Post on 22-Oct-2018
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE BREZO
(Calluna vulgaris) CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Y
EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD FRENTE AL VIRUS
DE LA HEPATITIS C
Departamento de Producción y Caracterización de Nuevos Alimentos
Grupo Ingredientes Alimentarios Funcionales
Centro Biología Molecular Severo Ochoa
VIRUS HEPATITIS C
2,8% POBLACIÓN INFECTADA
350.000 MUERTES/AÑO
NO EXISTE VACUNA
INTERFERÓN (IFN-) + RIBAVIRINA
Síntomas ~ gripe
Anemia hemolítica
Efectos teratológicos
efectos
secundarios
Necesidad de nuevos agentes con alto índice
terapéutico y pocos efectos secundarios
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
OH
O
OH
OH
O
OH
Acido oleanólico Acido ursólico
ANTIINFLAMATORIA
ANTI-TUMORAL
ANTI-REUMÁTICO
HEPATOPROTECTORA
ANTIVIRAL HEPATITIS C
Brezo (Calluna vulgaris) Brezo (Calluna vulgaris)
Afecciones
infecciosas vías
urinarias
Antiinflamatorio Antiespasmódico
Cicatrizante
FITOQUÍMICOS:
ANTIOXIDANTES, ANTIINFLAMATORIOS, ANTICANCERÍGENOS
Quercetina
Acido clorogénico
kaempferol-3-O-β-d-
galactosido
α,β-amirina
Sitosterol
Acido ursólico (52 mg/g)
Acido oleanólico (11 mg/g)
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
OBTENCIÓN DE
NUTRACEUTICOS E
INGREDIENTES ALIMENTARIOS
Celda de extracción 2 L
Separadores (S1, S2) 0.5 L
Recirculación CO2
Bomba cosolvente
28 µg/g extracto flores
125 µg/g extracto hojas
75 µg/g extracto flores
398 µg/g extracto hojas
Szakiel y col. 2013
Zhao, 2011
Extractos SFE: Taraxasterol, Friedelinol, α,β- amirin
A. Szakiel, B. Nizynski and C. Paczkowski. Natural Product Research. 2013. 27 (15) 1404-1407
J. Zhao. The extraction of high value chemicals from heather (Calluna vulgaris) and bracken (Pteridium aquilinum). PhD
Thesis, University of , 2011.
SFE
CONDICIONES DE EXTRACCIÓN
Ext. P T Tiempo Caudal CO2 co-solvente
(MPa) (ºC) (h) (g/ min) (% etanol)
1 20 50 3 60 0
2 30 50 3 60 0
3 40 50 3 60 0
4 50 50 3 60 0
5 40 40 3 60 0
6 40 60 3 60 0
7 40 70 3 60 0
8 30 50 3 60 5
9 30 50 3 60 10
10 30 50 3 60 15
Ext. P T Tiempo Caudal CO2 co-solvente
(MPa) (ºC) (h) (g/ min) (% etanol)
11a S1 50 50 4 50 0
11b S2
12a Etapa 1 25 50 1.5 50 0
12b Etapa 2 30 50 2.5 50 10
RESULTADOS SFE: EFECTO DE LA PRESIÓN
0 10 20 30
20
30
40
50
mg/g extrato
P (
bar)
50ºC
OA
UA
0.00
1.00
2.00
3.00
200 300 400 500
P (bar)
50ºC
RESULTADOS SFE: EFECTO DE LA TEMPERATURA
0 5 10 15 20 25 30 35
40
50
60
70
mg/g extrato
T (
ºC)
Variación de extracción triterpenos con la Tª de extracción a presión constante de 400 bar
OA
UA
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
40 50 60 70
Ren
dim
ien
to (
%)
Tª (ºC)
Variación del rendimiento con la Tª de extracción a presión constante de 400 bar
Rendimiento
Concentración
de triterpenos
RESULTADOS SFE: EFECTO DEL % COSOLVENTE
0 50 100 150 200 250
0
5
10
15
mg/g extrato
co
so
lve
nte
(%
)
Variación de extracción triterpenos con el % de cosolvente a presión y Tª constantes (300 bar, 50ºC)
OA
UA
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
0 5 10 15
Ren
dim
ien
to (
%)
Cosolvente (%)
Variación del rendimiento con el % de cosolvente a presión y Tª constantes (300 bar, 50ºC)
Rendimiento
Concentración
de triterpenos
RESULTADOS SFE: FRACCIONAMIENTO
Ext. Rendimiento Ácido oleanolico Ácido ursolico
(%) (mg/g extracto) (mg/g extracto)
11a S1 0.26 13.50 98.56
11b S2 1.94 2.53 2.95
El fraccionamiento en línea del extracto (Ext.11) produce: rendimiento S2
>S1, [triterpenos] >S1.
Cuando la extracción se lleva a cabo en dos etapas (Ext.12) el uso de etanol
en la segunda etapa da como resultado: ↑rendimientos, ↑ [triterpenos].
En el brezo ursólico>oleanólico (ratio ursólico/oleanólico ≈4), sin embargo
solubilidad oleanólico>ursólico en etanol produce: uso cosolvente ↓ratio
(ratio ursólico/oleanólico ≈0.7).
Ext. Rendimiento Ácido oleanolico Ácido ursolico
(%) (mg/g extracto) (mg/g extracto)
12a Step1 2.65 1.44 2.19
12b Step2 5.28 73.14 51.62
RESULTADOS: ACTIVIDAD ANTI-HCV
Diluciones extractos
SFE-brezo
Diluciones extractos
SFE-brezo
Células Huh7.5 no
infectadas
Células Huh7.5
infectadas con HCVcc
CC50
IC50
Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSIC-UAM), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Actividad Anti-HCV extractos IT>1
Ext.
OA
(mg/g extracto)
UA
(mg/g extracto)
Indice Terapéutico
(CC50/IC50)
2 2.36 16.92 0.99
4 5.66 18.86 0.80
5 2.49 17.85 0.44
7 9.19 21.59 1.40
8 12.41 11.33 2.84
9 69.75 55.57 3.25
10 82.87 141.45 1.52
11a 13.50 98.56 1.24
13b 73.14 51.62 3.60
OA 10.50
UA 5.00
RESULTADOS: ACTIVIDAD ANTI-HCV
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0
50
100
150
200
250
0 1 2 3 4
Th
era
pe
uti
c In
de
x (T
I)
mg
/g o
lea
no
lic +
urs
oli
aci
ds
ethanol/heather ratio
Uso etanol como
cosolvente aumenta
la concentración de
ácidos triterpénicos
en los extractos
pero reduce el TI
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 20 40 60 80 100
TI
(CC
50
/IC
50
)
mg/g olenolic acid
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 25 50 75 100 125 150
TI
(CC
50
/IC
50
)
mg/g ursolic acid
La SFE permite obtener extractos con altas
concentraciones de ácidos triterpénicos
(oleanólico y ursólico) (2-22 % en peso).
Aunque es necesario continuar con las
investigaciones, los extractos supercríticos de
brezo podrían presentar una alternativa
terapéutica contra el virus de la Hepatitis C.
CONCLUSIONES
Los extractos supercríticos de brezo presentan
actividad anti-HCV. Algunos extractos presentan
índices terapéuticos cercanos a los del ácido
ursólico aunque dos veces menores que los del
ácido oleanólico.