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Anexo: Compendio de preguntas de parciales anteriores (cursos 2000-2009): Nota: la inclusión de las siguientes preguntas y, particularmente, las respuestas esperadas que sirvieron de guía para la corrección de los parciales por parte de los docentes, no tienen otro propósito didáctico que el de orientar a los estudiantes acerca de cómo son los parciales de la materia y de cómo se corrigen. Aquellas preguntas de parciales que los docentes consideramos que aportaban a la mejor comprensión de algún capítulo de la materia, fueron incluidas en la guía de problemas y no se repiten aquí. Algunas de las preguntas de parciales integran más de un capítulo de las clases de problemas. Las preguntas de los parciales de la presente cursada tendrán el mismo espíritu pero serán diferentes en sus enunciados. El orden de los temas no es el mismo que en la guía.

Regulación e Ingeniería Genética

1) Los operones mce de Mycobacterium tuberculosis (bacteria que produce la tuberculo-sis) codifica para proteínas poten-cialmente involucradas en la viru-lencia de este patógeno. En el ge-noma de M. tuberculosis hay 4 ope-rones mce similares en secuencia y organización, que codifican para proteínas secretadas o de membrana y una proteína de tipo invasina. Es-tos genes son exclusivos de las mi-cobacterias y no se encuentran en otras bacterias mejor caracterizadas como Escherichia coli. Santángelo y col (del INTA Castelar) publica-ron en Microbiology (2002, 148:2997–3006) un trabajo en el que estudian la regulación de este operón en base a la información genómica disponible. Por un lado conocían las secuencias estructura-les de los genes mce pero no tenían bien caracterizado su promotor. Por otro lado, les llamó la atención un gen (llamado Rv) ubicado hacia 5’ de uno de los ope-rones dado que codificaba para una proteína cuya es-tructura predicha por los modelos bioinformáticos era similar a la de algunos factores de transcripción. Para estudiar la función de este gen realizaron las siguien-tes construcciones quiméricas:

pP3Rv contiene el gen Rv completo (incluyendo el promotor de Rv), la región intergénica completa hasta el codón de iniciación del primer gen mce (es decir, donde debería ubicarse el promotor de mce). La se-cuencia codificante para mce fue reemplazada por el gen lac pP3 es igual, pero sin Rv pJEM15 es el vector vacío (salvo por el gen lac) A, B y C representan segmentos de la región inter-génica (1-100, 1-200 y 200-500 pb hacia 5’ del ATG, respectivamente)

Lo primero que hicieron fue estudiar el efecto de in-troducir las construcciones quiméricas en E. coli obte-niendo los siguientes resultados: Efecto del gen Rv sobre el promotor mce:

Micobacterias transformadas con pJEM15 (vector sin insertos) [barras blancas] pP3 (construcción sin Rv) [barras grises]

pP3Rv (construcción con Rv) [barras negras] a) ¿Qué tipo de efecto tiene la presencia del gen Rv

sobre la regulación del gen quimérico? b) Si la construcción que interesa analizar es pP3Rv ¿para qué se hicieron los experimentos con pP3 y con pJEM15? c) ¿Por qué se reemplazó la secuencia codificante de mce por la de la β-gal? Para investigar la localización del sitio de unión de la proteína codificada por Rv hicieron gel-shifting en los que se diferencian electroforéticamente los DNAs “sueltos” de los que tienen “pegados” una proteína

porque ésta les re-trasa su migración en el gel. Los DNAs se detectan por hibridación con una sonda del

segmento génico. Se ron los siguientes productos de PCR: A) nucleótidos 1-100 B) 1-200, C) 200-500 con 1)

búfer 2) ex tractos de bacterias transformadas de E.coli conteniendo la construcción pP3Rv; 3) extrac-tos de bacterias de E. coli conteniendo la construc-ción pP3 d) ¿Dónde se localiza el sitio de unión de la proteína?

A B C 1 2 3 1 2 3 1 2 3 -

+

pP3

pJEM15

Promotor mce

A

β-gal

β-gal

β-gal

B

C

Rv 500 pP3Rv 200 100

2

e) ¿Por qué se utilizaron extractos de E. coli (transformadas con las construcciones) y no de micobacterias?

