2011_17 Fitorremediacion.pdf

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Agrobiotecnología Curso 2011

FitorremediaciónAlejandro Mentaberry

Agrobiotecnología

Fitorremediación

SumarioAlternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados

Fitorremediación

- Ventajas

- Limitaciones

- Tipos de plantas más utilizadas

Tipos de fitorremediación

- Fitoextracción

- Rizofiltración

- Fitotransformación

- Fitodegradación de compuestos orgánicos

- Fitoestimulación

- Fitoestabilización

Plantas transgénicas para detectar compuestos inorgánicos tóxicos en el medio ambiente

Referencias

Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Agrobiotecnología a Riley et al.b Clean up Standards for contaminated sites. New Jersey, Department of Environmental Protection(1996)c Microgramos por gramod Picocuries por gramoe Picocuries por kilogramof Stern et al.

-------0,00011-3.500.000 ePlutonio

-------0,02-46.900 eCesio

-------0,03-540.000 eEstronio

-------

250 f0,2-16.000 c

0,06-18.700 dUranio

pCi . g -1UnidadesRadionucleótidos

1.500150-5.000.000Zinc

60030-550.000Cobre

2700,1-1.800.000Mercurio

1005,1-3.950.000Cromo

20100-102.000Arsénico

100100-345.000Cadmio

6001.000-6.900.000Plomo

(mg/Kg) b(µµµµg/Kg) aMetales

Límite regulatorioRango de concentraciónElemento

Rangos de concentración comúnmente hallados y límites permitidos paralos contaminantes metálicos y los radionucleótidos más importantes

Fitorremediación

Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1998.

• Suelos- Rellenado de terrenos- Fijación química e impermeabilización

superficial

- Lixiviación y reposición del suelo

• Aguas- Precipitación o floculación- Intercambio iónico

- Osmosis inversa

- Microfiltración

Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Mercado potencial para la descontaminación ambiental en Estados Unidos mediante las tecnologías actuales

Agrobiotecnología

Fitorremediación

• En los últimos 10 años se ha desarrollado un mercad o . importante para la biorremediación, principalmente en . Estados Unidos.

Productos tóxicos: ~ U$S 400.000 M Metales pesados: ~ U$S 7.100 M Metales pesados y tóxicos: ~ U$S 35.400 M

• El costo estimado para remediar los sitios utilizad os . por el Departamento de Energía Atómica por mé todos . convencionales se calculó en U$S 142.000 M

• En 2005, el mercado norteamericano de remediación . ambiental era de U$S 6.000 a 8.000 M por año.

• El mercado norteamericano de fitorremediación era d e . U$S 100-150 M anuales (0.5% del total de remediació n).

• El mercado comercial de fitorremediación comprende . 80% de contaminantes orgánicos y 20% de inorgánicos .

• El mercado de fitorremediación creció de 3 y 5 veces . entre 1999 y 2005.

La fitorremediación es económicamente competitiva respecto de otras alternativas de remediación

Adaptado de Chappell, US Environmental Protection Agency,1998.

Fitorremediación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

“Conjunto de métodos para degradar, asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados y compuestos orgánicos por medio de la utilización de plantas.”

“Es el empleo de vegetación parael tratamiento in situ de suelos, sedimentos y aguas contaminadas.”

Fitorremediación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Se basa en los procesos que ocurren naturalmente por los cuales las plantas

y los microorganismos rizosféricos degradan y secuestran contaminantes

orgánicos e inorgánicos

• Sustratos sólidos (suelos y sedimentos):

- sitios militares (TNT, metales, orgánicos)- campos agrícolas (herbicidas, pesticidas, metales, selenio)- sitios industriales (orgánicos, metales, arsénico)- minas (metales)- sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos ar omáticos policíclicos; PAHs)

• Sustratos líquidos

- aguas residuales (nutrientes, metales)- drenajes de agricultura (nutrientes, fertilizantes , metales,

arsénico, selenio, boro, pesticidas orgánicos y her bicidas)- efluentes industriales (metales, selenio)- efluentes de minería (metales)- plumas subterráneas (metales, compuestos orgánicos )

• Sustratos gaseosos

- aire libre e interior (óxidos de nitrógeno, SO 2, ozono, CO 2, gases neurotóxicos, partículas de hollín, e hidrocarburos halogenados volátiles)

La fitorremediación permite detoxificar distintos sustratos

Contaminantes orgánicos

• Son consecuencia de las actividades humanas:

- industria petroquímica (derrames de combustibles y solventes)- actividades militares (explosivos y armas químicas )- agricultura (pesticidas, herbicidas)- industria química (efluentes)- industria forestal y maderera (efluentes)

• Dependiendo de sus propiedades, pueden ser:

- degradados en la zona radicular

- incorporados a la planta degradaciónsecuestrovolatilización

• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación:

Solventes orgánicos, herbicidas, explosivos, hidroc arburos derivados del petróleo, bifenilos policlorinados (PCB s), tricloroetileno (TCE), hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (PAHs).

• Pueden ser consecuencia de elementos naturales presentes en la corteza . terrestre y/o en la atmósfera, o resultado de actividades humanas:

- minería- industria- transporte- agricultura- actividades militares

• No pueden ser degradados, pero pueden fitorremediarse mediante . estabilización o secuestro en la parte cosechable de la planta.

• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación:

Macronutrientes vegetales (nitrato y fosfato), elem entos traza (Cr, Cu, Fe, . Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg , Se, Pb, V y W), e . isótopos radioactivos ( 238U, 137Cs y 90Sr), entre otros.

