CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Antecedentes:• Fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados.

Definición• La cromatografía es una técnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia.• Separación, aislamiento, purificación e identificación de sustancias, tanto orgánicas como inorgánicas.

Según al fundamento físico-químico en el que se basa la separación:

• C. de adsorción.• C. de reparto.• C. de cambio iónico.• C. de filtración molecular.• C. hidrofóbica.• C. de afinidad.

Tipos de cromatografía:

• Cromatografía en papel.• Cromatografía de capa fina.• C. en columna. • C. de gases.

Según al material sobre el que se lleva a cabo:

• Se utiliza para la evaluación, identificación, verificar pureza y para explorar los parámetros de métodos de cromatografía.

• El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva.

Aplicación:

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (CCF o TLC)

La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes.

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme de un absorbente manteniendo sobre una placa de vidrio u otro soporte.

• Resistencia a la temperatura • Resistencia a los reactivos agresivos de

la cromatografía en capa fina.• Mayor nitidez y sensibilidad de los

cromatogramas,• Mayor rapidez en su desarrollo.• Además, los cromatogramas obtenidos

pueden conservarse indefinidamente y archivarse.

La CCf presenta una serie de ventajas:

• El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos.

• si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos, para ello se emplean determinadas sustancias conocidas como reveladores entre los cuales el más utilizado es el Yodo

Tipos de cromatografía de capa fina • Cromatografía en capa fina

cualitativa: Sirve para determinar los distintos componentes de una mezcla.

• Cromatografía en capa fina preparativa: Sirve para separar y aislar a los distintos componentes de una mezcla. Se usan placas (20x20) de cristal.

Los requisitos esenciales son:

• Un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas.

• Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

• Es una técnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatográfico) y de fácil desarrollo.

• Se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas.

• Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc.) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc.)

• La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo).

• Se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa.

• Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio).

• Los tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2 y en algunos casos de micras de espesor.

• El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar.

ej: Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos se requerirán técnicas de revelado.

Fase móvil o eluyente:• El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” de los componentes.

• Debe encontrarse en un recipiente cerrado (cámara de cromatografía) y en contacto con la placa de cromatografía, asciende y arrastra las sustancias a distinta velocidad según la mayor o menor retención que experimenten.

La técnica, en forma generalizada, comprende:

* Preparación del disolvente* Preparación de la cámara de cromatografía* Desarrollo del cromatograma* Secado* Revelado de las sustancias separadas* Estudio del factor de retención (Rf)

Adsorbentes, Eluyentes, soportes y reveladores más comunes para cromatografía en capa fina.

• Adsorbentes:

Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente (yeso,...).

Algunos de los adsorbentes más utilizados son:

• Celulosa • Almidón • Azucares • Gel de sílice (silicagel) • Óxido de aluminio (alúmina) • Carbón activo (carbón en polvo)

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales.

Gel de sílice (silicagel)

• Uno de los más utilizados

• Su pH oscila entre 4-5, con lo cual no se deberá utilizar con sustancias que se corrompan con los ácidos.

• Suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes.

• El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å.

• Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso para proporcionar firmeza al adsorbente.

• También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde).

La alúmina u óxido de aluminio • Adsorbente ligeramente básico .• No consigue un desarrollo tan alto de

la sustancia depositada como el gel de sílice.

• Es tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas, básicas y neutras.

• Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas.

• Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que retendrá con mayor avidez a los componentes polares.

Elección del eluyente

• Dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.

Principales Eluyentes en orden creciente de polaridad: Éter de petróleo.Éter dietílico.Ciclohexano. Acetato de etilo.Tetracloruro de carbono.*Piridina.Benceno.*Etanol.Cloroformo.*Metanol.Diclorometano.Agua.Ácido acético. *compuestos cancerígenos.

En la elección del eluyente influyen varios factores:

• Precio. • Pureza. • No utilizar mezclas de Eluyentes

(reproducibilidad). • No utilizar compuestos muy volátiles. • Evitar que contengan trazas de metales

(catalizadores). • La elección del eluyente se realiza de forma

empírica. • Hay que estudiar la polaridad del componente y

probar con Eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.b) Aplicando un eluyente poco polar.c) Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar Eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros Eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina

• Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante:

• Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado.

• La introducción de la placa en vapores de yodo.

• El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases).

• Después calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta carbonizarlos compuestos.

Procedimiento para la realización:

1. Preparación de las placas:

El adsorbente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico.

La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente.

• Se utilizan como soporte del adsorbente, láminas de vidrio y de compuestos orgánicos más flexibles.

• Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro.

• En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.

• El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele ser de:

• 0.1-0.2 mm. Para separaciones analíticas.• 0.5- 2 mm. Para separaciones

preparativas.

• Las placas, se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente.

2. Aplicación de las muestras:

• El proceso se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc.) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.

• Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.

• se realiza normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad.

• La cromatografía se realiza en una cubeta.

3. Desarrollo de CCf

• Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmosfera.

• El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.

4. Localización de sustancias

• Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:

*Métodos químicos. *Métodos físicos.

Métodos químicos :• Consisten en realizar una reacción química entre un

reactivo revelador y los componentes separados.

• Se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.

• Otro reactivo revelador utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras.

El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.

Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:

• 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

• Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).

• Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).

• Ninhidrina (para aminoácidos).

Métodos físicos:• Consiste en añadir al adsorbente un

indicador fluorescente.

• Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.

Para calcular el valor de RF• De un compuesto dado,

se miden la distancia recorrida por este desde donde se depositó en la placa y la distancia recorrida por el disolvente. La medida se realiza desde el centro de la mancha.

• Los mejores datos se obtienen cuando las manchas no superan los 5 mm de diámetro.

Los datos más importantes que deben registrarse cuando se estudia un cromatograma, son:

1)    Adsorbente utilizado.2)    Espesor y grado de activación de éste.3)    Disolvente utilizado para el desarrollo de cromatograma.4)    Cantidad de muestra depositada en la placa.5)    Método utilizado para detectar los compuestos.6)    Valor de RF para cada sustancia.

Para la interpretación de resultados se debe tener en cuenta:

•Las diferencias en los valores de Rf para cada una de las sustancias, así como las formas de la mancha, tipo de color e intensidad. A partir de la estructura química hay que relacionar el mayor o menor valor de Rf con la mayor o menor solubilidad en las fases estacionaria y móvil.

Factores que influyen en una separación por CCf • Temperatura: a menor temperatura las sustancias se

adsorben más en la fase estacionaria. La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.

• Limpieza de las placas. muchas placas contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos, éstas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar completamente antes de aplicar la muestra.

• Pureza de los disolventes

Aparatos y materiales. Generalidades

Cubeta cromatográfica (con tapa hermética); la mayoría de las veces se trata de la cubeta .Normal. (profundidad del espacio para el gas: 3mm)

Placas de cromatografía: preparadas por uno mismo o ya fabricadas.

Pipetas de microlitro. Recipiente de vidrio con pulverizador. Probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para

preparar y mezclar la fase móvil) Secador. Plantilla para TLC o regla. En caso necesario: lámpara UV para comprobar la

fluorescencia o la disminución de la misma.

GRACIAS