Respuestas esperadas a) Activador b) La comparación entre la actividad de p3 y p3Rv es lo que permite determinar que Rv es un elemento activador (o represor si lo hubiese sido). pJEM15 es un control negativo. c) Porque es fácil de detectar enzimáticamente y los resultados no son afectados por la expresión de los genes mce endógenos (cromosómicos) de las mico-bacterias tranformadas. d) 100-200 e) Porque necesito extraer de una célula que exprese la proteína Rv, porque si no, nunca podría estudiar su efecto. 2) El Dr. Cureta, en su eterna búsqueda de la pócima de la juventud eterna, estudió la estructura y expre-sión del gen de la aloeverina que produce una proteína de maravillosas propiedades curativas y rejuvenecedo-ras en Aloe vera (planta no comestible). Este gen da origen a dos proteínas diferentes en las hojas y las raí-ces de la planta por splicing alternativo. Sin embargo, la única que tiene propiedades especiales es la de la hoja que se produce en cantidades muy pequeñas. Además, su purificación es ineficiente, con el agra-vante de que sus propiedades se ven afectadas por las fenoloxidasas que se liberan de los lisosomas cuando estas organelas se rompen en el proceso de homogeni-zación. Esta es la estructura del gen de la aloeverina:

Las flechas indican sitios para la enzima HindIII. Los dos mRNAs difieren porque en uno está presente y en el otro está ausente el exón E3 de 80 pb. El Dr. Cureta decidió obtener tomates transgénicos transfectando con un plásmido recombinante con el gen clonado de la aloeverina en el que había reemplazado al promotor nativo de la aloeverina por el de la actina de tomate, con el fin de analizar la expresión de mRNAs de aloe-verina en los distintos tejidos: 1) Sabiendo que los tomates no tienen ningún gen endógeno homólogo al de la aloeverina, dibuje el patrón de bandas de hibridación que esperaría obtener en un Southern de DNAs genómicos digeridos con HindIII provenientes de: a) tomate normal, b) Aloe

vera, c) tomate transgénico; hibridando con una sonda de cDNA de longitud completa. 2) ¿Por qué habrá elegido tomate y no tabaco, por ejemplo? 3) Analizando la expresión de los mRNAs de aloeve-rina en distintos tejidos del tomate transgénico por la técnica de Northern, usando como sonda al cDNA de aloeverina de longitud completa, se observó lo si-guiente: a) ¿Cuáles son los tamaños del mRNA I y mRNA II? b) En el primer esquema ubique (con flechas) la pro-bable ubicación del codón de iniciación y la del de terminación.

c) ¿Por qué el Dr. Cureta reemplazó en su experimen-to el promotor de la aloeverina por el de la actina de tomate? ¿Le parece que eligió el promotor más ade-cuado para sus propósitos? ¿Por qué? d) ¿Qué conclusiones saca a partir de los resultados del Northern en cuanto a la especificidad tisular del splicing del RNA del gen de la aloeverina? e) ¿Qué sugerencias experimentales le haría al Dr. Cureta para mejorar la performance de sus experimen-tos y así obtener los resultados deseados? Respuestas 1) tomate, no da nada. Aloe vera: 3 ban-das de 7, 3 y 12 kpb. Tomate transgénico: ídem. 2)

Porque el tabaco tampoco es comestible. El toma-te, sí. Respuesta alternativa: Si la idea es la de mejorar la productividad, el tabaco (por su alta producción de biomasa) podría haber sido una alternativa interesante. 3) a) 790 y 710, b) ATG: Una flecha un poco a la derecha del extremo del

exón 1 (no en el extremo porque siempre hay un ex-tremo 5´ de mRNA no codificante) o al principio del exón 2. Stop: una flecha un poco a la izquierda del extremo derecho del exón 4 (siempre hay un segmento 3´ no codificante a 3´ del codón de terminación), c) El promotor nativo es poco eficiente y lo reemplaza por uno constitutivo fuerte, pero podría haber elegido me-jor el promotor: por ej. uno específico de fruto de to-mate, que es el tejido de interés para alimentación. d) Aparentemente, el sistema que permite reconocer al exón 3 como tal, es específico de hoja y de especie y, tal vez, de gen (pero eso no lo podemos determinar con estos datos). e) Usar una construcción SIN intro-nes para evitar el procesamiento incorrecto.