Contaminantes inorgánicos

Ventajas

• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguascontaminadas (costo 7-10 veces menor respecto de los

. métodos tradicionales).

- Las plantas emplean energía solar.- El tratamiento es in situ.

• Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos.

• Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos largos.

• Es una metodología con buena aceptación pública.

• Se generan menos residuos secundarios.

Fitorremediación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Limitaciones

• El proceso se limita a la profundidad de penetraciónde las raíces o a aguas poco profundas.

• La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente contaminadas.

• Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.

• La biodisponibilidad de los compuestos o metaleses un factor limitante de la captación.

• Deben considerarse contaminaciones potencialesde la cadena alimentaria y napas de agua.

• Se requiere comprender mejor la naturalezade los productos de degradación (fitodegradación).

• Falta elaborar el marco regulatorio detallado.

Fitorremediación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

• Captación por las raíces:- Movilización de los metales

• Quelación mediante fitosideróforos• Unión a proteínas quelantes (fitoquelatinas)• Acidificación por exudado de H+

- Captación por la raíz

• Via apoplástica• Vía simplástica

• Transporte:- Almacenamiento en raíz o exportación al tallo por xilema- Transporte por xilema o redistribución por floema- Almacenamiento en vacuolas

• Mecanismos de evasión o tolerancia:- Captación celular limitada (evasión)

- Metabolismo tolerante a metales pesados- Detoxificación por quelación, compartimentalizacióno precipitación

• Mecanismos más probables:- Compartimentalización en vacuolas y quelación con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ )

- Precipitación como fitatos (Zn2+)

Biología de la acumulaciónde metalesen plantas

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Mecanismos involucrados en la quelación y compartimentali-zación

Mecanismos de tolerancia para contaminantes orgánic os e inorgánicos en plantas.La detoxificación generalmente involucra la conjugación seguida del secuestro activo en la

vacuola y el apoplasto, donde el contaminante hace el menor daño. Los quelantes son: glutatión (GSH), glucosa (Glu), metalotioneínas (MT), nicotinamina (NA), ácidos orgánicos (OA,

fitoquelatinas (PC). Los transportadores se representan por cajas con flechas.

Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Bi ollogy, 2005.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Contaminante

inorgánico

Contaminante

orgánico

adsorción

pared celular

secuestro

citoplasma

secuestro

vacuola

modificación

enzimática

degradación

enzimática

conjugación

Estrategias de fitorremediación utilizadas para remediar agua, suelo o aire contaminados.

Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Bi ology, 2005.

hidroponia(rizofiltración)

humedal artificial

barrera hidráulica fitoextracción y fitoestabilizacion

filtración de aire

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Plantas usadas como barrera hidráulica

para prevenir la contaminación de

napas y la dispersión horizontal de plumas.

Plantas usadas como filtros

• Selección de la especie vegetal

• Datos de toxicidad y de degradación de contaminante s

• Tasa de captación del contaminante y tiempo

de limpieza requerido

• Esquema y densidad de las plantaciones

• Costos de Irrigación, insumos agronó micos, . mantenimiento y gastos de cosecha.

• Zona de captura de agua y tasa de transpiración

• Análisis de riesgos contingentes (plagas, sequías, etc.)

Diseño de sistemas de fitorremediación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

• Freatófitas- Plantas de raíces profundas

(álamo, sauce, algodonero).

• Pasturas- Por su tipo de raíz retienen el suelo.

• Legumimosas- Permiten enriquecer el suelo en N2.

• Acuáticas- Permiten la degradación de contaminantes

en humedales artificiales.

Tipos de plantas más utilizadas

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Algunas especies propuestas para fitorremediación

Thlapsi caerulescens

Brassica juncea

Silene vulgaris Alyssum lesbiacum Festuca arundinacea

Hibiscus cannabinusLotus corniculatus

Agrobiotecnología

Ejemplosde pruebasde campo para fitorremediación de metales

Fitorremediación

Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.a: Métodos de fitorremediación. FE: fitoextracción; FV: fitovolatilización; RF: rizofiltración; FEAQ: fitoextracción asistida por quelantes; FEC: fitoextracción continua

Comentarios

La incorporación de Pb2+aplicando EDTA resultó en la reducción del 28% en la contaminación en el área en una temporada de cosecha.

Fitoextracción de suelos enmendados con barros sedimentarios. La acumulación de Zn2+

en T. caerulescensfue 10 veces mayor que en otras plantas.

Suelos enmendados con sedimentos.

El contenido de B extraiblepor agua se redujo entre 24% y 52%, y el de Se seredujo entre 13% y 48% por todas las especies.

Remoción de U de aguas subterráneas

Métodoa

FE-FEAQ

FE-FEC

FE-FEC

FE-FEC

FV

RF

Ubicación

Trenton, N.J.

Beltsville, Md.

Rothamstead, U.K.

Los Baños, California

Asthabula, Ohio

Planta

Brassica juncea


Silene vulgaris

Brassica oleracea

Raphanus sativus


Alyssum lesbiacum

Alyssum murale

Arabidopsis thaliana

Brassica juncea

Festuca arundinacea

Lotus corniculatus

Helianthus annus

Metal

Pb

Cd

Zn

Zn

Cd

Ni

Cu

Pb

Cr

Se

B

U

Comentarios

La incorporación de Pbresultó en la reducción del 28% en la contaminación en el área en una temporada de cosecha.

