5. ¿Cuáles son los mecanismos de resistencia antibacterianos de Pseudomona aeruginosa?

Mecanismos de resistencia antimicrobiana

P. aeruginosa es intrínsecamente resistente a diversos antibióticos, como beta

lactámicos, macrólidos, tetraciclinas, trimetoprima/sulfametoxazol y la mayoría de las

fluoroquinolonas, pero no tiene resistencia intrínseca a carboxipenicilinas (ticarcilina),

ureidopenicilinas (piperacilina), beta lactámicos más inhibidores de las beta

lactamasas (piperacilina/tazobactam y ticarcilina/ácido clavulánico), cefalosporinas

de cuarta generación y algunas de tercera generación (cefepima, ceftazidima y

cefoperazona), aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina y amikacina),

monobactámicos (aztreonam), algunas fluoroquinolonas (levofloxacina y

ciprofloxacina), carbapenémicos (imipinem/cilastatina, meropenem y ertapenem) y

las polimixinas (colistina). Sin embargo, es capaz de desarrollar resistencia a

cualquiera de estos agentes, con frecuencia bajo la influencia de la exposición

antibacteriana previa. El riesgo de aparición de resistencia antimicrobiana como

consecuencia de la exposición a antibióticos varía según el fármaco empleado, pero

en especial se asoció con ciprofloxacina y con imipenem/cilastatina. Los mecanismos

generales de resistencia antibacteriana comprenden el bloqueo del ingreso, la salida

activa de la célula, la degradación enzimática y la alteración de la estructura blanco.

OprD es una porina de membrana externa específica para los carbapenémicos. La

disminución o la ausencia de la expresión de OprD constituye un mecanismo primario

de resistencia a los carbapenémicos en los aislamientos clínicos y de laboratorio de P.

aeruginosa.

Los antibióticos pueden ser expulsados de P. aeruginosa mediante bombas de salida

(efflux pumps) de multidrogas. Las bombas de salida se denominan por sus

componentes proteicos y se caracterizaron 4 (MexA-MexB-OprM; MexC-MexD-OprJ;

MexE-MexF-OprN y MexX-MexY-OprM), aunque el genoma de P. aeruginosa contiene

al menos 10 operones distintos del sistema de bombas. Estas bombas pueden

expresarse constitutivamente a bajos niveles o sobreexpresarse cuando hay

mutaciones de los genes represores. La terapia antibiótica ejerce una presión

adicional para la selección de cepas de P. aeruginosa con sobreexpresión de las

bombas de salida, un fenómeno que puede ser un problema, en especial con las

fluoroquinolonas, que son sustratos de las 4 bombas.

P. aeruginosa tiene una beta lactamasa AmpC (o clase C) cromosómica y su expresión

puede ser inducida por la exposición a los beta lactámicos. La inducción de la beta

lactamasa AmpC puede provocar la resistencia tanto al agente inductor como a otros

beta lactámicos. No todos los beta lactámicos son inductores igualmente eficaces de

la beta lactamasa AmpC cromosómica. El imipenem es un inductor conocido,

mientras que las cefalosporinas de tercera y cuarta generación son inductores

débiles. Además, la transferencia horizontal del integrón que codifica las beta

lactamasas de amplio espectro (tipos VEB y GES), que son resistentes a los inhibidores

de beta lactamasas como el ácido clavulánico, constituye un fenómeno bien descrito

en P. aeruginosa y otras bacterias gramnegativas. En forma similar, las

metalobetalactamasas adquiridas (tipos VIM e IMP), que tienen actividad de

carbapenemasas, son un problema creciente en el mundo.

Las cepas de P. aeruginosa MR en general muestran diversos mecanismos de

resistencia simultáneos. La resistencia adquirida a los beta lactámicos suele ser

consecuencia de la desrepresión de la AmpC cromosómica o de la adquisición de un

plásmido que codifica beta lactamasas. En general, la resistencia a las

fluoroquinolonas se produce por la salida activa y las mutaciones de los blancos

antibacterianos (principalmente ADNgirasa y topoisomerasa por vía intravenosa). La

resistencia a los carbapenémicos se relaciona sobre todo con la disminución en la

expresión de la porina OprD; las bombas de salida y las beta lactamasas cumplen casi

siempre un papel secundario, en especial en mediar la resistencia al meropenem.

6. Mencione las características epidemiológicas de este microorganismo

Mecanismos de infección y virulencia

P. aeruginosa tiene un flagelo único que permite su motilidad y puede mediar las

interacciones iniciales de superficie. También tiene múltiples cilias en la superficie

celular que son responsables de la adherencia a las membranas celulares y otras

superficies. En las vías respiratorias, el glucolípido asialo gangliósido M1 (aGM1) es

uno de los blancos para la unión a la superficie epitelial celular.