E 1 E 2 E 3 E 4

7 k b 3 k b 1 2 k b

p r o m o t o r 2 1 0 p b 3 7 0 p b 8 0 p b 1 3 0 p b

E 1 E 2 E 3 E 4

7 k b 3 k b 1 2 k b

p r o m o t o r d e

a c t i n a de tomate

2 1 p b 3 7 0 p b 8 0 p b 1 3 0 p b

v e c t o r

RNA de tomate transgénico

_

+

Aloe vera: hoja raíz hoja raíz fruto flor

RNA de

mRNA I

mRNA II

3

3) Para el operón lactosa de Escherichia coli, indique el genotipo de al menos uno de los diploides parciales posibles capaces de producir beta-galactosidasa (codi-ficada por el gen Z) constitutivamente y permeasa (codificada por el gen Y) en forma normal (es decir inducible con análogos de la lactosa) usando la no-menclatura practicada en las clases de problemas. Respuesta: lacI+ lacOc lacZ+ lacY- / lacI+ lacO+ lacZ- lacY+ (en alguno de los 2 genotipos lacI puede ser lacI-) 3) En la película Blade II, el héroe (Blade) es un “se-mi”vampiro que lucha a favor de la humanidad con los vampiros “malos” que quieren dominar el mundo. En una escena trascendental de la película, Blade es capturado para poder extraer su sangre (y su ADN) porque los vampiros estaban diseñando nuevas varian-tes transgénicas clonadas con mejor adaptación. Si bien ya habían logrado obtener vampiros resistentes a la plata modificando el gen de la metalotionina, quer-ían extraer de Blade un gen de resistencia a la luz so-lar. Ud. ha sido contratado por los vampiros para hacer este trabajo (le han prometido vida eterna como forma de pago) y dispone de un laboratorio de inge-niería genética excelentemente equipado que le permi-te, entre otras cosas, cultivar in vitro vampiroblastos (células equivalentes a los fibroblastos humanos). Los vampiroblastos extraídos de vampiros comunes se lisan en presencia de luz solar, mientras que las célu-las extraídas del cuerpo de Blade son luminoresisten-tes. No se dispone de información alguna sobre la se-cuencia del gen a clonar, ni anticuerpos, ni secuencias parciales de aminoácidos de la proteína. Tampoco se pueden planear cruzamientos genéticos de Blade con vampiresas para estudiar su progenie porque llevaría mucho tiempo. Inspirándose en el ejemplo histórico del clonado molecular de los primeros oncogenes ¿qué estrategia de clonado y caracterización funcional del gen de resistencia a luz solar propondría? Respuesta: En caso de seguir los pasos históricos descriptos en el Recombinant DNA de Watson y col.: se extrae ADN total de Blade (sólo o con una “etique-ta” –tag- de secuencia nucleotídica conocida ligada) y se lo usa para transfectar vampiroplastos por la técnica de coprecipitación con fosfato de calcio. Después se exponen los vampiroblastos a la luz y se extrae ADN total de las células transgénicas resistentes y se fabrica una genoteca en fago lambda. Se releva (“screenea”) la genoteca con ADN repetitivo de Blade (el equiva-lente a secuencias Alu) o con la sonda para el tag para identificar el ADN procedente de Blade. Se confirma la identidad del clon de lambda por transfección de vampiroblastos que se convierten en luminoresisten-tes. Con técnicas más modernas se aislaría el ADN de Blade y se lo clonaría en BACs (se puede aceptar que sea en otros vectores como cósmidos o en fagos lambda). Con mezclas (“pooles”) de clones recombi-nantes se transfectan vampiroblastos para identificar células luminoresistentes (por electroporación o usan-do liposomas). A las mezclas que producen clones positivos se las separa en clones individuales hasta identificar el clon conteniendo el gen de interés. Una

vez identificado el clon se subclona y secuencia el inserto para ver si hay ORFs candidatos, los cuales son testados funcionalmente de la misma manera.

4) La Dra. Romántica está intentando encontrar genes que aceleren la floración. Con este objetivo en mente procede a transformar plantas de Arabidopsis thaliana mediante la utilización de Agrobacterium, con la si-guiente construcción:

LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA,

35S: enhancer fuerte y constitutivo, nptII: gen de re-

sistencia a kanamicina Pnos: promotor constitutivo, t-

nos: terminador

Entre las miles de plantas generadas encuentra una

mutante

(M) que florece en la mitad de tiempo que las plantas

salvajes (wild type = wt). A partir de una hoja de esta

planta extrae DNA, lo digiere con BamHI, lo corre en

un gel de agarosa, transfiere a una membrana y lo re-

vela con una sonda radiactiva correspondiente al T-

DNA completo. Cuando cruzó esta planta con una

planta salvaje, dentro de la descendencia, algunas

plantas presentaron floración temprana y otras no. Al

repetir el Southern blot con 10 plantas de la F1 se ob-

tuvieron los siguientes resultados:

a) ¿Para qué se incluyó el gen quimérico npt II en la construcción? b) ¿Cuál fue el objetivo de introducir un enhancer “suelto” no acompañado de un promotor o de una se-cuencia estructural? c) ¿Cree que el hecho de que se observen dos bandas en el mutante parental se deba a que BamHI corte de-ntro del T-DNA o a qué se insertaron dos T-DNAs (en lugar de uno) en más de un lugar en el genoma? Ana-lice teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la F1. d) ¿Qué plantas de la F1 seguiría analizando? Justifi-que. El hecho de conocer la secuencia de la construc-ción utilizada le permitió a la Dra. Romántica median-te PCR, secuenciación y finalmente comparación con la base de datos del genoma de Arabidopsis, identifi-car el sitio exacto de inserción del T-DNA. Este sitio de inserción se encuentra 1 kpb río arriba (5’) de un marco de lectura abierto aún no estudiado (ORF4329). e) ¿Qué efecto cree que tiene la inserción del T-DNA sobre el ORF4329? ¿Qué experimento haría para comprobarlo? Muestre mediante un diagrama los re-sultados esperados.

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f) ¿Cree que el ORF4329 es un gen inductor o repre-sor de la floración? Diseñe un experimento comple-mentario al realizado por la Dra. Romántica que, me-diante ingeniería genética, le permita comprobar su hipótesis, indicando los resultados esperados. Recuer-de que en la transformación mediante Agrobacterium el T-DNA no se integra mediante recombinación homóloga (en biobalística tampoco). g) Como Arabidopsis es un yuyo y sus flores son bas-tante feas, un estudiante de doctorado de la Dra. Romántica está interesado en ver si los rosales tam-bién tienen un gen homólogo al ORF4329. ¿Cómo lo haría experimentalmente sabiendo que el genoma del rosal no está secuenciado? En caso de que haya un gen homologo al ORF4329 presente, ¿cómo clonaría el gen homólogo completo? Respuestas esperadas a) Como gen marcador selectivo que permite selec-cionar las plantas transgénicas de las no transgénicas durante la regeneración de plantas en un medio conte-niendo el antibiótico kanamicina b) Porque el objeto del experimento es que este en-hancer estimule constitutiva y fuertemente los promo-tores cercanos al sitio de inserción del segmento T con la esperanza de que alguno de ellos estimule la flora-ción temprana. c) No puede haber ocurrido que haya sólo un sitio de inserción y que BamHI corte dentro del DNA-T pues en la F1 las dos bandas segregan independientemente. Seguramente el DNA-T se insertó en dos sitios distin-tos. d) Seguiría analizando alguna de las siguientes plan-tas: 1, 6 o 9 ya que presentan floración temprana, pero no heredaron el inserto del T-DNA no relacionado con la inducción temprana de la floración. El descartar las plantas 4, 7 y 10 facilita los pasos siguientes de identi-ficación del sitio de inserción. e) Dado que el T-DNA no interrumpe un gen ni el promotor mínimo, pero sí se ubica cercano al promo-tor, la inserción del DNA-T estaría aumentando la transcripción del ORF4329 mediante los enhancers 35S. Para comprobar esta hipótesis habría que realizar un Northern partiendo de mensajeros de plantas nor-males y mutantes (sería interesante comparar también tejidos florales y no florales ya que el enhancer 35S es constitutivo) utilizando una sonda complementaria al ORF4329. f) Es un inductor de la floración pues al aumentar su expresión se adelanta la floración. Para comprobarlo se podría hacer un antisense del ORF4329 y espero ver un retraso o ausencia de floración. Si repito el Northern vería menos mensajero que en el normal. g) Otra respuesta alternativa que pueden pensar los alumnos sería realizar un knock out de ese ORF. En realidad teóricamente no sería correcto pues en plan-tas no suelen realizarse knock outs, pero ellos proba-blemente no lo sepan (conceptualmente no importa, técnicamente, lo knock outs en la actualidad, salvo en bacterias, se hacen por interferencia transformando transitoriamente con RNAi o establemente con cons-trucciones que expresen iRNA). Además está la acla-ración de que la integración del T-DNA no es por re-