Fitoextracción de suelos enmendados con barros sedimentarios.

en T. caerulescensfue 10 veces mayor que en otras plantas.

Suelos enmendados con sedimentos.

El contenido de B extraiblepor agua se redujo entre 24% y 52%, y el de Se seredujo entre 13% y 48% por todas las especies.

Remoción de U de aguas subterráneas

Métodoa

FE-FEAQ

FE-FEC

FE-FEC

FE-FEC

FV

RF

Ubicación

Trenton, N.J.

Beltsville, Md.

Rothamstead, U.K.

Los Baños, California

Asthabula, Ohio

Planta

Brassica juncea


Silene vulgaris

Brassica oleracea

Raphanus sativus


Alyssum lesbiacum

Alyssum murale

Arabidopsis thaliana

Brassica juncea

Festuca arundinacea

Hibiscus cannabinus

Lotus corniculatus

Helianthus annus

Metal

Pb

Cd

Zn

Zn

Cd

Ni

Cu

Pb

Cr

Se

B

U

• Contaminantes orgánicos:No existen generalmente transportadores específicos en la planta. Se mueven por difusión en los tejidos vegetales, según sus propiedades químicas. La hidrofobicidad les permite atravesar f ácilmente la bicapa lipídica pero se mueven con dificultad por los flui dos celulares.

• Contaminantes inorgánicos :Incorporados por procesos biológicos mediante trans portadores de membrana, preexistentes porque son nutrientes o sim ilares a ellos (arsenato y selenato son incorporados por transportad ores de fosfato). Por ello, su captación es saturable .

• Los contaminantes inorgánicos causan en general tox icidad . por daños en la estructura celular (estrés oxidativ o por su . actividad redox) y reemplazan a otros nutrientes es enciales.

• Los contaminantes orgánicos suelen ser menos tó xicos: no . tienden a acumularse a altos niveles y son menos re activos.

• En los suelos con mezcla de ambos contaminantes, el . crecimiento vegetal y la posibilidad de fitorremedi ación son . más limitados

Características del contaminante que afectan la captación por la planta

Agrobiotecnología

Fitorremediación

La biodisponibilidad depende de:

• Las propiedades químicas del contaminante (hidrofob icidad. y volatilidad):

Las moléculas con extrema hidrofobicidad (PCBs, PAHs, hidrocarburos) se unen fuertemente a la materia orgánica y no se disuelven en el agua (contaminantes “recalcitrantes”).

Los contaminantes no volátiles son fitodegradados o secuestrados, mientras que los volátiles pueden liberarse a la atmósfera sin transformaciones.

• Las propiedades del suelo:

Los arcillosos (partículas pequeñas) retienen más agua que los arenosos y tienen más sitios de unión para iones (cationes), al igual que los de mayor concentración de materia orgánica (humus). Éstos pueden unir mayor cantidad de contaminantes hidrofóbicos. La biodisponibilidad de los contaminantes iónicos está afectada por el pH del suelo (pH ácido, aumenta la biodisponibilidad de cationes)

• Las condiciones medioambientales:

La temperatura y la humedad afectan la biodisponibilidad (por ejemplo, aumentando la migración de contaminantes disueltos en agua)

Factores físicos y químicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Interacciones planta-microorganismo:

- La liberación de fotosintatos por la planta aumenta la població n . microbiana capaz de remediar.

- La liberación de metabolitos secundarios de la pla nta puede activar . la expresión de genes relacionados a la degradació n de . contaminantes en los microorganismos o actuar como co-metabolitos . para la degradación por los microorganismos.

La biodisponibilidad es modificada por liberación d e:

• Biosurfactantes (ramnolípidos) liberados por bacterias que aumentan . disponibilidad de compuestos hidrofóbicos• Exhudados vegetales con compuestos que pueden promover la síntesis . de biosurfactantes por las bacterias• Enzimas (vegetales y bacterianas) que modifican las cadenas laterales de . algunos compuestos orgánicos aumentando su biodisponibilidad.• Quelantes por plantas y bacterias (sideróforos, ácidos orgánicos y . fenólicos) que aumentan disponibilidad de metales.• Secreción de H + por las plantas que acidifican el suelo.• Enzimas que convierten los metales a formas menos tóxicas o más . biodisponibles (por ejemplo, Cr VI a Cr III)

Factores biológicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante

Agrobiotecnología

Fitorremediación .

Procesos que requieren aumentar los conocimientos para aumentar la eficiencia de la fitorremediación:

• Interacciones planta- microorganismo y otros procesos . rizosféricos

• Captación por la planta

• Mecanismos de traslocación

• Mecanismos de tolerancia (compartimentalización, . degradación)

• Quelantes vegetales involucrados en transporte y . almacenamiento

• Movimiento de los contaminantes en los ecosistemas . vía el sistema suelo-agua-planta hacia niveles tróf icos . superiores

Aspectos que requieren de mayor investigación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Agrobiotecnología


Fitorremediación

Las bases conceptuales de la fitorremediación se apoyan en los mecanismospresentes en plantas que hiperacumulanmetales

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Adaptado de: Buchanan et al., Biochemisty and Molecular Biology of Plants, 2000.

Fitoestimulación

Acumulación o degradación en el tejido cosechable

Fitovolatilización

FitodegradaciónMicroorganismo

que degrada toxinas

Toxina

Fitoestabilización

Fitoextracción

Fitorremediación

• FitoextracciónLas plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).

• RizofiltraciónLas raíces de las plantas se usan para adsorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.

• FitoestimulaciónSe usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).

