Post on 13-Mar-2020
SCMIMC. GENER 2019
Julià Gonzalez Martin
Servei de Microbiologia-CDB
Hospital Clínic-ISGLOBAL
Departament Fonaments Clínics.
Facultat de Medicina, UB
NOVETATS EN EL DIAGNÒSTIC DE LA
TUBERCULOSI
Perquè el bacteri continua sent un
problema?
Metabolisme lent
Clínica lenta: retard diagnòstic
Respon lent al tractament: risc incompliment
Tendència a la latència
1/3 població del MON infectats (portadors)
Resposta lenta al tractament: risc incompliment
10% infectats emmalalteixen, però quan?
Proves diagnòstiques lentes: retard
diagnòstic
Divisió cada 18-24h
40 cops més lent que
E. coli
Metabolisme dorment o semi-dorment.
“Escapa” parcialment a antibiòtics
Quins són els principals problemes
del diagnòstic?
Mon Nostre entorn
Diagnòstic TB pulmonar en HIV i infants Diagnòstic formes paucibacilars: extra-
respiratòries, infants, immunodeprimits
Diagnòstic de la resistència Diagnòstic TB pulmonar en pacient
DIAGNÒSTIC MICROBIOLÒGIC
El diagnòstic microbiològic ACTUAL es recolza en:
Mostres adequades
Detecció microscòpica
mitjançant tincions
Detecció de material
genètic o d’antígens
Cultiu del
microorganisme
Identificació del
micobacteri i proves
de sensibilitat als
fàrmacs
Pro
ves ràpid
esP
roves len
tes
PL
PL
PR
PR
PR
DIAGNÒSTIC MICROBIOLÒGIC
• Altament diagnòstica si
positiva
• Ràpida i econòmica (<5€)
• Senzilla de fer
• Sensibilitat baixa
• Qüestionar en líquids biològics
• NO aplicable a sang i mostres
hemàtiques
Detecció microscòpica Cultiu
• Prova més sensible
• Permet identificar l’espècie
• Permet fer antibiograma i altres
• Lentitud
• Instal·lació de seguretat
biològica costosa
MGIT
BACT-ALERT
VERSATREK
Límit teòric: 10-100 bacteris/mL.
Mostres respiratòries i teixits sòlids: 70-85%
Mostres amb líquids biològics: 35-50%
Límit teòric: 50.000-100.000 bacteris/mL
Sensibilitat: 20-80% segons mostres. Mostres
respiratòries 45-60%, i teixits 60-80%. Líquids biològics
rarament positiva.
DIAGNÒSTIC MICROBIOLÒGIC
• POTENCIALS MILLORES:
• ús mètodes fluorescents (ja molt
estès), augment 8-10%
Detecció microscòpica Cultiu
• POTENCIALS MILLORES:
• Ús cultius líquids (molt estès).
Sòlid és complementari. Si només
un, líquid
MGIT
BACT-ALERT
VERSATREK
• Límit: pràcticament ja assolit
• Límit: pràcticament ja assolit.
Cap novetat significativa en els
darrers 20 anys
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Lisi dels bacteris i
extracció de l’ADN
Molts mètodes: manuals, semi-automatitzats,
integrats; temps real, electroforesis
Molt important la simplicitat i poca
manipulació
Principal dificultat des de
l’inici: menor sensibilitat que el
cultiu
Mètode integrat més conegut: Xpert MTB
Introducció de la mostra en cartutx on succeeix des de lisi fins detecció.
Primera versió amplifica gen rpoB, usant sondes fluorescents.
Diagnòstic i també detecció de mutacions de resistència més freqüents
a rifampicina . Procés en 2h. Recomanat per la OMS en 2011.