combinación homóloga y sí saben que para hacer un knock out dirigido se requiere recombinación homó-loga. h) Haría un Southern usando como sonda al ORF4329 y condiciones de baja rigurosidad en la hibridación. Para clonarlo haría una genoteca y locali-zaría el gen homólogo mediante hibridación con la sonda de Arabidopsis. 5) Los ritmos circadianos que corresponden a ciclos de aproximadamente 24 horas permiten a los orga-nismos regular su actividad con la alternancia día-noche. Aunque estos ritmos son autónomos, algunos estímulos externos, tales como la luz, pueden “poner en hora” este reloj interno. En mamíferos, existe un marcapasos central, ubicado en el núcleo supra-quiasmático (NSQ) del hipotálamo anterior. Varios genes están involucrados en el mecanismo molecular del reloj interno, existiendo entre ellos lazos de retroa-limentación positiva y negativa a nivel de la expresión y de la actividad de las proteínas que codifican. Se sabe que la fase de este marcapasos central se puede adelantar con un estímulo lumínico durante la “noche” relativa que es captado en la retina y llevado al NSQ a través del tracto retino-hipotalámico (que libera el neurotransmisor glutamato) y que este cambio de fase está asociado a un aumento rápido de la expresión del gen Per1. Río arriba (hacia 5’) de este gen se encuen-tra una secuencia cre (elemento de respuesta a cAMP), a la cual se puede unir en ciertas condiciones el factor de transcripción CREB. Se realiza el siguien-te experimento: a un cultivo sincronizado de células del NSQ de ratón se lo estimula durante la noche rela-tiva con concentraciones adecuadas de glutamato (provoca el mismo efecto que la luz provoca in vivo) o db-cAMP (dibutiril cAMP: análogo del cAMP que puede atravesar la membrana celular) o con solución salina (control). Después de 30 minutos se extraen RNA y proteínas. Northern Blot con sonda para Per1:

Control Glut db-cAMP

Relación entre CREB fosforilado (P) y no fosforilado

Relación Control Glut. db-cAMP

CREB-P/CREB 0,3 4,2 2,2

Esta relación se determinó realizando Western Blot con anticuerpos anti-CREB y anti-CREB-P. Para poder confirmar el rol de CREB se construyó el siguiente sistema indicador (reportero) y se transfectó en células del NSQ en cultivo.

Prom: promotor del gen Per1.

La luciferasa (codificada por la secuencia estructural del luc) es una enzima que reacciona con el agregado de luciferina produciendo luminiscencia. Se ensaya la

cre Sec estr.gen luc Prom

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actividad de estas células en las siguientes condicio-nes: - glutamato

+ inhibidor de AC - (baja expresión) - sin inhibidor - (baja expr.)

+ glutamato

+ inhibidor de AC + (expr. media) - sin inhibidor +++ (alta expr.)

AC (adenilato ciclasa): enzima que sintetiza cAMP a partir de ATP, responsable del aumento de cAMP du-rante la transducción de señales de diversos estímulos.

Interpretar estos resultados. Se sospecha que el glutamato ejerce su acción vía cAMP pero que esta podría no ser la única vía en que lo hace. ¿Qué opina acerca del rol de CREB en los dos tipos de estímulo? Justificar. Respuestas a) Esta respuesta implica un mínimo de detalle de descripción de para qué se hicieron los 3 experimentos y qué datos aporta cada uno. Conclusio-nes: tanto glutamato como cAMP inducen la expre-sión de Per1. La inducción por glutamato es más fuer-te que por cAMP. Además, el glutamato es capaz de activar el promotor de CREB aún en presencia de in-hibidores de la AC. b) La contestación a esta pregunta puede tener algunas variantes de respuesta y se evaluará en función de la coherencia del razonamiento que se emplee. La res-puesta esperada es que puede deberse a que el gluta-mato activa la misma vía de señal del cAMP y además otra (u otras) o a que activan vías totalmente separa-das que terminan en el mismo efecto (siendo la de glu-tamato una vía más fuerte). En cuanto a CREB, se ve que la fosforilación de CREB se corresponde con una alta expresión, por lo que podría pensarse que CREB está implicado en la activación de Per1. El menor efecto de cAMP también se ve en este caso, lo que lleva a pensar en principio que la menor expresión vista con cAMP se debería a una menor activación de CREB y no a que falte activarse otro factor de trans-cripción además de CREB que sí se active con gluta-mato. 6) Ciertos individuos de la abeja Apis mellifera pre-sentan un comportamiento particular en cuanto a la limpieza de las celdas que contienen a las larvas para-sitadas por el ácaro Varroa destructor (llamado com-portamiento higiénico). Este comportamiento se debe a la capacidad de las abejas de percibir un compuesto químico volátil producido por el ácaro. Con el fin de establecer si dicho comportamiento tiene una base genética, se llevaron a cabo una serie de estudios y experimentos que permitieron identificar algunos ge-nes candidatos (es decir, genes responsables del com-portamiento higiénico). a. ¿Qué metodología/s puede/n haber sido empleada/s para la detección de estos genes candidatos? A continuación, los investigadores se interesaron por la regulación de uno de los genes de interés, y enten-der así la relación entre la expresión de los mismos y la presencia de los volátiles emitidos por el ácaro, se realizaron las siguientes construcciones: (en blanco se indica la región del promotor que ha sido delecionada).

