermentation. Univ ersity of Wisconsin - Madison http://dwb.unl.edu.
2.3 Escherichia coli
Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, f lagelado, no esporulado, oxidasa negativo y
anaerobio facultativo, cuyo rango óptimo de temperatura es de 22 a 37ºC (Boone, 2001).
Presenta una marcada tolerancia a ambientes adversos incluyendo pH ácidos y bajas
concentraciones de humedad. Se ha demostrado también que puede sobrevivir a los procesos
de fermentación, secado y almacenamiento a 4°C en salchichas fermentadas con pH menor de
4.5 por más de dos meses (Glass et al., 1992).
Normalmente E. coli hace parte de la microflora del tracto intestinal de humanos y animales de
sangre caliente, por lo que la mayoría de las cepas son consideradas inocuas. Sin embargo,
algunas patogénicas son responsables de causar enfermedades diarreicas que pueden ser
autolimitantes o pueden conllevar a serias complicaciones. En la actualidad se reconocen cinco
variedades enteropatógenas de E. coli: cepas enterotoxigénicas (ECET), enteroinvasivas
(ECEI), enteropatógenas clásicas (ECEP) , enterohemorrágicas (ECEH) y enteroagregativas
12
(ECEAgg). Dos de estas categorías reciben una atención especial por parte de la Organización
Mundial de la Salud (OMS): ECET ya que per se o asociada a rotavirus, ocasiona el 80% de los
casos de enfermedad diarreica aguda (EDA) a nivel mundial (Escartin, 2000).
En algunas regiones del mundo la EDA constituye la tercera parte de los ingresos en los
hospitales. Esta situación resulta más dramática en los países en vías de desarrollo, donde esta
enfermedad constituye la principal causa de mortalidad (Riverón, 1992). ECEH constituye la
otra categoría priorizada, en este caso, debido a su potencial letalidad, al estar asociada a cuadros clínicos de mayor riesgo para la salud humana como son la colitis hemorrágica y el
síndrome urémico hemolít ico (Boyce et al., 1995; Barreto et al., 1998; 1999; Nataro y Kaper,
1998). Por otro lado, ECEH está considerado dentro de los agentes zoonóticos cuya presencia
se ha incrementado en este siglo (Martínez, 1999).
La supervivencia de E. coli en medios no entéricos es muy limitada por lo que su presencia en
alimentos listos para el consumo se relaciona directamente con mala manipulación a lo largo de
la cadena de producción o con contaminación reciente. Por esta razón se utiliza como indicador
de contaminación fecal de los productos (Escartin, 2000).
2.4 Listeria monocytogenes Las listerias son bacilos f lagelados, Gram positivos que tienen un metabolismo aeróbico y
anaerobio facultativo, produciendo ácido láctico a partir de la fermentación de glucosa. Son
oxidasa negativos, producen ß-D-galactosidasa, no reducen nitratos y no hidrolizan caseina.
Son catalasa posit ivos pero pueden dar reacciones negativas cuando crecen en medios de
cultivo con concentraciones bajas de carne o de extracto de levadura (Boone, 2001).
El género Listeria esta distribuido ampliamente en la naturaleza: t ierra, barros, agua, aguas
residuales, ensilados, vegetales, carnes crudas, heces de animales y personas sanas. La
temperatura óptima para su crecimiento está entre 30 y 37ºC aunque pueden crecer a
temperaturas entre 0.4 y 45ºC, sobreviviendo a condiciones de congelación. Las listerias crecen
mejor a pH neutros y por lo general mueren a pH inferiores a 4.6. Sin embargo, su capacidad
para crecer en pH bajos, está influenciada por el tipo de acidulante, donde los ácidos orgánicos
son más los más inhibidores debido a su naturaleza lipofílica (Escartin, 2000).
13
Listeria monocytogenes es un patógeno emergente causante de la listeriosis y cuya transmisión
se da principalmente a través de alimentos contaminados. Tiene la particularidad de crecer en
diferentes ambientes y está ampliamente distribuido en la naturaleza por lo que se considera
ubicuo (Chae, 2000). Es capaz invadir células de mamíferos y propagarse a nivel intracelular
causando serias complicaciones que van desde abortos, desarrollo de meningoencefalitis y
hasta la muerte. Cualquier individuo está expuesto a este tipo de infecciones, pero en especial
las personas altamente susceptibles (mujeres embarazadas, recién nacidos, adultos mayores e
inmunosuprimidos), son las que presentan cuadros de mayor severidad (NIH, 2005).
Cerca de 75 millones de casos reportados por ETAs resultan en 32.5000 hospitalizaciones y
sólo en Estados Unidos se han reportado aproximadamente 5.000 muertes al año por este tipo
de infecciones (NIH, 2005). Se ha estimado un total de 2.500 casos de listeriosis por año,
siendo esta enfermedad la de mayor mortalidad dentro del grupo de las ETAs. En los casos
reportados de listeriosis, el 90% requiere de hospitalización, el 20% resulta en muerte y entre el
10 y el 30% de los sobrevivientes presentan enfermedad residual con afecciones neurológicas
(Escartin, 2000).
Listeria monocytogenes es un bacilo Gram posit ivo, móvil y de distribución universal en la
naturaleza. Una de las pr incipales características de L. monocytogenes es la capacidad de
adaptación y supervivencia en superficies de contacto con los alimentos, convirtiéndose en un
foco silencioso de contaminación (Tompkin, 2005). También puede sobrevivir a procesos de
congelación, a altas concentraciones de sal y en algunos casos al calor, siendo los alimentos
listos para el consumo y los manufacturados sin altos estándares de calidad los más
susceptibles a su contaminación (Cutter y Henning 2003).
2.5 MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
La industria moderna de alimentos está siendo sometida a grandes cambios debido a la
demanda de los consumidores por adquirir alimentos inocuos, sanos, nutrit ivos, naturales y
mínimamente procesados. Estos requerimientos por parte de los consumidores exigen un
mayor conocimiento del comportamiento de los microorganismos en los diferentes sistemas
alimentarios y hacen que sean necesarias estrategias rápidas y proactivas para evaluar el riesgo microbiológico y poder producir alimentos microbiológicamente seguros (Schillinger,
1996).
14
La microbiología predictiva comprende el estudio cuantitativo del comportamiento microbiano en
alimentos. En función de los factores determinantes (intr ínsecos, extrínsecos, implícitos o de
elaboración y tratamiento) describe el crecimiento o inhibición de microorganismos en
alimentos. Este conocimiento objetivo y cuantitativo de la respuesta microbiana permite
entonces predecir el comportamiento de los microorganismos durante las operaciones de
procesado, distribución y almacenamiento mediante modelos matemáticos con base en
parámetros físico-químicos relevantes. La microbiología predictiva constituye, por lo tanto, un
enfoque interdisciplinario en el que se conjugan la microbiología, la matemática, la estadística, la tecnología de alimentos y de sistemas con el objeto de describir por medio de ecuaciones
matemáticas la respuesta de los microorganismos frente a combinaciones de condiciones
ambientales definidas y controladas (Cayré et al., 2004).
La microbiología predictiva de gran progreso, fortalecimiento y expansión en las últ imas
décadas es utilizada como soporte en sistemas de seguridad alimentaria como son HACCP y
ECRM dentro de los términos del objetivo de seguridad del alimento, OSA (Objetivo de
Seguridad Alimentario, Food Safety Objective, FSO) ( ICMSF, 1997, 1998, 2002). Sin embargo,
son pocos los estudios que se encuentran sobre cuantif icación de interferencia tipo
amensalismo o competición entre microorganismos. En la base de datos de ComBase
(Combined Database of Microbial Responses to Food Environments) se encontraron algunos
trabajos de investigación relacionados con el tema de este estudio (ComBase, 2006); sin
embargo en ninguno de ellos se realizaron cultivos mixtos con las BAL, L. plantarum y L.
paracasei, y la cepas patógenas, E. coli y L. monocytogenes.
Los datos encontrados para E. coli, se refieren en su mayoría a la respuesta bacteriana frente a
diferentes factores ambientales y cómo éstos influyen en el crecimiento del microorganismo. Ogw aro et al. (2002) determinaron la supervivencia de E. coli O157:H7 (ATCC 43888) en yogurt
fermentado artesanalmente por un cultivo mixto de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus
(NCIMB 11778) y Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (NCIMB 110368). Rash et al.
(1982) evaluaron el crecimiento de cepas de E. coli enteropatogénicas en queso Camembert
elaborado con leche ultrafiltrada, utilizando una cepa de Penicillium candidum como cultivo
iniciador. Similar a este estudio, Arocha et al. (1992) evaluaron el comportamiento de E. coli
enterohemorrágica O157:H7 en queso Cottage con un 4% de cultivo iniciador, mientras que
Feresu y Nyati (1990) evaluaron la viabilidad cepas de E. coli patógenas y persistencia de E.
coli O157:H7 en productos de fermentación diaria como mantequillas caseras.
15
Riordan et al. (2000) evaluaron el efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento de E. coli
O157:H7 en pepperoni. En un trabajo similar, Faith et al. (1997) determinaron la viabilidad de E.
coli O157:H7 durante la manufactura de pepperoni, teniendo en cuenta variables como la
atmósfera modif icada en el empaque al vacío. Clavero y Beuchat (1996) determinaron la
supervivencia de E. coli O157:H7 en salami procesado, evaluando el efecto del pH, la actividad
de agua y la temperatura e el desarrollo del patógeno.
Por otro lado, en estudios relacionados con el crecimiento de L. monocytogenes a nivel de industria alimentar ia, se encontraron varios trabajos relacionados con la inhibición competit iva
pero solo unos cuantos generaron modelos predictivos. Buchanan et al. (1997) evalúan la
efectividad de Carnobacterium piscicola LK5 para controlar el crecimiento de L. monocytogenes
Scott A en alimentos refrigerados. Jeppesen y Huss (1993) determinaron la actividad
antagónica de dos BAL contra L. monocytogenes y Y. enterocolitica en pescados refrigerados
a 5°C. Así mismo, Amezquita y Brashears (2002) evaluaron la inhibición competitiva de L.
monocytogenes en alimentos listos para el consumo por bacterias ácido lácticas y Schillinger et
al. (2001) evaluaron la eficacia de la nisina en combinación con cult ivos protectores contra L.
monocytogenes Scott A en tofú.
Se han realizado diferentes estudios para evaluar el crecimiento de L. monocytogenes en
productos cárnicos entre los cuales está el realizado por Duffy et al. (1994) quienes analizaron
el comportamiento de L. monocytogenes en presencia de L. innocua durante el
almacenamiento de f iletes de carne a 0 y a 10°C empacados al vacío. Katla et al. (2002)
evaluaron la inhibición de L. monocytogenes en pollo por adición de sakacina P y Lactobacillus
sakei productor de sakacina P. Barakat y Harris (1999) determinaron el crecimiento de L.
monocytogenes y Y. enterocolitica sobre carme cocida empacada en atmósfera modif icada en
presencia y ausencia de microbiota normal. Porto et al. (2002) establecieron la viabilidad de
cinco cepas de L. monocytogenes en salchichas empacadas comercialmente y preparadas con
y sin lactato de potasio al 2 y al 3%. Adicional a estos trabajos, Degnan et al. (1992) aplicaron
una cepa de Pediococcus acidilacti para controlar L. monocytogenes en beefs empacados.
Beumer et al. (1996) evaluaron el crecimiento de Listeria monocytogenes sobre tajadas de pollo
y carne procesados. Mano et al. (1995) determinaron el crecimiento y/o supervivencia de f lora
natural y L. monocytogenes sobre porciones de pavo y cerdo refrigeradas y empacadas bajo
atmósfera modif icada.
16
En cuanto a estudios relacionados con generación de modelos, Giménez y Dalgaard (2004)
modelaron el crecimiento simultáneo de L. monocytogenes y microorganismos deteriorativos en
salmón ahumado y propusieron una forma diferencial del modelo logístico. El crecimiento
simultáneo de E. coli O157:H7 y la microflora natural de la carne molida fue modelado por
Vimont et al. (2006) con un enfoque lineal de curvas fragmentadas. Breidt y Fleming (1998)
abordaron la modelación del crecimiento interactivo entre L. monocytogenes y Lactococcus
lactis en caldo de vegetales con un modelo dinámico de índole pseudo-mecanístico que
involucra el efecto del ácido láctico y el pH sobre el crecimiento de cult ivos en competencia. 2.5.1 INTRODUCCIÓN A LOS MODELOS PREDICTIVOS
La microbiología predictiva se construye a partir de las premisas de igualdad en la respuesta de
los microorganismos ante los mismos factores condicionales relevantes y de reconocer que el
efecto de estos factores puede predecirse por modelos matemáticos derivados de estudios
cuantitativos en poblaciones microbianas (Baranyi y Roberts, 1994).
El desarrollo de modelos predictivos contempla varias fases secuenciales entre las que se
encuentran el diseño experimental, la obtención sistémica de los datos experimentales, la
descripción matemática, la validación y el mantenimiento del modelo. Un buen diseño
experimental es fundamental para el desarrollo de los modelos, los cuales deben ser lo más
simples posible para su fácil aplicación. Este diseño contempla la definición de las
características relacionadas con las variables independientes y dependientes, el inóculo y el
modelo experimental. De esta forma, el comportamiento microbiano está determinado
básicamente por tres a cinco factores relevantes (variables independientes): temperatura, pH,
actividad de agua, atmósfera y/o presencia de inhibidores. Sin embargo, otros factores
particulares que influyen sobre el comportamiento microbiano deben ser identif icados para su
posterior inclusión en los modelos (Zw ietering, 1990).
En el área de la microbiología predictiva la variable dependiente inicialmente es la respuesta
primaria correspondiente a los cambios de concentración en una población microbiana en
función del tiempo (McMeekin et al., 1997). El resultado de este seguimiento son las llamadas
curvas de crecimiento o de inactivación de las cuales se pueden derivar los respectivos
parámetros cinéticos de crecimiento o inactivación (Zw ietering, 1990).
17
La curva de crecimiento microbiano en un sistema cerrado (como es un alimento) presenta tres
fases definidas (Zwietering, 1990). Una fase inicial, la fase lag, de latencia o de adaptación en la
que la tasa de crecimiento parte de cero y comienza a acelerarse durante cierto periodo de
tiempo. Durante esta fase, las células microbianas se adaptan f isiológicamente a su nuevo
ambiente llevando a cabo procesos de síntesis o de reparación si es el caso. La extensión de
esta fase depende del ambiente y del estado f isiológico de la población microbiana.
En la siguiente fase, la fase log, se alcanza la máxima tasa de crecimiento caracterizada por un crecimiento exponencial constante. A la tercera fase, la fase estacionaria, la antecede una
etapa de transición llamada de desaceleración que se caracteriza por una reducción gradual de
la tasa de crecimiento debido a limitación de nutrientes y/o a concentración de productos
tóxicos. Durante la fase estacionaria se alcanza el máximo número de microorganismos posible
y no se observa crecimiento neto, representando así la capacidad de soporte para el ambiente
en particular. Adicionalmente, durante el crecimiento microbiano también puede observarse una
fase f inal de decrecimiento o muerte (Zw ietering, 1990).
Así, cuando la curva de crecimiento se define por el logaritmo del número de organismos
presentes en una muestra determinada, a través del tiempo, estos cambios en la tasa de
crecimiento resultan en una curva sigmoidal (Zw ietering, 1990), como se presenta en la Figura
3.
Para efectos de modelación en el contexto de la microbiología predictiva las fases relevantes
las constituyen generalmente la fase lag y de crecimiento exponencial. Sin embargo, la fase
estacionaria y luego la fase de muerte pueden proveer información adicional para entender el
comportamiento microbiano en relación con los factores ambientales asociados a un alimento
en particular y para conocer el tipo de interacción con otras poblaciones microbianas
(Zw ietering, 1990).
La mayoría de los modelos describen el crecimiento o la inactivación de una sola cepa
microbiana, por tanto, para la generación de modelos de crecimiento seguros o conservadores,
se deben seleccionar cepas con la tasa de crecimiento más rápida y para modelos de
inactivación con las mismas características anteriores, las cepas más resistentes a los
tratamientos o condiciones de inhibición y en fase estacionaría como estado f isiológico más
resistente a condiciones de estrés (Baranyi y Roberts, 1994).
18
Figura 3. Curv a de crecimiento típica para una población bacteriana en un sistema cerrado. Fuente: Adaptada de Tullmin, M. 2001. Water Pages. Corrosion Club. www.corrosion-club.com/waterbactgrowth.htm.
En la actualidad se tiende a trabajar sobre la generación de modelos iniciados con cultivos
mixtos (cócteles de múltiples cepas microbianas) que representarían el peor escenario. La
mayor parte de los modelos de crecimiento utilizan como inóculo, cultivos de 18 a 14 horas en
caldo nutritivo y temperatura de crecimiento favorable, pero siempre se deben utilizar inóculos
estandarizados para garantizar así la reproducibilidad experimental. En general, el tamaño del
inóculo parece no afectar la velocidad de crecimiento ni la concentración de microorganismos
máxima posible. Pero si puede afectar la duración de la fase lag dependiendo de la metodología
de cuantif icación a emplear y por lo tanto de la variable de respuesta a ser modelada
(McMeekin et al., 1997).
En la microbiología predictiva se utilizan métodos de cuantif icación directos e indirectos. Los
métodos directos distinguen y cuantif ican individualmente los microorganismos mientras que los
indirectos miden alguna propiedad de la población microbiana. En el caso de los métodos
indirectos se requiere de una curva de calibración para poder relacionar la propiedad
cuantif icada con la concentración de microorganismos. El método de cuantif icación preferido
para el desarrollo de modelos predictivos es el recuento en placa, ya que una de las ventajas de
Fase Lag
Fase Exponencial
Fase Estacionaria
Fase de Muerte
Tiempo
Log UFC/mL
19
este método frente a otros, es que su límite mínimo de detección es inferior a 20 unidades
formadoras de colonia (UFC) por mL (Zw ietering, 1990).
En la actualidad se han desarrollado ya un buen número de modelos para describir el
crecimiento de microorganismos (patógenos y deteriorantes de alimentos), generalmente en
cultivo individual, en caldos óptimos para su crecimiento y en matrices simuladoras de alimentos
y en alimentos. De la misma manera se han generado modelos que describen la inactivación o
inhibición microbiana frente a diferentes condiciones de tratamiento (Baranyi y Roberts, 2004).
De acuerdo al tipo de curva, “crecimiento o sobrevivencia”, los modelos aplicados pueden
provenir de diferentes enfoques. Estos pueden ser modelos lineales, modelos no lineales o
modelos de distribución (McKellar y Lu, 2004). Ecuaciones como la logística, Gompertz
modif icado, Baranyi y Richards (Baranyi 1993) son funciones sigmoidales de uso frecuente que
describen de forma adecuada el crecimiento de microorganismos (número de células versus
tiempo) y la inactivación cuando se utilizan de forma inversa. También se encuentran algunas
aplicaciones de modelos dinámicos basados en ecuaciones diferenciales. Dentro de los pocos
estudios que describen el crecimiento de cultivos mixtos (BAL con diferentes patógenos como L.
monocytogenes), Breidt y Fleming (1998) proponen este t ipo de ecuaciones.
De forma general los modelos predictivos se construyen a partir de sistemas modelo (entorno
controlado) para luego ser validados en su propósito. La validación es una etapa importante en
el desarrollo de los modelos ya que ésta determina su aplicabilidad en alimentos (McMeekin et
al., 1997). En un proceso de validación las predicciones hechas por el modelo se comparan con
datos observados independientes provenientes de una matriz alimentar ía. Un modelo validado
debe predecir de forma consistente en la zona de seguridad. Por lo tanto, un modelo de
crecimiento para patógenos, debe ligeramente sobreestimar o idealmente coincidir exactamente
con las observaciones reales y para el caso de un modelo de inactivación, éste debe subestimar
ligeramente los datos experimentales de sobrevivientes (McKellar y Lu, 2004). La falta de
conocimiento de factores relevantes en los alimentos son los que realmente ocasionan la
inexactitud de algunos modelos. Los modelos pueden someterse a diferentes niveles de
validación. Se puede conducir una validación a partir de datos experimentales independientes a
los que se utilizaron para generar el modelo y también se pueden validar usando datos
experimentales provenientes de la literatura. Sin embargo, la validación más confiable es la
realizada sobre la propia matriz alimentaria, recolectando sistemáticamente datos
experimentales y evaluando el desempeño del modelo en dicha matriz, que f inalmente
20
representa las condiciones reales. Una vez que un modelo ha sido validado e implementado en
la práctica se debe definir un procedimiento que permita identif icar en qué momento el modelo
se torna obsoleto y que permita as í mantener el modelo actualizado (McMeekin et al., 1997).
2.5.2 TIPOS DE MODELOS
Actualmente la mayoría de los modelos predictivos son empíricos o pseudo-mecanísticos y
algunos pocos son considerados mecanísticos o teoréticos (“white box models”). Estos últ imos se basan en leyes físico-químicas y en el conocimiento de la estructura interna y funcional del
sistema. Los modelos empíricos o experimentales (“black box models”) sólo describen el
sistema observado y aunque su funcionalidad es ahora limitada, la evolución hacia modelos
más mecanísticos se logrará en la medida que se conozcan las bases y las causas de la
interacción entre los microorganismos y su entorno. Por lo tanto, la selección de un modelo
dependerá del conocimiento sobre un sistema o proceso. Otra clasif icación de los modelos los
divide en cinéticos y probabilísticos. Los cinéticos corresponden a la modelación de la extensión
y la velocidad de crecimiento o inactivación del microorganismo de interés, y los probabilísticos
prevén la probabilidad de algún evento (Ross y McMeekin, 2003).
2.5.3 DESARROLLO DE MODELOS
Los modelos predictivos se categorizan en modelos primarios, secundarios y terciarios. Los
primarios describen el comportamiento de los microorganismos en función del tiempo mientras
que los secundarios describen cómo los parámetros de la función dependen de las variables
independientes.
Los modelos de nivel primario describen el cambio en el número de microorganismos
(crecimiento o inactivación), la formación de una toxina u otro metabolito en función del tiempo.
En la Figura 4 se presentan los parámetros más relevantes dentro de un modelo de crecimiento
primario.
21
Figura 4. Modelo primario de crecimiento e identificación de los parámetros más relevantes. Fuente: García Gimeno, R.M. y Zurero Cosano, G. 1999.
Los modelos secundarios más empleados para caracterizar el crecimiento microbiano a
condiciones ambientales definidas respecto a sus parámetros cinéticos, fase lag, tasa de
crecimiento y concentración máxima son:
• Ecuación de Arrhenius: asume que la velocidad de crecimiento esta controlada por la velocidad límite de la reacción enzimática.
• Ecuación de Bélerádek: se basa en la relación lineal entre la raíz cuadrada de la velocidad de
crecimiento y la temperatura.
• Ecuaciones polinomiales: no asumen ninguna relación mecanística entre la variable
dependiente y la variable independiente. La ecuación solo representa el mejor ajuste a un
conjunto de datos en particular. Se obtienen superficies de respuesta cuando se cuantif ica la
interacción de más de un factor sobre un parámetro cinético (Figura 5).
22
Figura 5. Modelo secundario de superficie de respuesta. En la gráfica se describe la dependencia de la tasa específica de crecimiento en función de la temperatura y del pH. Fuente: Earnshaw, R. 1997.
Los llamados modelos terciarios comprenden rutinas de softw are basadas en modelos cinéticos
o probabilísticos primarios y/o secundarios (Whiting, 1995) como lo son:
• Pathogen Modeling Program PMP www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm (Figura 6)
• Growth Predictor www.ifr.ac.uk/Safety/Grow th Predictor/ (Figura 7)
• Sym´Previus www.symprevius.net
• Seafood Spoilage and Safety Predictor SSP www.dfu.min.dk/micro/sssp/
• Salmonella enteriditis Risk Assessment SERA (USDA)
• Microfit and DMFit www.ifr.bbsrc.ac.uk.
• ComBase Predictor http://ifrsvwwwdev.ifrn.bbsrc.ac.uk/CombasePMP/CBP/Login.aspx
(Figura 8)
23
• Perfringens Predictor (Figura 9) http://ifrsvwwwdev.ifrn.bbsrc.ac.uk/PerfringensPredictor/Login.aspx
24
25
Figura 6. Interfase Pathogen Modelling Program. Con diferentes opciones de aplicación (crecimiento, sobrevivencia, probabilidad)
Figura 7. Interfase Growth Predictor. Aplicación para predecir el crecimiento y sobrevivencia de microorganismos.
Figura 8. Interfase ComBase Predictor. Aplicación para predecir el comportamiento de microorganismos en diversas matrices.
26
Figura 9. Interfase Perfringens Predictor. Aplicación para predecir crecimiento de C. perfringens en carne.
La base datos Combase (www.combase.cc) que recopila miles de curvas de crecimiento e
inactivación en caldos y matrices alimentarias ha sido utilizadas para desarrollar el PMP y el
Growth Predictor. En la Figura 10 se presenta un ejemplo con los criterios de búsqueda (a) y
resultados del ComBase Internet brow ser (b).
a.
27
b. Figura 10. Criterios de búsqueda y resultados del ComBase Internet browser. Criterios de búsqueda (a) y resultados del ComBase Internet browser (b). 2.5.4 MODELOS PRIMARIOS DE CRECIMIENTO
El crecimiento de microorganismos en los alimentos está determinado por la acción conjunta de
diferentes factores físicos y químicos llamados factores intrínsecos, extrínsecos, implícitos y de
elaboración o tratamiento. Los factores intrínsecos comprenden los nutrientes, el pH, la
capacidad tampón, el potencial de redox, la actividad de agua, y los constituyentes y estructuras
antimicrobianas. La humedad relativa, la temperatura y la atmósfera gaseosa constituyen los
factores extrínsecos. Mientras que los factores implícitos se relacionan con las características
propias de cada microorganismo, como es la velocidad de crecimiento espec íf ica, por eso, la
identif icación de los factores más influyentes sobre el crecimiento de microorganismos se hace
necesaria para el desarrollo de los modelos predictivos. El lavado, envasado, irradiación,
pasteurización son entre otros los factores de elaboración o tratamiento (Ross y McMeekin, 1994).
Los modelos de crecimiento a nivel primario más utilizados se presentan en la Figura 11 y la
representación gráfica de algunos de ellos se representa en la Figura 12.
28
Figura 11 Representación matemática de algunos modelos de crecimiento primarios. Fuente: Dalgaard, P. 2004. Predictive microbiology – concept, models and software. www.df u.min.dk/mico7pd.htm.
Primary growth models
Primary growth models
29
Figura 12 Representación gráfica de algunos modelos de crecimiento primario. Fuente: Dalgaard, P. 2004. Predictive microbiology – concept, models and software. www.dfu.min.dk/mico7pd.htm.
Aunque existen diversas ecuaciones para modelar curvas de crecimiento microbiano de forma
sigmoidal, los modelos empleados con mayor frecuencia son: la ecuación modif icada de
Gompertz y la ecuación de Baranyi.
• Ecuación de Gompertz modificada (Zwietering et al., 1990) cuya expresión matemática es:
Donde:
L(t) = logaritmo decimal del recuento de microorganismos a un tiempo t.
A = logaritmo decimal del recuento inicial de microorganismos.
C = logar itmo decimal de la concentración máxima de microorganismos (valor as íntota
superior).
M = tiempo al cual el cultivo alcanza su máxima y absoluto velocidad de crecimiento (punto de
inflexión de la curva).
B = velocidad de crecimiento relativa al t iempo M.
Los cuatro parámetros de esta ecuación (A, C, M, y B) se encuentran relacionados
matemáticamente con los parámetros cinéticos característicos de crecimiento microbiano como
se muestra a continuación.
, velocidad de crecimiento exponencial
, tiempo de generación
, duración de la fase de latencia
, densidad máxima de población
)))(exp(exp()( MtBCAtL −−−+=
eBC
=µ
BCe
GT)2(log
=
)/1( BM=λ
CADMP +=
30
La ecuación modif icada de Gompertz es utilizada en los programas de predicción Pathogen
Modeling Program y Grow th Predictor.
• Ecuación de Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) pretende incluir un enfoque más mecanístico: presenta una fase de crecimiento exponencial lineal y una fase lag determinada
por una función de ajuste α(t).
Siendo
N(t) = número de microorganismos en el t iempo t = 0.
A = valor asíntota inferior, log N-∞.
C = valor asíntota superior, densidad máxima, log N+∞.
µmax = tasa de crecimiento exponencial máxima.
A(t) = integral de la función de ajuste, α(t).
El modelo Baranyi presenta el importante concepto de la fase lag como una combinación del
estado f isiológico de las células (q0) y de la adaptación al nuevo ambiente (v). Cuando las
células microbianas no se encuentran relativamente listas para crecer (q0 es pequeño) o cuando
su adaptación es lenta (v es pequeño) entonces la fase lag se extiende. Así:
2.5.5 AJUSTE Y SELECCIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS Los modelos no lineales se ajustan mediante el método de regresión no lineal basado en el uso
de algoritmos de estimación iterativa. Durante el proceso de regresión se minimiza la suma del
cuadrado (residuos) de las distancias verticales de los puntos experimentales de la curva del
modelo. Por esta razón se le denomina como método de mínimos cuadrados. Una vez
ajustados los modelos matemáticos más adecuados al tema de estudio y a la condición experimental, se evalúa la bondad de ajuste que permitirá llegar a seleccionar el modelo más
adecuado (Baranyi y Roberts, 1994).
))/)1ln(()( )()(max)(max
ACtt eeAAtLogN −−−+= αµµ
))exp(/()( 00 vtqqt −+=α
31
La bondad de ajuste del modelo a los datos experimentales se relaciona con la capacidad de un
determinado modelo matemático para describir el comportamiento del microorganismo de
interés a condiciones establecidas. Los criterios para evaluar qué tan adecuadamente se ajusta
un modelo a los datos experimentales son generalmente: la medida del error o residuo, el
coeficiente de determinación, el análisis de residuos y la estimación de los parámetros. El
principio de parsimonia representa el aspecto de simplicidad de un modelo. Ante dos modelos
posibles, similares en otros aspectos, se debe preferir el más sencillo, el que requiera de menos
supuestos para su construcción, pues relacionado con la simplicidad de un modelo esta su aplicabilidad y facilidad de uso (Baranyi et al., 1999).
2.5.6 VALIDACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS Los modelos predictivos se desarrollan en condiciones controladas reproducibles de laboratorio
y medios de cultivo. Para evaluar la aplicabilidad del mismo modelo en otra matriz y condiciones
ambientales algo diferentes se requiere del proceso de validación del modelo. Un modelo
predictivo que no ha sido validado no es confiable ya que no se conoce su desempeño en
condiciones diferentes a las que lo generaron (Baranyi et al., 1999).
La validación es un proceso que consiste en ajustar un modelo predictivo en particular a datos
obtenidos bajo nuevas condiciones. Para evaluar el desempeño del modelo existen métodos
gráficos y estadísticos. El análisis visual consiste en la construcción de gráficas que muestren
los datos experimentales y la curva de predicción del modelo a validar. Si la curva de predicción
se sitúa cercana a los datos observados se puede concluir que el modelo predictivo cumple su
función adecuadamente. Otra forma visual de análisis consiste en generar gráficas que incluyan
los datos observados versus los predichos. Si los datos predichos se localizan sobre la línea de
equivalencia o cerca de ella se trata de un modelo que predice adecuadamente. Para este tipo
de gráfica el coeficiente de correlación (r) también puede ayudar a la determinación del
desempeño del modelo predictivo (Baranyi et al., 1999). Para la evaluación matemática del
desempeño de modelos predictivos se pueden calcular diferentes criterios: el factor de exactitud
(Af), el porcentaje de discrepancia (%D), el factor de sesgo o bias (Bf), el porcentaje de bias o
sesgo (%B), la prueba del Ji cuadrado.
El Af propuesto por Ross (1996) y su redefinición, el %D propuesto por Baranyi et al. (1999)
indican en cuánto dif ieren los valores predichos de los observados. Entre más alto sea el valor
de Af menos preciso es el estimado medio. Un valor Af de 1 representa un perfecto ajuste del
32
modelo a los datos experimentales. El Bf indica en cuánto el modelo sistemáticamente sobre-
(Bf > 1) o sub-estima (Bf < 1) los datos experimentales. Un ajuste perfecto entre valores
predichos y observados se representan por un valor de Bf de 1 (Ross, 1996). Sin embargo, el
valor medio de Bf debe interpretarse cuidadosamente ya que sub-estimaciones grandes pueden
ser suprimidas por sobre-predicciones grandes estableciendo un valor de Bf cercano a la
unidad. El %B es la redefinición del Bf en términos de porcentaje y propuesto por Baranyi et al.
(1999).
31
3. JUSTIFICACIÓN
Listeria monocytogenes y E. coli son patógenos de gran importancia en salud pública, porque
además de tener una alta incidencia a nivel mundial, las enfermedades que producen ocupan los primeros lugares en mortalidad (NHI, 2005). Se estima un total de 2.500 casos de listeriosis
por año, siendo esta enfermedad la que ocasiona mayor número de muertes dentro del grupo
de las ETAs (Escartin, 2000); y se sabe también, que el 80% de los casos de enfermedad
diarreica aguda (EDA) a nivel mundial se deben a E. coli (Escartin, 2000), donde esta patología
constituye la principal causa de muerte en los países en vías de desarrollo (Riverón, 1992);
siendo en ambos casos, los alimentos listos para el consumo y los manufacturados sin altos
estándares de calidad, los más susceptibles a su contaminación (Cutter y Henning 2003).
Adicionalmente, se ha comprobado que estos patógenos pueden sobrevivir a procesos de
congelación, son resistentes a desinfectantes convencionales y forman biopelículas en
superficies de contacto con los alimentos, convirtiéndose en un foco silencioso de
contaminación (Tompkin, 2005; Glass et al., 1992).
Por eso, en busca de nuevos mecanismos para controlar patógenos en alimentos, se ha
encontrado que las BAL tienen efectos antagónicos frente a diferentes microorganismos y de
ahí su potencial uso como agentes biocontroladores, pues además de secretar bacteriocinas,
tienen la capacidad de inhibir patógenos a través de compuestos como ácido láctico, diacetilo y
peróxido de hidrógeno, siendo la aplicación de f lora competitiva una buena alternativa para
garantizar la seguridad e inocuidad de los alimentos. Sin embargo, poco se conoce sobre la
interacción entre las BAL y los patógenos dentro de matr ices alimentarias y específ icamente en
la leche, donde el tipo de interacción, amensalismo o competición, así como la dinámica de
poblaciones de dichos productos es poco conocida en la actualidad (Tannock, 2004).