• FitoestabilizaciónLas plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire.

• Fitotransformación- Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos.

- Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósferamediante la transpiración.


Agrobiotecnología

Fitorremediación

• Fitoextracción:

Usada principalmente para remediar metales y otros tóxicos inorgánicos .. (Se, As, radionucleótidos).

• Rizofiltración:

Técnica relativamente cara de implementar, siendo ú til para cantidades . pequeñas de aguas residuales conteniendo compuestos inorgánicos. peligrosos (radionucleótidos). Los humedales artif iciales se utilizan para . una amplia gama de contaminantes inorgánicos (metales, percloratos, cianuro, . nitratos y fosfatos) y contaminantes orgánicos (explosivos y herbicidas).

• Fitoestimulación:

Es usado para remediar contaminantes orgánicos hidrofóbicos que no pueden . ser incorporados por la planta pero que pueden ser degradados por los . microorganismos (PCBs, PAHs e hidrocarburos derivado s del petróleo).

Las diferentes estrategias de fitorremediación son adecuadas para distintos contaminantes

• Fitoestabilización:

Este técnica es usada cuando se plantan coberturas vegetales en sitios . conteniendo contaminantes orgánicos o inorgánicos ; o cuando se usan . árboles como barreras hidráulicas para permitir el filtrado de contaminantes . orgánicos e inorgánicos .

• Fitodegradación:

Es útil para compuestos orgánicos que se movilizan dentro de la planta, . (herbicidas, TNT, MTBE y TCE).

• Fitovolatilización:

Puede utilizarse para compuestos orgánicos con formas volátiles (TCE y . MTBE) y para algunos compuestos inorgánicos que pueden existir en forma . volátil (Se y Hg).

Las diferentes estrategias de fitorremediación son adecuadas para distintos contaminantes

Fitoextracción • Se utiliza para el tratamiento de contaminaciones c on metales (Cd 2+, Co2+, Cr2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Se2+, Zn2+).

• Características deseables en la planta:- Debe tolerar y acumular altas concentraciones de metalesen las partes cosechables

- Debe tener una alta tasa de crecimiento - Debe producir un gran volumen de biomasa

4258 ± 16820.574 ± 429559 ± 12175 ± 16Cd2+ (5)1

ThlapsiBrassicaThlapsiBrassicaMetal

RaícesTallos

8.425 ± 422011.475 ± 1252.739 ± 383587 ± 115Ni2+ (1)

8.545 ± 42205.486 ± 39389 ± 1580 ± 8Cr2+ (0,4)

60.716 ± 2151055.809 ± 9221623 ± 265159 ± 32Cu2+ (1)

2.990 ± 14241.816 ± 1739770 ± 32049 ± 31Zn2+ (3)

7.011 ± 36161.432 ± 140929 ± 233 ± 1Pb2+ (5)

Coeficiente de bioacumulación ± DE

1 Concentración inicial del metal en solución (mg/L)

Coeficiente de bioacumulación: relación entre la acumulación en el tejido (µg/g de peso seco) y concentración en solución (mg/L) o en suelo.

Agrobiotecnología

FitorremediaciónTomado de: Salt et al., Biotechnology 1995.

• Plantas típicas empleadas en fitoextracción:

• Hiperacumuladores:

- Girasol (Helianthus annuus)

- Mostaza de la India (Brassica juncea)- Nabos (Brassica napus; B. rapa)

- Cebada (Hordeum vulgare)

- Lúpulo (Humulus lupulus)- Ortigas (Urtica dioica; U. urens),

- Diente de León (Taraxacum officinale)

- Thlapsi caerulescens- Brassica juncea- Pelargonium spp..- Allysum lesbiacum

Fitoextracción

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Los metales en el suelo pueden estaren distintas formas:

• Como iones o complejos insolubles

• Adsorbidos a constituyentes inorgánicos del suelo o unidos a sitios de intercambio

• Unidos a moléculas orgánicas

• Como compuestos o precipitados insolubles(óxidos, carbonatos, hidróxidos)

• Integrados a la estructura de los silicatos

Formas de incrementar la biodisponibilidad:

• Agregado de quelantes de metales

• Establecimiento de un pH moderadamente ácido

• Disolución de surfactantes para contaminantes hidrofóbicos

• Agregado de microorganismos

Fitoextracción

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Esquema de fitoextracción continua y asistida por quelantes

Concentración de Pb2+ en tallos de Brassica juncea en un suelo contaminado con plomo (600 mg/kg de suelo) tratado con EDTA.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Adaptado de: D. E. Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.

Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.

Fase de crecimiento Cosecha

Fase de captaciónde metal

Fase de captaciónde metal

Fase de crecimiento Cosecha

Aplicacióndel quelante

La línea sólida naranja ( ) representa la concentración de metal en la biomasa, la línea discontinua ( ) representa la biomasa de tallo.

Con

cent

raci

ón d

e P

b2+en

tallo

s (µ

g/g)

EDTA aplicado (mmol/kg suelo)

Fitoextracción continua

Fitoextracción asistida por quelantes

Acumulación de metalesy toleranciaa manganesoen plantasde tabacoque expresanel gen cax2de Arabidopsis

• El transporte de metales desde el citosol a la vacuola es un componente importante para la tolerancia a metales en las plantas.

• El intercambiador de Ca2+ CAX2 (Calcium Exchanger 2) de Arabidopsises un regulador clave de este proceso.