b. ¿Cómo se evaluó la relevancia relativa de cada una de las regiones del promotor? (indique el gen reporte-ro y la obtención de los individuos utilizados para rea-lizar esta medición). ¿Qué cree usted que representa en el esquema la región pintada de negro? ¿Qué in-formación brindan, con respecto a la estructura del promotor, los resultados que se presentan en el es-quema? c. Finalmente, los investigadores se preguntaban cómo validar sus resultados, tanto con respecto a la función del gen (efecto sobre el comportamiento) como a su regulación. Elija una de estas dos opciones, y detalle al menos una metodología para poner a prueba su hipótesis. Rta a. Marcadores, genoteca dif, o arrays (por cual-quiera que lo encaren esta bien, mientras que este bien explicado) b. Deben mencionar un gen reportero (idealmente lu-ciferasa, proque ese es el que vieron para insectos) y deben explicar brevemente como transfectar insec-tos con estas construcciones. luego los deben exponer al olor para medir actividad. Parte pintada de negro: prom. minimo, siemrpe debe estar. regulacion: deben decir qué regiones de importancia se detactan en cada parte (2 reg positivas, 1a en la primera, 1a en la terce-ra) c. Función del gen: knockout, transposon-tagging, antisense. Funcion de las regiones regulatorias: apun-tamos a que se acuerden del ejemplo de footprinting de la guia. 7) Un grupo de criadores de caballos de Tennessee están interesados en el fenotipo champagne del pelaje de sus animales, que es controlado por un gen au-tosómico dominante CH, pero resulta muy difícil dis-tinguirlo del efecto producido por dilución de otros genes relacionados con la síntesis de melanina. Re-suelto a revelar las bases moleculares de este fenotipo acude al Departamento de Genética de la Universidad de Tennessee donde le proveen los siguientes datos de cruzamientos prueba en los cuales estaba involucrado uno de los genes candidatos (llamado P de pigmento) y obtiene la siguiente segregación genotípica: CHch Pp = 40 % CHch pp = 10 % chch pp = 40 % chch Pp = 10 % a) ¿A qué distancia genética se encuentran CH y P? b) Dada la implicancia del gen P en la pigmentación, ¿qué técnica utilizaría Ud. para verificar la expresión de dicho gen si conociera al menos un par de primers que amplifiquen alguno de sus exones? Puntualice de qué tejido partiría, qué aislaría y qué técnica emplear-ía ¿Qué control positivo realizaría? Para dilucidar las bases moleculares implicadas en el mecanismo de pigmentación y dado que el gen P es un miembro de la familia de proteínas transportadoras

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que cumplen un rol importante en el desarrollo del color del pelaje en mamíferos, Ud. decide investigar la regulación de la expresión de esta proteína. Según la bibliografía esta proteína había sido referida previa-mente como proton/amino acid transporter en huma-nos y en ratón. Para comenzar sus estudios clona la región promotora (p) ubicada a 5´del gen YFP (Yellow Fluorescent Protein). Luego, realiza los siguientes experimentos de transfección:

Línea celular Plásmido Fluorescencia YFP

Melanocitos M3 p/YFP +++

Queratinocitos Q8 p/YFP ----

c) ¿Cómo interpreta estos resultados en términos de mecanismos de regulación de la expresión génica y especificidad de tejidos? Para confirmar lo anterior, decide realizar un ensayo de EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Para ello, utiliza nuevamente la región promotora de este gen y la marca en uno de sus extremos 5´ con

32P. In-

cuba la preparación con y sin proteínas nucleares ex-traídas de tejido cutáneo de los animales y corre un gel nativo de agarosa. Luego revela por autoradiograf-ía. Calle 1: Región promotora del gen P marcada con

32P e incu-

bada sin extracto nuclear. Calle 2: Región promotora del gen P marcada con

32P e incu-

bada con extracto nuclear.

