Post on 25-Jun-2015
Vectores lentivirales
Lic. Saumel Pérez Rodríguez
Centro de Inmunología Molecular
Septiembre 2010
Virus como parásitos intracelulares obligados han desarrollado en su evolución mecanismos muy eficientes para la entrada de su material
genético (DNA/RNA) a una célula blanco
Virus recombinantes
Adenovirus Retrovirus
Lentivirus
Ventajas de los vectores lentivirales
Capacidad de infectar una amplia variedad de tipos celulares, en proliferación o no, altamente diferenciadas o no.
Integración al genoma
Expresión estable y a largo plazo
Muy baja frecuencia de inducción de mutagénesis insercional
No exacerban tumorigénesis in vitro y no existen observaciones de oncogénesis en animales tratados con vectores lentivirales in vivo o por lentitransgénesis
Ventajas de los vectores lentivirales
Physiol Genomics 31: 159–173, 2007.
Eficiencia de lentitransgénesis
Science. 2002 Feb 1;295(5556):868-72. 80% efficiency
Cows
70% efficiencyEMBO Rep. 2003 Nov;4(11):1054-60
Pigs
EMBO Rep. 2004 Jul ;5 (7):728-33 . Genesis. 2004 Jun;39(2):94-9.
Chickens
4 to 45 % germ line transmission46 % efficiency
Rats
Biol Reprod. 2004 Aug;71(2):405-9100% efficiency
Monkeys
Nature. 2008 Jun 12;453(7197):921-4 100 % efficiency
Mice
Estructura partícula viral
Arch. Immunol. Ther. Exp. 2010
Ciclo de vida viral
1. Unión cubierta viral al receptor celular
2. Fusión membranas
3. Pérdida cubierta viral y liberación del núcleo viral al citoplasma
4. Síntesis DNA viral y transporte activo del núcleo viral al núcleo de la célula
5. Integración al genoma celular del DNA viral
6. Expresión genes virales, empaquetamiento RNA viral full lenght y ensamblaje partícula viral
7. Maduración viriones
Arch. Immunol. Ther. Exp. 2010
Genoma viral
Deleción 80% genoma viralSolo se mantienen los genes que codifican para las proteínas
estructurales y reguladoras y elementos cis imprescindibles para la generación de los viriones recombinantes
GenesGag: proteínas estructurales
Pol: enzimas con ssRNA
Env: proteínas cubierta viral
Elementos cis
1. LTR: elementos flanqueantes con varias funciones. - 3´LTR actúa como terminador de la transcripción y señal de polyA.- Permiten la integración al genoma.- Deleción en el 3´LTR impide que el 5´LTR actúe como promotor de la
RNA pol II para evitar silenciamiento génico por metilación.2. RRE: secuencia que interactúa con Rev facilitando la exportación nuclear
del RNA viral full lenght.3. WPRE: aumenta la estabilidad del transcripto y por tanto la expresión del
gen de interés.3. cPPT: es necesario para el importe nuclear del complejo de
preintegración.4. Ψ: señal para el empaquetamiento del RNA viral específico en los
viriones formados.
Physiol Genomics 31: 159–173, 2007. Curr Gene Ther. 8(6): 483–488, 2008;.
pLWenhproC D69890 bp
potenciador mCD4
wpre
hCD6
5´ LTR
3´ LTR
pptrAmp
RRE
pbla
promotor hCD4
ori
SmaI (2339)
XmaI (2337)
EcoRV (3556)
NcoI (2344)
NcoI (4739)
NcoI (6919)
BamHI (2109)
BamHI (3560)
BamHI (4155)BamHI (5740)
BamHI (6335)
Producción de los vectores virales
CaPO4 method PEI method
87-95% of green cells
Promotores usados en vectores lentivirales
1. Promotores ubicuos:- Human ubiquitin C (UbC)- Fosfoglicerolquinasa (PKG)
>69% ratón, rata, cerdo, ganado F0, >92% ratón F1
Science 295: 868–872, 2002; Genesis 39: 94–99, 2004; Genesis 45: 177–183, 2007; Transgenic Res 16:661–664, 2007.
- CMV- Chicken β actina con un enhancer de CMV (CAG)- Factor de elongación 1-α
>94% cerdo y 100 % F0 ratón, >50% F1 ratón
Blood 103: 580–582, 2004; FEBS Lett 571: 233–236, 2004; Physiol Genomics 31: 159–173, 2007
2. Promotores tejido específico:
-K14 específico de keratinocitos basales en cerdos (13% F0)-miogenina-lck de linfocitos T
Science 295: 868–872, 2002 ;EMBO Rep 4: 1054–1060, 2003.
-Sinapsina 1-Pigmento rojo (RG)-Rodopsina (Rho)-K12 específico del epitelio de la córnea
Mol Ther 8: 666–673, 2003; J Neurosci Methods 152: 1–9, 2006.