• La expresión del gen cax2 en células de Saccharomyces cereviciaesuprime defectos en el crecimiento debidos a excesos de Ca2+ y Mn2+.

• Se transformaron plantas de tabaco con el gen cax2 dirigido por el promotor de 35S de CaMV. La secuencia se introdujo también en antisentido para usar esta construcción como un control interno.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Ensayo de tolerancia a Mn2+

en cepas de Saccharomycescereviciae que expresan el intercambiador CAX2.

Control: cepa salvaje de S. cereviciaecnb: cepa de S. cereviciae mutada en el gen de calcineurina (suceptibilidad a Mn2+) Vector: cepas transformadas con el vector vacío CAX2: cepas transformadas con el gen cax2

Vector ControlCAX2 Control Vector cnbCAX2 cnb

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol. 2000.

Las plantas de tabaco que expresan CAX2 acumularon más Ca 2+, Cd2+ y Mn2+ y fueron más tolerantes a niveles elevados de Mn 2+.

Concentración de iones en las raíces (izquierda) y en los tallos (derecha) de plantas transgénicas. Vector: controles transformados con el vector vacío. C-14: línea transformada con el gen cax2. Los ensayos se realizaron complementando el medio con 10 mM Cl2Ca, 0,1 µM Cl2Cd ó 0,1 mM Cl2Mn.

Captación de iones en vacuola de células de raíces de plantas que expresan el gen cax2. A: transporte de Cd2+; 10 µM total Cd2+. B: transporte de Mn2+; 100 µM total Mn2+. C: transporte de Ca2+; 10 µM total Ca2+.

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000. Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

Acumulación de metalesy toleranciaa manganesoen plantasde tabacoque expresanel gen cax2de Arabidopsis

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Vector CAX2

µg/g

pes

o se

co

µg/

g pe

so s

eco

µg/

g pe

so s

eco

µg/

g pe

so s

eco

Control

C-21

C-14

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

AT

rans

port

e de

ione

s (n

mol

es/m

g de

pro

teín

a)

Tiempo (min)Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

B

Tra

nspo

rte

de io

nes

(nm

oles

/mg

de p

rote

ína)

Tiempo (min)

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

C

Tra

nspo

rte

de io

nes

(nm

oles

/mg

de p

rote

ína)

Tiempo (min)

Las plantas acuáticas emplean dos mecanismos para separar metales y otros contaminantes (incluyendo radioisótopos) de aguas polucionadas:

- Reacción superficial rápida independiente del metab olismo:proceso de difusión que finaliza cuando los iones metálicos solubles se unen o adsorben a la pared celular. Puede removercantidades significativas en minutos.

- Reacción de incorporación intracelular lenta dependi ente del metabolismo: proceso de transferencia desde la pared celular al interior de la célula. Demanda horas o días.

Lemna minor Microspora

Remociónde metales utilizando algas y plantas acuáticas

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Tomado de: Axtell et al., Bioresource Technology, 2003.

Remociónde metales utilizando Lemna minor

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Tiempo (h)

Con

cent

raci

ón d

e N

i 2+

(mg/

L)C

once

ntra

ción

Pb2

+(m

g/L)

Tiempo (h)

0,0 mg/L Pb 2+

5,0 mg/L Pb 2+

10,0 mg/L Pb 2+

Modelo

0,0 mg/L Pb 2+

5,0 mg/L Pb 2+

10,0 mg/L Pb 2+

Modelo

0,0 mg/L Ni2+

2,5 mg/L Ni2+

5,0 mg/L Ni2+

Modelo

0,0 mg/L Ni2+

2,5 mg/L Ni2+

5,0 mg/L Ni2+

Modelo

Concentración inicialde Ni 2+ : 5 mg/L

Concentración inicialde Pb2+ : 10 mg/L

Rizofiltración• Se emplea en el tratamiento de contaminaciones por:

- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+)- Radioisótopos (137Cd, 90Sr, U)- Compuestos orgánicos hidrofílicos

• Características deseables en la planta:

- Debe tener raíces de crecimiento rápido y ramificación abundante.- Debe poder remover metales tóxicos por períodos prolongados.- No debe ser un translocador eficiente al tallo.

• La remoción tiene distintos componentes:

- Componente rápido: combinación de procesos físicos y químicos (quelación, intercambio iónico, adsorción); puede ocurrir en raíces muertas.

- Componentes intermedios: Incluyen captura intracelular, deposición en la vacuola y translocación a los tallos.

- Componente lento: precipitación mediada por la raíz; involucra exudados de la raíz.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Las plantas acuáticas son buenos candidatos para encarar procesos de rizofiltración

Rizofiltración

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Flujo vertical

Capas de

arena y

grava Eflujo

Scirpusvalidus

Esquema de rizofiltración basado en Scirpus validus

-

- Scirpus validus- Typha latifolia- Ceratophyllum demersum- Potamogeton pectinatus- Maranta arundinaceae- Lemna spp

• Plantas acuáticas emergentes:• Plantas acuáticas sumergentes:- Algas- Chara vulgaris- Myriophyllum aquaticum- Myriophyllum spicatum- Hydrilla verticillata

Rizofiltraciónde uranio usando cultivos de raíces de Brassica junceay Chenopodiumamaranticolor

Agrobacterium rhizogenes es capaz de transformar raíces y provocar el sobrecrecimiento de las mismas.

Tejido radicular de Brassica juncea y de Chenopodiumamaranticolor.

Se utilizaron raíces transformadas de ambas especie s para remover U de soluciones con baja concentración .