Teniendo en cuenta este panorama, se pretende con este trabajo utilizar la microbiología
predictiva como herramienta para el estudio y la modelación del crecimiento interactivo entre
BAL (L. plantarum y L. paracasei) y patógenos asociados a alimentos (L. monocytogenes y E.
coli), con el f in de establecer la viabilidad en la aplicación de las BAL dentro de los procesos de
biocontrol en la industria de alimentos y explicando también la cinética de dicha interacción. Con
32
la validación de los modelos predictivos, para este caso en leche entera UHT, se busca evaluar
el desempeño de los modelos desarrollados en caldo estándar, cuando son aplicados bajo otras
condiciones ambientales, siendo la leche entera un medio rico en nutrientes que además de
facilitar el crecimiento de los cuatro microorganismos en estudio, permitirá un acercamiento
controlado a la realidad de los procesos industriales.
A nivel nacional, este trabajo es pionero porque hasta el momento no se habían desarrollado
estudios sobre el crecimiento simultáneo entre BAL y patógenos de interés en alimentos utilizado la microbiología predictiva como herramienta para describir su comportamiento en una
matriz alimentaria. Adicionalmente, en otros países tampoco se han reportado trabajos similares
empleando cult ivos mixtos con las BAL, L. plantarum y L. paracasei, y las cepas patógenas, E.
coli y L. monocytogenes, siendo la literatura sobre la cuantif icación y matemática de
interacciones entre bacterias muy limitada. Todo esto constituye una buena oportunidad para
hacer que nuestro país participe activamente en la solución de las problemáticas que la
industria de alimentos presenta en el ámbito internacional, generando nuevas políticas y
planteando alternativas que pueden contribuir a la calidad y al mejoramiento continuo de los
productos.
Este estudio también representa un gran aporte al conocimiento y a la investigación en los
temas relacionados con ecología microbiana y dinámica de poblaciones, pues servirá de base a
la industria de alimentos en lo que se refiere a la reducción de la contaminación mediante el
biocontrol, y al desarrollo y optimización de productos, a través de la estimación cuantitativa de
las respuestas microbianas, favoreciendo de manera indirecta la salud y la calidad de vida de la
población en general, por la producción de alimentos sanos e inocuos.
33
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar y modelar el crecimiento de bacterias ácido lácticas (BAL) y patógenos asociados a
alimentos en cultivo mixto, a part ir de un medio de cult ivo estándar y una matriz alimentaria.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Modelar el crecimiento individual de dos especies de BAL, una como productora de
bacteriocinas (Lactobacillus plantarum) y otra como no productora de bacteriocinas
(Lactobacillus paracasei), en caldo MRS.
• Modelar el crecimiento individual de dos especies de patógenos asociados a alimentos,
Escherichia coli como bacteria Gram negativa y Listeria monocytogenes como bacteria
Gram positiva, en caldo MRS.
• Modelar el crecimiento en cultivo mixto de: L. plantarum y E. coli, L. plantarum y L.
monocytogenes, L. paracasei y E. coli; y L. paracasei y L. monocytogenes.
• Validar en leche entera UHT los modelos predictivos de crecimiento, tanto en cult ivo
individual como en cult ivo mixto, desarrollados previamente en medio estándar.
• Generar curvas de crecimiento en cultivo mixto extendidas y proponer un modelo
descriptivo preliminar.
34
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 FASES EXPERIM ENTALES
Generación de curv as de crecimiento bacteriano indiv iduales en medios de cultivo
Generación de curv as de crecimiento bacterianas mixtas en medios de cultivo
Selección de modelos predictivos
Ev aluación de la bondad de ajuste de los modelos predictiv os
FASE 1
FASE 2
Generación de curv as de crecimiento bacteriano indiv idual en leche entera UHT
Generación de curv as de crecimiento bacterianas mixtas en leche entera UHT
Validación de modelos predictiv os
FASE 3
Generación de curv as extensas de crecimiento mixto en caldo MRS
Generación de curv as extensas de crecimiento mixto en leche entera UHT
Selección de modelos predictivos
Ev aluación de la bondad de ajuste de los modelos predictivos
35
5.2 METODOLOGÍA 5.2.1 SELECCIÓN DE BAL PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS MIXTOS
CON PATÓGENOS ASOCIADOS A ALIMENTOS: Escherichia coli y L.
monocytogenes
Escherichia coli y L. monocytogenes fueron los dos patógenos asociados a alimentos
seleccionados para este estudio ya que se encuentran frecuentemente en muestras de leche cruda y se caracterizan por tener diferente estructura de la pared celular. Su procedencia se
describe a continuación:
• Escherichia coli ECO25: obtenida del cepario del Laboratorio de Ecología Microbiana
de Alimentos LEMA de la Universidad de Los Andes. Aislada de un jamón de plaza de
mercado.
• Listeria monocytogenes LM O26: obtenida del cepario del Laboratorio de Ecología
Microbiana de Alimentos LEMA de la Universidad de Los Andes. Aislada de un queso
comercial.
Como criterio de selección de las BAL se utilizó la capacidad de producir o no sustancias BLIS (bacteriocin-like inhibitory substances). Para poder obtener diferentes patrones de inhibición en
cultivo mixto se empleó una cepa BAL productora de BLIS y otra cepa no productora de BLIS.
Para seleccionar las BAL se verif icó el efecto inhibitorio de una colección de 11 cepas BAL de
origen alimentario (Tabla 26, Anexo 3) frente a los dos patógenos en estudio (E. coli y L.
monocytogenes).
Para la verif icación de la producción de BLIS se tuvo como referencia la técnica ¨Spot on the
law n̈ utilizada en diferentes trabajos previamente reportados (Cintas, 1998; Loessner, 2003;
Eppert, 1997) con algunas modif icaciones (Figura 13).
Para el ensayo se realizaron activaciones de las cepas reto por duplicado a partir de las perlas
de congelación, inoculándolas de manera independiente en 5mL de caldo MRS. Los inóculos
se incubaron a 37°C, hasta alcanzar concentraciones aproximadas del orden de 109 UFC/mL.
36
Cepas congelad as (Perlas de crio conservación)
Caldo MRS con 1 perla BAL Primera activación
BAL Réplica 1 Segunda activación
100µ L
Incubación 24 horas 37°C
Incubación 24 horas BAL Réplica 2
Segunda activación
Medición de pH Neutralización con N AOH 0.1N
Centrifugación 9335.3xg/ 10min
Sobrenadante neutralizado Sobrenadante no neutralizado
Concentración Incubación 37°C
1 semana
Cepa patógena Segunda activación
100 mL
Mueller Hinton Cepa patógena y sobrenadantes en
pozos
Medición de h alos de inhibición post in cubación
1 mL
40µ L 40µ L
Figura 13. Diagrama de flujo del ensayo de verificación de la producción de BLIS (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances) en BAL.
37
A los caldos crecidos con las BAL se les determinó el pH por medio de potenciómetro y los
inóculos que presentaron pH menores a 6,0 fueron neutralizados con NaOH 0.1N (una de las
dos réplicas) hasta obtener valores entre 6,0 y 6,5. Finalmente todos los tubos se marcaron y
organizaron en dos grupos: la réplica neutralizada y la no neutralizada. Ambas réplicas de cada
inóculo se centrifugaron a 9335,3xg por 10 minutos y los sobrenadantes recolectados se
transfirieron en condiciones asépticas a tubos eppendorf estériles y se incubaron a 37°C
durante una semana para su concentración.
Después del periodo de incubación, se realizó la activación de las cepas indicadoras L.
monocytogenes y E. coli, teniendo en cuenta las mismas condiciones empleadas para la
activación de las cepas reto. De los caldos crecidos con las bacterias patógenas se transfirió
1mL de inóculo a 100mL de medio Mueller Hinton estéril. Después de homogenizado el medio
se prepararon cajas de Petri estériles con 20 mL y una vez solidif icado se realizaron cuatro
pozos con pipetas pasteur estériles en cada una de las placas de petri. Posteriormente se
tomaron 40µL de cada uno de los sobrenadantes concentrados y se transfirieron a pozos.
Todas las placas de petri se incubaron por 48 horas a 37°C. Las lecturas se efectuaron
midiendo el diámetro de los halos de inhibición. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Finalmente, después de evaluar y analizar los resultados de los ensayos de inhibición se
eligieron para el estudio las cepas Lactobacillus plantarum WS4174 y Lactobacillus paracasei
LB279 por presentar el mejor efecto antagónico frente a las cepas indicadoras (Anexo 3). 5.2.2 MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo empleados en este proyecto se enuncian a continuación y su
composición se presenta en el Anexo 1:
• Agar MRS (Agar para Lactobacillus según DE MA N, ROGOSA y SHARPE) (Scharlau
Chemie S.A).
• Caldo MRS (Caldo para Lactobacillus según DE MA N, ROGOSA y SHARPE) (Scharlau Chemie S.A).
• Agar Mueller Hinton (Merck KGaA).
• Agar EMB (Agar eosina-azul de metileno-lactosa según LEV INE) (Merck KGaA).
• Agar Palcam (Agar selectivo para Listeria según VAN NETTEN et al.) (Merck KGaA).
• Agar Plate Count (Agar peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura) (Merck KGaA).
38
5.2.3 MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS
Las cepas bacterianas se conservaron a -70°C en viales de crio-conservación con perlas
CryoBankTM según instrucciones del fabricante (COPAN, 2005). La activación de las cuatro
cepas bacterianas se realizó en caldo MRS o en leche entera ultra pasteurizada (UHT) de una
reconocida marca comercial cuya composición química se encuentra referenciada en el Anexo
2 según las etiquetas del fabricante, dependiendo del caso, a 37°C por 24 horas.
Como control de identidad y verif icación de las cepas bacterianas se realizaron cultivos
constantes en diferentes medios de cultivo a 37°C por 24 horas: para L. plantarum y L.
paracasei en agar MRS, para E. coli en el medio EMB y para el mantenimiento de L.
monocytogenes en Palcam para Listeria con su respectivo suplemento. Adicionalmente se
verif icó su morfología y respuesta a la tinción de Gram bajo el microscopio.
5.2.4 MÉTODOS ESTADÍSTICOS
La determinación de diferencias signif icativas entre medias se realizó mediante análisis de
varianza (ANOVA) con P < 0.05 y después de un valor F signif icativo se aplicó el test de Tukey
con un nivel de signif icancia de 5% (Daniel, 2002). Este tratamiento se utilizó para el análisis de
los resultados obtenidos a partir de los siguientes procesos: validación estadística del método
modif icado de recuento en placa, estandarización de inóculos, validación estadística de cultivos
sincronizados, análisis de tasas de crecimiento, análisis de fases lag, análisis de la máxima
concentración alcanzada, análisis de la concentración inicial, análisis de valores de pH y
validación estadística en leche entera UHT del modelo desarrollado en caldo MRS.
La prueba T se empleó para determinar diferencias signif icativas entre dos medias y se aplicó
en la comparación estadística de la bondad de ajuste del modelo de Gompertz modif icado
versus la del modelo de Baranyi. La prueba del Ji cuadrado que proporciona una medida total
de la desviación (Daniel, 2002) se utilizó para la validación del modelo matemático desarrollado
en caldo MRS.
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (versión 13, SSPS Inc,
Chicago).
39
5.2.5 RECUENTO DE BACTERIAS
Para el recuento de bacterias, se empleó el método directo de recuento en placa y diluciones
seriadas, bajo las indicaciones del Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2003). El método
original (estándar) fue modif icado con f ines de alcanzar una mayor eficiencia en el estudio de
modelación. Al método de conteo en placa modif icado se le denominará de “recuento en
cuartos” ya que la placa de Petri estándar se dividió en cuatro zonas iguales (cuatro cuartos)
con un volumen de siembra de 20 µL de muestra para cada cuarto (Figura 14).
La validación estadística del método modif icado de recuento en placa, “recuento en cuartos”,
pretende establecer si hay diferencias signif icativas entre los dos métodos (estándar versus
modif icado) y así mismo evaluar el desempeño del método modif icado para f ines de trabajos en
modelación (Anexo 4). Esta metodología de siembra en cuartos disminuye los costos de
investigación, permitiendo optimizar el t iempo y los recursos en el laboratorio. Para ilustrar la
ventaja del uso del método de “recuento en cuartos” se plantea la siguiente analogía: para la
obtención de una sola curva de crecimiento con al menos tres réplicas y 18 puntos de
observación por réplica se generan 54 muestras. Estas 54 muestras se diluyen y al sembrarse 4 diluciones por muestra se generan un total de 216 placas utilizando el método estándar. Por
el método de “recuento en cuartos” sólo se necesitan 54 placas y al sembrar las 4 diluciones de
cada muestra de manera simultanea en una sola placa, produciéndose as í un ahorro de 162
placas. Estos datos cobran mayor importancia si se tiene en cuenta que en este trabajo se
realizaron más de 16 curvas de crecimiento.
Para realizar la validación estadística del método modif icado de recuento en placa, se tuvieron
en cuenta diferentes niveles de análisis:
- Evaluación entre métodos: método estándar de recuento en placa (siembra en placa
de petri completa) versus método modif icado de recuento en placa (recuento en cuartos)
para todos los microorganismos y en todas las diluciones.
- Evaluación entre microorganismos: L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L.
monocytogenes se evaluaron de manera individual por el método estándar de recuento y
por el método modif icado en todas las diluciones.
40
- Evaluación entre diluciones: se evaluaron de manera independiente cuatro diluciones
para los cuatro microorganismos en análisis y por los dos métodos aplicados.
A continuación se describe protocolo de validación realizando cuatro réplicas por prueba (Figura
14):
• A partir de las cepas congeladas, se tomó una perla del microorganismo de interés y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Se incubó a 37ºC por 24 horas, correspondiente a la
primera activación.
• Después del per íodo de incubación se tomaron 100µL del inóculo y se transfirieron a
5mL de caldo MRS. Este nuevo inóculo se incubó a 37°C por otras 24 horas para
completar la segunda activación.
• A partir del segundo inóculo se tomaron 50µL de muestra y se transfirieron a 450 µL de
solución salina al 0.98%, para realizar diluciones seriadas hasta llegar a la dilución 10-4.
Partiendo de la dilución 10-4 se realizaron diluciones intermedias así:
Dilución A: Se tomaron 200µL de la dilución 10-4 y se transfirieron a un tubo eppendorf
con 800µL de solución salina al 0.98%.
Dilución B: Se tomaron 500 µL de la dilución A y se transfirieron a un tubo eppendorf
con 500µL de solución salina al 0.98%.
Dilución C: Se tomaron 500 µL de la dilución B y se transfirieron a un tubo eppendorf
con 500µL de solución salina al 0.98%.
Dilución D: Se tomaron 500 µL de la dilución C y se transfirieron a un tubo eppendorf
con 500µL de solución salina al 0.98%.
• Para el método estándar de recuento en placa se realizaron siembras masivas en
superficie con rastrillos estériles, para lo cual se transfirieron 100µL de cada una de las
diluciones (A, B, C y D) a cuatro placas de petri completas de manera independiente.
De cada siembra se realizaron cuatro réplicas.
• Para realizar el mismo proceso de siembra, pero desarrollando el método modif icado de
recuento en placa por cuartos, se transfirieron 20 µL de cada una de las diluciones (A, B,
C y D) y se sembraron en una misma placa de petri, previamente dividida por cuartos.
De cada siembra se realizaron cuatro réplicas.
• Todas las placas se incubaron a 37ºC por 24 horas. Después de la incubación se realizaron las lecturas y los cálculos correspondientes.
41
Figura 14. Diagrama de flujo del ensayo de validación del método modificado de recuento en placa (siembra en cuartos de placa). El procedimiento explicado a través del diagrama de flujo, se realizó para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes con 4 réplicas por cada microorganismo. Tanto las siembras finales realizadas mediante el método estándar como las efectuadas mediante el método modificado se incubaron por 24 horas a 37°C en agar MRS.
Inóculo A Segunda acti vación
Incubación 24H
50µ L
450µL Solución salina 0.98%
500µL Sol ución salina 0.98%
A
100µ L
MRS
B
100µ L
MRS
C
100µ L
MRS
D
100µ L
MRS
x 4 R éplicas x 4 Microorganismos
Cepas congeladas (Perlas de crio-conservación)
Caldo MRS con 1 perla Primera acti vación
Incubación 24H 37°C
100µ L
450µL Sol ución salina 0.98%
450µL Sol ución salina 0.98%
450µL Sol ución salina 0.98%
50µ L 50µ L 50µ L
800µL Sol ución salina 0.98%
500µL Sol ución salina 0.98%
500µL Sol ución salina 0.98%
500µ L 500µ L 500µ L
200µ L
D A C B
10-1 10-4 10-2 10-3
A B
C D
20µ L 20µ L
20µ L 20µ L
Método estándar
Método modificado
42
5.2.6 DESARROLLO DE CULTIVOS SINCRONIZADOS Para la obtención de curvas de crecimiento de 34 horas con 18 puntos de muestreo se
generaron cultivos sincronizados con un desfase de 13 horas (Tabla 4). Para tal f in y para
obtener curvas de crecimiento con mínima variabilidad entre las diferentes réplicas se
estandarizó el inóculo inicial garantizando que al momento de conectar los cultivos
sincronizados no se presentaran diferencias signif icativas entre los recuentos de cada uno
(Anexo 5). Al f inal del proceso de activación, los dos inóculos (A y B) para los dos cultivos sincronizados (A y B) debía ser similar en concentración (UFC/mL).
Tabla 4. Sincronización de cultiv os para la generación de curvas de crecimiento con una extensión de 34 horas y 18 puntos de muestreo. En negro: Periodo de muestreo. En blanco: Periodo no muestreado.
Día Hora Punto de muestreo/ Tiempo curv a Cultiv o A Cultiv o B
7:00 8:00 1 (0 horas de crecimiento) 9:00
10:00 2 (2 horas de crecimiento) 11:00 12:00 3 (4 horas de crecimiento) 13:00 14:00 4 (6 horas de crecimiento) 15:00 16:00 5 (8 horas de crecimiento) 17:00
1
18:00 6 (10 horas de crecimiento) 7:00 7 (13 horas de crecimiento) 8:00 8 (24 horas de crecimiento) 9:00 9 (15 horas de crecimiento)
10:00 10 (26 horas de crecimiento) 11:00 11 (17 horas de crecimiento) 12:00 12 (28 horas de crecimiento) 13:00 13 (19 horas de crecimiento) 14:00 14 (30 horas de crecimiento) 15:00 15 (21 horas de crecimiento) 16:00 16 (32 horas de crecimiento) 17:00 17 (23 horas de crecimiento)
2
18:00 18 (34 horas de crecimiento)
Para evaluar tiempos de activación y homogeneidad de los inóculos, se realizaron tres procedimientos diferentes de activación para las cuatro cepas bacterianas (L. plantarum, L.
paracasei, E. coli y L. monocytogenes) con cuatro réplicas cada uno.
43
Mediante la técnica de conteo en placa se determinó la concentración f inal de los dos inóculos
(A y B) para el establecimiento de los cultivos sincronizados. Adicionalmente, se determinó la
absorbancia de cada cultivo, evaluando su densidad óptica a 540nm (OD540) para correlacionar
estas mediciones con el respectivo recuento en placa obtenido de cada inóculo. Los diagramas
de f lujo de cada uno de los procedimientos se describen en las Figuras 15 a 17.
Procedimiento número 1: inóculo A y B con dos activaciones
• Se tomó una perla de crio-conservación y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Este inóculo A, se llevó a incubar a 37°C por 24 horas sin agitación (primera activación).
• Transcurridas las 24 horas y a part ir del inóculo A se realizó una segunda activación. 100µL
del inóculo A (primera activación) se transfirieron a 5mL de caldo MRS y se llevó a incubar a
37°C por 24 horas sin agitación (segunda activación).
• El inóculo B se estableció con el mismo procedimiento anterior pero con 13 horas de
desfase y el inóculo A se utilizó para iniciar el primer cultivo y el inóculo B para iniciar el
segundo cultivo con 13 horas de desfase.
Procedimiento número 2: inóculo A y B con una activación.
• Se tomó una perla de crio-conservación y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Este inóculo A,
se llevó a incubar a 37°C por 24 horas sin agitación (primera activación).
• El inóculo B se estableció con el mismo procedimiento anterior pero con 13 horas de desfase y el inóculo A se utilizó para iniciar el primer cultivo y el inóculo B para iniciar el
segundo cultivo con 13 horas de desfase.
Procedimiento número 3: inóculo A con una activación e inóculo B con dos activaciones.
• Se tomó una perla de crio-conservación y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Este inóculo A,
se llevó a incubar a 37°C por 24 horas sin agitación. De manera simultánea se realizó el
mismo procedimiento con el f in de activar al mismo tiempo otro inóculo, el inóculo B.
Transcurridas las 24 horas y a partir del inóculo A (en primera activación) se inició el primer
cultivo.
• Transcurridas las 24 horas y a part ir del inóculo B se transfirieron 100µL del inóculo B
(primera activación) y se inocularon en 5mL de caldo MRS y se llevó a incubación por 24
horas a 37°C sin agitación (segunda activación). Después de completar las 24 horas, el
inóculo B (segunda activación) se utilizó para iniciar el segundo cultivo.
44
Figura 15. Diagrama de flujo del procedimiento número 1 para la estandarización inóculos.
7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 1
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 2
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 3
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 4
24:00
Inicio de curva (Día 1)
Caldo MRS con 100µL Incubación 24 Horas 37°C
Inicio de curva (Día 2) SINCRONIZACIÓN
Primera Activación
Segunda Activación Primera Activación
Segunda Activación
INÓCULO A
Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C
Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C
Caldo MRS con 100µL Incubación 24 Horas 37°C
INÓCULO B
45
Figura 16. Diagrama de flujo del procedimiento número 2 para la estandarización inóculos.
7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 1
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 2
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 3
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 4
24:00
Primera Activación
Inicio de curva (Día 1) Primera Activación
Inicio de curva (Día 2) SINCRONIZACIÓN
INÓCULO A
Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C
Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C
INÓCULO B
46
Figura 17. Diagrama de flujo del procedimiento número 3 para la estandarización inóculos.
7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 1
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 2
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 3
24:00 7:00 8:00 9:00
10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00
DÍA 4
24:00
INÓCULO B
Inicio de curva (Día 1) Segunda Activación
Inicio de curva (Día 2) SINCRONIZACIÓN
Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C
Primera Activación Primera Activación
Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C
Caldo MRS con 100µL Incubación 24 Horas 37°C
INÓCULO A
47
Para realizar esta validación estadística de esta metodología se realizaron curvas de
crecimiento microbiano con una extensión de 34 horas a partir de cult ivos sincronizados no
agitados. Para cada uno de los cuatro microorganismos en estudio (L. plantarum, L. paracasei,
E. coli, L. monocytogenes) se generaron cuatro curvas de crecimiento (4 réplicas) con 18
puntos de muestreo para evaluar un total de 34 horas de crecimiento (Tabla 5).
Tabla 5. Puntos de muestreo en cultiv os sincronizados a 13 horas de desfase.
DÍA 1
DÍA 2
HORA TIEMPO CULTIVO HORA TIEMPO CULTIVO 7:00am Preparación
Cultivo 1 7:00am 13 2 8:00am 0 1 8:00am 24 1 9:00am 9:00am 15 2
10:00am 2 1 10:00am 26 1 11:00am 11:00am 17 2 12:00m 4 1 12:00m 28 1 1:00pm 1:00pm 19 2 2:00pm 6 1 2:00pm 30 1 3:00pm 3:00pm 21 2 4:00pm 8 1 4:00pm 32 1 5:00pm 5:00pm 23 2 6:00pm 10
Preparación Cultivo 2
1 6:00pm 34 1
Las curvas de crecimiento continuas se realizaron utilizando un solo inóculo inicial ( inóculo A) y
evaluando de manera in-interrumpida los 18 puntos de muestreo, realizando as í siembras
constantes cada dos horas durante 34 horas seguidas. Estas curvas continuas se realizaron
para cada uno de los cuatro microorganismos en estudio (L. plantarum, L. paracasei, E. coli, L.
monocytogenes) realizando tres réplicas por curva.
5.2.7 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO INDIVIDUAL EN MEDIO ESTÁNDAR
Se realizaron cuatro curvas de crecimiento individuales en caldo MRS con las cepas de L.
plantarum, L. paracasei, L. monocytogenes y E. coli con cuatro réplicas de cada una. Las
curvas de crecimiento se generaron a part ir de 18 puntos de muestreo que se tomaron cada dos
horas siguiendo el procedimiento a continuación:
48
• A partir de las cepas congeladas, se tomó una perla del microorganismo de interés y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Se incubó a 37ºC por 24 horas, correspondiente a la
primera activación.
• Después del per íodo de incubación se tomaron 100µL del inóculo y se transfirieron a
5mL de caldo MRS. Este nuevo inóculo se incubó a 37°C por otras 24 horas para
completar la segunda activación.
• A partir de la segunda activación (concentración aprox. del inóculo de 109 UFC/mL) se
realizaron diluciones decimales seriadas tomando 100µL de muestra en 900µL de
solución salina al 0.98% hasta diluir el inóculo a 104 UFC/mL. De esta últ ima dilución se
transfirieron 100 µL de muestra a 12 tubos con 5mL de caldo MRS cada uno cuya
concentración f inal fue aproximadamente de 102 UFC/mL. Estos 12 tubos inoculados se
codif icaron con: cultivo 1.
• A las 24 horas de realizar la primera activación inicial, de manera separada e independiente se realizó el procedimiento anterior para sincronizar los cultivos y de esta
manera obtener mediciones del crecimiento bacteriano por 34 horas de incubación.
Para este segundo caso en lugar de 12 tubos con MRS se inocularon 6 para obtener las
18 mediciones totales de las curvas de crecimiento. Estos 6 tubos inoculados se
codif icaron con: cultivo 2. La Tabla 5 presenta la toma de muestras para la generación
de curvas de crecimiento con 34 horas de extensión.
• Con cada uno de los 18 tubos se realizaron diluciones decimales seriadas en tubos
eppendorf estériles, transfiriendo 50µL de muestra en 450µL de solución salina al
0.98%. Durante cada muestreo también se midieron los pH de cada inóculo para
obtener una medición de esta variable a través del tiempo.
• Las últimas cuatro diluciones efectuadas para cada punto de muestreo se sembraron por superficie en el agar MRS, transfiriendo 20 µL de cada dilución a los 4 cuadrantes
diferentes en los que estaba dividida cada placa de petri (método de recuento en placa
modif icado).
• Todas las placas de petri se incubaron a 37°C por 24 horas. Después de la incubación
se realizaron las lecturas de recuento prosiguiendo con los cálculos correspondientes,
49
para lo cual se multiplicó el número de colonias obtenidas en un cuadrante, por el factor
de dilución, por el factor 50 (valor correspondiente a la cantidad de muestra sembrada
en cada cuadrante).
5.2.8 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANAS EN CULTIVO MIXTO A PARTIR DE M EDIO ESTÁNDAR
Se realizaron cuatro curvas de crecimiento mixtas en caldo MRS para evaluar la interacción entre las BAL y las bacterias patógenas en alimentos. Se realizaron curvas mixtas de L.
monocytogenes con L. plantarum, de E. coli con L. plantarum, de L. monocytogenes con L.
paracasei y de E. coli con L. paracasei, con tres réplicas cada una.
Las curvas de crecimiento se establecieron a partir de 18 puntos de muestreo que se tomaron
cada dos horas siguiendo el protocolo empleado para las curvas individuales (numeral 5.2.7),
pero en este caso los 18 tubos (cultivos 1 y 2) se sembraron con 100 µL de cada uno de los
cultivos de los dos microorganismos problema, para poder obtener los cultivos mixtos.
5.2.9 DESARROLLO DE MODELOS PRIMARIOS Como modelos de crecimiento primario se seleccionaron los modelos de Gompertz modif icado
(Gibson et al., 1988) y Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994), que son los más utilizados para
describir el crecimiento sigmoidal microbiano. Las ecuaciones se ajustaron a los datos
experimentales utilizando el método de mínimos cuadrados con el softw are DMfit curve-f itting
program (http.//www.ifr.bbsrc.ac.uk) bajo las premisas de normalidad, independencia y varianza
constante.
5.2.10 MODELOS PRIMARIOS SELECCIONADOS
5.2.10.1 Ecuación de Gompertz modificada:
A: valor asintótico de log10 UFC/mL cuando t decrece
B: tasa de crecimiento relativa M: tiempo donde la tasa de crecimiento es máxima
C: crecimiento máximo cuando t se incrementa
( )( )( )MtBCAN −⋅−⋅+= expexp)log(
50
Los parámetros cinéticos derivados de la ecuación de Gompertz modif icada son
los siguientes:
La máxima (exponencial) tasa de crecimiento (log10 UFC/mL/h):
Duración de la fase lag (fase de adaptación):
Tiempo de generación (h):
5.2.10.2 Ecuación de Baranyi:
: logaritmo natural de la concentración celular en el t = t0.
: logaritmo natural de la máxima concentración celular.
: función para el retraso gradual en el t iempo.
: tasa máxima de crecimiento
5.2.11 EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO Y LA BONDAD DE AJUSTE DE LOS MODELOS PRIMARIOS
Los siguientes fueron criterios empleados para evaluar la bondad de ajuste y de desempeño de
los modelos predictivos: error cuadrado medio (MSE), error estándar (SE) análisis de residuos,
coeficiente de determinación (R2) y análisis de los estimados de los parámetros cinéticos.
5.2.11.1 Error cuadrado medio (MSE): El modelo ajusta mejor a los datos experimentales
entre más pequeño el valor de MSE. Donde n es el número de observaciones y p es el número
de parámetros a estimar.
eBC
=maxµ( )BM 1−=λ
BCegt 2log10=
( ) ( )( )
( ) ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ −+−+= − 0max
max
max01
1ln1
γγ
µ
µ m
tAm
ee
mtAyty
( )00 ln txy =
maxmax ln x=γ
( )tA
maxµ
51
5.2.11.2 Error estándar (SE): Es una medida de dispersión que corresponde a la raíz cuadrada
de la varianza de la distribución de todos los datos.
SE = σ
√n
5.2.11.3 Análisis de residuos: Los valores de los residuos permiten determinar si se cumplen
las hipótesis para el correcto uso de los modelos. Las gráficas de residuales permiten evaluar
desviaciones sistemáticas entre valores observados y predichos, “clustering” de residuales del
mismo signo y autocorrelación.
5.2.11.4 Coeficiente de determinación (R2): Es la proporción de variación explicada por el
modelo. Entre más alto sea su valor mejor será el ajuste del modelo.
Donde SSreg es la suma de las distancias entre los puntos y la curva de mejor ajuste
determinada por regresión no linear y SStot es la suma de los cuadrados de las distancias entre
los puntos de la línea occidental por el valor medio de todos los valores de Y.
5.2.11.5 Análisis de los parámetros cinéticos estimados: El propósito de este análisis es
evaluar los estimados de los parámetros de los modelos bajo los criterios de precisión y de
ajuste a la realidad.
5.2.12 VALIDACIÓN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS Como los modelos predictivos se generan inicialmente en condiciones controladas y medios de
cultivos altamente reproducibles deben ser validados para su aplicación en condiciones
diferentes a las que los generaron. Para evaluar el desempeño de los modelos predictivos se
emplearon métodos gráficos y estadísticos.
( )2pnobservedpredictedMSE
−∑ −=
tot
reg
SSSS
R −= 0.12
52
5.2.12.1 MÉTODO GRÁFICO Para la evaluación visual se construyeron gráficas presentando el ajuste del modelo predictivo
desarrollado en caldo MRS a 37ºC a los datos experimentales obtenidos en leche entera UHT a
37ºC. Adicionalmente se graficaron los datos observados versus los predichos para determinar
que tan cercanos se situaban los datos predichos de los observados.
5.2.12.2 MÉTODO MATEMÁTICO
Para la cuantif icación matemática del desempeño de los modelos predictivos de crecimiento se
calcularon los siguientes factores:
5.2.12.2.1 Factores de exactitud (Af) y bias (sesgo) (Bf): Los factores Af y Bf son una medida
cuantitativa para el desempeño de los modelos (Mellefont et al. 2003; Ross et al. 2003; Ross,
1996).
5.2.12.2.2 Porcentaje de Discrepancia (%D) y porcentaje de Sesgo o Bias (%B): También
se aplicaron las formas modif icadas del Af y Bf propuestas por Baranyi et al. (1999): porcentaje
de Discrepancia (%D) y porcentaje de sesgo o bias (%B).
Donde,
( )n
observedpredicted
fB∑
=/log
10
( )n
observedpredicted
fA∑
=/log
10
100*)1(exp% −= fAD
n
obspred
fA∑
=− 2)ln(ln
exp
100*)1)(exp(% )( −= BabsfBsignoB
53
Donde,
5.2.12.2.3 Prueba del Ji cuadrado: proporciona una medida total de la desviación. Donde obs representa la frecuencia observada y esp la frecuencia esperada.
5.2.13 GENERACIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EXTENDIDAS Y SU
MODELACIÓN PRELIMINAR Siguiendo el protocolo para la generación de curvas de crecimiento en cultivo mixto se
construyeron las curvas de crecimiento extendidas a 82 horas en caldo MRS y leche entera
UHT a 37ºC.
Para el proceso de modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas se ajustaron
modelos polinomiales con el programa SPSS (versión 13, SSPS Inc, Chicago) y se evaluó su
bondad de ajuste. Para tal f in se calculó el MSE, r y R2 y se realizó una prueba formal para falta
de ajuste para modelos de regresión, que consistió en cuantif icar dentro del error lo que
correspondía al error puro y al error por falta de ajuste.
Donde SSres corresponde a la suma de cuadrados de residuales, SSep a la suma de cuadrados
debida al error puro y SSfa a la suma de cuadrados debidos a la falta de ajuste. Si la relación F
de la falta de ajuste no es signif icativa, se rechaza la hipótesis de la signif icancia de la regresión
y el modelo puede considerarse como satisfactorio.
n
obspred
fB∑
=−lnln
exp
∑ −=
..)( 2
2
espespobs
χ
faepres SSSSSS +=
54
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 GENERACIÓN Y MODELADO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO INDIVIDUAL EN CALDO MRS
6.1.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL
La Figura 18 presenta las cuatro réplicas de las curvas de crecimiento sigmoidales obtenidas
para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes. Al analizar visualmente los datos
experimentales se observó que los cuatro microorganismos crecieron de manera similar en caldo MRS a 37°C durante 34 horas. Sin embargo, E. coli como las dos BAL (L. plantarum y L.
paracasei) no presentaron una fase lag bien definida como si se observó para L.
monocytogenes, que permaneció en proceso de adaptación entre 4 y 6 horas
aproximadamente.