1 2

e) ¿Por qué observa diferencias en la corrida electro-forética? Explique si estos resultados se relacionan con los resultados del ítem d) y por qué. Rtas. a) 20 % de recombinantes, por lo tanto, se encuentran a 20 unidades de recombinación. b) Se parte de tejido cutáneo y se realiza una extrac-ción de RNA. Posteriormente se realiza una retro-transcripción a fin de obtener cDNA. Finalmente se hace una PCR usando el par de primers (en lo posible cuantitativa qRT-PCR) que amplifiquen alguna región correspondiente a un exón determinado del gen P y así verificar la expresión del mismo, tejido-específica. Como control se podría realizar una PCR para algún gen constitutivo o conocido de ese tejido, por ejemplo B-actina. c) YFP se regula transcripcionalmente, se expresa bien en melanocitos y no en queratinocitos. Por lo tan-to, en este tipo celular se encuentran factores de trans-cripción específicos necesarios que se unen a regiones regulatorias que posibilitan la expresión del gen repor-tero y por lo tanto, regularían también la transcripción del gen P. e) Las diferencias en la corrida electroforética se de-ben a que al incubar la región promotora/reguladora con un extracto nuclear propio del tejido específico, se

le unen factores de transcripción y regulatorios y al correr los complejos en un gel nativo y revelar por autoradiografía, la marca de

32P aparece retrasada en

la calle con extracto porque pesa más por tener los factores unidos. Estos resultados apoyan los obtenidos en el punto anterior donde se verifica la actividad transcripcional en el caso de existir factores específi-cos para la región promotora de P. 8) En un laboratorio se obtuvieron protoplastos (célu-las vegetales sin pared) a partir de células de mesófilo de tabaco. Los mismos fueron electroporados (trans-formados en forma transitoria, es decir, sin buscar in-tegración estable) con tres plásmidos recombinantes distintos (uno por vez y en distintas células). Los 3 plásmidos portan la secuencia codificante para la beta-glucouronidasa (GUS) proveniente de un gen bacte-riano llamado uid A (cuya expresión transitoria puede detectarse mediante una reacción que da color azul, en una forma muy similar a la que se puede detectar al producto del gen lac Z) y un terminador adecuado pa-ra plantas. Lo que varía en los distintos plásmidos es el promotor (acompañado del respectivo enhancer en los casos 1 y 2, en el caso 3 no lo hay) que controla la expresión de las secuencias estructurales.

1 Promotor Rubisco

secuencia estructu-ral para GUS

terminador rubisco

2 Promotor 35S secuencia estructu-ral para GUS

terminador rubisco

3 Promotor lac secuencia estructu-ral para GUS

terminador rubisco

Aclaraciones: Rubisco = ribulosa bifosfato carboxila-sa (responsable de la fijación de C02 en la fotosíntesis) similar al de un problema de la guía; 35S = transcripto del virus del mosaico del coliflor (CaMV) que se ex-presa en forma constitutiva; lac = operón lactosa de E. coli. 1) Los investigadores no agregaron controles negati-vos o positivos ¿Es porque alguna/s de las 3 construc-ciones podría/n ser, a su vez, control/es positivo y/o negativo? Explique 2) ¿Con cuáles de las construcciones observará la apa-rición de color azul en las siguientes situaciones? a) protoplastos expuestos a la luz b) protoplastos en oscuridad c) protoplastos en oscuridad suplementados con lactosa d) protoplastos en oscuridad suplementados con lac-tosa y glucosa 3) El laboratorio no probó variantes de terminadores ¿Se podría haber agregado el terminador de otro gen? Explique si esto podría haber afectado los resultados. RTA:1) Rubisco: promotor INDUCIBLE por luz, sólo inducirá expresión cuando hay luz (en (a)). El 35S por ser constitutivo, se expresará en todas las condiciones. El lac es un promotor procariótico, por lo que NO es funcional en plantas. Nunca podrá inducir expresión. Además, aunque funcionara, carece del gen codifican-

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te para el represor y del gen para CAP (o CRP) como para poder activarse o reprimirse. La construcción 1 sirve como control positivo y la 3 de negativo, por todo lo anterior. 2) a) 1 y 2 b) 2 c) 2 d) 2 3) Salvo excepción, el terminador no influye en la ex-presión de un gen. Podría hacerlo en la vida media del mRNA (esto no se dio en teóricas) o en la unión (ad-hesión) a algún componente subcelular (esto lo verán, más adelante, en genética del desarrollo. 9) Las variantes heredables de la enfermedad de Alz-heimer, se dividen en varios tipos dependiendo de la causa genética que la produce. Una de ellas se cree que se debe una mutación en el promotor/enhancer del gen codificante para la APP (precursor de la proteína beta A4 amiloide, que es la proteína que se acumula excesiva y descontroladamente en esta enfermedad). Otra se debe a una falla en el procesamiento (splicing) alternativo del exón 19. En un estudio se produjeron ratones transgénicos que expresan APP murina bajo el control del promo-tor/enhancer aislado de DNA de humanos enfermos. Los ratones transgénicos enfermaron de Alzheimer a edad adulta. Al analizar por Southern blot a los ratones obtenidos, mediante hibridación con cDNA de APP (primera co-lumna) o con oligonucleótidos complementarios a las secuencias del promotor diferenciales (2° y 3° colum-nas), se observó el siguiente patrón:

Sonda: cDNA

APP murino

Sonda: promotor

APP murino

Sonda: promotor

APP humana

Ratón

normal

Ratón

transg.