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Xpert MTB RIF Rendiment tuberculosi Pulmonar
Tinció sensibilitat especificitat Status HIV
ZN+ 98% 99%
ZN- 67% 99%
No feta (substitueix a
tinció)
89% 99%
Totes 79% HIV positiu
Totes 86% HIV negatiu
Steingart KR et al. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2014
27 treballs, 9557 mostres. 59% de països de baixa i mitjana renda
Respecte a tinció, Xpert aporta 23% més de diagnòstics ràpids
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Xpert MTB RIF Rendiment tuberculosi Extrapulmonar
Localització sensibilitat especificitat
Meningitis (LCR) 71,1% 98%
Pleuritis (L.pleural) 50,9% 99%
Pleuritis (L. pleural) en quant clínica 22%
Pleuritis (biòpsia) 31%
Urinaria 82,7% 98,7%
Biòpsia teixit (gàngli, òs, etc) 82% 97%
Kohli et al. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2018
66 treballs, 16213 mostres. 76% de països de baixa i mitjana renda. Rendiment en
quant a cultiu
Respecte a tinció, Xpert la diferència es important, ja que la tinció sol ser negativa
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Nova versió (2016-17)
amb canvis per augmentar
sensibilitat
Xpert MTB RIF Ultra Detecció rpoB i també IS6110 i IS1081
Millores líquids i cambra d’amplificació i reacció nested amb
sondes Taqman (abans heminested i sondes mol.beacon
5 categories de positiu: high, medium, low, very low, traces
Resistència a rifampicina: si, no, indeterminat ( amb traces)
Límit teòric detecció: 15,6 UFC/mL (9 vegades més que Xpert , 131 UFC/mL
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Xpert MTB RIF Ultra
Mostres Sens ultra % Sens Xpert
%
RT-MTB
Abbot
Referència
382 85,4 73 Bisognin PlosPne 2018
104 78,9 66
1520 87,8 82,9 FIND. WHO 2017
2120 63 46 Tinció negativa Dorman Lancet ID 2018
259 73,4 -- Tinció negativa
237 89,3 82,1 78,6 Berhanu JCM 2018
237 64,7 41,2 41,2 Tinció negativa Berhanu JCM 2018
108 75,9% (ganglis
94,1%)
Tinció negativa.
extrapulmonar
Alcaide F 2018
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Xpert MTB RIF Ultra: especificitat
• Estudis recents (Dorman S et al. Lancet Infec Dis 2018; Berhanu R et al JCM 2018),
especificitat menor de ultra: 95,6% i 96% vs 98-100%
• Especificitat disminuïda respecte al cultiu, sobretot en positius traces o very low.
Aproximadament 50% d’aquest són cultiu negatiu.
• Falsos positius?
Possible Estratègia: repetir.
positiu: positiu
negatiu: negatiu I seguiment
Us en femta (Banada PP et al. Plos ONE 2016)
Nens, diagnostic de TBP, buscant secrecions deglutides en femta. Preparació senzilla, amb
tampó I filtratge. Limit de detecció 1000 UFC/mL. 9 cops menys sensible que Xpert.
Comparació amb cultiu o Xpert en alters mostres: 85% de sensibiitat.
Valorar facilitat de la mostra
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
ALTRES PLATAFORMES
• Real Time Nested PCR. Analitzador tipus ELISA. Amplifica IS6110 i Ag proteic b (PAB).
Límit teòric 17 UFC/mL
• Vinuesa et al- Diag Microbiol Inf Dis 2016: 257 mostres respiratòries. Sensibilitat
95,4%, Especificitat 100%.
• Hinic et al. Tuberculosis 2017: 200 mostres respiratòries. Sensibilitat 91,6%,
especificitat 99,5%
ABBOTT Real Time MTB
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
ALTRES MÈTODES AMPLIFICACIÓ
• Recerca en disseny de mètodes integrats, per proves individualitzades,
portàtils: important en el concepte d’ús in situ (POC, point of care)
• Alternatives a Xpert, més econòmiques : Truenat MTB (India), EasyNAT (Xina),
Vere MTB assay (Singapur)
• Truenat MTB (India), Real Time PCR. Aparell miniaturitzat. Sensibilitat global
91%, especificitat 100%. (Nikam C et at. Int J Mycobacteriol 2014
• EasyNAT (Xina) Amplificació Isotérmica. Sensibilitat en tinció negativa 59% (Ou X
et at. Tuberculosis 2014
• Vere MTB assay (Singapur) Multiplex PCR microarray. Detecció de 10 especies i
mutacions resistència a INH i RIF.