Todas las curvas generadas, presentaron el mismo patrón de comportamiento entre las horas 8
y 10, donde se observó un ligero decrecimiento de la tasa de crecimiento en la fase
exponencial, sugiriendo el posible crecimiento bifásico de los cultivos, lo cual puede signif icar
que en el mismo cult ivo se estén desarrollando, a diferentes ritmos, dos poblaciones
microbianas obtenidas a partir de un mismo inóculo inicial. También se hace evidente que los
cultivos de las cuatro cepas alcanzaron concentraciones máximas similares en la fase
estacionaria que se establece entre las 25 y las 30 horas de crecimiento, obteniendo valores
entre 8 y 9 log10 UFC/mL.
6.1.2 SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS
A cada una de las réplicas de las curvas de crecimiento de las cepas individuales con patrón
sigmoidal se ajustaron las ecuaciones de Gompertz modif icada (Gibson et al., 1988) y la de
Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) por ser las más utilizadas, por su desempeño, para describir
el crecimiento sigmoidal microbiano. La selección del modelo, para continuar con el estudio de
55
modelación, se realizó con base en el error estándar (SE) y el coeficiente de determinación (R2), así como en la estimación de los parámetros cinéticos.
Figura 18. Curvas de crecimiento en cultiv o individual. L. plantarum (a), L. paracasei (b), E. coli (c) y L. monocytogenes (d) en caldo MRS a 37ºC (4 réplicas por cepa).
El ajuste de estos modelos y los parámetros cinéticos estimados para cada una de las réplicas
de los cuatro microorganismos: la fase lag, la tasa de crecimiento, la concentración celular
inicial (mínima) y la máxima se resumen en la Tabla 6. Con base en el análisis de regresión no
lineal se pudo concluir que los dos modelos, Gompertz modif icado y Baranyi, presentaban un
buen ajuste. El SE y el R2 para cada uno de los modelos mostró que ambos modelos ajustaban
a b c d
L. plantarum 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 3 0 40
Tiem po (h )
log
UFC
/mL
L. plantarum 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 3 0 40
Tie mpo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum 3
0
2
4
6
8
10
0 10 2 0 30 40
Tiem po (h )
log
UFC
/mL
L. plantarum 4
0
2
4
6
8
10
0 10 20 3 0 40
Tiem po (h )
log
UFC
/mL
E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h )
log
UFC
/mL
E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 4 0
Tiem po (h )
log
UFC
/mL
E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 3 0 40
Tie mpo (h)
log
UFC
/mL
E. coli 4
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h )
log
UFC
/mL
L. monocytogene s 1
0
2
4
6
8
10
0 10 2 0 3 0 40
Tiem po ( h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 1 0 20 3 0 40
T iemp o (h)
log
UFC
/mL
L. paraca sei 1
0123456789
10
0 10 20 30 40
Tiem po ( h)
log
CFU
/mL
L. parac asei 2
0
2
4
6
8
10
0 1 0 20 30 40
Tiemp o (h)
log
CFU
/mL
L. paraca sei 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tie mpo (h)
log
CF
U/m
L
L. paraca sei 4
0
2
4
6
8
10
0 10 2 0 30 4 0
Ti empo ( h)
log
CF
U/m
L
L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 3 0 4 0
T iemp o (h)lo
g U
FC/m
L
L. monocy toge nes 4
0
2
4
6
8
10
0 10 2 0 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
56
adecuadamente a los datos experimentales, siendo 0,420 el SE más alto y 0,971 el R2 más bajo
para la totalidad de las 16 curvas de crecimiento individuales modeladas.
Tabla 6. Bondad de ajuste de los modelos predictiv os para curvas de crecimiento en cultivo indiv idual. a: L. plantarum. b: L. paracasei. c: E. coli. d: L. monocytogenes. R: Réplica. Mod: Modelo predictivo. B: Modelo Baranyi. G: Modelo Gompertz. C. Inicial: Concentración inicial observada (log10 UFC/mL). C. Máx: Máxima concentración obtenida (log10 UFC/mL). Tasa Cto: Tasa de crecimiento (horas-1). C. Inicial P: Concentración inicial predicha. C. Máx P: Máxima concentración predicha. SE: Error estándar. R2 : Coeficiente de determinación.
Cepa R Mod C. inicial C. Máx Tasa Cto (h-1)
Fase lag (horas) C. Inicial P C. Máx P SE R2
1 B 2,623 9,146 0,328 3,232 2,793 9,047 0,224 0,991 1 G 2,623 9,146 0,363 3,533 2,768 9,448 0,345 0,979
2 B 2,591 9,097 0,326 2,751 2,681 9,026 0,235 0,990
a 2 G 2,591 9,097 0,366 3,260 2,667 9,408 0,351 0,979
3 B 2,613 9,130 0,292 - 2,359 9,079 0,279 0,986
3 G 2,613 9,130 0,357 3,068 2,719 9,444 0,368 0,976
4 B 2,672 9,398 0,296 - 2,337 9,053 0,314 0,983
4 G 2,672 9,398 0,368 3,138 2,707 9,363 0,390 0,973
1 B 3,000 9,176 0,253 - 3,205 9,237 0,193 0,992
1 G 3,000 9,176 0,299 0,000 2,830 9,683 0,260 0,985
2 B 2,903 9,204 0,248 - 3,093 9,296 0,215 0,990 b 2 G 2,903 9,204 0,289 0,000 2,725 9,834 0,283 0,983
3 B 2,778 9,190 0,255 - 3,045 9,258 0,217 0,990
3 G 2,778 9,190 0,301 0,000 2,663 9,734 0,290 0,982
4 B 2,602 9,217 0,249 - 2,955 9,314 0,260 0,986
4 G 2,602 9,217 0,291 0,000 2,583 9,889 0,334 0,977
1 B 2,903 8,875 0,249 - 3,092 8,771 0,183 0,992
1 G 2,903 8,875 0,301 0,000 2,705 9,099 0,233 0,986
2 B 2,699 8,845 0,254 - 2,980 8,758 0,201 0,990 c 2 G 2,699 8,845 0,308 0,000 2,584 9,083 0,260 0,984
3 B 2,602 8,778 0,249 - 2,961 8,671 0,205 0,990
3 G 2,602 8,778 0,304 0,000 2,559 8,980 0,252 0,984
4 B 3,000 9,000 0,254 - 3,200 8,942 0,180 0,992
4 G 3,000 9,000 0,306 0,000 2,816 9,279 0,240 0,986
1 B 2,041 9,176 0,318 3,572 1,928 9,109 0,386 0,980
1 G 2,041 9,176 0,328 3,220 1,772 10,165 0,452 0,971
2 B 2,146 8,954 0,310 3,590 2,012 9,028 0,305 0,986 d 2 G 2,146 8,954 0,329 3,642 1,921 9,943 0,379 0,979
3 B 2,079 8,978 0,320 3,939 2,013 9,061 0,289 0,988
3 G 2,079 8,978 0,339 4,021 1,943 9,948 0,367 0,981 4 B 2,079 8,978 0,313 3,697 1,969 9,072 0,353 0,982 4 G 2,079 8,978 0,330 3,668 1,866 10,052 0,420 0,975
57
Sin embargo, para poder determinar cuál de los dos modelos presentaba un mejor ajuste, se
calculó la media aritmética del SE y la del R2 por microorganismo como se muestra en la Tabla
7. Los resultados obtenidos indican que para las cuatro cepas estudiadas, el modelo de Baranyi
tuvo el mejor ajuste con un SE menor y un R2 mayor comparado con el modelo de Gompertz.
Tabla 7. Evaluación de la bondad de ajuste de los modelos predictiv os. Réplica (R). Error estándar (SE). Coeficiente de determinación (R2).
Baranyi Gompertz Curva de
crecimiento R SE R2 SE R2 1 0,2240 0,9912 0,34496 0,97924
2 0,2348 0,9905 0,35063 0,97872 L. plantarum 3 0,2790 0,9862 0,36785 0,97603
4 0,3137 0,9826 0,39036 0,97314 Media 0,2629 0,9876 0,36345 0,97678 1 0,1934 0,9917 0,26030 0,98490 2 0,2147 0,9901 0,28270 0,98290
L. paracasei 3 0,2171 0,9900 0,28960 0,98230 4 0,2600 0,9862 0,33450 0,97700 Media 0,2213 0,9895 0,29178 0,98178 1 0,1825 0,9917 0,23335 0,98645
2 0,2013 0,9903 0,25997 0,98378 E. coli 3 0,2048 0,9897 0,25227 0,98435
4 0,1802 0,9921 0,24020 0,98597 Media 0,1922 0,9909 0,24645 0,98514 1 0,3864 0,9800 0,45173 0,97122 2 0,3050 0,9863 0,37893 0,97882
L. monocytogenes 3 0,2888 0,9880 0,36658 0,98073 4 0,3529 0,9821 0,42003 0,97466
Media 0,3333 0,9841 0,40432 0,97636
Para el modelo de Baranyi 94% y para el de Gompertz 56% de los SE estuvieron por debajo de
0,35 y el 100% de los R2 para ambos casos estuvieron por encima de 0,95. Adicionalmente, los
R2 de los dos modelos fueron analizados estadísticamente, donde la prueba de T arrojó
diferencias signif icativas para las cuatro cepas (Anexo 9), lo cual indicó que el modelo de
Baranyi generó valores de R2 más altos. Adicionalmente, el modelo de Gompertz modif icado
presentó ciertas dif icultades para establecer la duración de la fase lag de las BAL y de E. coli,
que con el modelo de Baranyi fueron omitidas en su mayoría.
58
Estos resultados establecieron que la ecuación de Baranyi presentó, efectivamente, un ajuste
superior a la ecuación modif icada de Gompertz, por lo cual el modelo de Baranyi se seleccionó
para continuar con su ajuste a las demás curvas de crecimiento generadas en este trabajo.
6.1.3 DESARROLLO DE LOS MODELOS PRIMARIOS
Para el desarrollo del modelo primario se ajustó la ecuación de Baranyi a la totalidad de los
datos obtenidos por cada cepa microbiana. Cada curva de crecimiento se construyó con 72
datos de observación (cuatro réplicas con 18 puntos muestreados por cada cepa bacteriana). El
ajuste del modelo de Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) a las cuatro curvas de crecimiento
obtenidas para cada cepa se presenta en la Figura 19.
Figura 19 Ajuste a las curvas de crecimiento indiv idual en caldo MRS a 37°C por el Modelo de Baranyi. (a) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de L. plantarum. (b) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de L. paracasei. (c) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de E. coli. (d) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de L. monocytogenes. Línea roja: Modelo Baranyi. Puntos negros: Datos observados.
El análisis gráfico evidencia el buen ajuste del modelo de Baranyi a los datos experimentales
para las cuatro cepas en estudio (L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes)
cuando crecen de manera individual en caldo MRS durante 34 horas a 37°C. La curva de
a b
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UF
C/m
L
E. coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
log
UFC
/ml
T ie mpo (h)
c d
59
predicción (representada por la línea roja), no dif iere mucho de los datos observados (puntos
negros) y se encuentra muy cerca a ellos. De igual forma, con la Tabla 8 que presenta la
bondad de ajuste del modelo de Baranyi, con la estimación de los parámetros cinéticos, se pudo
concluir lo mismo, ya que el SE y del R2 presentaron valores adecuados de 0,230 y 0,986,
respectivamente.
Tabla 8. Bondad de ajuste del Modelo de Baranyi para curvas de crecimiento en cultiv o individual. C: Curva de crecimiento. a: L. plantarum. b: L. paracasei. c: E. coli. d: L. monocytogenes. n: Número de datos. C.I: Concentración inicial (log10 UFC/mL). C.M: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). T. Cto: Tasa de crecimiento (horas-1). SE (t): Error estándar de la tasa de crecimiento. F lag: Fase Lag en horas. SE (lag): SE de la fase Lag. T lag: Tasa de Lag. C.I.P: Concentración inicial predicha (log10 UFC/mL). C.M.P: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). SE (log M): SE del log10 UFC/mL máximo. SE: Error cuadrado. R2: Coeficiente de determinación.
C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag
(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log
M) SE R2
a 72 2,591 9,398 0,325 0,013 2,855 0,641 0,928 0,775 2,736 9,035 0,054 0,230 0,990 b 72 2,602 9,217 0,251 0,005 - - - - 3,076 9,274 0,063 0,224 0,989 c 72 2,602 9,000 0,251 0,005 - - - - 3,058 8,785 0,050 0,209 0,989 d 72 2,041 9,176 0,315 0,014 3,702 0,778 1,165 0,790 1,978 9,070 0,099 0,304 0,986 Los resultados de la Tabla 8 muestran que L. plantarum y L. monocytogenes presentaron las
tasas de crecimiento más altas mientras que L. paracasei y E. coli crecieron a igual velocidad
(0,251 de tasa de crecimiento por hora). Al realizar el ANOVA (Anexo 10) se pudo establecer
que tanto L. paracasei como E. coli tenían tasas de crecimiento signif icativamente diferentes a
L. plantarum y a L. monocytogenes y que L. monocytogenes crecía a una velocidad
signif icativamente diferente a L. plantarum. Las tasas de crecimiento obtenidas para los dos
patógenos (0,251 h-1 para E. coli y 0,315 h-1 para L. monocytogenes) fueron muy similares a las
que se encontraron con el Predictor, (http://www.combase.cc/predictor.html), en donde se
asignaron las mismas condiciones del proyecto (37°C, 34 horas de crecimiento, caldo de cult ivo
estándar, pH 5,5 a 7,0), encontrándose para E. coli tasas de 0,240 h-1 y de 0,330 h-1 para L.
monocytogenes. Esta coincidencia en los resultados sugiere que el comportamiento presentado
por las cepas estudiadas se encuentra dentro de los rangos microbiológicos establecidos en las
bases de datos y que su desarrollo en caldos estándar diferentes a MRS, es el mismo.
De igual forma, las tasas de crecimiento obtenidas para las cuatro cepas en cultivos individuales
coincidieron con las reportadas en diferentes estudios: Oh y Marshall (1993) obtuvieron tasas
de crecimiento para L. monocytogenes de 0,334h-1 cuando creció de manera individual en caldo
60
tripticasa soya a 35°C con pH 5,5. Kamau et al. (1990) también reportaron para L.
monocytogenes tasas de 0,372h-1 en cultivos en leche semidescremada a pH 6,6. En otros
trabajos, Teo et al. (1996) reportaron tasas de crecimiento de 0,2146 h-1 para E. coli O157:H7
en caldo estándar a 35°C. Koutsoumanis et al. (2000) obtuvieron tasas de crecimiento de
0,2940 h-1 en caldo nutrit ivo a 20°C para BAL aisladas de pescado fresco.
Por otro lado, la fase lag del cult ivo de L. monocytogenes (3,7 horas) fue la más prolongada
entre los cuatro microorganismos estudiados, seguida por la de L. paracasei con 2,8 horas. Las otras dos cepas, de acuerdo con el estimado por el modelo de Baranyi no presentan fase lag
(Anexo 11). Sin embargo, la estimación de este parámetro de crecimiento para esta fase solo
fue aceptable como lo indicaron los valores relativamente altos del SE. Así mismo al observar
las curvas de crecimiento en la Figura 19 se puede apreciar que el modelo tiene dif icultades con
la determinación de una fase lag de corta duración y por consiguiente con su tasa de
aceleración por no estar claramente definida por los datos experimentales.
La fase lag que presentó L. monocytogenes en estas curvas de crecimiento también ha sido
observada por otros investigadores en diferentes estudios: El-Shenawy et al. (1990) reportaron
para esta bacteria fases lag de 3 horas cuando se cultivó a 35°C en caldo tripticasa soya a pH
7,0, y Pinon et al. (2004), obtuvieron fases lag entre 3 y 6 de duración, para L. monocytogenes a
10°C en productos cárnicos frescos.
En cuanto a la concentración inicial microbiana, no se encontraron diferencias signif icativas
entre las cuatro cepas estudiadas (Anexo 12), con lo que se puede afirmar que todas las curvas
de crecimiento realizadas iniciaron con la misma concentración de bacterias. Estos resultados
también reafirman los datos obtenidos durante la estandarización de inóculos (Anexo 7).
Al analizar los estimados de la concentración máxima alcanzada por los cuatro
microorganismos evaluados se encontraron diferencias signif icativas (Anexo 13), con excepción
de L. plantarum y L. monocytogenes que presentaron concentraciones máximas (log10 UFC/mL)
muy similares, de 9,035 y 9,070 respectivamente y mantuvieron un patrón de crecimiento similar
a lo largo de todas las curvas.
Los datos de concentración máxima alcanzada obtenidos en este estudio para las dos cepas
patógenas, son muy similares a las encontradas por el Predictor de Combase
(http://www.combase.cc/predictor.html) en donde se encontraron concentraciones de 8,7
61
log10UFC/mL y de 9,0 log10UFC/mL, para L. monocytogenes y E. coli, respectivamente, bajo
condiciones ambientales iguales a las del proyecto (37°C, 34 horas de crecimiento, caldo de
cultivo estándar, pH 5,5 a 7,0). Estos hallazgos resultan importantes porque permiten
demostrar que durante las curvas de crecimiento, las patógenas están recibiendo el tratamiento
adecuado para desarrollarse normalmente en el caldo MRS, aún sabiendo que este medio no
es el más idóneo para el cultivo de E. coli y L. monocytogenes.
Los resultados de la Tabla 8 para las máximas concentraciones alcanzadas, presentan gran similitud con los datos publicados por diferentes autores: El-Shenawy et al. (1990) reportaron
concentraciones máximas para L. monocytogenes de 8,7 log10UFC/mL a 35°C en caldo
tripticasa soya; y para E. coli, Ogwaro et al. (2002) encontraron concentraciones máximas de 10
log10UFC/mL en cultivos en leche pasteurizada a 30°C; y Buchanan et al. (1991) reportaron
concentraciones máximas de 8,6 log10UFC/mL para la BAL Carnobacterium piscicola en leche
UHT a 19°C. Estas coincidencias con los datos reportados en otros trabajos, sirvieron también
para ratif icar que el comportamiento de los patógenos estudiados en este trabajo fue muy
similar al que presentan diferentes cepas de la misma especie en otro tipo de matrices
alimentarias.
6.2 GENERACIÓN Y MODELADO DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO MIXTO EN CALDO MRS
6.2.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO
En la Figura 20, se presentan las curvas de crecimiento en cultivo mixto realizadas en caldo
MRS a 37°C donde se hace evidente que el crecimiento de las cepas patógenas (en rojo) se
alteró cuando se cultivaron de manera simultánea con las BAL (en azul).
Tanto E. coli como L. monocytogenes no alcanzaron las concentraciones celulares máximas
previamente alcanzadas en cultivos individuales (solo el 0,003%), presentando también en este
caso, una fase estacionaria con iniciación prematura en comparación con los cultivos
individuales (de 10 a 15 horas antes). Listeria monocytogenes presentó una ligera tendencia a
declinar después de las 25 horas de crecimiento, mientras que en E. coli este hecho no fue tan
marcado.
62
Figura 20. Curv as de crecimiento en cultiv o mixto en caldo MRS a 37°C. A: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curva s de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curva s de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En Azul: Cepas BAL. En Rojo: Cepas patógenas.
En cuanto a la fase lag, se encontró que Listeria monocytogenes presentó cuando se
encontraba en cultivo mixto con L. plantarum y L. paracasei, una fase lag más extendida (4 a 6
horas aproximadamente) que la mostrada en cultivo individual, mientras que E. coli en cultivo
mixto, al igual que en sus cultivos individuales, no presentó esta fase.
Por otro lado, L. plantarum y L. paracasei presentaron un comportamiento similar al observado
cuando se cultivaron de manera individual, lo cual sugiere que la interferencia en el crecimiento
L. plantar um + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)lo
g U
FC/m
L
L. p lantarum + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantar um + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + E. co li 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Ti empo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L . monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. par acasei + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. par acasei + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
A
B
C
D
63
de las patógenas no se debe al agotamiento de nutrientes en el medio (Efecto Jameson) y
podría estar más ligada a un antagonismo directo de las BAL debido a la producción de
sustancias inhibidoras y/o pH, presentándose as í un caso típico de amensalismo. En una
relación de amensalismo el crecimiento de un microorganismo (en este caso las BAL) no se vió
afectado por el crecimiento del otro microorganismo (en este caso E. coli y L. monocytogenes)
que si se vió inhibido por el primero, y tampoco toma ventaja de ninguna clase (Madigan, 1999).
Las BAL en cultivo mixto repitieron la ligera tendencia hacia un crecimiento bifásico. Entre los
patógenos, solo L. monocytogenes en co-cultivo con L. paracasei lo presentó.
6.2.2 DESARROLLO DE LOS MODELOS PRIMARIOS El modelo de Baranyi se ajustó a las curvas de crecimiento a partir de los datos observados y
los resultados de dicho ajuste se presentan en las Figuras 21 y 22 y en la Tabla 9.
Figura 21. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cultiv o mixto de L. plantarum en caldo MRS a 37°C. A. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. plantarum y E. coli. B. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. plantarum y L. monocytogenes. En azul: log10 UFC/mL observado de L. plantarum. En negro: log10 UFC/mL predicho de L. plantarum. En rojo: log10 UFC/mL observado de cepas patógenas. En verde: log10 UFC/mL predicho de cepas patógenas.
Como se hizo evidente al analizar los resultados del proceso de regresión no lineal la ecuación
de Baranyi describe adecuadamente el crecimiento de las dos cepas en cultivo mixto. El mayor
valor para el SE de 0,326 y el menor valor de R2 de 0,903 se obtuvo para el caso de L.
monocytogenes con L. plantarum. Los valores de los SE para todas las demás condiciones
estuvieron por debajo de 0,218 y los valores del R2 por encima de 0,965.
A BL. plantarum + E. coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UF
C/m
L
64
Figura 22. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cultiv o mixto de L. paracasei en caldo MRS a 37°C. A. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. paracasei y E. coli. B. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. paracasei y L. monocytogenes. En azul: log10 UFC/mL observado de L. paracasei. En negro: log10 UFC/mL predicho de L. paracasei. En rojo: log10 UFC/mL observado de cepas patógenas. En verde: log10 UFC/mL predicho de cepas patógenas.
Tabla 9. Comparación del Modelo de Baranyi para el crecimiento en cultiv o mixto de L. plantarum y E. coli, L. plantarum y L. monocytogenes, L. paracasei y E. coli, y L. paracasei y L. monocytogenes. A) L. plantarum y E. coli. B) L. plantarum y L. monocytogenes. C) L. paracasei y E. coli. D) L. paracasei y L. monocytogenes. C: Cepa. n: Número de datos. C.I: Concentración inicial (log10 UFC/mL). C.M: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). T. Cto: Tasa de crecimiento (horas-1). SE (t): Error estándar de la tasa de crecimiento. F lag: Fase Lag en horas. SE (lag): SE de la fase Lag. T lag: Tasa de Lag. C.I.P: Concentración inicial predicha (log10 UFC/mL). C.M.P: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). SE (log M): SE del log10 UFC/mL máximo. SE: Error estándar. R2: Coeficiente de determinación. A) L. plantarum (a) y E. coli (b)
C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag
(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log
M) SE R2
a 54 2,580 9,146 0,320 0,013 2,685 0,663 0,861 0,858 2,716 9,102 0,059 0,212 0,992
b 54 2,778 5,929 0,333 0,017 - - - - 2,767 5,754 0,028 0,170 0,965 B) L. plantarum (a) y L. monocytogenes (b)
C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag
(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log
M) SE R2
a 54 2,591 9,161 0,321 0,014 2,796 0,680 0,899 0,881 2,729 9,085 0,060 0,218 0,991
b 54 2,041 5,000 0,568 0,155 5,419 0,771 3,078 2,952 2,140 4,635 0,054 0,326 0,903 C) L. paracasei (a) y E. coli (b)
C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag
(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log
M) SE R2
a 54 2,845 9,204 0,250 0,005 - - - - 3,061 9,290 0,066 0,199 0,991
b 54 2,699 5,544 0,149 0,006 - - - - 2,971 5,311 0,023 0,120 0,978
A B
L. paracasei + E.coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
CFU
/mL
65
D) L. paracasei (a) y L. monocytogenes (b)
C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag
(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log
M) SE R2
a 54 2,778 9,204 0,253 0,005 - - - - 3,033 9,274 0,068 0,210 0,990
b 54 2,041 5,176 0,170 0,008 1,618 0,748 0,275 0,903 1,967 5,134 0,029 0,121 0,989
Cuando se compararon las tasas de crecimiento de las cepas en cultivo individual frente a las
tasas obtenidas de las mismas cepas pero en cultivos mixtos, no se encontraron diferencias
signif icativas para las BAL (L. plantarum y L. paracasei), pero sí para los dos patógenos (E. coli
y L. monocytogenes) (Anexo 10). Estos resultados demostraron que el comportamiento de las
BAL en las curvas no se alteró por el crecimiento en cult ivo mixto con las cepas patógenas. Por
el contrario, las patógenas al cult ivarse en asocio con las BAL sí modif icaron su
comportamiento.
En presencia de L. plantarum, E. coli aumentó su tasa de crecimiento en un 33% mientras que
al crecer con L. paracasei su tasa de crecimiento se redujo en un 41%. Comportamiento similar
se observó con L. monocytogenes en cult ivo mixto. En presencia de L. plantarum su tasa de
crecimiento se aceleró en un 80% mientras que creciendo con L. paracasei su velocidad de
crecimiento diminuyó en un 46%. Se sugiere que la aceleración en la velocidad del crecimiento
de E. coli y L. monocytogenes, puede estar relacionada con el t ipo de sustancias que se
producen en el medio durante el proceso de producción de BLIS por parte de L. plantarum, las
cuales podrían inducir mecanismos de defensa en los patógenos, que los llevan a acelerar su
tasa de crecimiento para contrarrestar el efecto antagónico (Maldonado et al., 2003).
Cuando se comparó la fase lag de L. plantarum en cult ivo individual versus la presentada en
cultivo mixto con los dos patógenos de manera independiente, no se encontraron diferencias
signif icativas (Anexo 11), lo cual concuerda con lo discutido anteriormente donde se afirmó que
el comportamiento de las BAL no resulta afectado cuando se cultivan en asocio con L.
monocytogenes y E. coli, representando así un caso de amensalismo.
Por otro lado, al realizar esta misma comparación pero teniendo como referencia los cult ivos de
L. monocytogenes de manera individual y en cultivo mixto, se encontró que esta cepa conserva
la fase lag descrita en sus curvas de crecimiento individual, aunque con variaciones en la
duración, pues su fase lag se redujo de 3,7 horas a 1,6 horas cuando se realizaron co-cultivos
con L. paracasei. Pero por el contrario, al cultivarse en asocio con L. plantarum, la fase lag del
patógeno aumentó a 5,4 horas, lo cual pudo deberse también a la interacción del patógeno con
66
los metabolitos de la BAL, que impidieron que su crecimiento inicial se desarrollara
normalmente.
El aumento en la tasa de crecimiento de los dos patógenos cuando se encuentran en cult ivo
mixto con L. plantarum, as í como el aumento en la duración de la fase lag de L. monocytogenes
podrían estar relacionados con la actividad metabólica de la BAL cuando inicia la producción de
BLIS, lo que puede provocar alteraciones en el comportamiento las bacterias asociadas.
Maldonado et al. (2003) reportaron que la presencia de bacterias como E. coli y Streptococcus
pneumonie en co-cultivo con L. plantarum, actúa como señalización ambiental que induce en la
BAL el mecanismo de producción de bacteriocinas a través de quórum sensing, proceso
durante el cual las sustancias liberadas al medio pueden interferir con el desarrollo normal de
las otras bacterias.
Adicionalmente se compararon estadísticamente las máximas concentraciones bacterianas
obtenidas por las cepas en cultivo individual, versus cuando crecieron en asocio con otros
microorganismos (Anexo 13). En el caso de L. plantarum se presentaron diferencias
signif icativas entre su comportamiento en cultivo individual frente a su comportamiento cuando
creció en co-cultivo con E. coli, donde su máximo recuento celular aumentó, pasando de 9,0 a
9,1 log10 UFC/mL. Sin embargo, se sugiere que estas diferencias a nivel estadístico se deben a
la uniformidad de los datos obtenidos y a la poca variabilidad de los resultados experimentales,
lo que a su vez produce mayor sensibilidad en las pruebas estadísticas, detectándose así las
diferencias mínimas, que en la realidad y para este estudio en particular, no resultan
importantes. Por el contrario, para L. paracasei no se presentaron diferencias signif icativas
cuando se compararon sus máximos recuentos a nivel mixto y a nivel individual.
Por otro lado, en cuanto a máximas concentraciones alcanzadas, para E. coli sí se presentaron
diferencias signif icativas (Anexo 13) cuando se cultivó en asocio con L. plantarum y con L.
paracasei, reduciendo en gran medida sus recuentos celulares, pues al cult ivarse de manera
individual, su máxima concentración alcanzó los 8,7 log10 UFC/mL, pero al cult ivarse con L.
plantarum, el patógeno llegó a 5,7 log10 UFC/mL y a 5,3 log10 UFC/mL cuando se cultivó con L.
paracasei. El crecimiento de E. coli se modif icó signif icativamente hacia la hora 10 post
incubación, donde se observó una reducción de su crecimiento de casi tres ciclos logarítmicos
con respecto al crecimiento individual. Esta reducción se mantuvo constante a partir de la hora
10 donde después de una fase exponencial corta se produjo una fase estacionaria constante
67
hasta las 34 horas de medición. En este caso el crecimiento de L. plantarum y L. paracasei
tampoco se afectó por el desarrollo del patógeno en cultivo mixto.
Diferentes estudios muestran reducción del crecimiento de E. coli en presencia de sustancias
inhibidoras como ácidos (ácidos clorhídrico, láctico, c ítrico), donde se comprueba que altas
concentraciones de estas sustancias pueden reducir el crecimiento de E. coli hasta cinco ciclos
logar ítmicos (McWilliam et al., 2002 y Buchanan et al., 1999). Así mismo, Cheng et al. (2001)
reportaron una reducción en el crecimiento de E. coli O157:H7 (de 6,0 a 3,5 log10 UFC/mL) cuando se cultivó en productos lácticos fermentados tipo yogur durante 140 horas a 7°C, pH
3,6; y Ogwaro et al. (2002) observaron que E. coli O157:H7 redujo su crecimiento de 8,5 a 6,3
log10 UFC/mL después de 140 horas de cultivarse a 4°C en un yogur fermentado por
Lactobacillus delbreuckii ssp. Bulgaricus y Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus.
Por otro lado, para L. monocytogenes también se presentaron diferencias signif icativas cuando
se cultivó en asocio con L. plantarum y con L. paracasei. Aproximadamente a partir de la hora
10 post incubación, cuando apenas se iniciaba la fase exponencial, el crecimiento de L.
monocytogenes se inhibió manteniéndose estable como en fase estacionaria hasta la hora 34
(último punto del muestreo). El crecimiento de L. monocytogenes en estos cultivos mixtos se
redujo casi cuatro ciclos logarítmicos comparado con los recuentos obtenidos en las curvas
individuales, pasando de 9,0 log10 UFC/mL a 4,6 log10 UFC/mL con L. plantarum y a 5,1 log10
UFC/mL con L. paracasei. En este caso, el crecimiento y el comportamiento de L. plantarum y
L. paracasei en el cultivo mixto tampoco se afectó por el crecimiento del patógeno, ya que todos
sus parámetros cinéticos permanecieron iguales tanto en sus cultivos individuales como en los
mixtos. Esta reducción en el crecimiento de L. monocytogenes con valores en ciclos
logar ítmicos similares a los obtenidos en este trabajo ha sido reportada en otros estudios y se
ha asociado a la interacción con bacterias ácido lácticas o a metabolitos antagónicos. Por
ejemplo, Amézquita y Brashears (2002) evaluaron la inhibición competitiva de L.
monocytogenes en alimentos listos para el consumo por bacterias ácido lácticas, reportando
una reducción en el crecimiento del patógeno de 5,2 a 2,0 log10 UFC/mL después de un
almacenamiento de 600 horas a 5°C; y Schillinger et al. (2001) evaluaron la eficacia de la nisina
en combinación con cultivos protectores contra L. monocytogenes Scott A en Tofú de
manufactura casera, donde observaron una reducción de dos ciclos logarítmicos en el
crecimiento de esta bacteria en presencia de 700UI/mL (Unidades Internacionales por mililitro)
de nisina a 10°C.
68
Como se estableció anteriormente en las curvas de crecimiento individual, la concentración
inicial de todas las curvas de crecimiento mixto, tampoco presentaron diferencias signif icativas
(Anexo 12). En forma gráfica las diferencias iniciales en cuanto a la concentración pueden
obviarse normalizando las curvas de crecimiento. Este procedimiento se realizó para evidenciar
que el patrón de las curvas en co-cultivo sigue siendo el mismo a pesar de estas variaciones y
que las pequeñas diferencias no signif icativas en la concentración inicial de microorganismos no
afectan el comportamiento general (Figura 23).
Figura 23. Curvas de crecimiento en cultivo mixto normalizadas en caldo MRS a 37°C. A: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli. B: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes. C: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli. D: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes. En Azul: Cepas BAL. En Rojo: Cepas patógenas.
A B
L. plantarum + E. coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + E.coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tie mpo (h)
log
UFC
/mL
C D
69
6.3 DETERMINACIÓN DEL PÉRFIL DE pH DURANTE EL CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL Y MIXTO DE LAS CEPAS BACTERIANAS
Paralelo a los recuentos bacterianos, se determinaron los valores de pH a lo largo del
crecimiento para cada uno de los cultivos, individuales y mixtos. En la Figura 24 se presenta el
comportamiento del pH en función del tiempo, simultáneo al crecimiento bacteriano, donde los
valores del pH representan la media ar itmética de las tres réplicas, siendo 0,09 el valor de
desviación estándar más alto calculado.
La evaluación del comportamiento del pH inicial de los cultivos individuales y mixtos no presentó
diferencia signif icativa en el ANOVA (Anexo 14), lo cual confirma igualdad de condiciones al
momento de comenzar las curvas de crecimiento.