Tasa de acumulación de U en raíces de Brassica juncea y de Chenopodiumamaranticolor. Los valores se expresan como µg U/g tejido seco.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.

Concentración de U (µM)

C. amaranticolor

µg

U/g

tejid

o se

co

µg

U/g

tejid

o se

coB. juncea


C. amaranticolorB. juncea

• Se utilizaron raíces transformadas de ambas especie s para remover U de soluciones con alta concentración .

• Para todas las concentraciones utilizadas, el 90% del U fue absorbido por las raíces dentro de las 10 hde tratamiento.

Tasa de acumulación de U en raíces de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor .Los valores se expresancomo µµµµg U/g tejido seco.

Las raíces transformadas de ambas especies podrían usarse como bioabsorbentes de uranio, para lo cual podrían producirse a gran escala en biorreactores.

Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.

Rizofiltraciónde uranio usando cultivos de raíces de Brassica junceay Chenopodiumamaranticolor

Agrobiotecnología

Fitorremediación

B. juncea

C. amaranticolor


µg

U/g

D.w

.t. (

X10

3 )

Empleada en tratamientos de contaminación por:

• Herbicidas (atrazina, alaclor)• Aromáticos (BTEX: benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos)• Alifáticos clorinados (TCE: tricloroetileno; tetracloroetileno)• Deshechos de nutrientes (NO3

-, NH4+, PO4

3-)• Deshechos explosivos (TNT; RDX: hexahidrotrinitrotriazina)

Depende de:

• Concentración del compuesto disuelto en el suelo

• Eficiencia de captura, que depende de:- las propiedades físico-químicas del compuesto- especie química- propiedades de la especie vegetal

• Tasa de transpiración, que depende de:- el tipo de planta- área foliar- nutrientes- humedad del suelo- temperatura- viento- humedad relativa

Fitotransformación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

La fitotransformació n comprende los procesos de fitodegradación y fitovolatilización

- Almacenamiento del producto (o de sus productos de .degradación) vía conjugación o lignificación

- Metabolización a distintos productos de degradación

- Volatilización por la transpiración

- Mineralización (CO2 + H2O)

• Plantas típicas empleadas en fitotransformación:

- Arboles freatófitos (álamo, sauce, álamo americano)

- Pasturas (centeno, sorgo, festuca)

- Leguminosas (trébol, alfalfa, caupí)

Fitotransformación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

• Una vez translocado, el compuesto puede tener los siguientes destinos:

Fitodegradación de compuestos orgánicos

Las plantas pueden desarrollar una serie de reaccio nes para metabolizar o mineralizar compuestos orgánicos

Completan la degradación del TNT. Aparentemente involucradas en la incorporación de fragmentos de anillos aromáticos en la biomasa vegetal

Intervienen en la lignificación y delignificación por adición de oxígeno

Lacasas

Procesan grupos cianidados de los anillos aromáticos en herbicidas y otros compuestos cianidados

Detoxifican compuestos aromáticos cianamidados naturales

Nitrilasas

Deshalogenan solventes clorinadosEstán vinculadas a la degradación de subproductos de etileno durante la senescencia

Deshalogenasas

Empleadas en el tratamiento de aguas residuales para degradar fenoles

Degradan en forma no específica compuestos fenólicos, lignina, y otros

Peroxidasas

Procesan grupos fosfato de pesticidas organofosfatados y de compuestos que afectan el sistema nervioso

Su rol es el procesamiento de fosfato durante el desarrollo

Fosfatasas

Reducen grupos nitrato en explosivos y otros compuestos nitroaromáticos y remueven el nitrógeno del anillo aromático

Su función es la reducción de nitrato para obtener nitrógeno destinado al crecimiento celular

Nitroreductasas

Aplicaciones en fitorremediaciónRol naturalEnzimas

Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin, 1998.

• Las té cnicas tradicionales se basan en la . incineración o en utilizació n de microorganismos . e implican remoción del suelo

• La alternativa frente a las técnicas tradicionales fue . usar sistemas de fitorremediación:

- Cultivos celulares de remolacha que degradan nitroglicerina (GNT)

- Plantas acuáticas y cultivos de raíces que biotransforman. trinitroglicerina (TNT)

• El éxito fue limitado, ya que la GNT sólo pudo ser . denitrificado a di- y mononitroglicerol; la remoción . completa de grupos nitratos no se logró nunca.

• Además, la degradación de TNT produjo la . acumulación de otra toxina: aminodinitrotolueno.

• Otra desventaja es que las plantas captan y . metabolizan los compuestos nitrogenados 10 veces . más lentamente que los microorganismos.

Contaminación con explosivos

Agrobiotecnología

Fitorremediación

ADNT: aminodinitrotolueno;DANT: diaminonitrotolueno; TAT: triaminotolueno;TNT: trinitrotolueno

Rutas de degradacióndel TNT mediante nitroreductasasy lacasasvegetales

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.

Crecimiento brotes de tabaco no transformado y tran sgénico(NR 3-2) en medio líquido.

Detoxificaciónde TNT por plantas de tabaco transformadas con el gen de nitroreductasade Enterobactercloacae Crecimiento de plantas de tabaco no transformado y t ransgénicas (NR 3-2)

luego de la germinación en medio conteniendo explosi vos.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.