AMPLIFICACIÓ GENÈTICA
Tulshidas S et al. Exp Op. Ther. Pat. 2018
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Tinció I cultiu probablement ja han assolit el màxim
Amplificació genètica: queda marge de millora
millorar mètodes actuals: ex. Xpert Ultra
noves metodologies d’amplificació
millora en l’extracció d’ADN (marge mentre el cultiu sigui millor)
Detecció genètica de resistències: queda marge de millora
introduir nous marcadors genètics de resistència
desenvolupar seqüenciació massiva
Buscar biomarcadors/biosensors: queda MOLT marge de millora
Detecció de lipoarabinomanan (LAM) en orina.
Detecció de compostos aromàtics volàtils
Versions de IGRA amb antígens diferents als actuals
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Biosensors en el diagnòstic de Tuberculosi
TRANSDUCTOR DE
SENYAL BIORECEPTOR
ANALITZADOR
DE SENYAL
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Biosensors en el diagnòstic de Tuberculosi
En base a que detecta En base al transductor usat
ESPUT
Productes volàtils
Cel·lula MT total
DNA
Ag secretats per MT
Ac anti MTB
Altres biomarcadors
Productes volàtils
Cel·lula MT total
DNA
Ag secretats per MT
SANG
ORINA
Potenciometria
Conductometria
Impedància
Longitud d’ona
evanescència
Fibra òptica
quimioluminescència
Piezoelèctric (basat
en microbalanç de
cristalls de quars)
Ressonància
magnètica nuclear
Electroquímic
Òptic
Bassat en massa
Magnètic
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Detecció d’antigen lipoarabinomanan (LAM) a orina.
• Actualment existeix un mètode basat en immucromatografia. Es molt poc usat degut a la baixa
sensibilitat.
• Només s’ha vist útil en pacients VIH+ amb menys de 50 CD4.
• Ser una mostra d’emissió espontània i fins a cert punt homogènia la fa interessant.
CD4 Sens %
>200 4
<200 39
<150 45,7
<100 51,7
<50 66,7
Sipal et al. (FIND) JCM; 2018
Obtenen 100 anticossos monoclonals en front diferents epítops de LAM.
Un grup de 11 funcionen bé in vitro. Lectura amb plataforma
electroquimioluminiscència
En orines de 75 pacients adults HIV+ I HIV- amb diagnòstic microbiològic
de TB:
93% sensibilitat; 97% especifcitat.
Només HIV-: sensibilitat 80%
Alere-LAM detecta 33%, només en HIV 13%
Antigen diana: 5-metil-tio-D-xilofuranosa (MTX). Epítop especific de MTC
Tecnologia a desenvolupar
Alere-LAM
Detecció no comercial LAM
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Sandlund et al. Diagn Microbiol Infect Dis 2018
Utilització d’un sensor colorimètric per detectar compostos volàtils
Estructura d’array dins cartutx plàstic amb 73 indicadors cromogènics capaços de
canviar de color en combinar-se amb compostos.
Compostos propis del bacteri i/o de l’hoste
Lectura amb un scanner
Dades preliminars:
sensibilitat 50-80%
especificitat 50-70%
Cal millorar
Detecció compostos volàtils a orina
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Zetola et al. JID 2017
Utilització de sensors composats d’un array de metal·lo porfirines i un mètode de
microbalança de quars. Davant de diferents compostos aromàtics es produeixen
canvis de freqüència mesurables amb oscil·lòmetre. colorimètric per detectar
compostos volàtils
En pacient i controls recullen alè en recipient com globus. Processament en
2h.Mesura amb els sensors i anàlisi informàtic
51 pacients amb TB (comprovada per cultiu) i 20 controls.