Adicionalmente se realizó el mismo análisis para el pH final de los medios, que correspondió al
valor de pH más bajo obtenido a las 34 horas de crecimiento. Se presentaron diferencias
signif icativas cuando se compararon los pH de las curvas de crecimiento individuales y mixtas
en medio MRS (Anexo 14). Con excepción de L. plantarum y L. paracasei que no presentaron
variabilidad entre los valores de pH obtenidos cuando crecieron de manera individual frente a lo
observado cuando crecieron en asocio con los dos patógenos, los otros cultivos si presentaron
diferencias signif icativas cuando se compararon estadísticamente los valores de pH finales
obtenidos de los cultivos individuales frente a los obtenidos de los mixtos. Así, el pH final para el
cultivo individual de L. monocytogenes fue de 5,1 aproximadamente, mientras que en cultivo
mixto con L. plantarum y L. paracasei, el pH del medio alcanzó valores de 3,7 y 3,1
respectivamente. Estos resultados mostraron que cuando el patógeno creció en asocio con las
BAL, el comportamiento del medio a nivel de pH fue similar al presentado cuando las BAL
crecieron de manera individual, donde las BAL fueron responsables en gran parte de generar
una mayor acidez. Lo mismo ocurrió con el cultivo de E. coli que de manera individual alcanzó
un pH de 4,9 pero cuando creció en asocio con L. plantarum y L. paracasei el pH final se redujo
a 3,6 y a 3,1 respectivamente. Cuando se analizó el perf il de pH (los 18 puntos de muestreo) en
todas las curvas de crecimiento, se presentaron diferencias signif icativas entre el pH de L.
plantarum y L. monocytogenes a nivel de cultivos individuales Así mismo entre el de L.
paracasei y E. coli, y L. paracasei y L. monocytogenes. De esta forma se pudo determinar que
L. monocytogenes y E. coli presentaron un comportamiento igual frente a esta variable durante
los 18 puntos evaluados (Anexo 14).
70
Figura 24. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual y mixto en caldo MRS a 37°C. En verde: pH. En azul: Curvas de crecimiento predichas para BAL. En rojo: Curvas de crecimiento predichas para patógenas. En rombos negros: Curvas de crecimiento observadas para BAL. En triángulos blancos: Curvas de crecimiento observadas para patógenas.
L. par acasei
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
log
CFU
/mL
01
23456
7
pH
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
log
CFU
/mL
01234567
pH
E. coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
log
CFU
/mL
01234567
pH
L. monocytogenes
0
2
4
6
8
1 0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
logC
FU/m
L
0
12
3
4
56
7
pH
L. plantarum + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
L. plantarum + E. coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
L. paracasei + E.coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
L. paracasei + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
log
CFU
/mL
0
1
2
3
4
5
6
7pH
71
Los resultados de los análisis estadísticos y la observación de la Figura 24 mostraron que L.
paracasei produjo mayor acidez en el medio presentando valores de pH mucho más bajos que
los cultivos de las otras tres bacterias. Esta BAL alcanzó pH de 3,0 a partir de la hora 20 de
crecimiento.
En la Figura 24 se puede observar que la inhibición en el crecimiento de L. monocytogenes y E.
coli cuando se encontraban en cultivo mixto con L. plantarum no se relacionó directamente con
el pH del medio, pues ésta no coincidió con el inicio de la fase estacionaria que se observa en los patógenos, y tampoco pudo relacionarse con haber alcanzado el pH mínimo determinado en
sus cultivos individuales (4,9 para E. coli y 5,1 para L. monocytogenes), valores a partir de los
cuales, el crecimiento de los patógenos comenzó a desacelerarse.
De igual forma este hecho podr ía explicarse por la producción de metabolitos antimicrobianos
durante la fase exponencial de la BAL, donde las bacteriocinas podrían tener un papel
antagónico frente a E. coli y L. monocytogenes. Estos resultados coincidieron con lo reportado
por otros autores donde se demostró la efectividad de las bacteriocinas como inhibidores
naturales de patógenos en alimentos y cuya producción se da principalmente cuando el medio
se encuentra entre rangos de pH entre 6.0 y 5.0 (Jack, 1995; Talw alkar, 2003; Loessner, 2003).
También se sugiere que la reducción del crecimiento de L. monocytogenes y E. coli en los
cultivos mixtos con L. plantarum no se encuentra relacionada con agotamiento de nutrientes en
el medio (efecto Jameson), puesto que la BAL continúa creciendo normalmente, alcanzando las
mismas concentraciones que presentó en cultivo individual. Por otro lado, la inhibición que
presentó el crecimiento de L. monocytogenes y E. coli cuando se encontraban en cultivo mixto
con L. paracasei si podría estar más relacionada con la acidif icación del medio, pues ésta
coincide con el inicio de la fase estacionaria que se observa en los patógenos. Adicionalmente,
los cultivos de L. paracasei presentaron los valores de pH más bajos entre todos los cultivos,
llegando a pH entre 3,0 y 4,0, rango entre el cual ambos patógenos pueden verse afectados
disminuyendo su tasa de crecimiento (Escartin, 2000), ver también numeral 6.6.5 (Aproximación
al mecanismo inhibitorio de las BAL frente a las patógenas estudiadas) de la discusión f inal.
Finalmente, después de modelar el crecimiento en cultivo individual y mixto de L. plantarum, L.
paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS (correspondiente a la fase experimental
uno), se logró determinar que los modelos de Gompertz modif icado y Baranyi presentaron una
bondad de ajuste adecuada y fueron aptos para predecir el crecimiento microbiano de las cuatro
72
cepas en estudio a nivel individual y en cultivos mixtos. Sin embargo, el modelo de Baranyi
presentó mejor ajuste que la ecuación de Gompertz modif icada al evaluar los criterios de SE, R2
y estimación de parámetros.
Por otro lado, se observó que el crecimiento de los patógenos, E. coli y L. monocytogenes, se
redujo en cultivo mixto con las BAL. Mientras que el crecimiento de las BAL, L. plantarum y L.
paracasei, no se afectó con el crecimiento simultáneo de los patógenos, lo que sugiere un caso
de amensalismo. Esta inhibición del crecimiento de los patógenos al cultivarse con L. plantarum
no pudo correlacionarse de forma directa con la acidif icación del medio, ni con el agotamiento
de nutrientes y podría deberse a la producción de metabolitos antimicrobianos durante la fase
exponencial de la BAL. Pero la inhibición en el crecimiento de los patógenos al cultivarse con L.
paracasei sugiere estar más relacionada con el pH, debido a que la acidif icación del medio en
este caso se produjo de una forma más acelerada y de manera paralela a la entrada a la fase
estacionaria de L. monocytogenes y E. coli.
6.4 VALIDACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS
En este punto se presentan los resultados obtenidos para la fase dos de este estudio. Se
generaron las curvas de crecimiento individuales paras las cuatro cepas bacterianas (L.
plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes) y mixtas en leche entera UHT.
Posteriormente se realizó la validación de los modelos predictivos desarrollados en caldo MRS.
El proceso de validación de los modelos en leche contempló una validación gráfica y
matemática de los datos observados con los predichos.
6.4.1 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO INDIVIDUAL EN LECHE ENTERA UHT.
A partir del protocolo utilizado para la generación de curvas de crecimiento bacteriano
individuales en caldos estándar se obtuvieron tres curvas independientes el leche entera UHT a
37ºC para cada uno de los cuatro microorganismos evaluados. La Figura 25 presenta las tres
réplicas de las curvas de crecimiento obtenidas para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L.
monocytogenes.
73
Figura 25. Curv as de crecimiento en cultivo individual en leche entera UHT a 37°C. L. plantarum (A), L. paracasei (B), E. coli (C) y L. monocytogenes (D) en leche UHT a 37ºC (3 réplicas por cepa).
El análisis visual del conjunto de curvas de crecimiento evidencia que tanto E. coli como las dos
BAL (L. plantarum y L. paracasei) no presentaron una fase lag bien definida como si se observó
para L. monocytogenes que permaneció en proceso de adaptación durante aproximadamente 4
a 6 horas. Los cultivos de las cuatro cepas alcanzaron concentraciones máximas similares (9,0
log10 UFC/mL) en la fase estacionaria que se estableció entre las 25 y las 30 horas de
crecimiento.
Paralelo a los recuentos bacterianos, se obtuvieron los valores de pH a lo largo de las curvas de
crecimiento para cada uno de los cultivos. En la Figura 26 se presenta el comportamiento del
pH en función del t iempo, simultáneo al crecimiento bacteriano. Los valores del pH en las
gráficas representan la media ar itmética de las tres réplicas, siendo 0,09 la desviación estándar
más alta.
Se observa en la Figura 26 que las BAL acidif icaron la leche mucho más rápido que las cepas
patógenas y alcanzaron valores de pH entre 3 y 4 después de 24 horas de cultivo, siendo L.
paracasei la cepa que presentó los valores más bajos. Listeria monocytogenes y E. coli
presentan valores de pH cercanos a 5 después de 24 horas de cultivo.
L. pla nta rum 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40Tiemp o (h)
log
UFC
/mL
L. pla nta rum 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40Tiemp o (h)
log
UFC/
mL
L. pl anta rum 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40Tiemp o (h)
log
UFC
/mL
E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40Tiem po (h)
log
UFC/
mL
E. c ol i 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 4 0
T iempo ( h)lo
g U
FC/m
L
L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 4 0Tiemp o (h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 4 0T iempo ( h)
log
UFC/
mL
L. pa rac ase i 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiemp o (h)
log
CFU/
mL
L. parac ase i 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiemp o (h)
log
CFU
/mL
L. pa ra ca sei 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
CFU
/mL
L. m onocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 3 0 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
A
B
C
74
Figura 26. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual generadas en leche entera UHT a 37°C. En v erde: pH. En azul: log10 UFC/mL observada para BAL con tres réplicas. En rojo: log10 UFC/mL observada para patógenas con tres réplicas.
6.4.2 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO MIXTO EN LECHE ENTERA UHT.
En la Figura 27 se presentan las curvas de crecimiento en cultivo mixto realizadas en leche
UHT a 37°C con sus respectivas réplicas. Las gráficas claramente muestran que el crecimiento
de las cepas patógenas (en rojo) se modif icó cuando se cultivaron de manera simultánea con
las BAL (en azul).
La interferencia en el crecimiento de E. coli y L. monocytogenes fue evidente al observar que en
cultivo mixto, estas bacterias no alcanzaron las concentraciones celulares previamente
obtenidas cuando se cultivaron de manera individual (9,5 y 9,9 log10 UFC/mL respectivamente),
presentando en este caso una fase estacionaria prematura (hacia las 10 horas de crecimiento).
Cuando E. coli creció en asocio con L. plantarum su crecimiento solo llegó a concentraciones de
5,8 log10 UFC/mL y de 5,4 log10 UFC/mL cuando se cultivó con L. paracasei. De igual forma,
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
log
CF
U/m
L
0
12
34
5
67
pH
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
log
CF
U/m
L
01234567
pH
E. coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tie mpo (h)
log
CF
U/m
L
01234567
pH
L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
logC
FU/m
L01234567
pH
75
cuando L. monocytogenes creció en cultivo mixto con L. plantarum alcanzó concentraciones
máximas de 4,9 log10 UFC/mL y de 5,1 log10 UFC/mL con L. paracasei.
Figura 27. Curvas de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C. A: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En azul: log10 UFC/mL observada para BAL. En rojo: log10 UFC/mL observada para patógenas.
En todas las réplicas obtenidas para los cultivos mixtos de L. monocytogenes con BAL la
bacteria patógena presentó una marcada fase lag similar a la descrita cuando se cultivó de
L. plantar um + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tie mpo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + E. co li 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Ti empo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
L. plantar um + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Ti empo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. m onocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Ti empo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L . monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Ti empo (h)
log U
FC/m
L
L. par acasei + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40
Tiempo (h)lo
g U
FC/m
L
A
B
C
D
76
manera individual en leche a 37°C, y muy parecida a la que presentó también en las curvas
crecimiento mixtas obtenidas en MRS, cuya duración en todos los casos fue de 4 a 6 horas
aproximadamente.
Por otro lado, L. plantarum y L. paracasei presentaron un comportamiento similar al observado
cuando se cultivaron de manera individual, lo cual sugiere que la interferencia en el crecimiento
de las patógenas no se debe al agotamiento de nutrientes en el medio y podría estar más ligada
a una interacción de amensalismo debido a la producción de sustancias inhibidoras, como bacteriocinas y ácidos orgánicos, por parte de las BAL.
Igual que para las curvas individuales, paralelo a los recuentos bacterianos, se obtuvieron los
valores de pH a lo largo de las curvas de crecimiento para cada uno de los cultivos. En la Figura
28 se presenta el comportamiento del pH en función del tiempo, simultáneo al crecimiento
bacteriano. Los valores del pH en las gráficas representan la media aritmética de las tres
réplicas estudiadas, siendo 0,08, el valor de desviación estándar más alto calculado.
La Figura 28 muestra que el comportamiento del pH para los cuatro tipos de cultivo mixto es
muy similar al obtenido para los cultivos individuales de BAL alcanzando valores entre 3 y 4 en
todos los casos. De igual forma, El A NOVA no determinó diferencias signif icativas entre el pH
de los cultivos individuales de las BAL y sus respectivos cultivos mixtos (Anexo 14). En las
curvas también se puede observar que tanto para E. coli como para L. monocytogenes los
valores de pH mínimos alcanzados en los cultivos mixtos se encuentran por debajo del rango de
su pH óptimo de crecimiento.
Con respecto a la inf luencia del pH en el proceso de inhibición del crecimiento de las cepas
patógenas, se encontró que en la leche se presentó la misma tendencia observada en los co-
cultivos en caldo MRS. Con L. plantarum la inhibición del crecimiento (establecimiento de la
fase estacionaria) tanto de E. coli como de L. monocytogenes no pudo relacionarse claramente
con los mínimos valores de pH alcanzados tanto en co-cultivo como en los respectivos cultivos
individuales.
En los cult ivos mixtos de las cepas patógenas en asocio con L. paracasei sí podr ía sugerirse
una posible influencia del pH sobre la inhibición en el crecimiento de las primeras. La fase de
desaceleración coincidió con los valores mínimos de pH alcanzados por estas cepas en cultivo
77
individual (4,9 para E. coli y 5,1 para L. monocytogenes), donde la fase estacionaria se
estableció casi sincrónicamente con los valores de pH mínimos alcanzados por los co-cultivos.
Figura 28. Comportamiento del pH en curv as de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C. En verde: pH. En azul: log10 UFC/mL observada para BAL con tres réplicas. En rojo: log10 UFC/mL observada para patógenas con tres réplicas.
6.4.3 VALIDACIÓN DE LOS MODELOS DE CRECIMIENTO PREDICTIVOS
DESARROLLADOS EN CALDO MRS Se validaron en leche entera UHT los cuatro parámetros cinéticos de la ecuación de Baranyi
(Baranyi y Roberts, 1999). En la Tabla 10 se presentan los resultados obtenidos de las
predicciones de estos parámetros (tasa de crecimiento, fase lag, concentración inicial y
concentración máxima) para las curvas de crecimiento en cult ivos individuales y mixtos de L.
plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS a 37°C.
El análisis gráfico para determinar la bondad de ajuste y desempeño de los modelos predictivos
es un criterio muy importante y el primer paso en el proceso de su evaluación (Baranyi et al.,
1999). Las Figuras 29, 31, 33 y 35 presentan de forma visual el desempeño del modelo
L. plantarum + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Ti empo (h)
log
UFC/
mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
L. plantarum + E. co li
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pHL. paracasei + E.coli
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
log
UFC/
mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pHL. paracasei + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30
Tie mpo (h)
log
CFU
/mL
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
78
predictivo. La bondad de ajuste del modelo a validar se puede evaluar visualmente al ajustar el
modelo desarrollado en caldo estándar a los datos experimentales de crecimiento obtenidos, en
este caso, en leche entera UHT (Figuras 30, 32, 34 y 36).
Tabla 10. Parámetros cinéticos del modelo de Baranyi generado en MRS a 37°C para curvas de crecimiento en cultiv o individual y mixto.
Cultivo Tasa de
Crecimiento por hora
Fase lag en horas
Concentración Inicial predicha (log10 UFC/mL)
Concentración máxima predicha (log10 UFC/mL)
L. plantarum indiv idual 0,325 2,855 2,736 9,035 L. plantarum con E. coli 0,320 2,685 2,716 9,102 L. plantarum con L. monocytogenes 0,321 2,796 2,729 9,085 L. paracasei individual 0,251 - 3,076 9,274 L. paracasei con E. coli 0,250 - 3,061 9,290 L. paracasei con L. monocytogenes 0,253 - 3,033 9,274 E. coli indiv idual 0,251 - 3,058 8,785 E. coli con L. plantarum 0,333 - 2,767 5,754 E. coli con L. paracasei 0,149 - 2,971 5,311 L. monocytogenes indiv idual 0,315 3,702 1,978 9,070 L. monocytogenes con L. plantarum 0,568 5,419 2,140 4,635 L. monocytogenes con L. paracasei 0,170 1,618 1,967 5,134
Los factores bias o sesgo (Bf) y de exactitud (Af), propuestos por Ross (1996) como también
sus redefiniciones propuestas por Baranyi et al. (1999) se presentan en las Tablas 11, 12, 13 y
14. Adicionalmente se incluye el test del Ji cuadrado como otra prueba para determinar la
calidad del ajuste de los modelos.
6.4.3.1 Validación del modelo de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto
La Figura 29 presenta el ajuste del modelo predictivo de crecimiento desarrollado para el cult ivo
individual de L. plantarum y mixto con E. coli y L. monocytogenes. Las gráficas muestran que el
modelo presentó un buen ajuste en general ya que los valores predichos fueron muy próximos a
los datos observados tanto en cultivo individual (Figura 29a) como mixto (Figura 29b y c).
Sin embargo, para los cultivos mixtos el modelo presentó un mejor ajuste, pues al analizar la
Figura 29a de L. plantarum en cultivo individual se pudo observar que el modelo presentó una
ligera tendencia a subestimar los datos en la fase de desaceleración y estacionaria, que se
79
explica por un mejor crecimiento de L. plantarum en leche entera UHT que en medio MRS a
iguales condiciones.
En la Tabla 11 se presentan los criterios de evaluación de desempeño de los modelos de
predictivos de crecimiento en cultivo individual y mixto para L. plantarum. Los resultados
obtenidos demostraron que los modelos de crecimiento para este microorganismo tanto en
cultivo mixto como a nivel individual t ienen un buen desempeño. Tanto para el modelo
predictivo de crecimiento individual como para el de crecimiento en co-cultivo de L. plantarum
con E. coli y con L. monocytogenes la prueba de Ji cuadrado fue no signif icativa indicando el
buen ajuste de los modelos de estos modelos predictivos (Anexo 15).
Tabla 11. Validación del modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultiv o indiv idual y mixto.
(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o El Af para el modelo de crecimiento individual de L. plantarum según Ross (1996) presentó un
valor de 1,05 que equivale a un 5,0% de inexactitud en la predicción total del modelo
matemático. Al traducirse en términos de porcentaje de discrepancia %D según de Baranyi et
al. (1999) corresponde al 5,8%. Estos criterios de desempeño indicaron que este modelo
predictivo de crecimiento desarrollado en MRS t iene una exactitud del 94% aproximadamente.
Curva Af (1) %D
(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2
L. plantarum 1,05 5,84 0,96 (-) 3,91 N.S
L. plantarum con E. coli 1,03 3,66 1,00 (-) 0,11 N.S
L. plantarum con L. monocytogenes 1,03 3.40 1,00 (-) 0,07 N.S
80
Figura 29. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observ ados obtenidos de curvas en leche entera UHT a 37°C a: L. plantarum. b: L. plantarum y E. coli. c: L. plantarum y L. monocytogenes.
L. plantarum en cultivo mixto con E. col i
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC/
mL
a
b
c
81
Figura 30. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C Línea negra: Valores observados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: L. plantarum. b: L. plantarum y E. coli. c: L. plantarum y L. monocytogenes.
a
b
c
L. plantarum
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
L. plantarum en cultivo mixto con E. coli
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC/
mL
pred
icho
L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
82
Para los dos modelos predictivos de crecimiento en cultivo mixto, el Af según Ross (1996) fue
de 1,03 que se asemejó al calculado según Baranyi et al. (1999) en términos de porcentaje de
3,6 para el modelo de L. plantarum en co-cultivo con E. coli y de 3,4% para L. plantarum en co-
cultivo con L. monocytogenes. Con una exactitud de predicción de mínimo un 96,0% estos
modelos se pueden considerar confiables y aplicables para predecir comportamiento de L.
plantarum en leche entera UHT tanto en cult ivo individual como mixto. El modelo de crecimiento
individual para L. plantarum presentó un valor de 0,96 para el Bf según Ross (1996) y un % Bias
de (-) 3,9 según Baranyi et al. (1999) lo cual indicó que los valores predichos tendieron a diferir
subestimando los valores observados en aproximadamente 4,0%. El signo menos frente al %B
solo se refiere a que los modelos predictivos tienden a subestimar los datos experimentales.
En el caso de las curvas de crecimiento en cultivo mixto con E. coli y L. monocytogenes, el
modelo predictivo de crecimiento para L. plantarum presentó un ajuste casi perfecto a los datos
experimentales: según Ross (1996) el Af y el Bf fue de 1 y por otro lado según Baranyi et al.
(1999), el % Bias tuvo un valor de (-) 0,1% para el caso de L. plantarum en co-cultivo con E.
coli y de (-) 0,07% para L. plantarum en co-cultivo con L. monocytogenes.
El análisis de los valores de los criterios de desempeño anteriormente presentado y resumido
en la Tabla 11 confirma lo sugerido en la Figura 29, que muestra claramente el buen
desempeño tanto del modelo crecimiento predictivo individual como el de los modelos de
crecimiento predictivos para cultivos mixtos para describir los datos experimentales
determinados en leche entera UHT a 37ºC. Esta capacidad descripción de los modelos
predictivos para L. plantarum en cultivo individual y mixto con E. coli y L. monocytogenes
respectivamente se evidencia en la Figura 30, en las cuales los valores predichos se situaron
muy cerca de la línea de equivalencia. Los coeficientes de correlación calculados confirman
esta condición: r = 0.998 para el cultivo individual, r = 0.997 para L. plantarum en cultivo mixto
con E. coli y r = 0.998 para L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes.
6.4.3.2 Validación del modelo de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto
La Figura 31 muestra el ajuste de los modelos predictivos de crecimiento desarrollados en caldo
MRS a los datos experimentales de crecimiento obtenidos para el cultivo individual de L.
paracasei y mixto con E. coli y L. monocytogenes.
83
Se pudo apreciar que los modelos predictivos para el cult ivo individual y los cultivos mixtos
presentaron un buen ajuste como también lo demostraron los criterios para evaluar su
desempeño contenidos en la Tabla 12. La prueba de Ji cuadrado fue no signif icativa indicando
el buen ajuste de estos modelos predictivos; tanto para el modelo predictivo de crecimiento
individual como para el de crecimiento en co-cultivo de L. plantarum con E. coli y con L.
monocytogenes (Anexo 15).
Tabla 12. Validación del modelo en leche UHT a 37°C para curv as de crecimiento de L. paracasei en cultiv o mixto e individual.
Curva Af (1) %D
(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2
L. paracasei 1,08 9,12% 0,94 (-) 6,50% N.S
L. paracasei con E. coli 1,03 4,00% 1,00 (-) 0,41% N.S
L. paracasei con L. monocytogenes 1,03 3,76% 1,00 (-) 0,19% N.S
(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o
El modelo predictivo de crecimiento individual para L. paracasei, presentó un valor de Af y Bf de
1,08 y 0,94 respectivamente. Estos valores indicaron que el modelo predijo con una exactitud
del 92,0% con una ligera tendencia a subestimar del 6,0%. Si observamos los mismos criterios
modif icados según Baranyi et al. (1999) se llegó a resultados similares: una discrepancia entre
los datos observados y predichos del 9,0% con una tendencia a la subestimación del 6,5%. Al
igual que L. plantarum, L. paracasei tuvo un mejor desarrollo en leche entera UHT comparado
con MRS a iguales condiciones. Los modelos predictivos de crecimiento para L. paracasei en
asocio con E. coli y con L. monocytogenes presentaron un mejor ajuste a los datos
experimentales. Los factores de Af y Bf de 1,03 y 1,00 respectivamente para los dos modelos.
Aunque el Bf muestra un valor de 1,00 el ajuste de los modelos no es perfecto ya que los otros
factores de evaluación de desempeño determinados no lo confirman. Según el Af los modelos
predicen con una exactitud del 97,0% y se constata con el valor de D del 4,0%. Los modelos
predictivos de crecimiento para crecimiento mixto tienen una tendencia subestimar menor al
0,5% según el % de sesgo. La Figura 32 muestra que los valores predichos se encuentran muy
cercanos a la línea de equivalencia. Los coeficientes de correlación calculados confirman esta
condición: r = 0,995 para el cultivo individual y r = 0,997 para L. paracasei en cultivo mixto con
E. coli o con L. monocytogenes.
84
Figura 31. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observ ados obtenidos de curvas en leche entera UHT a 37°C. a: L. paracasei. b: L. paracasei y E. coli. c: L. paracasei y L. monocytogenes.
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
L. paracasei en cultivo mixto con E. coli
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
a
b
c
85
Figura 32. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C Línea negra: Valores observados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: L. paracasei. b: L. paracasei y E. coli. c: L. paracasei y L. monocytogenes.
a
b
c
L. paracasei
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
L. paracasei en cultivo mixto con E. coli
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
86
6.4.3.3 Validación del modelo de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. La Figura 33 presenta el ajuste del modelo de crecimiento desarrollado para E. coli en MRS
para describir los datos experimentales obtenidos en leche entera UHT a 37°C. El análisis
gráfico y la Tabla 13 muestran que el modelo predictivo de crecimiento presentó un buen
desempeño, pues la prueba de Ji cuadrado no signif icativa determinó que el modelo predictivo
si mostró un buen ajuste (Anexo 15).
Sin embargo, el modelo predictivo describió mejor el crecimiento en cult ivo mixto de E. coli ya
que en cultivo individual el modelo tendió a subestimar ligeramente sobre la fase de
desaceleración y la fase estacionaria de crecimiento.
Tabla 13. Validación del modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de E. coli en cultiv o mixto e individual.
Curva Af (1) %D
(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2
E. coli 0,06 6,55% 0,96 (-) 4,40% N.S
E. coli con L. plantarum 0,02 3,01% 1,00 (-) 0,31% N.S
E. coli con L. paracasei 0,03 3,64% 0,99 (-) 1,39% N.S
(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o
En cultivo individual el modelo predictivo para E. coli presentó un Af de 1,06, lo cual indicó que
el modelo predijo con una exactitud del 94,0%. El %D determinó una discrepancia entre lo
observado y lo predicho del 6,5%.
El valor de Bf de 0.96 muestra que el modelo predictivo de crecimiento tendió a subestimar en
un 4,0%. El criterio redefinido por Baranyi et al. (1999) es muy similar, pues el %B indicó una
subestimación del (-) 4,4%. Al igual que las BAL, E. coli creció mejor en leche entera UHT que
en MRS a iguales condiciones.
El modelo predictivo de crecimiento de E. coli en asocio con L. plantarum, predijo con una
exactitud del 98,0% (Af = 1.02) y según el criterio de Baranyi et al. (1999) el modelo discrepó
de 3,0% con los datos observados en leche entera UHT a 37ºC.
87
Resultados similares se obtuvieron para el modelo de E. coli en co-cultivo con L. paracasei,
donde el Af fue de 1,03 y el %D de 3,6. Al observar la Tabla 13, el modelo predictivo de E. coli
en asocio con L. plantarum, presentó un ajuste aparentemente perfecto a los datos
experimentales ya que el valor de Bf fue de 1.
Sin embargo el %B evidenció que, aunque pequeño, si hay una subestimación por parte del
modelo predictivo del (-) 0,3%. El modelo predictivo de crecimiento de E. coli en asocio con L.
paracasei no presentó casi sesgo con un Bf de 0,99 y un %B de (-) 1,4%, también con una
tendencia a subestimar.
La Figura 34 corroboró lo anteriormente explicado, pues los datos predichos se localizaron muy
cercanos a la línea de equivalencia, indicando buena exactitud de predicción para los modelos
tanto individual como mixto.
Los coeficientes de correlación de r = 0,997 para el cult ivo individual y de r = 0,994 para E. coli
en cultivo mixto con L. plantarum o L. paracasei confirman la buena capacidad de los modelos
predictivos para describir el crecimiento de este patógeno en leche.
6.4.3.4 Validación del modelo de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto
La Figura 35 presenta el modelos predictivos de crecimiento desarrollado en MRS para L.
monocytogenes describiendo los datos experimentales de crecimiento obtenidos para leche
entera UHT a 37ºC. Aunque el análisis visual indicó cierto desajuste del modelo predictivo para
la condición de crecimiento individual (Figura 35a), los criterios estadísticos indicaron un ajuste
adecuado (Tabla 14).
Para los tres modelos predictivos, el individual y los dos mixtos de L. monocytogenes con L.
plantarum y L. paracasei, la prueba del Ji cuadrado fue no signif icativa (Anexo 15).
88
Figura 33. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observ ados obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C. a: E coli. b: E. coli y L. plantarum. c: E. coli y L. paracasei.
E. coli en cultivo mixto con L. plantarum
02
468
1012
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
02468
1012
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
E. coli en cultivo mixto con L. paracasei
a
b
c.
89
Figura 34. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C. Línea negra: Valores observ ados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: E coli. b: E. coli y L. plantarum. c: E. coli y L. paracasei.
a
b
c
E. coli
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observadolo
g U
FC/m
L pr
edic
ho
E. coli en cultivo mixto con L. plantarum
2
3
4
5
6
7
2 3 4 5 6
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
E. coli en cultivo mixto con L. paracasei
2
3
4
5
6
7
2 3 4 5 6
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
90
Tabla 14. Validación del modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultiv o mixto e indiv idual.
Curva Af (1) %D
(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2
L. monocytogenes 0,19 21,03% 0,84 (-) 19,04% N.S
L. monocytogenes con L. plantarum 0,06 8,00% 1,00 (-) 0,28% N.S
L. monocytogenes con L. paracasei 0,03 3,81% 1,00 (-) 0,46% N.S
(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o
Para el modelo predictivo de crecimiento individual para L. monocytogenes se determinó un Af de 1,19, lo cual indicó que el modelo predijo con una exactitud del 81,0%. Este resultado se
corroboró con el valor del %D obtenido del 21,0%. Al analizar los factores de sesgo Bf y %B se
estableció de manera matemática que el modelo predictivo presentó una tendencia algo más
marcada que en las situaciones anteriores con L. plantarum, L. paracasei y E. coli a subestimar.
El valor de Bf fue de 0,84 y el %B de (-) 19,0% para el cultivo individual de L. monocytogenes en
condición individual en leche entera UHT a 37ºC. El crecimiento de L. monocytogenes se
favoreció en leche entera UHT, de manera más importante que las otras tres cepas estudiadas.
Los modelos predictivos para L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum y L.
paracasei presentaron un ajuste bueno. Para el cultivo de L. monocytogenes con L. plantarum
el modelo predictivo presentó una exactitud de mínimo del 92,0% (Af = 1,06 y %D = 8,0%). En
crecimiento simultáneo con L. paracasei, el modelo para L monocytogenes predijo con una
exactitud de mínimo 97,0% (Af = 1,03 y %D = 4,0%). Aunque los factores de sesgo (Bf) para los
dos cultivos mixtos de L. monocytogenes presentaron un valor de 1, el %B evidenció una
subestimación del (-) 3,0% y del (-) 5,0% para L. monocytogenes con L. plantarum y con L.
paracasei respectivamente.
La Figura 36 muestra la representación gráfica de lo anteriormente expuesto. La Figura 36a
presenta la subestimación generalizada de L. monocytogenes en cultivo individual y el mejor
desempeño del modelo predictivo de L. monocytogenes en cultivo mixto L. paracasei (Figura
36c).
91
Figura 35. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observados obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C. a: L. monocytogenes. b: L. monocytogenes y L. plantarum. c: L. monocytogenes y L. paracasei.
a
b
c
0
24
6
810
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei
0246
81012
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC/m
L
L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum
L. monocytogenes
02
46
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
logU
FC
/mL
92
Figura 36. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curvas en leche entera UHT a 37°C Línea negra: Valores observ ados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: L. monocytogenes. b: L. monocytogenes y L. plantarum. c: L. monocytogenes y L. paracasei.
a
b
c
L. monocytogenes
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10
log UFC/mL observado
log
UFC/
mL
pred
icho
L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum
2
3
4
5
6
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
log UFC/mL observado
log
UFC
/mL
pred
icho
L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei
2
3
4
5
6
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
log UFC/mL observado
log
UFC/
mL
pred
icho
93
Los coeficientes de correlación también reflejan este comportamiento: r = 0,994 para el cult ivo
individual y de r = 0,997 para L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei. El modelo
predictivo L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum (Figura 36b) presenta un r de
0,971 con ligeros problemas de predicción en la fase estacionaria.
Finalmente, la validación de los modelos predictivos de crecimiento evidenció que todos los
modelos desarrollados en caldo MRS para cult ivos individuales y mixtos presentaron un buen
desempeño con una tendencia generalizada a subestimar ligeramente y son aptos para su
aplicación en leche UHT a 37ºC, siendo los modelos desarrollados para cultivos mixtos los que
mostraron siempre un mejor desempeño.
6.5 MODELACIÓN PRELIMINAR DE CURVAS EXTENSAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO
MIXTO
Las curvas de crecimiento en cult ivo mixto, tanto en MRS como en leche entera UHT a 37ºC,
con una extensión de 34 horas (Figuras 20 y 27) evidenciaron que las cepas patógenas, L.
monocytogenes y E. coli, tendían a disminuir su concentración hacia la fase f inal después de 26
horas de crecimiento. Este fenómeno fue más pronunciado para L. monocytogenes en asocio
con L. plantarum. Por esta razón se decidió construir curvas de crecimiento en cult ivo mixto más
extendidas en el t iempo, de 82 horas, para evaluar el comportamiento después de las 34 horas.
En esta sección se presentan los resultados correspondientes a la tercera fase experimental.
Las curvas de crecimiento generadas en cultivo mixto en medio de cultivo estándar y leche
entera UHT a 37ºC mostraron claramente que las concentraciones de los patógenos seguían
disminuyendo en función del tiempo.
6.5.1 CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS
6.5.1.1 Generación de curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en caldo MRS
Durante 82 horas (17 puntos de muestreo) se evaluó el comportamiento de cada una de las
cuatro cepas al cultivarse en asocio con otro microorganismo. En la Figura 37 se presentan las
curvas de crecimiento para cultivos mixtos realizadas en caldo MRS a 37°C, donde se hizo
94
evidente que el crecimiento de las cepas patógenas (en rojo) se alteró cuando se cultivaron de
manera simultánea con las BAL (en azul).
Figura 37. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en caldo MRS a 37°C. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curva s extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En azul: Cepas BAL. En rojo: Cepas patógenas.