Algunos aislamientos de P. aeruginosa superproducen el polisacárido extracelular

alginato, con una morfología mucoide en los cultivos. En general, los aislamientos

mucoides expresan mutaciones en el gen mucA. El alginato tiene diversos efectos que

obstaculizan la depuración bacteriana por el huésped infectado, como la

antioxidación de los radicales libres liberados por los macrófagos, el actuar como una

barrera física que impide la fagocitosis y la inhibición de la quimotaxis de los

neutrófilos y la activación del complemento. Además, los alginatos parecen ser

importantes para la formación de las biopelículas. Las biopelículas de P. aeruginosa se

encuentran en la vía aérea de los pacientes con FQ.

Cuando P. aeruginosa se une a las células epiteliales puede activarse el sistema de

secreción tipo III que permite la liberación de ciertas proteínas efectoras dentro de la

célula epitelial, con la consiguiente alteración en la respuesta inmunitaria, la lesión

celular y la muerte celular. Cuatro exoenzimas conocidas (ExoS, ExoT, ExoU, ExoY)

tienen expresión variable en diferentes cepas de P. aeruginosa y distintas actividades.

Entre ellas, ExoU es responsable de la mayor virulencia. La secreción de exoenzimas

por el sistema de secreción tipo III se asocia con infección invasiva o más aguda en

comparación con los estados de infección crónica observados por lo general en los

pacientes con FQ. La expresión del sistema de secreción tipo III en los aislamientos de

P. aeruginosa se asoció con aumento de la mortalidad en los pacientes con

neumonía, sepsis e insuficiencia respiratoria y con enfermedad más grave en los

casos de NAR.

Hay otros factores de virulencia secretados por P. aeruginosa, como la exotoxina A

que inhibe el factor 2 de elongación eucarionte, con la interrupción en la síntesis

proteica y la contribución a la muerte de las células del huésped; las proteasas

alcalinas, elastasas y proteasa IV, que degradan múltiples proteínas

inmonorreguladoras del huésped; y las fenacinas, como la piocianina, que producen

disfunción ciliar en las vías respiratorias y efectos proinflamatorios y oxidantes que

dañan las células del huésped.

Anticuerpos quiméricos

Un anticuerpo quimérico (AcQ) es una molécula artificial en la cual, las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VH y VL son obtenidas de un AcMo múrido (Figura 5). El objetivo perseguido con la construcción de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratón o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Es conocido que las porciones más inmunogénicas de la molécula de Ig están asociadas a la porción constante de la molécula, en particular a la región Fc (115). Al reemplazar estas regiones por las equivalentes de origen humano se busca que la molécula resultante sea menos "extraña" para los seres humanos y así facilitar su uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas (Figura 5). Adicionalmente, ya que la fisiología, catabolismo y las funciones efectoras de un Ac están asociadas al fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en forma óptima al ser administrados en humanos.

La técnica de "quimerización" fue desarrollada por Morrison y col. (73) y Boulliane (7) a mediados de los años 80. El procedimiento implica la clonación de los genes VH y VL múridos y la inserción de los genes clonados en vectores de expresión eucariota a los que, previamente, se ha incorporado los genes codificadores de la porción constante de las cadenas pesada y liviana humanas. Estos vectores son finalmente transfectados en forma estable en una línea celular seleccionada. La clonación de los genes VH y VL se realiza mediante RT-PCR (Figura 5) utilizando como molde ARN total o ARN mensajero (ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad de interés y oligonucleótidos complementarios a los extremos 3’ y 5’ de cada gen como iniciadores. En la actualidad, se encuentran disponibles familias de oligonucleótidos para la clonación de los genes VH y VL del ratón, del humano y otras especies. Estas familias son capaces de amplificar la mayoría, sino la totalidad, de los genes V funcionales de estas especies y, usualmente, contienen sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, las cuales facilitan la identificación, manipulación e inserción en los vectores de expresión de los genes V amplificados por PCR (2, 12, 19, 30, 58-60, 66, 80, 93, 95, 111, Montaño y Morrison). Una serie de vectores tipo "cassette" están disponibles donde los genes V pueden ser fácilmente clonados en el contexto de cualquier isotipo de cadena liviana y pesada humana (18, Montaño y Morrison). De forma similar, avances en el campo de la tecnología de transferencia de genes también han facilitado, y hecho más eficiente, el proceso de inserción de ADN foráneo en diferentes líneas celulares eucariotas.