Sin TNT TNT 0,25 mM

NT NR 3-2 NT NR 3-2

Sin TNT TNT 0,05 mM TNT 0,1 mM

NTNT NR 3-2NR 3-2 NTNT NR 3-2NR 3-2 NTNT NR 3-2NR 3-2

Crecimiento de raíces para brotes de plantas no tra nsformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2) luego de 21 días de exposic ión a TNT

Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae

e.s.= Error estándar Indice de tolerancia = longitud de las raíces de brotes tratados con TNT/longitud de las raíces de brotes control x 100

NT NR 3-2

TNT (mM)

Longitud de las raíces (cm ± e.s.)

0

0,05

0,1

8,1 ± 0,1

5,5 ± 0,6

0,2 3

68

100

Indice de tolerancia de las raíces (%)

8,1 ± 0,1

6,2 ± 0,9

5,5 ± 0,9 68

77

100

Longitud de las raíces (cm ± e.s.)

Indice de tolerancia de las raíces (%)


Estudios de toxicidad de TNT en plantas no transformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2)

Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae


NT NR 3-2

TNT (mM)

Peso antes del TNT (g)

Peso después del TNT (g)

Ganancia / pérdida de peso (g)

0

0,1

0,25

11,37 ± 0,17

11,2 ± 0,14

11,59 ± 0,01 7,59 ± 0,19

11,3 ± 0,02

-4,00 ± 0,21

+0,13 ± 0,15

+5,52 ± 0,4516,9 ± 0,28

Peso antes del TNT (g)

Peso después del TNT (g)

Ganancia / pérdida de peso (g)

11,08 ± 0,05

11,4 ± 0,95

11,93 ± 0,18 13,95 ± 1,20

14,65 ± 0,07

-2,02 ± 1,01

+3,24 ± 0,88

+5,79 ± 0,2316,88 ± 0,18

Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous

• El explosivo hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) es tóxico para todo tipo . de organismos y un posible carcinógeno. Su degradac ión ambiental es muy lenta . y su presencia en suelos y napas de agua constituye un problema grave.

• El RDX es tóxico para las plantas. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las . bacterias del género Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no . desarrollan suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradación.

• La molécula responsable de la degradación es un cit ocromo P450. Como prueba . de concepto, se aisló el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus. rhodocochrous y se lo expresó en plantas de Arabidopsis thaliana . Las plantas .. fueron utilizadas en ensayos de detoxificación de su elos contaminados con RDX.

Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.

Ruta de degradación de RDX por el citocromo P450 cod ificado por el gen XplA de R. rhodocochrous y ensayos de actividad realizados con proteína expresada en E. coli. Los controles fueron realizados con proteína someti da a 100oC.

4-nitro-2,4-diazabutanal


Caracterización de plantas transgénicas que expresa n el gen XplA

a) Análisis de Northern y Western blot de líneas de A. thaliana que expresan el gen XplA en forma constitutiva.

b) Captación de RDX de medio acuoso por plántulas d e A. thaliana . Los resultados son el promedio de repeticiones de cinco experimentos.



Estudios en suelos contaminados con RDX empleando p lantas wild type y transformadas con 35S::XPLA. Se cultivaron plantas de A. thaliana de 8 semanas de edad en suelo conteniendo

50, 250, 500 y 2000 mg de RDX/Kg de suelo. Se muestr an las mediciones de biomasa (tallos y raíces) obtenidos en las diferentes condiciones exp erimentales (promedio de cinco ensayos).


Principales interconversiones del mercurio en el medio ambienteEl ciclo biogeoquímico del mercurio y de la biomagnificaciónde metilmercurio

Agrobiotecnología

FitorremediaciónHg(0): mercurio elementalHg(II): mercurio iónico libreRSHg: mercurio unido a azufreMeHg: metilmercurio

• No se conocen plantas capaces de detoxificar Hg.

• En cambio, existen microorganismos presentes en los sitios contaminados que poseen dos enzimas (organomercúricoliasa, gen merB, y mercúrico reductasa, gen merA) que permiten convertir metilmercurio en Hg elemental, detoxificado este metal.

• Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con los dos genes mencionados aislados de Desulfovibrio desulfuricans.

Expresiónde los genes merA y mer Bde Desulfovibriodesulfuricansen plantas transgénicasde Arabidopsis thaliana

Agrobiotecnología

Fitorremediación

R-CH2-Hg+ + H+ R-CH3 + Hg(II)MerB

Hg(II) + NADPH Hg(0) + NAD+ + H+

MerA

R-CH2-Hg+ + H+ R-CH3 + Hg(II)MerB

Hg(II) + NADPH Hg(0) + NAD+ + H+

MerA

MerB: organomercúrico liasaMerA: mercúrico reductasa

Plantas NT y transgénicas creciendo en medios con m ercurio orgánico.

Tasas de volatilización de Hg(0)en plantas control y en 6 líneas transgénicas de A. thaliana

0 µµµµM 1 µµµµM 5 µµµµM 10 µµµµM

merB merA/B-1 merA NT merB merA/B-1 merA NT merB merA/B-1 merA NT merB merA/B-1 merA NT

Tomado de: Bizily et al., Nature Biotechnology, 2000.

Fenotipos de resistencia a mercurio orgánico de plantas control y de 3 líneas transgénicas para merA/merB

pgH

g(0)

.min

-1/m

gde

te

jido

Líneas de plantas

Expresiónde los genes merA y mer Bde Desulfovibriodesulfuricansen plantas transgénicasde Arabidopsis thaliana

Agrobiotecnología

Fitorremediación

0 µµµµM PMA 5 µµµµM PMA

NT A/B-1 A/B-2 A/B-3A/B-1 A/B-2 A/B-3

A/B-4 A/B-5 A/B-6 A/B-4 A/B-5 A/B-6

NT

Fitorremediación de organomercurialesvía transformación de cloroplastos (genes merAy mer B de Desulfovibriodesulfuricans) Efecto de la concentración de acetato de fenilmercu rio en el crecimiento

de plantas de tabaco controles (NT) y transgénicas (5A y 9)

Agrobiotecnología

Fitorremediación

Tomado de: Ruiz et al., Plant Physiol., 2003.