Cuando L. monocytogenes se cultivó en asocio con L. plantarum en caldo MRS a 37°C, el
recuento celular del patógeno llegó a cero hacia las 66 horas de incubación, mientras que
cuando creció con L. paracasei la concentración más baja alcanzada fue de aproximadamente
L. plantar um + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantar um + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiem po (h)
log
UFC/
mL
L. plantarum + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Ti empo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L . monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. par acasei + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. par acasei + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiem po (h)lo
g U
FC/m
L
A
B
C
D
95
1,6 log10 UFC/mL después de las 80 horas de incubación. Por otro lado, en estas curvas de
crecimiento extendidas las BAL también empezaron a declinar en concentración. La
concentración f inal de L. plantarum fue de 6,0 log10 UFC/mL y de L. paracasei de 6,1 log10
UFC/mL.
La Figura 37 también muestra que cuando E. coli y L. monocytogenes se cultivaron en asocio
con L. plantarum en caldo MRS a 37°C, aproximadamente hacia las 74 horas de incubación el
recuento celular de los patógenos llegó a cero, mientras que cuando crecieron con L. paracasei la concentración más baja alcanzada fue de aproximadamente 2,6 log10 UFC/mL y de 2,0 log10
UFC/mL para E. coli y L. monocytogenes respectivamente después de las 80 horas de
incubación.
En el caso de los co-cultivos de L. plantarum con las bacterias patógenas se evidenció que
estas últimas declinan en concentración a una tasa mayor que L. plantarum: L. monocytogenes
descendió a una tasa de aproximadamente de 0,085 h-1, E. coli de 0,107 h-1 y L. plantarum de
0,053 h-1. Cuando las patógenas se iniciaron en cult ivo con L. paracasei se obtuvo una
disminución bastante paralela de las dos cepas: L. monocytogenes declinó a una tasa de
aproximadamente 0,050 h-1, E. coli de 0,062 h-1 y L. paracasei de 0,050 h-1.
6.5.1.2 Determinación del perfil de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las cepas bacterianas en MRS
Paralelo a los recuentos bacterianos, se determinaron los valores de pH a lo largo del
crecimiento para cada uno de los cultivos mixtos. En la Figura 38 se presenta el
comportamiento del pH en función del tiempo, simultáneo al crecimiento bacteriano, donde los
valores de pH representan la media aritmética de tres réplicas con una desviación estándar
máxima de 0,08.
Cuando se analizó el perf il de pH (los 17 puntos de muestreo) en todas las curvas de
crecimiento, se pudo determinar que el cult ivo mixto de L. plantarum con L. monocytogenes
presentó un pH estable entre 3.7 y 3.6 a partir de la hora 34. Estos valores de pH también se
presentaron en el cultivo mixto de L. plantarum con E. coli, pero a partir de la hora 20 post-
incubación.
96
Por otro lado, los cultivos mixtos de L. paracasei en asocio con E. coli y con L. monocytogenes,
presentaron valores mínimos de pH entre 3.2 y 3.0 que se estabilizaron a partir de la hora 20
aproximadamente. Estos resultados demostraron que L. paracasei acidif icó el medio más
rápido que la otra BAL y alcanzó valores de pH más bajos.
Al observar la Figura 38, y como ya se discutió en el numeral 6.2.2.2, la inhibición del
crecimiento de L. monocytogenes y E. coli, en cultivo mixto con L. paracasei pudo relacionarse
con el pH del medio, por la entrada a fase estacionaria de los patógenos paralela al descenso del pH.
Figura 38. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en caldo MRS a 37°C con el comportamiento del pH. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes C: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes. En verde: pH del cultivo mixto. En negro: pH de patógeno en cultivo individual. En azul: log10 UFC/mL de BAL. En rojo: log10 UFC/mL de patógenas.
A B
L. plantarum + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
1 0
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UF
C/m
L
0
2
4
6
8
10
pH
L. paracasei + E.coli
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
2
4
6
8
10
pH
L. paracasei + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 7 0 84Tiempo (h)
log
CF
U/m
L
0
2
4
6
8
10
pH
L. plantarum + E. col i
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 8 4
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
2
4
6
8
10
pH
C D
97
Para el caso de L. plantarum en cult ivo mixto con L. monocytogenes o E. coli, la causa de la
inhibición del patógeno no se pudo relacionar claramente con el descenso del pH durante el
cultivo. Podr ía sugerirse que en estos co-cultivos la inhibición del patógeno podría estar
relacionada con la producción de metabolitos antimicrobianos durante la fase exponencial de la
BAL, donde compuestos BLIS podr ían tener un papel antagónico frente a E. coli y L.
monocytogenes.
6.5.1.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en MRS
Las curvas de crecimiento extendidas no presentaron el patrón tradicional sigmoidal que incluye
solo tres fases principales: fase lag, fase log y fase estacionaria. Las curvas de crecimiento que
se obtuvieron presentaron la fase adicional de muerte o de declinación. Esto implicó que no se
podían utilizar los modelos generalmente empleados para describir el crecimiento microbiano
como son las ecuaciones de Gompertz modif icada (Gibson et al., 1988) y la de Baranyi (Baranyi
y Roberts, 1994).
Como en esta etapa tampoco se podían generar modelos dinámicos por no tener el
conocimiento necesario del sistema, se optó por ajustar modelos netamente descriptivos como
son las ecuaciones polinomiales.
Para justif icar el grado de complejidad requerido para obtener un buen ajuste se inició con una
función lineal (ecuación polinómica de primer grado) hasta llegar a una ecuación cúbica o
polinómica de tercer grado. El Anexo 16 presenta la justif icación de los parámetros relacionados
con la ecuación polinomial de tercer grado.
La Tabla 15 contiene el MSE, el r y R2 provenientes del análisis de regresión para los tres
modelos polinomiales ajustados a los datos experimentales. Como se hace evidente el modelo
cúbico presentó el mejor ajuste con valores de MSE entre 0.051 y 0.119 y valores de R2 entre
0.912 y 0.986.
Las Figuras 39 para L. plantarum, 40 para L. paracasei, 41 para E. coli y 42 para L.
monocytogenes muestran el ajuste adecuado del modelo cúbico con la ecuación
correspondiente para cada uno de los casos. Sin embargo, la aplicación de la prueba de falta de
98
ajuste arrojó resultados signif icativos determinando que el modelo polinómico de tercer grado
no era el más adecuado para describir los datos experimentales.
Se debe considerar que aunque el resultado de esta prueba estadística reflejó una falta
adecuada de ajuste, esta está influenciada por las características del sistema con un error puro
menor que el esperado en un contexto experimental biológico.
Tabla 15. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. r: Coeficiente de Correlación. R2: Coef iciente de Determinación. MSE: Error del Modelo
Modelo Lineal Modelo Cuadrático Modelo Cúbico Cultivo R MSE R2 MSE R2 MSE
L. plantarum con E. coli 0,403 2,804 0,930 0,465 0,986 0,067 L. plantarum con L. monocytogenes 0,385 2,873 0,932 0,449 0,986 0,065 L. paracasei con E.coli 0,489 2,702 0,901 0,680 0,977 0,119 L. paracasei con L. monocytogenes 0,384 3,205 0,913 0,620 0,978 0,095 E. coli con L. plantarum 0,761 1,691 0,947 0,426 0,979 0,084 E. coli con L. paracasei 0,462 0,857 0,867 0,276 0,912 0,108 L. monocytogenes con L. plantarum 0,764 1,243 0,917 0,487 0,978 0,069 L. monocytogenes con L. paracasei 0,451 0,876 0,894 0,225 0,952 0,051
En la literatura no se encontraron, hasta el momento, modelos predictivos para este tipo de
curvas completas: fase lag, exponencial, estacionaria y de muerte. Una primera y fácil
aproximación a la modelación de este tipo de curva de crecimiento es el uso de modelos
lineales segmentados. Sin embargo, en este tipo de modelos lineales fragmentados los puntos
de inflexión siempre son motivo de complejidad. Por lo tanto, se desarrollaron modelos
predictivos preliminares con solo la intención de describir el comportamiento microbiano de
manera continua. Al emplear modelos polinomiales, los parámetros de estas ecuaciones no
pueden relacionarse con parámetros cinéticos de crecimiento o de muerte microbiana. La
bondad de ajuste para este caso se evalúo mediante una prueba formal de falta de ajuste
donde se determinó la diferencia signif icativa entre el error por falta de ajuste y el error puro.
99
Figura 39. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. plantarum durante curv as de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: L. plantarum en cultivo mixto con E. coli. B: L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. plantarum observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
L. plantarum + E. coli
y = 5E-05x3 - 0,0091x2 + 0,4487x + 2,1409R2 = 0,9859
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. monocytogenes
y = 5E-05x3 - 0,0091x2 + 0,4524x + 2,1026R2 = 0,986
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
100
Figura 40. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. paracasei durante curv as de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: L. paracasei en cultivo mixto con E. coli. B: L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. paracasei observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
L. paracasei + E. coli
y = 6E-05x3 - 0,0107x2 + 0,5013x + 2,0546R2 = 0,9775
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + L. monocytogenes
y = 6E-05x3 - 0,0105x2 + 0,498x + 2,0508R2 = 0,978
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
101
Figura 41. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: E. coli en cultivo mixto con L. plantarum B: E. coli en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: E. coli observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
A
B
E. coli + L. plantarum
y = 5E-05x3 - 0,0083x2 + 0,3017x + 2,9548R2 = 0,9795
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
E. coli + L. paracasei
y = 4E-05x3 - 0,0059x2 + 0,236x + 3,1645R2 = 0,9123
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
102
Figura 42. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum B: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: L. monocytogenes observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
L. monocytogenes + L. plantarum
y = 6E-05x3 - 0,0086x2 + 0,3002x + 1,9727R2 = 0,9782
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes + L. paracasei
y = 4E-05x3 - 0,006x2 + 0,2411x + 1,7979R2 = 0,9527
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
103
6.5.2 CULTIVOS MIXTOS EN LECHE ENTERA UHT
6.5.2.1 Generación de curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en leche entera UHT
Al igual que en caldo MRS, se generaron en leche entera UHT tres réplicas independientes de
curvas extensas de crecimiento en co-cultivo por cada cepa bacteriana en estudio. Los cultivos
mixtos evaluados fueron: L. plantarum con E. coli, L. plantarum con L. monocytogenes, L.
paracasei con E. coli y L. plantarum con L. monocytogenes.
Durante 82 horas (17 puntos de muestreo) se evaluó el comportamiento de cada una de las
cuatro cepas al cultivarse en asocio con otro microorganismo. En la Figura 43 se presentan las
curvas de crecimiento mixtas realizadas en leche entera UHT a 37°C donde se hace evidente
que el crecimiento de las cepas patógenas (en rojo) se vio afectado cuando se cultivan de
manera simultánea con las BAL (en azul).
Tanto E. coli como L. monocytogenes no alcanzaron las concentraciones celulares máximas
previamente alcanzadas en cult ivos individuales (9,5 y 9,9 log10 UFC/mL en cult ivos individuales
y 5,8 y 5,0 log10 UFC/mL en cultivos mixtos, respectivamente). Sin embargo, el patrón de
comportamiento de las BAL fue muy similar para todos los co-cultivos alcanzando las
concentraciones celulares más bajas sobre las 82 horas aproximadamente de 7,0 log10
UFC/mL.
Entre las 70 y las 74 horas de incubación el recuento celular de L. monocytogenes llegó a cero
cuando se cultivó en asocio con L. plantarum en leche UHT a 37°C (Figura 43b). Escherichia
coli presentó un comportamiento similar a L. monocytogenes al cultivarse en asocio con L.
plantarum aunque las concentraciones celulares máximas fueron más altas para E. coli (5,8
log10 UFC/mL versus 5,0 log10 UFC/mL ) (Figura 43a).
Para el caso de los co-cultivos de L. paracasei con E. coli y L. monocytogenes se obtuvieron
patrones de crecimiento e inhibición similares para los dos patógenos. Las concentraciones
f inales no fueron de 0 UFC/mL, pero si disminuyeron a 1,6 log10 UFC/mL después de las 74
horas de incubación para L. monocytogenes (Figura 43d) y a 2,7 log10 UFC/mL para E. coli
(Figura 43c).
104
Los co-cultivos de BAL con patógenos presentaron un patrón de comportamiento similar
respectivamente en MRS y leche entera UHT a 37ºC como lo muestran la Figuras 37 y 43.
Figura 43. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curva s extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En azul: Cepas BAL. En rojo: Cepas patógenas.
L. plantar um + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantar um + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. p lantarum + L. monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiem po (h)
log
UFC/
mL
L. plantarum + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + E. coli 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + E. coli 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L. monocytogenes 1
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Ti empo (h)
log U
FC/m
L
L. paracasei + L . monocytogenes 2
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log U
FC/m
L
L. par acasei + L. monocytogenes 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. par acasei + E. coli 3
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiem po (h)
log
UFC
/mL
A
B
C
D
105
6.5.2.2 Determinación del perfil de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las
cepas bacterianas en leche entera UHT Paralelo a los recuentos bacterianos se determinaron los valores de pH a lo largo del
crecimiento para cada uno de los cultivos mixtos. La Figura 44 presenta el comportamiento del
pH en función del t iempo, simultáneo al crecimiento bacteriano, donde los valores del pH
representan la media aritmética de tres réplicas, siendo 0,09 el valor de desviación estándar
más alto calculado.
Cuando se analizó el perf il de pH (los 17 puntos de muestreo) en todas las curvas de
crecimiento en leche entera UHT, se pudo determinar que el cultivo mixto de L. plantarum con
L. monocytogenes presentó un pH estable entre 3,7 y 3,6 a partir de la hora 34. Estos valores
de pH también se obtuvieron para los cultivos mixtos de L. plantarum con E. coli, pero a partir
de la hora 20 post incubación.
Por otro lado, los cultivos mixtos de L. paracasei en asocio con E. coli y con L. monocytogenes,
presentaron valores mínimos de pH entre 3,2 y 3,0 que se estabilizaron a partir de la hora 20
aproximadamente. Estos resultados demuestran que L. paracasei tiende a acidif icar la leche
más rápido que la otra BAL y a alcanzar valores de pH más bajos al igual que como se observó
en caldo MRS.
Al igual que lo observado en los cultivos mixtos realizados en MRS, la inhibición del crecimiento
de L. monocytogenes y E. coli, en cultivo mixto con L. paracasei pudo relacionarse con el pH del
medio. Sin embargo, la inhibición del crecimiento de los patógenos por parte de L. plantarum
puede estar más relacionada con la presencia de sustancias inhibidoras.
6.5.2.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en leche entera UHT
Por las razones expuestas en el numeral 6.5.1.3 se ajustaron modelos netamente descriptivos
como son las ecuaciones polinomiales a los datos experimentales obtenidos para cultivos
mixtos en leche entera UHT. El Anexo 16 presenta la justif icación de los parámetros
relacionados con la ecuación polinomial de tercer grado.
106
Figura 44. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C con el comportamiento del pH. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes C: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes. En verde: pH del cultivo mixto. En negro: pH de patógeno en cultivo individual. En azul: log10 UFC/mL de BAL. En rojo: log10 UFC/mL de patógenas.
La Tabla 16 contiene el MSE, el r y R2 provenientes del análisis de regresión para los tres
modelos polinomiales ajustados a los datos experimentales. El modelo cúbico presentó el mejor
ajuste con valores de MSE entre 0,053 y 0,119 y valores de R2 entre 0,907 y 0,980.
Las Figuras 45 para L. plantarum, 46 para L. paracasei, 47 para E. coli y 48 para L.
monocytogenes muestran el ajuste adecuado del modelo cúbico con la ecuación
correspondiente para cada uno de los casos.
A B
L. plantarum + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
1 0
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UF
C/m
L
0
2
4
6
8
10
pH
L. paracasei + E.coli
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 7 0 8 4
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
2
4
6
8
10pH
L. paracasei + L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 7 0 84Tiempo (h)
log
CFU
/mL
0
2
4
6
8
10
pH
L. plantarum + E. col i
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 8 4
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
0
2
4
6
8
10
pH
C D
107
Como para el caso anterior, la aplicación de la prueba de falta de ajuste arrojó resultados
signif icativos determinando que el modelo polinómico de tercer grado no era el más adecuado
para describir los datos experimentales.
De igual manera se debe considerar que aunque el resultado de la prueba estadística reflejó
una falta adecuada de ajuste, ésta fue determinada por las características del sistema con un
error puro muy pequeño. Tabla 16. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultiv os mixtos en leche UHT a 37°C. r: Coeficiente de correlación. R2: Coeficiente de determinación. MSE: Error del Modelo.
Modelo Lineal Modelo Cuadrático Modelo Cúbico Cultivo R MSE R2 MSE R2 MSE
L. plantarum con E. coli 0,551 2,323 0,912 0,574 0,980 0,094 L. plantarum con L. monocytogenes 0,551 2,323 0,910 0,584 0,977 0,085 L. paracasei con E.coli 0,489 2,702 0,901 0,680 0,975 0,119 L. paracasei con L. monocytogenes 0,491 2,701 0,897 0,713 0,970 0,109 E. coli con L. plantarum 0,767 1,607 0,947 0,411 0,975 0,095 E. coli con L. paracasei 0,462 0,857 0,867 0,276 0,907 0,108 L. monocytogenes con L. plantarum 0,782 1,011 0,935 0,333 0,977 0,087 L. monocytogenes con L. paracasei 0,464 0,838 0,890 0,227 0,961 0,053
Finalmente, se determinó que las curvas de crecimiento extendidas en cult ivo mixto, tanto en
MRS como en leche entera UHT, mostraron que el crecimiento de los patógenos, E. coli y L.
monocytogenes, no solamente no alcanzaron las concentraciones máximas para sus cultivos
individuales sino que presentaron una fase de muerte más marcada que las BAL,
especialmente para L. monocytogenes cuyos recuentos celulares después de las 66 horas
fueron de 0 UFC/mL. No obstante el resultado de la prueba de falta de ajuste, se puede decir
que la ecuación polinomial de tercer grado describió de manera satisfactoria el comportamiento
de las cuatro cepas bacterianas en los respectivos cultivos mixtos.
108
Figura 45. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. plantarum durante curv as de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: L. plantarum en cultivo mixto con E. coli. B: L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. plantarum observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
L. plantarum + E. coli
y = 6E-05x3 - 0,0094x2 + 0,4487x + 2,1791R2 = 0,9802
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. plantarum + L. monocytogenes
y = 6E-05x3 - 0,0102x2 + 0,4753x + 2,1001R2 = 0,9772
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
109
Figura 46. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. paracasei durante curv as de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: L. paracasei en cultivo mixto con E. coli. B: L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. paracasei observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
L. paracasei + E. coli
y = 6E-05x3 - 0,0105x2 + 0,4943x + 2,0521R2 = 0,975
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei + L. monocytogenes
y = 7E-05x3 - 0,0106x2 + 0,4964x + 2,0517R2 = 0,9707
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
110
Figura 47. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: E. coli en cultivo mixto con L. plantarum B: E. coli en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: E. coli observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
E. coli + L. plantarum
y = 5E-05x3 - 0,0081x2 + 0,2938x + 2,9363R2 = 0,9752
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
E. coli + L. paracasei
y = 4E-05x3 - 0,0057x2 + 0,2253x + 3,2624R2 = 0,9072
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
111
Figura 48. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum B: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: L. monocytogenes observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.
L. monocytogenes + L. plantarum
y = 4E-05x3 - 0,0069x2 + 0,2405x + 2,3459R2 = 0,9772
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes + L. paracasei
y = 4E-05x3 - 0,0061x2 + 0,2384x + 1,9915R2 = 0,9613
0
2
4
6
8
10
0 14 28 42 56 70 84
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
A
B
112
6.6 DISCUSIÓN FINAL
6.6.1 ANÁLISIS COMPARATIVO DEL COMPORTAMIENTO DE LOS PARÁM ETROS
CINÉTICOS ENTRE LOS MODELOS EN CALDO MRS Y EN LECHE ENTERA UHT PARA CULTIVOS INDIVIDUALES Y MIXTOS.
Los resultados contenidos en el numeral 6.4 sobre validación, demostraron que los modelos
predictivos desarrollados en MRS presentaron un buen desempeño y podían ser aplicados para
predecir el crecimiento de los cultivos individuales y mixtos en leche entera UHT a 37ºC no
obstante su tendencia generalizada a subestimar los datos experimentales. Este estudio, sin
embargo, no permitió ver de manera clara las diferencias y características en el crecimiento que
presentaron los cultivos individuales y mixtos cuando los cultivos se realizaron y MRS y leche
entera UHT respectivamente. Para tal f in, se realizó un análisis comparativo de los parámetros
cinéticos y de los valores de pH obtenidos en caldo MRS y en leche.
El ANOVA no arrojó diferencias signif icativas para los parámetros cinéticos de fase lag (Anexo
11), concentración inicial (Anexo 12) y pH (Anexo 14) calculados en caldo MRS versus los
obtenidos en leche entera UHT como se muestra en la Tabla 17
Tabla 17. Comparación de parámetros cinéticos y pH obtenidos en caldo MRS versus los obtenidos en leche entera UHT. CIP: Concentración inicial predicha (log10 UFC/mL). Tasa Cto: Tasa de crecimiento por hora. CMP: Concentración máxima alcanzada (log10 UFC/mL). N.S: No significativo. S: Significativo.
CULTIVO CIP Fase Lag Tasa Cto CMP pH L. plantarum individual N. S N. S S S N. S L. plantarum con E. coli N. S N. S N.S N. S N. S L. plantarum con L. monocytogenes N. S N. S N.S S N. S L. paracasei individual N. S N. S S S N. S L. paracasei con E.coli N. S N. S N.S N. S N. S L. paracasei con L. monocytogenes N. S N. S N.S S N. S E. coli individual N. S N. S S S N. S E. coli con L. plantarum N. S N. S N.S N. S N. S E. coli con L. paracasei N. S N. S N.S N. S N. S L. monocytogenes individual N. S N. S N.S S N. S L. monocytogenes con L. plantarum N. S N. S N.S N.S N. S L. monocytogenes con L. paracasei N. S N. S N.S N.S N. S
Cuando se compararon estadísticamente las tasas de crecimiento (Anexo 10) y las máximas
concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) (Anexo 13) en caldo MRS versus las obtenidas en
113
leche entera UHT se encontraron diferencias signif icativas para algunos cultivos individuales y
mixtos como se muestra en la Tabla 17. Sin embargo, en la Figura 49, donde se presentan las
curvas de crecimiento de los microorganismos con diferencias estadísticamente signif icativas,
se observó que el crecimiento de estos microorganismos era muy similar en caldo MRS y leche
entera UHT no obstante, que el crecimiento en caldo MRS fuera algo inferior que en leche
entera UHT.
Para L. plantarum en cult ivo individual se presentaron diferencias signif icativas en su tasa de crecimiento y en su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL). Esta BAL presentó un
mejor crecimiento en leche que en caldo MRS, alcanzando concentraciones un poco más
elevadas en la matriz alimentaria (0,6 ciclos logar ítmicos aproximadamente) y con tasas de
crecimiento mayores (3,2%). Estos resultados demostraron que la leche entera constituyó un
medio de crecimiento con mejores condiciones nutricionales que el caldo MRS (Anexo 2), lo que
se reflejó en la subestimación de las predicciones del modelo desarrollado. Por otro lado, la
máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL) de esta BAL en cultivo mixto con L.
monocytogenes también presentó diferencias signif icativas (Anexo 13) y al igual que el caso
anterior se debe a las características f isicoquímicas de la leche que favorecen el crecimiento de
la BAL.
Para L. paracasei en cultivo individual también se presentaron diferencias signif icativas en su
tasa de crecimiento y en su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL). La BAL aumentó
su tasa de crecimiento en leche en un 3,9% y su máxima concentración alcanzada (log10
UFC/mL) en 0,8 ciclos logarítmicos aproximadamente. La máxima concentración alcanzada
(log10 UFC/mL) de esta BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes también presentó
diferencias signif icativas (Anexo 13) y al igual que el caso anterior se debe a las características
f isicoquímicas de la leche que favorecen el crecimiento de la L. paracasei (Figura 49b).
En la Figura 50 se presentan las curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L.
paracasei en asocio con L. monocytogenes, tanto en MRS como en leche entera UHT, donde
se puede observar que a pesar de presentar diferencias signif icativas en la máxima
concentración alcanzada (log10 UFC/mL), las BAL tienen un patrón de comportamiento muy
similar en ambos medios cuando crecen en co-cultivos con L. monocytogenes.
114
Figura 49. Modelos de crecimiento para cultivos individuales de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS yen leche entera UHT a 37°C. En azul: Modelos de crecimiento para cultivos individuales en leche UHT. En rojo: Modelos de crecimiento para cultivos individuales en caldo MRS. a: L. plantarum. b: L. paracasei. c: E. coli. d: L. monocytogenes.
Figura 50. Modelos de crecimiento para cultiv os mixtos de L. plantarum y L. paracasei en asocio con L. monocytogenes en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C. En azul: BAL en leche entera UHT. En rojo: BAL en caldo MRS. En verde: Patógeno en leche entera UHT. En naranja: Patógeno en caldo MRS. a: L. plantarum con L. monocytogenes. b: L. paracasei con L. monocytogenes.
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 2 5 3 0 35
Tiempo (h)
log
UF
C/m
L
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 1 5 2 0 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 1 0 15 20 25 3 0 35
Tiempo (h)lo
g U
FC/m
L
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 1 5 2 0 25 3 0 35
log
UFC
/ml
T ie mpo (h)
L. plantarum con L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 1 5 20 25 3 0 35
Tie mpo (h)
log
UF
C/m
L
L. paracasei con L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 1 5 20 25 3 0 3 5
log
UF
C/m
l
T iempo (h )
a b
115
Al comparar las tasas de crecimiento y las máximas concentraciones de E. coli en caldo MRS
versus las obtenidas en leche entera UHT se encontraron diferencias signif icativas para el
patógeno en cultivo individual (Anexos 10 y 13). Estas diferencias se presentaron, al igual que
en los casos anteriores, porque la bacteria presentó un crecimiento ligeramente mejor en leche
que en caldo MRS (Figura 49c), aumentando su tasa de crecimiento en un 2,7% y en 0,8 ciclos
logar ítmicos su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL).
Cuando se compararon las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) por L. monocytogenes en cultivo individual en los dos medios, se encontraron diferencias
signif icativas. La bacteria presentó un crecimiento ligeramente inferior en caldo MRS que en
leche entera UHT (Figura 49d), con una reducción de aproximadamente 0,7 ciclos logar ítmicos
con respecto a su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL).
Después de analizar el comportamiento de los cultivos, tanto individuales como mixtos, en los
dos medios estudiados (caldo MRS y leche entera UHT), se pudo concluir que las diferencias
existentes entre las tasas de crecimiento y las máximas concentraciones alcanzadas fueron
pequeñas no alterando el patrón de comportamiento de los cultivos que fue muy similar.
6.6.2 ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN CALDO MRS
Se compararon las tasas de crecimiento, las fases lag y las máximas concentraciones
alcanzadas obtenidas de los cultivos individuales versus los cultivos mixtos desarrollados en
MRS a 37°C. Este análisis se realizó con el f in de establecer si existían diferencias signif icativas
entre el comportamiento de los microorganismos cuando crecieron de manera individual, frente
a su comportamiento cuando lo hicieron en asocio con otros microorganismos.
Una forma sencilla de análisis lo constituye la determinación de coeficientes (parámetro cultivo
individual/parámetro cultivo mixto) para los tres parámetros mencionados. El valor de 1 para el
coeficiente signif icó por lo tanto equivalencia entre el parámetro cinético calculado para cult ivo
individual y el mixto. Valor superior a 1 representó un mayor valor para el parámetro cinético en
cultivo individual y un valor inferior a 1, un mayor valor para el parámetro cinético en cultivo
mixto.
116
6.6.1.1 Tasas de crecimiento
La Tabla 18 contiene los coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales
versus los cultivos mixtos con todas las réplicas en MRS a 37°C. Se presentaron diferencias
signif icativas al comparar las tasas de crecimiento de los patógenos en cult ivo individual versus
sus tasas en cultivo mixto con las BAL, en caldo MRS (Anexo 10) y como se reportó en el
numeral 6.2.2, en presencia de L. plantarum, E. coli aumentó su tasa de crecimiento en un 33%
mientras que al crecer con L. paracasei su tasa de crecimiento se redujo en un 41%.
Comportamiento similar se observó con L. monocytogenes en cultivo mixto, pues en presencia
de L. plantarum su tasa de crecimiento se aceleró en un 80% mientras que creciendo con L.
paracasei su velocidad de crecimiento diminuyó en un 46% (Tabla 18a y 18b).
Por causas no identif icadas experimentalmente, tanto E. coli como L. monocytogenes
incrementaron su tasa de crecimiento al crecer en asocio con L. plantarum. Este tipo de
respuesta se observa normalmente cuando las condiciones de crecimiento ambientales y
nutricionales se mejoran para un microorganismo en particular. En este caso las condiciones
permanecen constantes con relación a las presentes durante los cultivos individuales.
Cualquiera fuera la causa de este aumento en la tasa de crecimiento se indujo por el
crecimiento interactivo entre las dos cepas bacterianas: síntesis de algún factor de crecimiento
o cualquier tipo de compuesto con función de señal.
Tabla 18 Coeficientes ente las tasas de crecimiento de los cultiv os individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.
CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 E. coli 4
E. coli con L. plantarum 1 1,70 1,72 1,71 1,71 E. coli con L. plantarum 2 1,73 1,74 1,70 1,73 E. coli con L. plantarum 3 1,75 1,73 1,72 1,72 E. coli con L. paracasei 1 0,74 0,75 0,74 0,73 E. coli con L. paracasei 2 0,76 0,77 0,73 0,76 E. coli con L. paracasei 3 0,73 0,76 0,73 0,75
117
b.
CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3 L. mono 4
L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,89 1,91 1,92 1,92 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,88 1,89 1,91 1,92 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,87 1,89 1,90 1,89 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,67 0,61 0,65 0,64 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,59 0,62 0,65 0,63 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,65 0,61 0,63 0,60
c.
CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3 L. planta 4
L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,01 1,01 1,02 L. plantarum con E. coli 2 1,01 1,00 0,99 1,01 L. plantarum con E. coli 3 1,01 1,00 0,99 0,99
L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,02 1,10 1,00 1,02 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,01 1,01 0,99 0,98 L. plantarum con L. monocytogenes 3 0,99 1,00 0,98 1,02
d.
CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3 L. parac 4
L. paracasei con E. coli 1 1,01 1,02 1,00 1,01 L. paracasei con E. coli 2 1,02 0,98 1,01 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,01 1,01 1,00 0,99
L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 1,00 0,98 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,01 1,01 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,02 0,98 1,00 1,00
Al comparar el comportamiento de las tasas de crecimiento en los cultivos individuales versus
los mixtos para las BAL, se pudo determinar que no existen diferencias marcadas entre las
tasas de crecimiento de las bacterias cuando crecieron de manera individual frente a sus
cultivos mixtos con los patógenos y así mismo, en los ANOVA realizados, tampoco se
presentaron diferencias signif icativas al comparar estas tasas (Anexo 10). Estos resultados se
pueden observar en la Tabla 18c y 18d, donde los coeficientes obtenidos para cada caso son
muy cercanos a la unidad. Estos resultados confirman lo planteado en el numeral 6.2.2 donde
se sugiere que la interacción que se presenta al interior de los cultivos mixtos puede tratarse de
un caso de amensalismo, donde en este caso, las bacterias patógenas resultaron afectadas y
fueron inhibidas, mientras las BAL no modif icaron su comportamiento y se desarrollaron bajo
condiciones normales.
118
6.6.1.2 Fase Lag
En la Tabla 19 se presentan los coeficientes calculados para comparar las fases lag de los
cultivos individuales versus los cultivos mixtos con todas sus réplicas en MRS a 37°C. Los
coeficientes obtenidos para los cultivos de E. coli (Tabla 19a) y L. paracasei (Tabla 19d)
demostraron que no existen diferencias en este parámetro cinético para estas bacterias cuando
crecieron de manera individual frente a cuando crecieron en asocio con otros microorganismos.
Lactobacillus plantarum presentó esta misma tendencia de equivalencia entre las fases lag, cuando se compararon sus cultivos mixtos frente a sus individuales, lo cual se reflejó en los
cocientes con valores muy cercanos a la unidad en todas sus réplicas (Tabla 19c).
Cuando se compararon las fases lag de L. monocytogenes, se pudo determinar que la duración
de esta fase se redujo considerablemente (de 3.7 horas a 1,6 horas) cuando el patógeno creció
en cultivo mixto con L. paracasei (Tabla 19b), siendo 2,41 el coeficiente más alto obtenido,
dando diferencias signif icativas en el ANOVA realizado (Anexo 11). Sin embargo cuando se
compararon los cultivos individuales de L. monocytogenes con los mixtos en asocio con L.
plantarum se presentó un aumento de 5,4 horas en la duración de la fase lag, que se vió
reflejado en cocientes menores a 1, siendo 0.60 el coeficiente más bajo. Tampoco se
presentaron diferencias signif icativas en este caso (Anexo 11).
El comportamiento observado en la fase lag de L. monocytogenes se mostró contrario a lo
observado con las tasas de aceleración. La causa de este patrón de crecimiento permanece
aún desconocida. Sin embargo, ya para la construcción de los modelos dinámicos tendrá que
identif icarse el factor asociado a este comportamiento.
Tabla 19. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.
CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 E. coli 4
E. coli con L. plantarum 1 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 2 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 3 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 1 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 2 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 3 1,00 1,00 1,00 1,00
119
b.
CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3 L. mono 4
L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,12 2,03 2,41 2,21 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,56 1,32 1,52 2,16 L. monocytogenes con L. plantarum 3 2,00 1,89 1,86 2,14 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,73 0,69 0,76 0,68 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,85 0,62 0,73 0,77 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,72 0,60 0,74 0,81
c.
CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3 L. planta 4
L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 1,00 L. plantarum con E. coli 2 0,99 0,98 0,97 1,01 L. plantarum con E. coli 3 1,01 0,99 1,00 1,00
L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,00 1,02 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,02 1,01 0,97 0,99 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,03 0,98 1,00 1,01
d.
CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3 L. parac 4
L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 2 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,00 1,00 1,00 1,00
L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,00 1,00 1,00 1,00
6.3.1.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada
En la Tabla 20 se presentan los cocientes obtenidos para comparar las máximas
concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cult ivos individuales versus los cultivos
mixtos con todas sus réplicas en MRS a 37°C.
Los coeficientes con valores superiores a la unidad, demostraron una reducción en las
concentraciones alcanzadas por los patógenos cuando crecen en asocio con las BAL (Tabla
20a y 20b).
120
Tabla 20. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultiv os individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.
CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 E. coli 4
E. coli con L. plantarum 1 1,78 1,76 1,75 1,70 E. coli con L. plantarum 2 1,69 1,68 1,66 1,71 E. coli con L. plantarum 3 1,75 1,70 1,67 1,75 E. coli con L. paracasei 1 1,63 1,83 1,81 1,86 E. coli con L. paracasei 2 1,72 1,77 1,59 1,61 E. coli con L. paracasei 3 1,63 1,62 1,71 1,59
b.
CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3 L. mono 4
L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,82 1,76 1,72 1,76 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,78 1,75 1,71 1,73 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,80 1,75 1,74 1,70 L. monocytogenes con L. paracasei 1 1,95 1,90 1,91 1,95 L. monocytogenes con L. paracasei 2 1,98 1,89 1,92 1,86 L. monocytogenes con L. paracasei 3 2,01 1,95 1,96 2,02
c.
CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3 L. planta 4
L. plantarum con E. coli 1 1,01 1,00 0,99 1,01 L. plantarum con E. coli 2 0,99 0,99 1,00 0,99 L. plantarum con E. coli 3 1,00 0,99 1,00 1,00
L. plantarum con L. monocytogenes 1 0,99 1,00 1,00 0,99 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,00 0,99 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,00 0,99 1,00 1,00
d.
CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3 L. parac 4
L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 0,99 L. paracasei con E. coli 2 1,01 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 0,99 1,00 0,99 1,00
L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,01 1,00 1,01 L. paracasei con L. monocytogenes 2 0,99 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,01 1,00 1,00 1,00
En la Figura 51 se presenta en el comportamiento alterado de los patógenos cuando crecen en
asocio con las BAL, donde se pudo evidenciar que esta reducción del crecimiento en caldo
MRS a 37°C, de L. monocytogenes y E. coli puede ser hasta de 3 y 5 ciclos logar ítmicos (log10
121
UFC/mL) respectivamente. Cuando se compararon estadísticamente las máximas
concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) entre las patógenas en cult ivo individual, frente a
sus cultivos mixtos, se presentaron diferencias signif icativas (Anexo 13).
Por otro lado, al comparar el comportamiento de las máximas concentraciones alcanzadas
(log10 UFC/mL), en los cultivos individuales versus los mixtos para las BAL, se pudo determinar
que no existen diferencias signif icativas entre las concentraciones de las bacterias cuando
crecen de manera individual frente a sus cultivos mixtos con los patógenos (Anexo 13). Estos resultados se pueden observar en la Tabla 20c y 20d, donde los índices obtenidos para cada
caso fueron muy cercanos a la unidad.
La similitud en este parámetro cinético confirma lo planteado en el numeral 6.2.2 donde se
sugiere que la interacción que se presenta al interior de los cultivos mixtos puede tratarse de un
caso de amensalismo, donde en este caso, las bacterias patógenas resultaron afectadas y
fueron inhibidas, mientras las BAL no modif icaron su comportamiento y se desarrollaron bajo
condiciones normales. En la Figura 52 se presenta la similitud del comportamiento de las BAL
cuando crecen en asocio de manera individual y en asocio con las patógenas, en caldo MRS a
37°C.
Figura 51. Modelos de crecimiento para cultivos individuales y mixtos de cepas patógenas en caldo MRS a 37°C. a: E. coli. b: L. monocytogenes. En rojo: Patógenos en cultivo individual. En azul: Patógenos en cultivo mixto con L. plantarum. En v erde: Patógenos en cultivo mixto con L. paracasei.
a b
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC/
mL
L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)
log
UFC/
mL
122
Figura 52. Modelos de crecimiento para cultiv os individuales y mixtos de BAL en caldo MRS a 37°C. a: L. plantarum. b: L. paracasei. En rojo: BAL en cultivo individual. En azul: BAL en cultivo mixto con E. coli. En verde: BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes.
6.6.3 ANÁLISIS DE LOS PARÁM ETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN LECHE ENTERA UHT
Se compararon las tasas de crecimiento, las fases lag y las máximas concentraciones
alcanzadas obtenidas de los cultivos individuales versus los cultivos mixtos desarrollados en
leche entera UHT a 37°C. Este análisis se realizó con el f in de establecer si existían diferencias
signif icativas entre el comportamiento de los microorganismos cuando crecieron de manera
individual, frente a su comportamiento cuando lo hicieron en asocio con otros microorganismos.
Al igual que en el numeral anterior (6.6.2) se determinaron los coeficientes (parámetro cult ivo
individual/parámetro cult ivo mixto) para los tres parámetros mencionados.
6.6.3.1 Tasas de crecimiento
La Tabla 21 contiene los coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales
versus los cultivos mixtos con todas las réplicas en leche entera UHT a 37°C. Se presentaron
diferencias signif icativas al comparar las tasas de crecimiento de los patógenos en cultivo
individual versus sus tasas en cultivo mixto con las BAL (Anexo 10). En la Tabla 21a, se pudo
observar que E. coli aumentó su tasa de crecimiento al cult ivarse en asocio con L. plantarum,
presentando coeficientes por encima de la unidad y siendo 1,75 el valor más alto. Contrario a
esto, cuando E. coli creció en co-cultivo con L. paracasei su tasa de crecimiento disminuyó, lo
cual se vió reflejando por coeficientes por debajo de la unidad, siendo 0,71 el valor más bajo
(Tabla 21b). Este mismo patrón de comportamiento se observó en los cultivos mixtos de L.
monocytogenes y en la Tabla 21b se pudo observar que en asocio con L. plantarum se
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
log
UFC/
ml
Tiempo (h)
a b
123
obtuvieron coeficientes por encima de la unidad y en asocio con L. paracasei coeficientes por
debajo de ella, siendo 0,92 y 0,51 los coeficientes más alto y bajo, respectivamente.
Tabla 21. Coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultiv os indiv iduales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en leche entera UHT a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.
CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 4
E. coli con L. plantarum 1 1,71 1,70 1,73 E. coli con L. plantarum 2 1,71 1,72 1,75 E. coli con L. plantarum 3 1,65 1,69 1,66 E. coli con L. paracasei 1 0,74 0,74 0,75 E. coli con L. paracasei 2 0,79 0,80 0,81 E. coli con L. paracasei 3 0,72 0,71 0,74
b.
CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3
L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,91 1,92 1,91 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,85 1,90 1,82 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,83 1,85 1,84 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,51 0,51 0,52 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,62 0,65 0,60 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,52 0,56 0,54
c.
CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3
L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,02 1,00 L. plantarum con E. coli 2 1,01 1,04 0,98 L. plantarum con E. coli 3 1,01 1,01 0,90
L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,12 1,11 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,01 1,00 0,97 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,01 1,00 0,98
d.
CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3
L. paracasei con E. coli 1 1,01 1,03 1,01 L. paracasei con E. coli 2 0,99 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,02 1,03 1,01
L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 0,98 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,01 1,02 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 0,99 1,00 1,00
124
Al comparar el comportamiento de las tasas de crecimiento en los cultivos individuales versus
los mixtos para las BAL, se pudo determinar que no existen diferencias marcadas entre las
tasas de crecimiento de las bacterias cuando crecieron de manera individual frente a sus
cultivos mixtos con los patógenos y así mismo, en los ANOVA realizados, tampoco se
presentaron diferencias signif icativas al comparar estas tasas de crecimiento (Anexo 10). Estos
resultados se pueden observar en la Tabla 21c y 21d, donde los coeficientes obtenidos para
cada caso son muy cercanos a la unidad.
6.6.3.2 Fase Lag
En la Tabla 22 se presentan los coeficientes calculados para comparar las fases lag de los
cultivos individuales versus los cultivos mixtos con todas sus réplicas en leche entera UHT a
37°C. Los coeficientes obtenidos para los cultivos de E. coli (Tabla 22a) y L. paracasei (Tabla
22d) demostraron que no existen diferencias en este parámetro cinético para estas bacterias
cuando crecieron de manera individual frente a cuando crecieron en asocio con otros
microorganismos. Lactobacillus plantarum presentó esta misma tendencia de equivalencia entre
las fases lag, cuando se compararon sus cultivos mixtos frente a sus individuales, lo cual se vió
reflejado en los cocientes con valores muy cercanos a la unidad en todas sus réplicas (Tabla
22c).
Cuando se compararon las fases lag de L. monocytogenes, se pudo determinar que la duración
de esta fase se redujo de tres a horas a una hora, aproximadamente cuando el patógeno creció
en cultivo mixto con L. paracasei, siendo 3.64 el coeficiente más alto obtenido (Tabla 22b). En el
ANOVA realizado para este caso se presentaron también diferencias signif icativas (Anexo 11).
Sin embargo cuando se compararon los cultivos individuales de L. monocytogenes con los
mixtos en asocio con L. plantarum se presentó un aumento de tres horas aproximadamente en
la duración de la fase lag, que se vió reflejado en coeficientes menores a 1, siendo 0.67 el
coeficiente más bajo y no se presentaron diferencias signif icativas en este caso (Anexo 11).
125
Tabla 22. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en leche entera UHT a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.
CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3
E. coli con L. plantarum 1 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 2 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 3 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 1 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 2 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 3 1,00 1,00 1,00
b.
CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3
L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,23 3,64 3,20 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,54 2,55 2,39 L. monocytogenes con L. plantarum 3 2,01 1,96 1,84 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,71 0,73 0,68 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,75 0,76 0,71 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,71 0,70 0,67
c.
CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3
L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 L. plantarum con E. coli 2 0,92 0,97 1,07 L. plantarum con E. coli 3 0,95 1,08 0,98
L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,05 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 2 0,97 1,10 0,94 L. plantarum con L. monocytogenes 3 0,92 0,98 0,98
d.
CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3
L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 2 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,00 1,00 1,00
L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,00 1,00 1,00
126
6.6.3.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada
En la Tabla 23 se presentan los coeficientes obtenidos al comparar las máximas
concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cult ivos individuales versus los cultivos
mixtos con todas sus réplicas en leche entera UHT a 37°C.
Tabla 23. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultiv os individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en leche entera UHT a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.
CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3
E. coli con L. plantarum 1 1,66 1,65 1,70 E. coli con L. plantarum 2 1,64 1,63 1,68 E. coli con L. plantarum 3 1,64 1,63 1,68 E. coli con L. paracasei 1 1,53 1,51 1,56 E. coli con L. paracasei 2 1,52 1,50 1,55 E. coli con L. paracasei 3 1,52 1,51 1,56
b.
CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3
L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,80 1,76 1,77 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,79 1,75 1,76 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,80 1,76 1,77 L. monocytogenes con L. paracasei 1 1,99 1,94 1,95 L. monocytogenes con L. paracasei 2 1,99 1,95 1,96 L. monocytogenes con L. paracasei 3 2,00 1,95 1,96
c.
CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3
L. plantarum con E. coli 1 0,99 0,99 0,99 L. plantarum con E. coli 2 0,99 1,00 0,99 L. plantarum con E. coli 3 1,00 1,00 1,00
L. plantarum con L. monocytogenes 1 0,99 1,00 0,99 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,00 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,00 1,00 1,00
127
d.
CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3
L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 2 0,99 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 0,99 1,00 0,99
L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,01 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 2 0,99 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 0,99 1,00 1,00
Los coeficientes con valores superiores a la unidad, demostraron una reducción en las
concentraciones alcanzadas por los patógenos cuando crecen en asocio con las BAL (Tabla
23a y 23b).
En la Figura 53 se presenta en el comportamiento alterado de los patógenos cuando crecen en
asocio con las BAL, donde se pudo evidenciar que esta reducción del crecimiento en leche
entera UHT a 37°C, de L. monocytogenes y E. coli fue de hasta de 3 y 5 ciclos logar ítmicos
(log10 UFC/mL) respectivamente. Cuando se compararon estadísticamente las máximas
concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) entre las patógenas en cult ivo individual, frente a
sus cultivos mixtos, se presentaron diferencias signif icativas (Anexo 13).
Por otro lado, al comparar el comportamiento de las máximas concentraciones alcanzadas
(log10 UFC/mL), en los cultivos individuales versus los mixtos para las BAL, se pudo determinar
que no existen diferencias signif icativas entre las concentraciones de las bacterias cuando
crecen de manera individual frente a sus cultivos mixtos con los patógenos (Anexo 13). Estos
resultados se pueden observar en la Tabla 23c y 23d, donde los índices obtenidos para cada caso fueron muy cercanos a la unidad.
La similitud en este parámetro cinético confirma lo planteado en el numeral 6.2.2 donde se
sugiere que la interacción que se presenta al interior de los cultivos mixtos puede tratarse de un
caso de amensalismo, donde en este caso, las bacterias patógenas resultaron afectadas y
fueron inhibidas, mientras las BAL no modif icaron su comportamiento y se desarrollaron bajo
condiciones normales. En la Figura 54 se presenta la similitud del comportamiento de las BAL
cuando crecen de manera individual y en asocio con las patógenas, en leche entera UHT a
37°C.
128
Finalmente, cuando se compararon las tasas de crecimiento, las fases lag y las máximas
concentraciones alcanzadas de los cultivos individuales versus los cultivos mixtos desarrollados
en leche entera UHT, se obtuvieron resultados iguales a los obtenidos en MRS y se pudo
comprobar que el patrón de comportamiento de las bacterias tanto en cult ivo individual, como
mixto fue igual en los dos medios (Anexos 10, 11 y 13).
Figura 53 Modelos de crecimiento para cultiv os indiv iduales y mixtos de cepas patógenas en leche entera UHT 37°C. a: E. coli. b: L. monocytogenes. En rojo: Patógenos en cultivo individual. En azul: Patógenos en cultivo mixto con L. plantarum. En verde: Patógenos en cultivo mixto con L. paracasei. Figura 54. Modelos de crecimiento para cultiv os indiv iduales y mixtos de BAL en leche entera UHT a 37°C. a: L. plantarum. b: L. paracasei. En rojo: BAL en cultivo individual. En azul: BAL en cultivo mixto con E. coli. En verde: BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes.
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)
log
UFC/
mL
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35
log
UFC
/ml
T iempo (h)
a b
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 2 0 25 30 35
Tiempo (h)
log
UFC
/mL
L. monocytogenes
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 2 5 30 35
Tiempo (h)lo
g U
FC/m
L
a b
129
6.6.4 ANÁLISIS COMPARATIVO DEL pH ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS Y EN LECHE ENTERA UHT A 37°C
En la Figura 55 se presenta el comportamiento del pH en los cultivos individuales de L.
plantarum y L. paracasei desarrollados en MRS y en leche entera UHT a 37°C, comparado con
los valores obtenidos en sus cultivos mixtos. Con las curvas de pH contenidas en la Figura 55
se pudo comprobar lo planteado en el Anexo 14, donde se demostró que no existen diferencias
signif icativas entre el comportamiento del pH de los cultivos individuales de las BAL versus sus
cultivos mixtos con los patógenos tanto en caldo MRS como en leche entera UHT. Como se
mostró en la Tabla 17, se pudo confirmar que los valores del pH de estos cultivos fueron muy
similares en caldo MRS y en leche entera UHT. Por otro lado, en la Figura 56 se presenta el
comportamiento del pH en los cult ivos individuales de E. coli y L. monocytogenes desarrollados
en MRS y en leche entera UHT a 37°C, comparado con el que presentaron sus cultivos mixtos.
Figura 55. Comportamiento del pH en cultivos individuales y mixtos de las BAL en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. A: Cultivos de las BAL en MRS. B: Cultivos de las BAL en leche entera UHT. En rojo: pH de las BAL en cultivo indiv idual. En azul: pH de las BAL en cultivo mixto con E. coli. En verde: pH de las BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes.
L. paracasei en MRS
01
23
4
56
7
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
pH
01
23
4
56
7
pH
L. plantarum en MRS
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
L. paracasei en leche entera UHT
01
2
345
67
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
01
2
345
67
pH
L. plantarum en leche entera UHT
0
12
3
45
6
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
0
12
3
45
6
7
pH
A
B
130
Las gráficas en la Figura 56 permitieron concluir, al igual que lo discutido en el numeral 6.3, que
el pH de los cultivos mixtos con las cepas patógenas en asocio con las BAL, disminuyó
considerablemente al compararse con el pH de sus cultivos individuales. Adicionalmente se
pudo observar que el pH de los cultivos mixtos de los patógenos fue similar al presentado en los
cultivos individuales de las BAL, lo cual sugiere que la acidez que presentan los medios en los
cultivos mixtos, está mediada por la acción de las BAL con su producción de ácidos orgánicos.
También se pudo determinar que los cultivos mixtos con L. paracasei presentaron valores de pH
más bajos que los que se reportaron con L. plantarum, con una diferencia aproximada entre ambos de 0,6 y 0,7 unidades. Como se mostró en la Tabla 17, se pudo confirmar que los
valores de pH de los cultivos fueron muy similares en caldo MRS como en leche entera UHT,
respectivamente.
Figura 56. Comportamiento del pH en cultiv os individuales y mixtos de las bacterias patógenas en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. A: Cultivos de las patógenas en MRS. B: Cultivos de las patógenas leche entera UHT. En rojo: pH de las patógenas en cultivo individual. En azul: pH de las patógenas en cultivo mixto con L. plantarum. En v erde: pH de las patógenas en cultivo mixto con L. paracasei.
L. monocytogenes en MRS
0
12
3
4
5
67
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
0
12
3
4
5
67
pH
E. coli en MRS
0
1
2
34
5
6
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
0
1
2
34
5
6
7
pH
L. monocytogenes en leche entera UHT
0
12
34
5
67
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
0
12
34
5
67
pH
E. coli en leche entera UHT
0
12
34
5
67
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH
0
12
34
5
67
pH
A
B
131
6.6.5 APROXIMACIÓN AL M ECANISMO INHIBITORIO DE LAS BAL FRENTE A LAS PATÓGENAS ESTUDIADAS
Como se mencionó anteriormente en el numeral 6.3, la inhibición en el crecimiento de E. coli y
L. monocytogenes por parte de L. plantarum y L. paracasei en los cultivos mixtos estudiados en
este trabajo, puede deberse principalmente a efectos del ácido láctico producido por las BAL o a
sus metabolitos secundarios, tipo bacteriocinas, o incluso, a la acción combinada de ambos
factores. Por esto, y teniendo en cuenta que se ha publicado que bajo rangos de pH entre 3,0 y
4,0, el crecimiento de estos patógenos puede verse afectado disminuyendo su tasa de
crecimiento (Escartin, 2000), se realizó un estudio de viabilidad para determinar a qué valores
de pH resultaban afectadas las cepas de E. coli y L. monocytogenes empleadas en este trabajo.
Para el estudio de viabilidad se realizaron cultivos individuales de las cuatro cepas estudiadas
(L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes), en caldo MRS a 37°C por 24 horas.
Como control se utilizó caldo MRS estándar a pH 6.5. Se evaluaron en total nueve cultivos
bacterianos con diferentes valores de pH inicial (6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0 y 2,5), cuyo
ajuste se efectuó con HCL 0.1N. Después del periodo de incubación se sembraron 100µL de
cada cultivo en placas de MRS y se llevaron a incubar nuevamente por 24 horas a 37°C. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y las lecturas f inales se efectuaron mediante recuento
en placa.
En la Tabla 24 se presentan los resultados obtenidos del estudio de viabilidad donde se pudo
determinar que para las dos cepas patógenas la disminución del pH en el medio afectó
considerablemente su concentración inicial (9,0 log10 UFC/mL para E. coli), mientras que el
crecimiento de las BAL, por ser menos sensibles a bajos valores de pH, no se alteró cuando
crecieron en medios de mayor acidez. También se pudo establecer que la cepa de L
monocytogenes fue inhibida totalmente, presentando una concentración de 0 log 10 UFC/mL al
inocularse en los medios con pH de 3,5 y menores a él. Por otro lado, la cepa de E. coli resultó
inhibida y presentando recuentos de 0 log 10 UFC/mL cuando se inoculó en medios con pH de 3,0 y menores a este valor. Los resultados obtenidos concuerdan con los datos mencionados
anteriormente publicados por Escartin (2000).
Teniendo en cuenta los rangos de pH en que son inhibidas las cepas patógenas estudiadas en
este trabajo, se pudo hacer un análisis más detallado del comportamiento de esta variable en
132
las curvas de crecimiento mixto previamente desarrolladas y así establecer si el pH del medio
fue el factor responsable del efecto inhibitorio en cada caso.
Tabla 24. Evaluación del crecimiento de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS con diferentes valores de pH a 37°C por 24 horas.
En la Figura 57 se presenta el crecimiento de las BAL cuando se encuentran en cult ivo
individual y en cultivo mixto en caldo MRS, donde, como ya se ha discutido en esta sección, el
patrón de comportamiento permaneció siempre constante y su crecimiento no se alteró cuando
crecieron en asocio con las patógenas, por lo que se habla de amensalismo. En la misma
figura, se presenta también el perf il del pH de los cultivos individuales y mixtos de ambas BAL
con las dos patógenas de manera independiente, donde se pudo observar que el pH del medio
fue muy similar para los cult ivos individuales y mixtos de las BAL, (entre 4,0 y 3,5 para L.
plantarum, y entre 3,5 y 3,0 para L. paracasei), sobretodo para el caso de L. paracasei, cuyos
cultivos no presentaron mayores diferencias en cuanto a pH.
En la Figura 58 se presentan las curvas de crecimiento de las dos patógenas (E. coli y L.
monocytogenes), tanto en cult ivos individuales como en cultivos mixtos, con su correspondiente
curva de pH. En esta gráfica se pudo observar que cuando E. coli, al crecer en asocio con L.
plantarum, entró de manera prematura (después de 10 horas de crecimiento) a fase
estacionaria, el pH del medio se encontraba entre 5.0 y 4,5 rango entre el cual, teniendo en
cuenta los resultados de la Tabla 24, se presentó una ligera reducción en la viabilidad de la
cepa, sin alterar signif icativamente su concentración, por lo que se concluyó que la inhibición de
E. coli por parte de L. plantarum no se encuentra directamente relacionada con el pH del medio
y podría estar más asociada con la producción de bacteriocinas. La fase de desaceleración y la
fase estacionaria se establecieron antes de la aparición de condiciones estresantes de pH.
Recuento en placa (log 10 UFC/mL), 37°C por 24horas pH del medio L. plantarum L. paracasei E. coli L. monocytogenes
6,5 9,041392685 9,130333768 9 9,041392685 6,0 9 9,096910013 8,977723605 8,977723605 5,5 9,021189299 9,113943352 8,977723605 8,977723605 5,0 9 9,096910013 8,929418926 8,929418926 4,5 8,977723605 9,06069784 8,875061263 7,84509804 4,0 9 9,041392685 5,544068044 3,77815125 3,5 8,977723605 9,06069784 3,954242509 0 3,0 8,929418926 9,041392685 0 0 2,5 8,84509804 8,977723605 0 0
133
Figura 57. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultiv os individuales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas.
L. plantarum
01
23
45
6
7
89
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
MRS ind. MRS mix. E.coli MRS mix. L. mon.pH MRS ind. pH MRS mix. E. coli pH MRS mix. L.mon.Crecim. individual
pH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono
Mixto con E. coli Mix to con L. mono
L. paracasei
01
2
34
56
78
910
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
MRS ind. MRS mix. E. coli MRS mix. L.mon.pH MRS ind. pH MRS mix. E. co li pH MRS mix. L. mon.
Crecim. individualpH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono
Mixto con E. coli Mixto con L. mono
134
Figura 58. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cultiv os indiv iduales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas.
E. coli
0
1
2
3
45
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
MRS ind. MRS mix. L. plant. MRS mix. L. parac.pH Mrs ind. pH MRS mix. L.plant. pH MRS mix. L. parac.
Crecim. individual
pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei
Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracasei
L. monocytogenes
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
MRS ind. MRS mix. L. p lant. MRS mix. L. parac.pH MRS ind. pH MRS mix. L. plant. pH MRS mix. L. parac.
Crecim. individual
pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei
Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracasei
135
Para el estudio de verif icación de BLIS a partir de cultivos mixtos, se utilizó el mismo
procedimiento explicado anter iormente (Figura 13), pero evaluando sobrenadantes obtenidos a
partir de cult ivos de las BAL en asocio con las dos cepas patógenas. Los ensayos se realizaron
tanto en caldo MRS como en leche entera UHT y se realizaron por duplicado. Los resultados
de esta evaluación se presentan en la Tabla 25, donde también se incluyeron los resultados
obtenidos en los estudios anteriores a partir de cultivos individuales para facilitar su análisis.
Tabla 25. Verificación de BLIS a partir de sobrenadantes de cultiv os mixtos de las BAL y las cepas patógenas estudiadas en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C por 24 horas. SSN: Sobrenadante sin neutralizar. SN: Sobrenadante neutralizado.
Caldo MRS Leche entera UHT
Inhibición de L. monocytogenes
(mm de diámetro)
Inhibición de E. coli (mm de diámetro)
Inhibición de L. monocytogenes
(mm de diámetro)
Halos de Inhibición para E. coli (mm d e
diámetro) Cultivo
SSN SN SSN SN SSN SN SSN SN
Lactobacillus p aracasei 15 0 14 0 14 0 15 0
Lactobacillus plantarum 17 17 16 15 16 17 17 15
L. paracasei + L. monocytogenes
14 14 15 14 15 14 14 14
L. paracasei + E. coli 15 15 14 13 16 15 14 14
L. plantarum + L. monocytogenes 16 17 15 16 17 16 16 14
L. plantarum + E. coli 17 15 15 16 16 15 16 15
Los resultados presentados en la Tabla 25 coinciden en su mayor ía con lo reportado en el
Anexo 3. Sin embargo, se observó que a diferencia de los resultados de la verif icación de BLIS
anteriores, en este caso, con los sobrenadantes neutralizados de L. paracasei y obtenidos a
partir de sus cultivos mixtos con E. coli y L. monocytogenes, se inhibió el crecimiento de
ambos patógenos, sugiriendo la producción de bacteriocinas por parte de esta BAL, actividad
que anteriormente se había descartado.
Estos resultados coinciden con Maldonado et al. (2003) quienes reportaron que la presencia de
bacterias como E. coli y Streptococcus pneumonie en co-cultivo con L. plantarum, actúa como
señalización ambiental que induce en la BAL el mecanismo de producción de bacteriocinas a
través de quorum sensing, proceso durante el cual las sustancias liberadas al medio pueden
interferir con el desarrollo normal de las otras bacterias.
136
Estos resultados permitieron sugerir que la reducción en el crecimiento de E. coli en co-cultivo
con L. paracasei estuvo mediada por la disminución en el pH del medio hasta rangos
potencialmente inhibitorios, que coincidieron con la entrada a fase estacionaria del patógeno.
Este antagonismo, también pudo haberse debido a la producción de bacteriocinas por parte de
la BAL que desde el inicio del co-cultivo interf irieron con el desarrollo de E. coli así como se
presentó en la Figura 58.
Por otro lado, al analizar el comportamiento de L. monocytogenes en cultivo mixto con las dos BAL (Figura 58) se pudo determinar que cuando el patógeno creció en asocio con L. plantarum
ingresó de manera prematura (después de 12 horas de crecimiento) a fase estacionaria, el pH
del medio se encontraba entre 5.0 y 4,5 rango entre el cual, teniendo en cuenta los resultados
de la Tabla 24, se presentó una ligera reducción en la viabilidad de la cepa, sin alterar
directamente su concentración, por lo que se concluyó que la inhibición de L. monocytogenes
por parte de L. plantarum no se encuentra directamente relacionada con el pH del medio y
podría estar más asociada con la producción de bacteriocinas. Sin embargo después de 34
horas de crecimiento, al presentarse una disminución más signif icativa en el crecimiento del
patógeno, el pH del medio alcanzó valores inhibitorios, por lo que se sugiere que este factor
potencializa el antagonismo al f inal de la curva. Al igual que ocurrió con E. coli, cuando L.
monocytogenes creció en asocio con L. paracasei, su reducción en el crecimiento y su entrada
a fase estacionaria a partir de la hora 22 post incubación, coincidió con valores de pH
inhibitorios (Tabla 25), pues el pH del medio para este cult ivo mixto a dicha hora se encontraba
entre 3,5 y 3,0.
Sin embargo, como se observa en la Figura 58, desde el inicio de la curva, L. monocytogenes
en este co-cultivo, presentó un crecimiento atípico desde el principio, por debajo de su
crecimiento normal, lo cual sugiere que desde el inicio del cultivo se está presentando algún
factor antagónico, diferente al pH, que interf iere con el comportamiento del patógeno y como se
comprobó anteriormente, este factor puede obedecer a la interacción de bacteriocinas en el
medio producidas por L. paracasei.
En las Figuras 59 y 60 se presenta el comportamiento de las cuatro cepas estudiadas, en
cultivos individuales y mixtos, desarrolladas en leche entera UHT a 37°C. Este comportamiento
fue muy similar al presentado por las cepas en caldo MRS, donde también se sugiere que el pH
del medio y la producción de BLIS constituyen los principales mecanismos inhibitor ios. Sin
embargo, los cultivos mixtos desarrollados en leche entera UHT para L. monocytogenes en
137
asocio con las BAL, presentaron desde las primeras horas, niveles de crecimiento por debajo de
las concentraciones normales alcanzadas por el patógeno en cultivo individual, aunque
conservando el patrón general de inhibición (Figura 60).
Después de analizar el comportamiento de las cuatro cepas en estudio, en cultivo individual y
mixto, se pudo concluir que las diferencias existentes entre las tasas de crecimiento y las
máximas concentraciones alcanzadas que se presentaron al comparar los dos medios
estudiados (caldo MRS y leche entera UHT), fueron realmente pequeñas y no alteraron el patrón de comportamiento que fue muy similar para todos los casos.
Los resultados obtenidos demostraron que la leche entera constituyó un medio de crecimiento
con mejores condiciones nutricionales que el caldo MRS, ya que todos los microorganismos se
desarrollaron mejor en ella, lo que se reflejó en la subestimación de las predicciones del modelo
matemático desarrollado en caldo MRS.
El comportamiento del pH en los cultivos mixtos fue igual al presentado por las BAL a nivel
individual, lo que confirma que la acidif icación del caldo MRS y de la leche entera UHT está
mediada principalmente por las BAL. Este comportamiento también influyó en la reducción del
crecimiento de las patógenas en los cultivos mixtos.
Lactobacillus paracasei presentó actividad antagónica por sustancias BLIS frente a E. coli y L.
monocytogenes cuando se utilizaron sobrenadantes provenientes de cult ivos mixtos de la BAL y
las patógenas. Se pudo determinar que valores de pH menores a 3,5 inhibieron completamente
el crecimiento de L. monocytogenes y valores de pH menores a 3,0, el de E. coli. La reducción
en el crecimiento de E. coli y L. monocytogenes al crecer en asocio con L. plantarum se pudo
relacionar directamente con la producción de bacteriocinas por parte de la BAL. Los resultados
sugieren que el mecanismo inhibitorio de L. paracasei en los cultivos mixtos con E. coli y con L.
monocytogenes fue la acción conjunta del ácido láctico y de las bacteriocinas producidas por la
BAL desde el inicio del cult ivo mixto.
138
Figura 59. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultiv os individuales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas.
L. plantarum
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
Milk ind. Milk mix. E. coli Mi lk mix. L. monpH mi lk ind. pH milk mix. E. coli pH milk mix. L.mon.Crecim. individual Mixto con E. coli Mixto con L. mono
pH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono
L. paracasei
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
Milk ind. Milk mix. E. coli Milk mix. L. monpH milk ind. pH milk mix. E. coli pH milk mix. L. mon.
Crecim. individualpH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono
Mixto con E. coli Mixto con L. mono
139
Figura 60. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cultiv os indiv iduales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas.
E. coli
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
Milk ind. Mi lk mix. L. plant. Milk mix. L. parac.pH milk ind. pH mi lk mix. L.plant. pH milk mix. L. parac.
Crecim. individual
pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei
Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracas ei
L. monocytogenes
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34Tiempo (horas)
log
UFC
/mL
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
Milk ind. Milk mix. L. plant. Milk mix. L. parac.pH milk ind. pH milk mix. L.plant. pH milk mix. L. parac.Crecim. individual
pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei
Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracasei
140
CONCLUSIONES
1. El crecimiento de los patógenos en co-cultivo con BAL se redujo signif icativamente tanto
en caldo MRS como en leche entera UHT mientras que el crecimiento de las BAL no se
modif icó presentándose un claro caso de amensalismo. Esta relación de interferencia
fue evidente porque E. coli y L. monocytogenes modificaron sus patrones de comportamiento, disminuyendo sus máximas concentraciones alcanzadas, y entrando a
fases estacionarias prematuras (en comparación con sus cultivos individuales) en tanto
que las BAL no presentaron ningún tipo de variación en los cultivos mixtos.
2. El modelo de Baranyi se ajustó adecuadamente al crecimiento de las BAL y al de las
patógenas en cultivo individual y mixto en caldo MRS, describiendo con alta precisión el
comportamiento de las bacterias en cada caso. El buen desempeño del modelo se
reflejó en la similitud encontrada entre los datos observados a nivel experimental y las
estimaciones obtenidas a partir del modelo, de donde se obtuvieron valores altos en los
coeficientes de determinación y valores bajos en los errores estándar.
3. El modelo predictivo desarrollado para cultivos individuales y mixtos se validó
satisfactoriamente en leche entera UHT y se determinó a nivel estadístico que las
predicciones obtenidas de los modelos desarrollados en caldo MRS explican con
precisión los datos experimentales obtenidos a partir de las curvas de crecimiento
realizadas en leche entera UHT. También se estableció que la leche entera constituye
un mejor medio de cultivo para las cuatro cepas estudiadas, en comparación con el
caldo MRS, porque en todos los casos el desarrollo de los microorganismos fue mejor
en el alimento que en el medio estándar, observándose concentraciones microbianas
más elevadas en la leche.
4. En las curvas extensas de crecimiento, se observó que la fase de muerte en las
bacterias patógenas se estableció con anterioridad a la fase de muerte de las BAL y de
forma más acelerada en co-cultivos, lo cual está directamente relacionado con el
proceso de antagonismo que se evidenció en los cultivos mixtos, sugiriéndose también
141
que la disminución en el crecimiento de las patógenas no se encuentra asociada con
agotamiento de nutrientes y obedece más a inhibición por parte de las BAL.
5. El modelo polinomial de tercer grado describió de manera satisfactoria el
comportamiento de las cuatro cepas estudiadas en cultivo mixto, tanto en caldo MRS
como en leche entera UHT cuando se desarrollaron curvas de crecimiento extensas, lo
cual se confirmó por los altos valores obtenidos en los coeficientes de determinación en
cada caso. Sin embargo es necesario plantear nuevos modelos matemáticos a partir de los cuales se puedan explicar los parámetros cinéticos.