Sensibilitat 94% i especificat 90%
Millorable en el futur
Detecció compostos volàtils a l’alè
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Detecció compostos volàtils
Rates a Gambia (Cricetomys gambianus) entrenades per detector compostos
volàtils en mostres d’esput de pacients tuberculosos
https://www.youtube.com/watch?v=KoRvdyuHxdE&index=18&list=UUuK8qSq_q5Lt0RsLGnwXkmQ
IDENTIFICACIÓ
DELS CULTIUS
La majoria de mètodes es basen en amplifcació genètica.
Ample varietat de tècniques
Detecció Ag MP64 per
immunocromatografia
Identifica M.tuberculosis
Dues tecnologies importants. Cobreixen
gran part de les necessitats:
Cultiu a identificar :
M. intracellulare
Perfil patró: M.
intracellulare
Les versions actuals poden identificar
159 de les 170 especies descrites. Prova de referencia per identificar especies
Maldi-TOF
Seqüenciació
DETECCIÓ DE LA
RESISTÈNCIA
Fenotip. Antibiograma, métode
referència. Molt lent
Genotip. Detecció d’algunes
mutacions de resistencia conegudes
Actualment es complementen, NO es pot prescindir del fenotípic.
El antibiograma genotípic avança informació quan es resistent.
També ajuda a confirmar les resistències fenotípiques, sobretot les de baix nivell.
Orienta sobre el grau de resistència:
Isoniazida inhA: resistència creuada amb etionamida i protionamida. Resistència de baix nivell
Isoniazida katG: resistència de baix nivell. NO creuada amb etionamida
Rifampicina rpoB: mutacions als codons 511, 516, 522, possible sensibilitat a rifabutina
Fluorquinolones, gyrA: codó 94 resistència a moxifloxacino, levofloxacino, ofloxacino i ciprofloxacino. Codons
90,91: resistència a ofloxacino i ciprofloxacino, sensibilitat a moxifloxacino.
DETECCIÓ DE LA
RESISTÈNCIA
Fenotip. Antibiograma, métode
referència. Molt lent
Genotip. Detecció d’algunes
mutacions de resistencia conegudes
Actualment s’estan desenvolupant metodologies de seqüenciació massiva per detecció de
resistències. La fita es substituir l’antibiograma (possible a mig termini?)
Un estudi recent publicat a NEJM (Cryptic consortium and the 100,000 genomes project),
caracteritza 10.000 soques de diferents països. Objectiu establir valors de predicció de la
sensibilitat a fàrmacs de 1L:
INH 99,9%, RF 97,5%, EB 94,6%, PZ 91,3%
(menys sensibilitat quan menys es coneixen les mutacions de resistència)
DETECCIÓ DE LA
RESISTÈNCIA
Fenotip. Antibiograma, métode
referència. Molt lent
Genotip. Detecció d’algunes
mutacions de resistencia conegudes
Us també de seqüenciació massiva per diagnòstic.
Limitacions més importants: sensibilitat per a mostres clíniques, encara no suficient.
Accés a la tecnologia, encara escàs per a molts centres
Interpretació de resultats: a mig termini bases d’interpretació accessibles sense coneixements
bioinformàtics (PhyResSE, TBProfiler, CASTB)
Cost: aprox. 250-300€/mostra.
FUTUR DEL DIAGNÒSTIC
Què millorarà el diagnòstic?
MILLORES en tècniques moleculars, sobretot extracció i equips integrat
Desenvolupament i universalització de seqüenciació massiva
Detecció de biomarcadors: ideal en orina o sang
Desenvolupament de biosensors (nassos electrònics i similars)
Facultat de Medicina
GRISELDA TUDÓ
ALEX LOPEZ
ELENA PORTELL
ROSA MONTÉ
DOLORS RICART
LORENA SAN NICOLÁS
VALNES RODRIGUES
ESTIBALIZ PAREJA
DIEGO MARTINEZ
ANA MARTINEZ
ANGELY ROMAN
MARIANA FERNANDEZ