Concentración de P

MA

NT 5A 9

Se transformaron cloroplastos de tabaco con dos versiones de esta construcción con y sin región 3´ no traductible (3´ UTR) portando el operón MerAB

16S→→→→ trnI →→→→ aadAaadA merBmerB trnA →→→→

P 3´UTR

merA

Aumento de la acumulacióny tolerancia a selenio en plantas transgénicasde Arabidopsisque expresanla enzima selenocisteína liasa I de ratón

• La toxicidad del selenio (Se) se debe a la . incorporación inespecífica de selenocisteí na . (Se-Cys) a las proteínas.

• Estrategia:

Expresar el gen de la selonocisteína liasa de ratónen citoplasma y cloroplastos de Arabidopsis thaliana

Se-Cys Se elemental + alaninaSe-Cys liasaAgrobiotecnología

Fitorremediación

Aumento de la acumulacióny tolerancia a selenio en plantas transgénicas de Arabidopsisthaliana

Incorporación de Se a proteínasen brotes de Arabidopsis thaliana no transgénicas (NT) y transgénicas (citosólicas y plastídicas)

Toleranciaa Se-Cys

selenato y selenito de

brotes de Arabidopsis

no transgénicosy transgénicos.

Agrobiotecnología

Fitorremediación

cyt SL cp SL

Control

50 µM Se-Cys

25 µM SeO2-3

50 µM SeO2-4

Larg

o de

raí

ces

(mm

)

Control

50 µM Se-Cys

25 µM SeO2-3

50 µM SeO2-4

Tomado de: Pilon et al. , Plant Physiol., 2003. NT

µg S

e g

prot

ein

-1

cit SL cp SL

µg S

e g

prot

ein

-1

cit SL cp SL

NT

• Las plantas proveen el hábitat para el incrementoen el tamaño y actividad de poblaciones microbianas.

• Los exudados vegetales estimulan lastransformaciones efectuadas por las bacterias (inducción enzimática).

• La síntesis de carbón orgánico aumenta la tasade mineralización microbiana (enriquecimiento de sustrato).

• El oxígeno que difunde con las raí ces asegura un medio adecuado para las transformaciones

. aeróbicas.

• Los hongos micorríticos asociados a las raíces vegetales metabolizan contaminantes orgánicos.

Fitoestimulación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

• Empleado en el tratamiento de contaminación orgánic a causada por pesticidas (atrazina ), compuestos

. aromáticos, e hidrocarburos aromáticos policíclicos

. (PAHs)

• Se basa en la liberación por la planta de exudados entre los que se incluyen:

- ácidos orgánicos de cadena corta- compuestos fenólicos- bajas concentraciones de enzimas y péptidos

• Plantas típicas empleadas en fitoestimulación:

- Liberadoras de compuestos fenólicos (mora,

manzano, Maclura pomífera)- Pastos con raíces fibrosas (centeno, festuca)

para contaminantes hasta 1 metro de profundidad

- Arboles freatófitos para contaminantes hasta 3 metros de profundidad

- Plantas acuáticas para sedimentos

Fitoestimulación

Agrobiotecnología

Fitorremediación

• Empleada en el tratamiento de contaminación por:

- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, As2+, Cu2+, Se2+, U)- Compuestos orgánicos hidrofóbicos: hidrocarbonos

aromáticos policiclícos (PAHs), bifenilospoliclorados (PCBs), dioxinas, furanos, pentaclorofenol, DDT, dieldrina

• Características deseables en la planta:

- Debe tolerar altos niveles de metales tóxicos- Debe inmovilizar los metales vía captura

y posterior precipitación y reducción- Debe acumular bajas concentraciones en las

raíces

• Plantas típicas empleadas en fitoestabilización:

- Arboles freatrófitos que transpiren grandes volúmenes de H2O

- Pastos con raíces fibrosas que estabilicenla erosión del suelo

- Plantas con sistemas radiculares robustoscapaces de absorber/unir contaminantes

Fitoestabilización

Agrobiotecnología

Fitorremediación

1. Pilon-Smits. Phytorremediation. Annual Review of Plant Biology, 56:15-39. 2005.

2. Eapen and D’Souza. Prospects of genetic engineering of plants for phytoremediation of toxic metals. Advances in Biotechnology, 23:97-114, 2005.

3. Mejáre, M. and Bulow, L. Metal binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals. Trends in Biotechnology, 19:67-73, 2001.

4. Kovalchuk, O., Titov, V. Hohn, B. and Kovalchuk, I. A sensitive trangenic plant system to detect toxic inorganic compounds in the environment. Nature Biotechnology, 19:568-572, 2001.

5. Salt, D. E., Smith, R.D., and Raskin I. Phytoremediation. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 49:643-668, 1998.

6. http://www.hawaii.edu/abrp/Technologies

7. http://www.envirotools.org/factsheets/phytoremediation.shtml

Referencias

Agrobiotecnología

Fitorremediación

2011_17 Fitorremediacion.pdf

Documents

Transcript of 2011_17 Fitorremediacion.pdf