6. Los resultados sugieren que el factor pH y la producción de BLIS pueden estar
involucrados en el mecanismo de inhibición del crecimiento de las cepas patógenas en
co-cultivo con BAL. Se sugiere también que la inhibición de las patógenas cuando
crecieron en asocio con L. plantarum se encuentra más relacionada con la producción
de BLIS por parte de la BAL, que con la acción directa de la acidez del medio, pues la
caída del pH parece no coincidir con la entrada prematura a fase estacionaria por parte
de los patógenos. Por otro lado se sugiere que la disminución en el crecimiento de los
patógenos en los co-cultivos con L. paracasei tiene mayor relación con la acidif icación
del medio, puesto que hay mayor coincidencia entre los valores bajos de pH y la entrada
a fase estacionaria. Sin embargo, en este caso, la producción de BLIS también parece
estar asociada a la inhibición, sobretodo durante las primeras horas de crecimiento
donde tanto L. monocytogenes como E. coli presentaron un crecimiento rezagado desde
el principio.
7. Finalmente, se comprobó el gran potencial de las BAL dentro de los procesos de
biocontrol, como importantes inhibidores de patógenos en una matriz alimentaria y a
través de la microbiología predictiva se logró cuantif icar esta inhibición, estableciéndose
también una aproximación al mecanismo inhibitorio.
142
RECOMENDACIONES
1. Validación de los modelos predictivos para cultivos individuales y mixtos
desarrollados en caldo MRS para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en otras matrices alimentarias diferentes a leche.
2. Estudio del posible comportamiento bifásico del crecim iento microbiano observado
en caldo MRS y leche entera UHT para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L.
monocytogenes.
3. Estudio de cultivos m ixtos iniciados a diferentes concentraciones de BAL y
patógenos (E. coli y L. monocytogenes), con el fin de establecer el patrón de
crecimiento de los m icroorganismos y generar modelos secundarios que pueden ser
de gran aplicabilidad a nivel industrial.
4. Estudio de cultivos m ixtos con ot ras cepas de BAL y patógenos de origen
alimentario.
5. Estudio de cultivos m ixtos con cócteles de BAL y patógenos de origen alimentario.
6. Estudio de curvas extendidas de BAL con patógenos para completar la totalidad de
las fases de crecimiento y poder identificar el tipo de interacción entre ellas.
7. Seguimiento de las variables fi sico-químicas del medio de cultivo para la
construcción de modelos dinámicos.
8. Seguimiento de la producción de compuestos antimicrobianos durante el crecimiento
en cultivos m ixtos para la construcción de modelos dinámicos.
9. Verificación de la producción de BLIS por parte de las BAL en ot ras matrices
alimentarias y producción de BLIS en co-cultivos.
143
REFERENCIAS Amézquita, A. y Brashears, M. M. 2002. Competitive inhibition of Listeria monocytogenes in ready-to-eat meat products by lactic acid bacteria. J. Food Protection, 65: 316-325. Arocha, M., McVey, M., Loder, S., Rupnow, J., Bullerman, L. 1992. Behaviour of haemorrhagic Escherichia coli O157:H7 during the manufacture of cottage cheese. Journal of Food Protection. 55: 379 – 381. Barakat, R.K. y Harris, L.J. 1999. Grow th of Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica on cooked modif ied-atmosphere-packaged poultry in the presence and absence of a naturally occurring microbiota. Applied and Environmental Microbiology 65: 342 – 345. Baranyi, J. y Roberts, T.A. 2004. Predictive microbiology-quantitative microbial ecology. Culture, March. Consultado de la red mundial el 13 de Junio de 2006. Disponible en www.ifr.ac.uk/safety/comicro/Culture.25pdf. Baranyi, J., Pin, C., Roos, T. 1999. Validating and comparing predictive models. International Journal of Food Microbiology, 48: 159-166. Baranyi, J. y Roberts, T.A. 1994. Review paper: A dynamic approach to predicting bacterial grow th in food. International Journal of Food Microbiology, 23: 277-294.
Baranyi, J., Roberts, T.A. y McClure, P. 1993. A non-autonomous differential equation to model bacterial grow th. Food Microbiology. 10: 43-59. Barreto, G., Jiménez, O. y Díaz, S. 1998. E. coli verotoxigénico (VTEC): una nueva variedad; un nuevo riesgo. Rev. Productos Animales, 10: 5-26. Beerens, H., Luquet, F.M. 1990. Guía práctica para el análisis microbiológico de la leche y los productos lácteos. Acribia, Zaragoza. pp 83-91. Beumer, R.R., te Giffel, M.C., de Boer, E., Rombouts, F.M. 1996. Grow th of Listeria monocytogenes on sliced cooked meat products, Food Microbiol. 13: 333-340. Boone, D. R. 2001. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd edición. Vol 1: 1208-1234. Boyce, T.G., Swerdlow, D.L. y Griffin, P.M. 1995. E. coli O157:H7 and the hemolytic uremic syndrome. New England Journal of Medicine, 10: 364-368. Breidt, F. y Fleming, H.P. 1998. Modeling of the competitive grow th of Listeria monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth. Applied and Environmental Microbiology, 7: 3159-3165.
144
Buchanan, R.L. y Bagi, L. K. 1997. Microbial competition: Effect of culture conditions on the suppression of Listeria monocytogenes Scott A by Carnobacterium piscicola. Journal of Food Protection. 60: 254-261. Buchanan, R., Edelson, S. 1999. pH-Dependent Stationary-Phase Acid Resistance Response of Enterohemorrhagic Escherichia coli in the Presence of Various Acidulants. Journal of Food Protection. 62: 211–218. Caridi, A. 2002. Selection of Escherichia coli-inhibiting strains of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29: 303–308. Cayré, M.E., Vignolo, G., Garro, O. 2004. Modelo dinámico para el crecimiento de bacterias lácticas sobre emulsiones cárnicas. Universidad Nacional del Nordeste, Comunicaciones Científ icas y Tecnológicas. Volumen 8. pp. 76-90. Casadei, M.A., Mañas, P., Niven, G., Needs, E. y Mackey, B.M. 2002. The role of membrane f luidity in pressure resistance of Escherichia coli 8164. Applied and Environmental Microbiology. 68: 5965-5972. Chae, M., Schraft, H. 2000. Comparative evaluation of adhesion and biofilm formation different Listeria monocytogenes strains. International Journal of Food Microbiology, 62: 103-111. Cheng, H. y Hoover, D.G. 2003a. Bacteriocins and their food applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2: 82-100. Cheng, H. y Hoover, D.G. 2003b. Modeling the combined effect of high hydrostatic pressure and mild heat on the inactivation kinetics of Listeria monocytogenes Scott A in w hole milk. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 4, 25-34. Cheng, H.Y., Yang, H.Y. y Chou, C.C. 2001: Acid adaptation and temperature effect on the survival of E. coli O157:H7 in acidic fruit juice and lactic fermented milk product. International Journal of Food Microbiology 70:189-195. Cintas, L., Casaus, P., Fernandez, F. y Hernandez, P. E. 1998. Comparative antimicrobial activity of enterocin L50, pediocin PA-1, nisin A, and lactocin S against spoilage and foodborne pathogenic bacteria. Food Microbiology. 15: 289–298. Clavero, M.R., Beuchat, L.R. 1996. Survival of Escherichia coli O157:H7 in broth and processed salami as influenced by pH, w ater activity and temperature and suitability of media for its recovery. Applied Environmental Microbiology. 62: 2735-2740. ComBase, Combined Database of Microbial Responses to Food Environments. 2006. Food Standards Agency and the Institute of Food Research from the United Kingdom; the USDA Agricultural Research Service and its Eastern Regional Research Center from the United States; and the Australian Food Safety Centre of Excellence. Consultado de la red mundial el 10 de Agosto de 2006. Disponible en http://www.combase.cc/. Consejo Nacional de Educación para la Vida y El Trabajo (CONEVyT). 2006. Portal de matemáticas. Instituto Nacional de Educación para los Adultos (INEA). California. Consultado de la red mundial el 3 de Agosto de 2006. Disponible en Disponible en http://www.conevyt.org.us
145
COPAN Diagnostics Inc. (USA). 2005. Sistema CryoBankTM para conservación de cepas. Consultado de la red mundial el 9 de Marzo de 2006. Disponible en http://www.copanusa.com/html/spanishCryo.html Cutter, C., Henning, W. R. 2003. Control de Listeria monocytogenes en plantas pequeñas procesadoras de carnes y aves. College of Agricultural Sciences. Agricultural Research and Cooperative Extensión. Penn State. Vol 3. pp 55-72. Dalgaard, P. 2004. Predictive microbiology – concept, models and softw are. Consultado de la red mundial el 10 de Agosto de 2006. Disponible en http://www.dfu.min.dk/mico7pd.htm Daniel, W. 2002. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. Cuarta edición. Limusa Wiley. pp 186-188, 295. Degnan, A.J., Yousef, A.E. y Luchansky, J.B. 1992. Use of Pediococcus acidilacti to control Listeria monocytogenes in temperature-abused vacuum-packaged Wieners. Journal of Food Protection. 55: 98 – 103. Duffy, L.L., Vanderlinde, P.B., Grau, F.H. 1994. Grow th of Listeria monocytogenes on vacuum-packed cooked meats: effects of pH, aw , nitrite and ascorbate. Int J Food Microbiol. 23:377-90. Earnshaw, R. 1997. Predictive modeling: shaping food safety and quality. Department of Microbiology, Campden & Chorleyw ood Food Research Association, Chipping Campden, Glos, G155 6LD, UK. pp. 812–816. Eck, A. 1990. El queso. Editorial Omega, Barcelona, España. Vol. 3. pp 123-135. Ekici, K., Bozkurt, H. y Isleyici, O. 2004. Isolation of some pathogens from raw milk of different milk animals. Pakistan Journal of Nutrition. 3: 161-162. El-Shenawy, M.A. y Marth, E.H. 1990. Behavior of Listeria monocytogenes in the presence of Gluconic Acid and during preparation of cottage cheese curd using Gluconic acid. J. Dairy Sci. 73: 1429-1438. Eppert, I., Valde´s-stauber, N. y Scherer, S. 1997. Grow th Reduction of Listeria spp. Caused by Undefined Industrial Red Smear Cheese Cultures and Bacteriocin-Producing Brevibacterium linens as Evaluated In Situ on Soft Cheese. Applied And Environmental Microbiology. 63: 124812–4817. Escartin. F. E. 2000. Microbiología e Inocuidad de los Alimentos. Universidad Autónoma de Querétalo. pp. 252,23,240-243. Faith, N.G., Parniere, N., Larson, T., Lorang, T.D., Luchansky, J.B. 1997. Viability of Escherichia coli O157:H7 in pepperoni during manufacture of sticks and the subsequent storage of slices at 21, 4 and -20°C under air, vacuum and CO2. International Journal of Food Microbiology. 37: 47 – 54. Feresu, S. y Nyati, H. 1990. Fate of pathogenic and non-pathogenic Escherichia coli strains in tw o fermented milk products. Journal of Applied Bacteriology. 69: 814 – 821.
146
Foegeding, P.M., Thomas, A.B., Pilkington, D.H. y Klaenhammer, T.R. 1992. Enhanced control of Listeria monocytogenes by in situ produced pediocin during dry fermented sausage production. Applied and Environmental Microbiology, 4: 884-890. Food & Drug Administration. 2003. Center for Food Safety & Applied Nutrit ion FDA. Conventional Plate Count Method. Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 3. Consultado de la red mundial el 3 de Agosto de 2006. Disponible en http://www.usda.gov/fda.ol.bam.htm Fox, P.F., Guinee, T.P., Cogan, T.M. y McSweeney, P.L.H. 2000. Fundamentals of cheese science. Ed. Aspen, USA. pp. 113-116. Garcia, G.M., Zurera, G. 1994. Modelamiento predictivo del crecimiento microbiano en los alimentos. II: Tipos de procesos de predicción y aplicaciones. Alimentaria. 256: 89-96. Garneu, S. Martín, N.I., Vederas, J.C. 2002. Tw o peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Biochimie 84: 577-592.
Gibson, A.M., Bratchell, N. y Roberts, T.A. 1988. Predicting microbial grow th: growth responses of salmonellae in a laboratory medium as affected by pH, sodium chloride and storage temperature. International Journal of Food Microbiology, 6: 155-178. Giménez, B.C., Dalgaard, P. 2004. Modelling and predicting the simultaneous grow th of Listeria monocytogenes and spoilage microorganisms in cold-smoked salmon. Journal of Applied Microbiology, 96: 96-109. Glass, K.A., Loeffelholz, J.M., Ford, J.P. y Doyle, M.P. 1992. Fate of Escherichia coli O157:H7 as affected by pH or sodium chloride and in fermented, dry sausage. Appl Environ Microbiol. 58:2513-6. Gombas, D.E. 1989. Biological competit ion as a preserving mechanism. Journal of Food Safety, 10: 107-117. Holzapfel, W.H., Geisen, R. y Schillinger, U. 1995. Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins, and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology, 24: 343-362. ICMSF. 1998. Potential application of risk assessment techniques to microbiological issues related to international trade in food and food products. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Journal of Food Protection. 61: 1075-1086. ICMSF. 1997. Establishment of microbiological safety criteria for food in international trade. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. World Health Statistics Quaterly. Institute of Food Technologists. 50: 119-123. Jack, R. Tagg, J.R. y Ray, B. 1995. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Microbiological Review s. 59: 171-200. Jeppesen, V.F. y Huss, H.H. 1993. Antagonistic activity of two strains of lactic acid bacteria against Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica in a model f ish product at 5°C. International Journal of Food Microbiology. 19: 179 – 186.
147
Kalalou, I., Faid, M. y Touhamy Ahami, A. 2004. Extending shelf life of fresh minced camel meta at ambinet temperatura by Lactobacillus delbrueckii Subs. Delbrueckii. Electronic Journal of Biotechnology. 7: 246-250. Kalmokoff, M. L., E. Daley, J. W. Austin y J. M. Farber. 1999. Bacteriocin-like inhibitory activities among various species of Listeria. International Journal of Food Microbioly. 50:191–201. Kamau, D.N., Doores, S. y Pruitt, K.M. 1990. Antibacterial activity of the lactoperoxidase system against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in milk. Journal of Food Protection, 53: 1010 – 1014. Katla, T., Moretro, T., Sveen, I., Aasen, I.M., Axelsson, L., Rorvik, L.M., Naterstad, K. 2002. Inhibit ion of Listeria monocytogenes in chicken cold cuts by addit ion of sakacin P and sakacin P-producing Lactobacillus sakei. J. Applied Microbiology, 93: 191-196. Kelly, A.F., Park, S., Bovill, R. y Mackey, B.M. 2001. Survival of Campylobacter jejuni during stationary phase: Evidence for the absence of a phenotypic stationary-phase response. Applied and Environmental Microbiology. 67: 2248-2254. Koutsoumanis, K.P., Taoukis, P.S., Drosinos, E.H. y Nychas, GJ. 2000. Applicability of an Arrhenius model for the combined effect of temperature and CO2 packaging on the spoilage microflora of f ish. Applied Environemental Microbiology. 66: 3528-3534. Leroy, F. y De Vuyst, L. 2005. Modeling bacteriocin resistance and inactivation of Listeria innocua LMG 13568 by Lactobacillus sakei CTC 494 under sausage fermentation condit ions. Applied and Environmental Microbiology, 9: 7567-7570. Leroy, F. y De Vuyst, L. 2004. Modelling interactions betw een bacteriocin-producing sausage starter culture or cocultures and Listeria monocytogenes revels how to improve the eff iciency of Listeria killing. In: III International Symposium on Applications of Modelling as an Innovative Technolohy in the Agri-Food Chain. pp. 234- 236. Leroy, F. y De Vuyst, L. 2003. A combined model to predict the functionality of the bacteriocin-producing Lactobacillus sakei strain CTC 494. Applied and Environmental Microbiology, 2: 1093-1099. Leroy, F. y De Vuyst, L. 1999. Temperature and pH condit ions that prevalí during fermentation of sausages are optimal for production of the antilisterial bacteriocin sakacin K. Applied and Environmental Microbiology, 3: 974-981. Loessner, M., Guenther, S., Steffan, S. y Scherer, S. 2003. A Pediocin-Producing Lactobacillus plantarum Strain Inhibits Listeria monocytogenes in a Mult ispecies Cheese Surface Microbial Ripening Consortium. Applied and Environmental Microbiology. 69:1854–1857. Lozo, J., Vukasinovic, M., Strahinic, I., Topisirovic, L. 2004. Characterization and antimicrobial activity of bacteriocin 217 produced by natural isolate Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGBUK2-16. Journal of Food Protection. 67: 2727-34. Mackey, B.M., Kelly, A.F., Colvin, J.A., Robbins, P.T. y Fryer, P.J. 2005. Predicting the thermal inactivation of bacteria in a solid matrix: simulation studies on the relative effects of
148
microbial thermal resistance parameters and process conditions. International Journal of Food Microbiology 65: 267-273 Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. 1999. Brock Biología de los microorganismos. Octava edición revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid. pp. 819-833. Makras, L., Van Acker, G, y De Vuyst, L. 2005. Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 8700:2 Degrades Inulin-Type Fructans Exhibiting Different Degrees of Polymerization. Appl Environ Microbiol. 11: 6531–6537. Maldonado, A., Jiménez, R. Ruiz, B. 2004. Induction of Plantaricin Production in Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture w ith Specif ic Gram-Positive Bacteria Is Mediated by an Autoinduction Mechanism. Journal of Bacteriology. 186: 1556-1564 Mano, S.B., Ordoñez, J.A., Garcia, G.D. 1995. Grow th/survival of natural f lora and Listeria monocytogenes on refrigerated uncooked pork and turkey packaged under modif ied atmospheres. Journal of Food Safety. 15: 305-319. Martinez, J.A. 1999. “Epizootiología en el año 2000”. Memorias de la IX Jornada Provincial de Ciencias Veterinarias. Camagüey, Cuba. Ed. Camagüey. pp. 81-86. Martinez-Rodriguez, A. y Mackey, B. M. 2005. Factors affecting the pressure resistance of some Campylobacter species. Letters in Applied Microbiology. 41: 321-326. McEntire, J. 2004. IFT Issues update on foodborne pathogens. News & Análisis, Vol. 58, No. 7.pp. 123-126. McKellar, R.C., Lu, X. 2004. Modelling microbial responses in food. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Journal of Food Protection. 62: 1024-1036. McMeekin, T.A., Brown, J., Krist, K., miles, D., Neumeyer, K., Nichols, D.S., Olley, J., Presser, K., Ratkowsky, D.A., Ross, T., Salter, M. y Soontranon, S. 1997. Quantitative microbiology: a basis for food safety. Emerging Infectious Diseases. 4: 541-549.
McMeekin, T.A. y Ross, T. 1994. Predictive Microbiology. International Journal of Food Microbiology. 2: 241-264. McWilliam Leitch, E.C. y Stewart, C. S. 2002. Susceptibility of Escherichia coli O157 and non-O157 isolates to lactate. Letters in Applied microbiology, 35: 176-180. Mellefont, L.A., McMeekin, T.A. y Ross, T. 2003. Performance evaluation of a model describing the effects of temperature, w ater activity, pH and lactic acid concentration on the grow th of Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology. 82: 45-58. Montville, T.J. y Chen, H. 1998. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions Appl Microbiol Biotechnol 50: 511-519 Muriana, P. M. 1996. Bacteriocins for control of Listeria spp. in food. International Journal of Food Microbioly. Prot. Suppl. 59:54–63.
149
Murry, A.C., Hinton, A. y Morrison, H. 2004. Inhibition of grow th of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Clostridium perfringens on chicken feed media by Lactobacillus salivarius and Lactobacillus plantarum. International Journal of Poultry Science, 3: 603-607. Nataro, R.J. y Kaper, J.B. 1998. Diarrheagenic E. coli. Clinical Microbiology Reviews, 23: 869-872. Nacional Institute Health. 2005. Consultado de la red mundial el 26 de abril de 2005. Disponible en http//:www.niaid.nih.gov/factsheets/foodbornedis.htm. Niven, G.W., Fuks, T., Morton, J.S., Rua, S.A. y Mackey, B.M. 2005. A novel method for the automated measurement of lag time of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Mehods 48: 35-42 Ogwaro, B.A., Gibson, H., Whitehead, M. y Hill, D.J. 2002. Survival of Escherichia coli O157:H7 in tradit ional African yoghurt fermentation. International Journal of Food Microbiology. 79: 105-112. Oh, D.H. y Marshall, D.L. 1993. Antimicrobial activity of ethanol, glycerol monolaurate or lactic acid against Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiology. 20: 239-46. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). 2006. Problemas relativos a la calidad e inocuidad de los alimentos y su repercusión en el comercio. Boletín del Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del Consumidor. Consultado de la red mundial el 17 de Agosto de 2006. Disponible en http//:www.fao.gov//foodcontrol.htm. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) 1998. Boletín del Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del Consumidor. Consultado de la red mundial el 20 de abril de 2006. Disponible en http//:www.fao.gov//foodsafety/feedbach.htm. Pagán, R., Jordan, S., Benito, A. y Mackey, B.M. 2001. Enhanced acid sensitivity of pressure-damaged Escherichia coli O157 cells. Applied and Environmental Microbiology. 67: 1983-1985. Paustian, T. 2000. Metabolism – Fermentation. University of Wisconsin-Madison. Consultado de la red mundial el 22 de abril de 2006. Disponible en http://dw b.unl.edu. Pelczar, M.J., Reid, R., Chan, E.C.S. 1999. Microbiología de los Alimentos. Cuarta edición. McGraw -Hill, Mexico. 703-724. Pinon, A., Zwietering, M., Terrier, L., Vialette, M. 2004. Development an validation of Experimental protocols for use of cardinal model for prediction of microorganism grow th in food products. Applied and Environmental Microbiology. 70: 1081-1087. Porto, A.C., Franco, B.D., Santanna, E.S., Call, J.E., Piva, A., Luchansky, J.B. 2002. Viability of a f ive-strain mixture of Listeria monocytogenes in vacuum-sealed packages of Frankfurters, commercially prepared w ith and w ithout 2.0 or 3.0% added potassium lactate, during extended storage at 4 and 10C. Journal of Food Prot. 65:1705. Rabel, L. K. y Hillier, S. L. 2003. Optimization of Media for Detection of Hydrogen Peroxide Production by Lactobacillus Species Journal of Clinical Microbiology. 41: 3260-3264.
150
Rash, K.E. y Kosikowski, F.V. 1982. Behaviour of enteropathogenic Escherichia coli in Camembert cheese made from ultrafiltered milk. Journal of Food Science. 47: 728 – 732 Reilly, S.S. y Gilliland, S.E. 1996. Consultado de la red mundial el 23 de junio de 2006. Disponible en http//:www.ansi.okstate.edu/research/1996rr/8.pdf. Riordan, D.C., Duffy, G., Sheridan, J.J., Whiting, R.C., Blair, I.S., McDowell, D.A. 2000. Effect of acid adaptation, product pH, and heating on survival of Escherichia coli O157:H7 in pepperoni. Applied and Environmental Microbiology. 66: 1726 - 1729. Riverón, R.L. 1992. Etiología infecciosa de las EDA. Ed. Ciencias Médicas. La Habana. pp. 14-16. Rodríguez, A. 1988. Manual de Elaboración de productos lácteos fermentados. Tecnología de Elaboración de Suero Costeño. ICTA. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá D.C. pp. 57-62. Ross, T. 1996. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology. Journal of Applied Bacteriology. 81: 501-508. Ross, T. y McMeekin, T.A. 1994. Predictive microbiology. International Journal of Food Microbiology. 23: 241-264. Ross, T., Ratkowsky, D.A., Mellefont, L.A. y McMeekin, T.A. 2003. Modelling the effects of temperature, w ater activity, pH and lactic acid concentration on the grow th rate of Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology. 82: 33-43. Savadogo, A., Ouattara, C.A.T., Bassole, I.H.N. y Traore, A.S. 2004. Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from Burkina Faso fermented milk. Pakistan Journal of Nutrition,3: 174-179. Schillinger, U., Becker, B., Vignolo, G. y Holzapfel, W.H. 2001. Eff icacy of nisin in combination w ith protective cultures against Listeria monocytogenes Scott A in tofu. Int. J. Food Microbiology, 71: 159-168. Schillinger, U., Geisen, R., Holzapfel, W.H. 1996. Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends of Food Science Technology. 7: 158–164. SIVIGILA. Ministerio de la Protección Social - Instituto Nacional de Salud. 2004. Reporte Epidemiológico de ETAs en Colombia. Consultado de la red mundial el 14 de abril de 2005. Disponible en http//:www.sivigila.ins.co/repepidem/2004/pdf Sookkhee, S., Chulasiri, M. y Prachyabrued, W. 2001. Lactic acid bacteria from healthy oral cavity of Thai volunteers: inhibit ion of oral pathogens. Journal of Applied Microbiology. 90: 172-179. Stanley, G. 1998. Microbiología de los productos lácteos fermentados. Tecnología de los productos lácteos. 2ª Edición. Ed. Acribia. Zaragoza, España. pp. 93-97. Talwalkar, A. y Kailasapathy, K. 2003. Metabolic and Biochemical Responses of Probiotic Bacteria to Oxygen. American Dairy Science Association. J. Dairy Sci. 86: 2537–2546.
151
Tannock, G.W. 2004. Reviews: A Special Fondness for Lactobacilli. Applied And Environmental Microbiology. 70: 3189–3194. Teo, A.Y., Ravishankar, S., Sizer, C.E. 1996. Synergistic effect of high temperature and high pH on the destruction of Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7. Journal of Food Protection, 59: 1023-1030. Tompkin, J. 2005. Consultado de la red mundial el 26 de abril de 2006. Disponible en http://www.icmsf.iit.edu/pdf/045-051_Tompkin.pdf Tullmin, M. 2001. Water Pages. Corrosion Club. Consultado de la red mundial el 29 de abril de 2006. Disponible en http//:www.corrosion-club.com/w aterbactgrowth.htm. Vamanu, E., Vamanu, A., Popa, O., Campeanu, G. 2005. Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders. African Journal of Biotechnology, 4: 403-408. Vimont, A., Vernozy-Rozand, C., Montet, M.P., Lazizzera, C., Bavai, C., Delignette-Muller, M.L. 2006. Modeling and predicting the simultaneous grow th of Escherichia coli O157:H7 and ground beef background microflora for various enrichment protocols. Applied and Environmental Microbiology 3: 261-268. Whiting, R.C. 1995. Microbial modelling in foods: Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35: 467-494. Zalán, Z., Németh, E., Baráth, A. y Halász, A. 2005. Inf luence of Grow th Medium on Hydrogen Peroxide and Bacteriocin Production of Lactobacillus Strains. Food Technol. Biotechnol. 43: 219–225. Zwietering, M.H., Jongen Burger, I., Rombouts, F.M., van´t Riet, K. 1990. Modeling of the bacterial grow th curve. Applied and Environmental Microbiology, 56: 1875-1881.
152
ANEXO 1
COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (Gramos/Litro)
AGAR EM B (Agar eosina-azul de metileno-lactosa según LEVINE)
• Peptona universal......................... .................. .................. .................. .................10.0 • Lactosa................................... ................. .................. .................. .................. .......10.0 • Hidrogenofosfato dipotásico.................... ................. .................. .................. ..........2.0 • Eosina amarillenta................. .................. .................. .................. .................. .........0.4 • Azul de metileno.................... .................. .................. .................. .................. .....0.065 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................13.5
AGAR M RS (Agar para Lactobacillus según DE MAN, ROGOSA y SHARPE)
• Peptona Universal............................ .................. .................. .................. ..............10.0 • Extracto de carne...................... .................. .................. .................. .................. .....5.0 • D (+) –Glucosa..................... .................. .................. .................. .................. ........20.0 • Hidrogenofosfàto dipotásico.................... ................. .................. .................. ..........2.0 • Tw eenR 80........................................ ................. .................. .................. .................1.0 • Hidrogencitrato diamónico............ .................. .................. .................. ................. ..2.0 • Acetato sódico......................................... .................. .................. .................. .........5.0 • Sulfato de Magnesio..................... .................. .................. ................. .................. ..0.1 • Sulfato de Manganeso....... .................. .................. ................. .................. ...........0.05 • Agar Agar.................................................... .................. .................. .................. ...12.0
AGAR M UELLER HINTON
• Infusión de carne................... .................. .................. .................. ................. ..........2.0 • Hidrolizado de caseína.......... .................. .................. .................. ................. ........17.5 • Almidón............. .................. .................. ................. .................. .................. ............1.5 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................13.0
AGAR PALCAM (Agar selectivo para Listeria según VAN NETTEN et al.)
• Peptona universal......................... .................. .................. .................. .................23.0 • Almidón............. .................. .................. ................. .................. .................. ............1.0 • Cloruro sódico............................ ................. .................. .................. .................. .....5.0 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................13.0 • D (-) manitol................. .................. .................. .................. ................. ..................13.0 • Citrato de amonio y hierro (III)...... .................. .................. .................. .................. ..0.5 • Esculina................ .................. .................. ................. .................. .................. .........0.8 • Glucosa.................... .................. .................. ................. .................. .................. .....0.5 • Cloruro de lit io.......... .................. ................. .................. .................. .................. ...15.0 • Rojo de fenol............ ................. .................. .................. .................. .................. ...0.08
153
AGAR PLATE COUNT (Agar peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura) • Peptona de caseína........... .................. .................. ................. .................. .............5.0 • Extracto de levadura.......... .................. .................. .................. .................. ............2.5 • D (+) –glucosa............................. .................. .................. .................. ................. ....1.0 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................14.0
CALDO MRS (Caldo para Lactobacillus según DE MAN, ROGOSA y SHARPE)
• Peptona Universal............................ .................. .................. .................. ..............10.0 • Extracto de carne...................... .................. .................. .................. .................. .....5.0 • D (+) –Glucosa..................... .................. .................. .................. .................. ........20.0 • Hidrogenofosfàto dipotásico.................... ................. .................. .................. ..........2.0 • Tw eenR 80........................................ ................. .................. .................. .................1.0 • Hidrogencitrato diamónico............ .................. .................. .................. ................. ..2.0 • Acetato sódico......................................... .................. .................. .................. .........5.0 • Sulfato de Magnesio..................... .................. .................. ................. .................. ..0.1 • Sulfato de Manganeso....... .................. .................. ................. .................. ...........0.05
154
ANEXO 2
COMPOSICIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE ENTERA UHT
Según etiqueta del fabricante
• Grasa Total.................. .................. .................. ................. .................. ..................6.0g/L • Grasa saturada............................. .................. .................. .................. ..................4.0g/L • Colesterol................. .................. .................. ................. .................. .................. ..30mg/L • Sodio...... .................. .................. ................. .................. .................. .................. ..96mg/L • Carbohidratos totales................ .................. .................. .................. ................. ......10g/L • Azúcares............................................... ................. .................. .................. ............10g/L • Proteína................ .................. ................. .................. .................. .................. ..........6g/L • Vitamina A....................... .................. ................. .................. .................. .................. .4% • Vitamina D............ .................. .................. ................. .................. .................. ..........40% • Calcio................ .................. .................. .................. ................. .................. ..............48% • Hierro........................... .................. .................. .................. ................. .................. .....1%
155
ANEXO 3
ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BLIS
Con los sobrenadantes neutralizados se comprobó que la inhibición observada (determinada
por el diámetro en mm de halos) no se relaciona directamente con bajos pH debidos a la
producción de ácido láctico (Figura 61). Durante los ensayos, el pH de los cultivos de BAL se
mantuvieron entre 5,0 y 6,5, rangos entre los cuales la producción de bacteriocinas es óptima
(Jack, 1995; Talw alkar, 2003). Por otro lado, medios de cultivo como el MRS y el BHI
empleados en la verif icación de BLIS, tienen dentro de su composición química
hidrogenofosfato dipotásico (2g/L y 2.5g/L respectivamente) que actúa como buffer, impidiendo
cambios acelerados de pH, lo cual permit ió sugerir con mayor seguridad que el mecanismo
inhibitorio con los sobrenadantes neutralizados obedece más a la acción de metabolitos
secundarios tipo bacteriocinas, que a acidez del medio.
Figura 61. Fotografía de los resultados de verificación de la producción de BLIS. Sobrenadante neutralizado de Lactobacillus plantarum (A), sobrenadante neutralizado de Leuconostoc mesenteroides (B), sobrenadante neutralizado de Pediococcus acidilacti (C) y sobrenadante neutralizado de Lactobacillus paracasei. (D). Cepa indicadora: L. monocytogenes. Medio Mueller Hinton a 37°C.
La posibilidad que la inhibición en el crecimiento de las patógenas por parte de las BAL se deba
a la acción de peróxidos también fue descartada, pues se ha reportado que el medio MRS es
excelente para el aislamiento y crecimiento de la mayoría de Lactobacillus spp. pero su
A B
C D
156
composición química inhibe la producción de peróxidos por parte de las cepas (Rabel y Hillier,
2003). En otro estudio, cepas de Lactobacillus spp. fueron evaluadas con catalasa y tetra-
methylbenzidina en diferentes medios de cultivo, comprobando que producían peróxidos; sin
embargo, estas mismas cepas, al ser cultivadas en MRS no presentaron dicha actividad, por lo
que recomendaron no utilizar el MRS para los ensayos de producción de peróxido de hidrógeno
(Sookkhee, 2001), lo cual hace que este medio sea ideal para evaluar la producción de BLIS.
En la Tabla 26 se presentan los resultados obtenidos al evaluar los sobrenadantes neutralizados y sin neutralizar de diferentes BAL. El sobrenadante neutralizado de L. plantarum
(productor de bacteriocinas) mostró efectos inhibitorios frente a L. monocytogenes y E. coli con
halos de inhibición de 17 y 15mm de diámetro respectivamente, siendo esta cepa entre las 11
evaluadas la de mejor desempeño en cuanto a potencial de inhibición. Por otro lado, con el
sobrenadante sin neutralizar de L. paracasei (no productor de bacteriocinas) se logró inhibir el
crecimiento de L. monocytogenes y E. coli con halos de inhibición de 15 y 14mm de diámetro
respectivamente, siendo esta BAL entre las reportadas como no productoras de bacteriocinas,
la de mayor efecto antagónico.
Finalmente, después de evaluar y analizar los resultados de los ensayos de inhibición se
eligieron para el estudio las cepas Lactobacillus plantarum WS4174 y Lactobacillus paracasei
LB279 por presentar el mejor efecto antagónico frente a las cepas indicadoras. Los resultados
de esta verif icación coinciden con lo publicado por Cintas et al. (1998) y por Schillinger et al.