RNA interferencia
1. Utilización de promotores de la RNA pol III: H1 y U6.
-Ubicuos
-Expresión eficiente de shRNA
-Promotor U6 más fuerte que H1
2. Eficiencia 13-23% en ratones fundadores
3. Posible letalidad embrionaria debido al knockdown de un gen esencial
Curr Gene Ther. 8(6): 483–488, 2008
Utilización vectores lentivirales en transgénesis
1. Microinyección en el espacio perivitelino
2. Remoción de zona pelúcida
3. Transferencia nuclear usando células somáticas o embrionarias modificadas
4. Modificación de espermatozoides
5. Modificación de spermatogonial stem cells (SSC)
30-50% eficiencia transducción en SSC murinas con establecimiento de colonias espermatogénicas en 100% ratones
50% progenie transgénica en ratas
Desventajas
1. Nivel de seguridad BSL2
2. Límites de tamaño del vector viral
- Backbone vector viral 2.2 kb, promotor-gen <10 kb
1. Mosaicismo genético
- Proceso de integración dura aproximadamente 48 h o más
- T1/2 largo de los viriones en el espacio perivitelino
- Persistencia del complejo de preintegración en el citoplasma
4. Modificaciones epigenéticas:
Presencia de KRAB en sistema tet inducible provoca silenciamiento
total si no hay doxycyclina en los primeros días de desarrollo del
embrión.
Metilación promotores y genes en islas CpG internas (PKG)
Metilación del promotor por efecto de posición
5. Toxicidad vector
-VSVG tiene propiedad fusogénica
-Determinar dosis viral
Bioseguridad
1. Deleción 3´LTR garantiza partículas virales deficientes de replicación.
2. Separación de elementos cis y trans.
3. Deleción 80% genoma viral
4. Eliminación vectores con detergentes suaves, bleach o hipoclorito, seguido de lavado con etanol
Lentivectores en terapia génica
1. Células hepatocarcinoma humano transducidas con lentivectores con un gen de suicidio bajo el promotor de alfa feto proteína resultó en una destrucción específica de estas células malignas.
Cancer Gene Ther 10:689–695, 2003
2. Erradicación específica de células cancerosas in vitro y en un modelo tumoral murino con lentivectores conteniendo el gen de la toxina A diftérica bajo el promotor de PSA
Science 314:126–129, 2006
Seudotipaje de los lentivectores
1. VSVG: amplio rango de tipos celulares
2. Uso glicoproteínas virales tejido específicas
3. Ingeniería genética de los dominios de unión al receptor de proteínas de cubierta existentes para restringir, ampliar o cambiar laespecificidad viral.
4. Fusión de proteínas virales de cubierta a ligandos naturales.
5. Sistema de proteínas virales de cubierta del virus del sarampión:
-F: fusión de membranas
-H: mutación de residuos de unión y unión covalente a ligandosnaturales (EGF) o single chain antibody (anti CD20)
Mol Ther 16:1427–1436, 2008
ObjetivoObtener un BALB/c GFP transgénico como prueba de concepto de
lentitransgénesis en este background genético
Resultados
Baja toxicidad de la preparación viral:
- 60% embriones BALB/c y 66% FVB/n
Eficiencia transgénesis:
- total: 58% BALB/c y 48% FVB/n
- Activa: 20% BALB/c y 22% FVB/n
No interferencia GFP en el desarrollo y reproducción
Expresión de GFP por 6 generaciones
B
A. Identificación macroscópica de una cría BALB/ GFP+ entre crías controles bajo luz ultravioleta. B. Análisis de Southern Blott para determinar número de copias integradas. Carriles 1 y 2: ratones BALB/c GFP positivos. Carriles 3, 4 y 5: ratones BALB/c no transgénicos. Carriles 6 y 7: DNA no añadido. Carril 8: vector de transferencia LTRcPPT- EF1a-GFP-WPRELTR. ** Fragmentos mayores de 7 Kb. * Fragmento de 7 Kb.
c-f: Expresión de GFP en secciones de músculo (c), intestino (d), bazo (e), y nodos linfáticos (f) contrateñido con DAPI. Intensidad alta de fluorescencia GFP está asociada con el esqueleto fibroblástico-estromal de la pulpa blanca (*), y elementos vasculares incluyendo la arteriola central esplénica(**), y las vénulas de endotelio alto en el nodolinfático (***).
Caracterización de un ratón BALB/c GFP+
Perfil de distribución celular de la intensidad de fluorescencia de GFP en sangre periférica. Izquierda: Dot plot que identifica poblaciones celulares por morfología. Centro: Distribución de la intensidad de fluorescencia GFP. Se definen 3 grupos celulares por su intensidad de fluorescencia R1 (baja), R2 (media) y R3 (alta). Derecha: Dot plotdonde se muestran las poblaciones R1 (gris claro), R2 (gris oscuro) y R3 (negro).
Caracterización de un ratón BALB/c GFP+
Ratones BALB/c quimerasCaracterización de un ratón BALB/c quimérico de médula ósea
Caracterización de un ratón BALB/c quimérico de médula ósea
Aplicaciones de este modelo BALB/c GFP+
Formación de tumores
Diseminación células tumorales
Homing y recirculación de linfocitos
Estudios de poblaciones celulares ex vivo
Vectores lentivirales
Lic. Saumel Pérez Rodríguez
Centro de Inmunología Molecular
Septiembre 2010