(1996) quienes reportaron efectos inhibitorios satisfactorios de bacteriocinas producidas por L.
lactis, L. plantarum y P. acidilacti frente a diferentes patógenos de importancia en alimentos,
entre ellos L. monocytogenes y E. coli.
Adicionalmente, varios autores (Kalmokoff, 1999; Eppert, 1997; Muriana, 1996) han reportado el
uso y la aplicación de la pediocina producida por L. plantarum para el control de cepas de
Listeria spp. resistentes a temperaturas de refrigeración y a tratamientos con desinfectantes
convencionales en la industria alimentaria. Murry et al. (2004) también reportaron la inhibición en el crecimiento de cepas de E. coli, Salmonella spp. y Clostridium spp. debida a la presencia
de L. plantarum y L. salivarius en el medio.
157
Tabla 26. Resultados de v erificación de la producción de BLIS en MRS a 37°C.
En este ensayo de verif icación de producción de BLIS se encontró que la cepa de Lactobacillus paracasei LB279 aislada de Suero Costeño, no produjo metabolitos antimicrobianos de tipo
bacteriocinas, puesto que con el sobrenadante neutralizado no se presentó ninguna inhibición
frente a las cepas indicadoras (L. monocytogenes y E. coli).
Contrario a estos resultados, Lozo et al. (2004) reportaron que la cepa Lactobacillus paracasei
subsp. paracasei BGBUK2-16 aislada de un queso casero, produjo la bacteriocina 217 (Bac217;
aproximadamente de 7 kDa de peso), la cual presentó actividad bactericida frente a cepas de
Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. Sin embargo, estos resultados contrarios pueden
deberse a que se utilizaron distintas cepas de L. paracasei y diferentes condiciones de
crecimiento en ambos estudios.
CEPAS RETO Halos de Inhibición para L. monocytogenes LMO026
(mm de diámetro)
Halos de Inhibición para E. coli ECO25 (mm de diámetro)
Ref. BAL
PROCEDENCIA
Sobrenadante sin neutralizar
Sobrenadante neutralizado
Sobrenadante sin neutralizar
Sobrenadante neutralizado
LB2 Lactobacillus pentosus Suero Costeño.
Universidad de La Sabana 13 11 11 10
LB10 Lactobacillus acidophilus
Suero Costeño. Universidad de La
Sabana 14 12 13 12
LB40 Lactobacillus brevis Suero Costeño.
Universidad de La Sabana 15 0 12 0
LB156 Pediococcus acidilacti Suero Costeño.
Universidad de La Sabana 14 13 13 11
LB206 Lactococcus lactis Suero Costeño.
Universidad de La Sabana 15 10 12 0
LB381 Lactococcus lactis spp lactis
Suero Costeño. Universidad de La
Sabana 14 11 14 12
LB279 Lactobacillus paracasei Suero Costeño.
Universidad de La Sabana 15 0 14 0
LB238 Lactobacillus plantarum
Suero Costeño. Universidad de La
Sabana 14 12 13 11
WS4174 Lactobacillus plantarum
Queso. Technische Universitat Munchen
17 17 16 15
P120 Pediococcus acidilacti Crema de Leche.
Universitie de Poitiers de Francia 17 16 16 14
Y105 Leuconostoc mesenteroides
Vegetales frescos. Universitie de
Poitiers de Francia 15 13 16 13
158
Caridi (2002) reportó que cepas de L. paracasei subs. paracasei aisladas de queso de cabra
manufacturado artesanalmente presentaron una marcada actividad antagónica frente a cepas
de E. coli, aseguró que la aplicación de esta BAL en la leche cruda garantiza un mayor tiempo
en la conservación del alimento; sin embargo, no atribuye esta actividad antagónica a la
presencia de bacteriocinas.
Luego de determinar la actividad antagónica de L. plantarum WS4174 y L. paracasei LB279
frente E. coli ECO25 y L. monocytogenes LMO26 en caldo MRS a 37°C, se realizó el mismo procedimiento de verif icación de BLIS con estas cuatro cepas pero utilizando como medio de
crecimiento leche entera UHT (las pruebas se hicieron por duplicado). Este estudio se realizó
con el f in de determinar si en ambos medios (MRS y leche) se presentaba el mismo patrón de
comportamiento y las BAL seguían inhibiendo a las patógenas de la misma manera. En la
Tabla 27 se presentan los resultados obtenidos de esta verif icación en leche entera UHT, donde
también se incluyen, para facilitar la comparación, los resultados previamente discutidos
obtenidos en MRS.
Tabla 27. Resultados de v erificación de la producción de BLIS en leche entera UHT a 37°C.
Leche entera UHT Halos de Inhibición para L. monocytogenes
LMO026 (mm de d iámetro) Halos de Inhibición para E. coli ECO25
(mm de diámetro) Cultiv o Sobrenadante sin neutralizar
Sobrenadante neutralizado
Sobrenadante sin neutralizar
Sobrenadante neutralizado
Lactobacillus p aracasei LB279 14 0 15 0
Lactobacillus plantarum WS4174 16 17 17 15
Caldo MRS Halos de Inhibición para L. monocytogenes
LMO026 (mm de diámetro) Halos de Inhibición para E. coli ECO25
(mm de diámetro) Cultiv o Sobrenadante sin neutralizar
Sobrenadante neutralizado
Sobrenadante sin neutralizar
Sobrenadante neutralizado
Lactobacillus p aracasei LB279 15 0 14 0
Lactobacillus plantarum WS4174 17 17 16 15
Como se presenta en la Tabla 27, se pudo determinar que en leche entera UHT a 37°C las dos
BAL siguen teniendo efectos antagónicos frente a las dos cepas patógenas evaluadas. Así
mismo se confirmó que en este medio, la cepa de L. paracasei LB279, no produjo metabolitos
159
antimicrobianos de tipo bacteriocinas, puesto que con el sobrenadante neutralizado no se
presentó ninguna inhibición frente a las cepas indicadoras (L. monocytogenes y E. coli),
mientras que con el sobrenadante sin neutralizar se obtuvieron halos de inhibición de 14mm y
15mm respectivamente.
Por otro lado, L. plantarum WS417 inhibió el crecimiento de los dos patógenos cuando se utilizó
su sobrenadante neutralizado y sin neutralizar, sugiriéndose también en este caso, su potencial
como productor de bacteriocinas. Frente a E. coli, L. plantarum generó halos de inhibición de 15mm (sobrenadante neutralizado) y de17mm (sobrenadante sin neutralizar). Frente a L.
monocytogenes generó halos de inhibición de 17mm y 16mm respectivamente.
Finalmente se comprobó que en ambos medios, MRS y leche entera UHT se presentó el mismo
patrón de inhibición y que el comportamiento de las BAL frente a las cepas patógenas no se
alteró por el cambio de medio.
160
ANEXO 4
ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS VALIDACIÓN ESTADÍSTICA DEL MÉTODO MODIFICADO DE RECUENTO EN
PLACA
Los resultados obtenidos para la validación del método modif icado de recuento en placa o en
cuartos se presentan en la Tabla 28. El recuento de las colonias (UFC/mL) realizado
directamente del cultivo, se mult iplicó por el factor de dilución correspondiente y se cuantif icó a
UFC/mL (se multiplicó por 10 para siembra en placa de petri completa y por 50 para la siembra
en cuartos de caja). Fotografías del crecimiento bacteriano obtenido a partir de siembras
realizadas en cuartos de placa se presentan en la Figura 62.
El ANOVA muestra que no hay diferencia signif icativa entre los resultados de conteo (UFC/mL)
obtenidos por ambos métodos, el estándar y el modif icado demostrándose que el método
modif icado de “recuento en cuartos” puede utilizarse con confiabilidad como técnica alterna al
método estándar. El ANOVA de los dos métodos por microorganismo (L. plantarum, L.
paracasei, E. coli y L. monocytogenes), tampoco presentó diferencia signif icativa lo que
demuestra que el método modif icado puede ser empleado para el recuento de diferentes
microorganismos (Anexo 6).
Sin embargo, el A NOVA por método, microorganismos y dilución si arrojó diferencias
signif icativas. El test de Tukey evidencia que a mayores diluciones los dos métodos tienden a contabilizar una mayor concentración de bacterias (UFC/mL). De los 16 grupos analizados
(cuatro microorganismos por cuatro diluciones), cuatro presentaron diferencia signif icativa a
nivel de dilución. Los grupos con diferencia signif icativa se presentaron en las muestras con las
dos mayores diluciones, así: L. plantarum en la dilución C, L. paracasei en la Dilución C y E. coli
en las diluciones C y D (Anexo 6). Sin embargo, en el 75% de los resultados no se obtuvo
diferencia signif icativa.
161
Tabla 28. Validación estadística del método modificado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar).
Figura 62. Fotografías del método modificado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar). L. monocytogenes en agar MRS a 37°C (Diluciones decimales -2, -3, -4, -5) (A) y L. plantarum en agar MRS a 37°C (Diluciones decimales -3, -4, -5, -6) (B).
RECUENTO EN PLACA (Número de colonias obtenidas x factor de dilución)
Dilución A Dilución B Dilución C Dilución D
CEPA Réplica Placa
completa Placa x cuartos
Placa completa
Placa x cuartos
Placa completa
Placa x cuartos
Placa completa
Placa x cuartos
1 8280 8150 4850 4700 3140 3000 1850 1750 2 8190 8000 4880 4750 3220 3100 1970 1950 3 8270 8250 4950 4900 3250 2900 1940 1900
Lactobacillus plantarum
4 8220 8100 4920 4850 3200 3150 1890 1850
1 8230 8250 4410 4450 2540 2500 1340 1350
2 8170 8000 4380 4400 2480 2300 1350 1400
3 8210 8200 4450 4300 2500 2400 1300 1400
Lactobacillus paracasei
4 8250 8150 4400 4350 2510 2400 1310 1250
1 4400 4250 2240 2350 1280 1100 710 600
2 4290 4350 2350 2250 1330 1050 750 500 3 4450 4100 2380 2300 1310 1250 770 600
Esch erichia coli
4 4370 4300 2200 2250 1220 1200 700 700
1 2260 2250 1100 1200 620 650 300 300
2 2340 2300 1170 1150 640 600 280 300 3 2300 2200 1120 1000 650 550 290 250
Listeria monocytogenes
4 2270 2250 1190 1100 650 600 300 300
A B
162
Como se trata de una tendencia a sobreestimar observada en ambos métodos (error inherente
a la técnica básica de ambos métodos) no afecta la validez del método modif icado de “recuento
en cuartos” para f ines de cuantif icación de células bacterianas. Estas discrepancias también se
encuentran reportadas en el Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2003) donde se afirma que
pueden presentarse desviaciones al realizar diluciones muy altas (mayor número de
transferencias) o al seleccionar muestras con muy baja concentración microbiana, por lo que se
recomienda emplear las diluciones más bajas (las más concentradas), para las técnicas de
recuento celular.
La metodología de “recuento en cuartos” no se encuentra publicada de forma detallada en todos
artículos indexados que la emplean, por conocerse ya su validez como método de conteo con
f ines de investigación y en especial para estudios de modelación del comportamiento
microbiano. Sin embargo, existen diferentes trabajos publicados sobre microbiología predictiva
que utilizan esta metodología (Mackey et al., 2005; Martínez-Rodriguez y Mackey, 2005; Niven
et al., 2005; Casadei et al., 2002; Pagán et al., 2001; Kelly et al., 2001).
163
ANEXO 5
ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS
Los resultados obtenidos a partir de los tres procedimientos realizados para la estandarización
de inóculos se presentan en la Tabla 29. Para los tres casos, el inóculo A representó el cultivo
utilizado para iniciar el primer cultivo y el inóculo B representó el cultivo que se sincroniza para
continuar con la curva el segundo día.
En el procedimiento número 1 (donde ambos inóculos recibieron dos activaciones) no se
presentaron diferencias signif icativas entre los inóculos A y B para los cuatro microorganismos
evaluados (Anexo 7). Estos resultados indicaron que con ambos inóculos se obtuvieron
concentraciones bacterianas iguales, lo cual garantizó una mínima en la variabilidad de los
recuentos celulares cuando se realizan curvas de crecimiento a partir de cultivos sincronizados.
En el procedimiento número 2 (donde ambos inóculos recibieron sólo una activación) se
presentaron diferencias signif icativas entre los inóculos A y B para L. monocytogenes. De igual
forma, el procedimiento número 3 (inóculo A con una activación y B con dos activaciones)
presentó diferencia signif icativa entre los inóculos A y B de L. monocytogenes. Los
procedimientos 2 y 3 fueron, por lo tanto, descartados como método de preparación de inóculo.
Los resultados anteriores demuestran que dos activaciones son necesarias para obtener
poblaciones bacterianas más homogéneas en número (UFC/mL) y estado f isiológico. Esta
condición permitió sincronizar exitosamente cultivos bacterianos y garantizó la menor
variabilidad entre las réplicas de un mismo experimento.
A través de este estudio también se pudo establecer que para la estandarización de inóculos, la
técnica de recuento en placa es más apropiada que los métodos turbidimétricos. Los resultados
de medición de la densidad óptica (OD540) presentaron mayor variabilidad entre las mediciones
realizadas a los inóculos de una misma cepa bacteriana (Figura 63).
164
Tabla 29. Estandarización de inóculos para la sincronización de cultiv os paralelos. L. plantarum (a), L. paracasei (b), E. coli (c), L. monocytogenes (d), en caldo MRS a 37ºC.
a. Lactobacillus plantarum
Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3 Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B
Recuento 1,2 x 109 1,5 x 109 1,0 x 109 2,0 x 109 1,2 x 109 9,0 x 108 Réplica 1 Absorbancia 1,4995 1,7943 1,6334 1,8956 1,9871 1,4823
Recuento 1,0 x 109 1,5 x 109 9,5 x 108 2,0 x 109 1,2 x 109 9,5 x 108 Réplica 2 Absorbancia 1,8754 2,1046 1,9065 2,1268 2,3123 1,9322
Recuento 9,5 x 108 1,0 x 109 8,0 x 108 1,5 x 109 9,5 x 108 1,3 x 109 Réplica 3 Absorbancia 1,0228 1,2424 1,9260 2,046 1,0342 1,2523
Recuento 9,5 x 108 1,0 x 109 9,0 x 108 1,5 x 109 9,0 x 108 8,5 x 108 Réplica 4 Absorbancia 1,9056 2,0233 1,8561 2,049 2,0342 1,7399
b. Lactobacillus paracasei Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3
Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Recuento 1,4 x 109 1,6 x 109 1,5 x 109 2,0 x 109 1,3 x 109 1,0 x 109 Réplica
1 Absorbancia 1,9991 1,9948 2,0114 1,9952 2,0873 1,9887 Recuento 1,1 x 109 1,5 x 109 1,3 x 109 1,6 x 109 1,1x 109 9,0 x 108 Réplica
2 Absorbancia 2,0761 2,1046 2,0659 2,0163 2,1128 1,9390 Recuento 1,0 x 109 1,3 x 109 1,0 x 109 1,3 x 109 1,5 x 109 1,3 x 109 Réplica
3 Absorbancia 2,1268 2,0417 2,0846 2,0141 2,0545 2,0526 Recuento 1,5 x 109 1,2 x 109 1,2 x 109 1,5 x 109 9,5 x 108 1,2 x 109 Réplica
4 Absorbancia 1,9958 2,1150 2,0841 2,1013 2,1146 2,1691
c. Escherichia coli Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3
Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Recuento 7,5 x 108 8,0 x 108 8,0 x 108 9,5 x 108 8,0 x 108 9,5 x 108
Réplica 1 Absorbancia 0,6425 0,6998 0,7056 0,8977 0,8675 0,6723 Recuento 8,0 x 108 7,5 x 108 8,5 x 108 1,0 x 109 8,5 x 108 1,0 x 109
Réplica 2 Absorbancia 0,7013 0,7684 0,7564 0,9768 0,9115 0,876 Recuento 6,0 x 108 6,5 x 108 8,0 x 108 1,5 x 109 1,5 x 109 2,0 x 109
Réplica 3 Absorbancia 0,9082 0,9229 1,1065 1,2123 0,9123 0,9365 Recuento 7,0 x 108 7,5 x 108 7,0 x 108 9,5 x 108 7,0 x 108 1,2 x 109
Réplica 4 Absorbancia 0,6285 0,6994 0,8112 1,0865 0,6113 0,6456
d. Listeria monocytogenes Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3
Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Recuento 5,5 x 108 6,0 x 108 6,0 x 108 7,5 x 108 6,5 x 108 9,0 x 108
Réplica 1 Absorbancia 0,4986 0,5523 0,5954 0,621 0,4112 0,4034 Recuento 6,0 x 108 6,5 x 108 5,5 x 108 8,5 x 108 6,0 x 108 9,5 x 108
Réplica 2 Absorbancia 0,5492 0,6012 0,6089 0,6993 0,6123 0,5542 Recuento 5,5 x 108 5,5 x 108 5,5 x 108 8,5 x 108 5,5 x 108 8,5 x 108
Réplica 3 Absorbancia 0,5489 0,6137 0,4567 0,6098 0,4901 0,4558 Recuento 6,5 x 108 7,5 x 108 6,0 x 108 8,0 x 108 5,5 x 108 8,0 x 108
Réplica 4 Absorbancia 0,4889 0,4198 0,5954 0,621 0,4072 0,4873
165
0123456789
10
List
eria
E.co
li
L. p
lant
arum
L. p
arac
asei
log 1
0 U
FC/m
L
0
0,5
1
1,5
2
2,5
OD
540
log10 UFc/mL OD
Los resultados también evidencian que las BAL presentan valores de absorbancia más altos
que los patógenos E. coli y L. monocytogenes a concentraciones similares. La lectura de un
inóculo de E. coli al alcanzar concentraciones de 12,8 x 108 UFC/mL presentó una OD540 de
0,7826, mientras que la de un inóculo de L. paracasei al alcanzar concentraciones similares (de
12,5 x 108 UFC/mL) presentó una absorbancia mucho más alta (2,0615). Estas diferencias entre
absorbancias y recuentos pueden relacionarse a las diferencias existentes entre las cuatro
cepas evaluadas en cuanto características de crecimiento (como variaciones morfológicas y
estado fisiológico), o a cambios en la composición del medio originado por el metabolismo característico de cada cepa.
En la Tabla 30 se presentan los resultados obtenidos a partir de las curvas de crecimiento
fraccionadas y las curvas continuas desarrolladas para validar la sincronización de cultivos a
través del tiempo. Los recuentos bacterianos (log10 UFC/mL) obtenidos para L. plantarum, L.
paracasei, E. coli y L. monocytogenes durante 34 horas de crecimiento se sometieron a un
ANOVA para determinar la validez del uso de curvas de crecimiento fragmentadas a partir de
cultivos sincronizados.
Figura 63. Relación entre el recuento celular y la densidad óptica (OD540) de cultiv os de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en MRS a 37°C.
166
R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,845 2,699 2,778 2,903 2,699 2,602 3,0002 3,462 3,477 3,491 3,505 3,477 3,398 3,6814 3,929 3,875 3,903 3,929 3,875 3,875 4,0416 4,699 4,602 4,653 4,699 4,602 4,653 4,8138 5,398 5,477 5,301 5,398 5,301 5,301 5,60210 5,875 5,903 5,813 5,875 5,903 5,778 6,02113 6,301 6,290 6,301 6,398 6,301 6,301 6,47715 6,778 6,740 6,699 6,778 6,699 6,602 6,92917 7,097 7,061 7,041 7,114 7,079 7,041 7,30119 7,477 7,544 7,301 7,544 7,544 7,398 7,81321 7,903 7,845 7,813 7,875 7,845 7,778 8,06123 8,477 8,398 8,301 8,398 8,398 8,176 8,69924 8,740 8,653 8,602 8,699 8,653 8,544 8,84526 8,740 8,845 8,699 8,740 8,813 8,699 8,92928 8,875 8,845 8,778 8,875 8,845 8,778 9,00030 8,778 8,813 8,699 8,778 8,813 8,602 8,90332 8,699 8,740 8,602 8,602 8,544 8,544 8,87534 8,653 8,699 8,602 8,653 8,602 8,602 8,778
b. Escherichia coli
Tiempo (h)Curvas continuas Log 10 (UFC/mL) Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)
Tabla 30. Resultado de los recuentos en placa para la validación estadística de las curvas de crecimiento bacteriano a partir de cultiv os sincronizados. Recuentos (log10 UFC/mL) obtenidos de L. plantarum (a), E. coli (b), L. paracasei (c) y L. monocytogenes (d) en agar MRS a 37ºC por 34 horas.
R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,623 2,602 2,580 2,623 2,591 2,613 2,6722 3,041 3,000 3,146 3,079 3,000 3,146 3,0414 3,362 3,279 3,322 3,362 3,255 3,342 3,3426 3,978 3,954 3,845 3,778 3,740 3,778 3,6538 4,740 4,778 4,875 4,699 4,778 4,903 4,90310 5,398 5,301 5,477 5,301 5,301 5,398 5,54413 5,903 5,875 5,978 5,813 5,875 5,778 5,92915 6,544 6,398 6,477 6,398 6,398 6,477 6,47717 6,929 6,903 6,929 6,903 6,903 6,929 6,92919 7,929 7,978 7,903 7,954 7,978 7,929 8,02121 8,477 8,477 8,301 8,477 8,398 8,398 8,39823 8,954 8,978 9,000 8,954 8,978 9,000 8,97824 9,041 9,079 9,079 9,041 9,079 9,097 9,06126 9,061 9,097 9,061 9,146 9,097 9,130 9,39828 9,021 9,041 9,000 9,097 9,079 9,097 9,04130 9,021 8,929 9,000 9,021 9,000 9,000 8,84532 8,978 8,954 8,929 8,778 8,740 8,813 8,69934 8,929 8,954 8,903 8,813 8,778 8,740 8,778
a. Lactobacillus plantarum Curvas continuas Log 10 (UFC/mL)
Tiempo (h)Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)
167
El ANOVA no mostró diferencia signif icativa (Anexo 8), lo cual comprueba que la metodología
empleada en la realización de curvas de crecimiento a partir de cult ivos sincronizados es
adecuada y valida para el trabajo de modelación, pues no genera mayor variabilidad en las
concentraciones microbianas alcanzadas versus las obtenidas al realizar una evaluación
continua y de manera in- interrumpida.
R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,699 2,903 2,778 3,000 2,903 2,778 2,6022 3,613 3,602 3,591 3,681 3,505 3,477 3,3984 4,041 4,041 3,954 4,041 3,929 3,954 3,8756 4,813 4,740 4,740 4,813 4,699 4,699 4,6538 5,602 5,398 5,544 5,602 5,398 5,477 5,30110 6,000 5,978 5,929 6,021 5,875 5,929 5,77813 6,544 6,477 6,602 6,477 6,398 6,398 6,30115 6,903 6,778 6,875 6,929 6,778 6,845 6,60217 7,301 7,176 7,176 7,301 7,114 7,097 7,04119 7,778 7,602 7,699 7,813 7,544 7,602 7,39821 8,061 7,929 7,978 8,061 7,875 8,000 7,77823 8,653 8,477 8,602 8,699 8,398 8,602 8,17624 9,079 9,097 9,097 9,130 9,097 9,097 9,11426 9,190 9,204 9,190 9,176 9,204 9,176 9,21728 9,146 9,176 9,161 9,161 9,190 9,161 9,17630 9,146 9,176 9,176 9,146 9,176 9,190 9,19032 9,161 9,190 9,161 9,176 9,190 9,146 9,16134 9,130 9,161 9,146 9,130 9,176 9,146 9,204
c. Lactobacillus paracasei
Tiempo (h)Curvas continuas Log 10 (UFC/mL) Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)
R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,041 2,146 2,204 2,041 2,146 2,079 2,0792 2,114 2,176 2,230 2,114 2,176 2,204 2,1764 2,204 2,301 2,279 2,204 2,279 2,255 2,2556 2,740 2,699 2,653 2,602 2,740 2,653 2,4778 3,740 3,778 3,813 3,778 3,699 3,813 3,81310 4,699 4,602 4,544 4,740 4,602 4,398 4,60213 5,021 5,000 4,978 4,954 5,000 4,929 4,92915 5,398 5,267 5,279 5,130 5,267 5,290 5,11417 5,903 6,000 5,954 5,954 6,000 5,978 5,95419 6,544 6,477 6,653 6,398 6,477 6,653 6,47721 7,041 7,061 7,061 7,079 7,061 7,061 7,04123 7,653 7,740 7,813 7,653 7,699 7,813 7,60224 8,699 8,845 8,778 8,813 8,653 8,778 8,74026 8,903 8,875 8,929 8,845 8,875 8,813 8,81328 9,041 8,954 8,978 9,176 8,954 8,978 8,97830 8,978 8,875 8,903 8,929 8,845 8,903 8,92932 8,929 8,875 8,954 8,903 8,875 8,954 8,90334 8,903 8,929 8,845 8,875 8,813 8,845 8,845
d. Listeria monocytogenes
Tiempo (h)Curvas continuas Log 10 (UFC/mL) Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)
168
ANEXO 6
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO MODIFICADO DE RECUENTO EN PLACA
ANOVA Evaluación entre métodos:
METODOS F Sig. Estándar versus modificado 0,027 0,869 Evaluación entre microorganismos:
CULTIVO F Sig. L. plantarum individual 0,015 0,902 L. paracasei individual 0,002 0,962 E. coli individual 0,038 0,848 L. monocytogenes individual 0,012 0,914 Evaluación entre diluciones:
DILUCIONES F Sig. L. plantarum Dilución A 4,187 0,087 L. plantarum Dilución B 3,896 0,096 L. plantarum Dilución C 7,534 0,034 L. plantarum Dilución D 0,988 0,359 L. paracasei Dilución A 1,317 0,295 L. paracasei Dilución B 0,974 0,362 L. paracasei Dilución C 6,339 0,045 L. paracasei Dilución D 0,449 0,528 E. coli Dilución A 4,024 0,092 E. coli Dilución B 0,000 1,000 E. coli Dilución C 6,856 0,040 E. coli Dilución D 9,052 0,024 L. monocytogenes Dilución A 2,442 0,169 L. monocytogenes Dilución B 0,466 0,520 L. monocytogenes Dilución C 3,429 0,114 L. monocytogenes Dilución D 0,140 0,722
169
ANEXO 7
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA ESTANDARIZACIÓN DE INÓCULOS
ANOVA
PROCEDIMIENTO 1 F Sig. L. plantarum individual 1,082 0,338 L. paracasei individual 1,000 0,356 E. coli individual 0,222 0,654 L. monocytogenes individual 1,043 0,346
PROCEDIMIENTO 2 F Sig. L. plantarum individual 1,635 0,248 L. paracasei individual 3,769 0,1 E. coli individual 5,165 0,063 L. monocytogenes individual 85,714 0,000
PROCEDIMIENTO 3 F Sig. L. plantarum individual 0,559 0,483 L. paracasei individual 1,010 0,354 E. coli individual 1,029 0,350 L. monocytogenes individual 51,194 0,000
170
ANEXO 8
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS
ANOVA Comparación entre concentraciones celulares (log10 UFC/mL) de cultivos sincronizados versus continuos
CULTIVO F Sig. L. plantarum 0,003 0,958 L. paracasei 0,014 0,905 E. coli 0,009 0,926 L. monocytogenes 0,004 0,949
171
ANEXO 9
COMPARACIÓN ESTADÍSTICA DE LA BONDAD DE AJUSTE DEL MODELO DE
GOMPERTZ MODIFICADO VERSUS LA DEL MODELO DE BARANYI
Prueba de T para dos muestras de varianzas iguales
Coeficientes de determinación para modelos ajustados a curvas de crecimiento individual
CULTIVO T Sig. L. plantarum 4,445 0,002 L. paracasei 3,767 0,004 E. coli 6,762 0,000 L. monocytogenes 2,745 0,001
172
ANEXO 10
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE TASAS DE CRECIMIENTO
ANOVA Cultivos individuales versus individuales
MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. paracasei individual 51,251 0,000 E. coli indiv idual 51,251 0,000 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 51,251 0,894 L. plantarum indiv idual 51,251 0,000 E. coli indiv idual 51,251 1,000 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 51,251 0,000 L. plantarum indiv idual 51,251 0,000 L. paracasei individual 51,251 1,000 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 51,251 0,000 L. plantarum indiv idual 51,251 0,894 L. paracasei individual 51,251 0,000
MRS
L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 51,251 0,000 L. paracasei individual 218,482 0,000 E. coli indiv idual 218,482 0,000 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 218,482 0,000 L. plantarum indiv idual 218,482 0,000 E. coli indiv idual 218,482 0,034 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 218,482 0,001 L. plantarum indiv idual 218,482 0,000 L. paracasei individual 218,482 0,034 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 218,482 0,000 L. plantarum indiv idual 218,482 0,000 L. paracasei individual 218,482 0,001
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 218,482 0,000
173
Cultivos individuales versus mixtos
MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,039 0,977 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,039 0,965 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,840 0,862 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,840 0,688 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 247,782 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 247,782 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 163,694 0,000
MRS
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 163,694 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,317 0,295 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,317 0,362 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,222 0,654 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,222 0,346 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 610,276 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 610,276 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 157,375 0,000
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 157,375 0,000
174
ANEXO 11
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE FASES LAG
ANOVA Cultivos individuales versus individuales
MEDIO CULTIVO VERSUS F Sig. L. paracasei individual 12,037 0,492 E. coli indiv idual 12,037 0,492 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 12,037 0,070 L. plantarum indiv idual 12,037 0,492 E. coli indiv idual 12,037 1,000 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 12,037 0,000 L. plantarum indiv idual 12,037 0,492 L. paracasei individual 12,037 1,000 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 12,037 0,000 L. plantarum indiv idual 12,037 0,070 L. paracasei individual 12,037 0,000
MRS
L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 12,037 0,000 L. paracasei individual 15,898 0,001 E. coli indiv idual 15,898 0,001 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 15,898 0,001 L. plantarum indiv idual 15,898 0,001 E. coli indiv idual 15,898 1,000 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 15,898 1,000 L. plantarum indiv idual 15,898 0,001 L. paracasei individual 15,898 1,000 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 15,898 1,000 L. plantarum indiv idual 15,898 0,001 L. paracasei individual 15,898 1,000
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 15,898 1,000
175
Cultivos individuales versus mixtos
MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,138 0,977 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,138 0,965 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,941 0,862 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,941 0,688 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 0,788 0,367 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 0,789 0,199 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 63,690 0,092
MRS
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 63,690 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,816 0,295 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,816 0,367 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,222 0,654 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,222 0,346 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 610,276 0,230 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 610,276 0,224 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 55,372 0,103
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 55,372 0,000
176
ANEXO 12
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL
(log10 UFC/mL)
ANOVA Cultivos individuales versus mixtos
MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,769 0,527 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,769 0,631 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,387 0,677 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,387 0,971 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 0,089 0,998 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 0,089 0,922 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 0,049 0,954
MRS
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 0,049 0,968 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,039 0,967 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,039 0,970 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,236 0,953 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,236 0,973 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 1,311 0,495 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 1,311 0,339 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 16,422 0,294
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 16,422 0,231
177
ANEXO 13
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA MÁXIMA CONCENTRACIÓN
ALCANZADA (log10 UFC/mL)
ANOVA Cultivos individuales versus mixtos
MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 5,782 0,134 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 5,782 0,114 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,235 0,841 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,235 0,994 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 2146,766 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 2146,766 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 40212,49 0,000
MRS
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 40212,49 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,317 0,295 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,317 0,362 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,225 0,654 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,225 0,346 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 14968,74 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 14968,74 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 68171,167 0,000
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 68171,167 0,000
178
ANEXO 14
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL pH
ANOVA Comparación pH total de cultivos indiv iduales versus mixtos
MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,135 0,917 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,135 0,960 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,841 0,812 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,841 0,609 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 47,782 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 47,782 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 13,699 0,000
MRS
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 13,699 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,317 0,225 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,317 0,162 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,222 0,554 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,222 0,646 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 10,278 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 10,278 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 17,376 0,000
Leche entera UHT
L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 17,376 0,000
179
ANEXO 15
VALIDACIÓN ESTADÍSTICA EN LECHE ENTERA UHT DEL MODELO GENERADO
EN CALDO MRS ANOVA Comparación del log10 UFC/mL predicho en MRS versus log10 UFC/mL observado en leche entera UHT.
CULTIVO F Sig. L. plantarum individual 0,160 0,691 L. plantarum con E. coli 0,000 0,990 L. plantarum con L. monocytogenes 0,002 0,999 L. paracasei individual 0,493 0,487 L. paracasei con E.coli 0,004 0,994 L. paracasei con L. monocytogenes 0,001 0,969 E. coli individual 0,275 0,603 E. coli con L. plantarum 0,002 0,963 E. coli con L. paracasei 0,066 0,798 L. monocytogenes individual 1,278 0,266 L. monocytogenes con L. plantarum 0,002 0,999 L. monocytogenes con L. paracasei 0,002 0,960
180
ANEXO 16
VALIDACIÓN ESTADÍSTICA DE LA ECUACIÓN POLINOMIAL DE TERCER GRADO
PARA MODELACIÓN ANOVA Ajuste de las Ecuaciones Polinomiales a los datos experimentales
Lineal Cuadrática Cúbica MEDIO
CULTIVO F Sig. F Sig. F Sig.
L. plantarum con E. coli 9,515 0,003 152,573 0,000 794,989 0,000 L. plantarum con L. monocytogenes 8,505 0,005 159,955 0,000 833,612 0,000 L. paracasei con E.coli 15,407 0,000 104,007 0,000 473,650 0,000 L. paracasei con L. monocytogenes 6,755 0,012 120,055 0,000 608,891 0,000 E. coli con L. plantarum 67,243 0,000 206,683 0,000 768,822 0,000 E. coli con L. paracasei 13,295 0,001 72,790 0,000 148,274 0,000 L. monocytogenes con L. plantarum 68,604 0,000 126,037 0,000 690,998 0,000
MRS L. monocytogenes con L. paracasei 12,487 0,001 95,654 0,000 334,214 0,000 L. plantarum con E. coli 21,397 0,000 118,405 0,000 564,651 0,000 L. plantarum con L. monocytogenes 21,405 0,000 115,933 0,000 623,943 0,000 L. paracasei con E.coli 15,407 0,000 104,007 0,000 473,650 0,000 L. paracasei con L. monocytogenes 15,605 0,000 98,443 0,000 516,926 0,000 E. coli con L. plantarum 69,929 0,000 208,696 0,000 653,742 0,000 E. coli con L. paracasei 13,295 0,001 72,790 0,000 148,274 0,000 L. monocytogenes con L. plantarum 77,190 0,000 167,815 0,000 473,931 0,000
LECHE L. monocytogenes con L. paracasei 13,471 0,001 91,220 0,000 312,284 0,000