Ratón

normal

Ratón

transg.

Ratón

normal

Ratón

transg.

a) ¿Por qué la banda del segundo carril electroforéti-co (columna 1) tiene un color más intenso?

b) Explique las diferencias observadas al utilizar sondas de promotores de origen humano y muri-no.

Posteriormente, realizaron Northern blots con RNA de cerebro de ratón, usando como sonda cDNA de APP en ratones transgénicos jóvenes (sanos) y adultos (en-fermos).

Ratones jóvenes Ratones adultos Normal Transg

. Nor-mal

Transg.

c) ¿Qué conclusión extrae en cuanto al rol de la trans-cripción? d) ¿Qué fenotipos se obtendrían si (utilizando el mis-mo promotor), en lugar de la secuencia codificante para APP se hubiera utilizado: i) un gen indicador (reportero) como GFP,

ii) la secuencia codificante de APP mutagenizada para contener un codón de terminación de lectura muy cercano al codón de iniciación iii) una secuencia antisentido o interferente? Los ratones transgénicos correspondientes: ¿desarro-llarían Alzheimer o qué? Estos experimentos ¿servir-ían para reforzar su conclusión en c)? Posteriormente, decidieron cruzar ratones transgéni-cos y sanos, comprobando que el carácter fue domi-nante (como ocurre en humanos). Por otro lado, con-siguieron una muy rara mutante que, sometida a de-terminadas condiciones de alimentación y estrés mos-traba la aparición de Alzheimer por problemas de splicing del RNA de APP tal como ocurre en huma-nos. Decidieron, entonces hacer un cruzamiento entre transgénicos (homocigotas para el transgén) y mutan-tes (también homocigotas). Para determinar el fenoti-po, se los dejó llegar a edad adulta. En caso de no des-arrollar Alzheimer, se los sometió a condiciones de alimentación especial y estrés y, posteriormente, se los volvió a evaluar. - Toda la F1desarrolló Alzheimer sin necesidad de someterlos a alimentación especial y estrés. - En la F2 se obtuvieron 236 ratones Alzheimer sin necesidad de someterlos a alimentación especial y estrés, 64 que desarrollaron Alzheimer únicamente después de tratamiento especial y 23 que nunca desa-rrollaron Alzheimer. e) ¿Se ajusta este resultado a las proporciones espera-das a partir de las leyes de Mendel? En caso de no ser así, explicar estos resultados y comprobar la hipótesis. Rta a) Porque detecta las copias endógenas del gen normal ya presentes en el ratón y, además, la copia (adicional) del transgén APP. b) La sonda murina detecta el gen endógeno pero no el transgén, la humana: viceversa c) En ratones jóvenes, la expresión es similar. En los adultos, disminuye notablemente en los normales y aumenta en los transgénicos. Existiría asociación entre la expresión de APP y aparición de Alzheimer. d) i) Fluorescencia leve en cortes de cerebro de ratón joven y fluorescencia fuerte en adultos ii) Ninguna diferencia iii) Ninguna diferencia o, dependiendo del grado de interferencia, puede haber letalidad debida a la no expresión de APP en ratones jóvenes (ambas respues-tas se considerarán correctas) En ninguno de los 3 casos se desarrollará Alzheimer. Refuerzan la conclusión de c) porque sirven de con-troles (testigos) negativos, indicando que no es la mu-tación en el promotor la causante directa de este comportamiento, sino la resultante sobre-expresión descontrolada del gen de APP. e) Epístasis dominante 12:3:1 10) Hace poco más de una década se desarrolló, me-

diante ingeniería genética, una tecnología para estu-

diar los genes expresados por un determinado patóge-

no cuando éste infecta a un huésped. Esta tecnología

se denominó in vivo expression technology (IVET).

Esta estrategia se utilizó para hallar genes que se ex-

presan diferencialmente en Salmonella cuando ésta

8

infecta ratones. Para ello se generó una genoteca

genómica empleando ADN genómico de Salmonella

digerido con una enzima de restricción de corte fre-

cuente, en cantidades limitantes, y luego clonado en el

MCS del siguiente plásmido:

AmpR: gen de resistencia a ampicilina mob: origen de transferencia conjugativa dependiente de genes tra (no codificados en el plásmido) CAT: gen de resistencia a cloranfenicol sin su promo-tor oriR6K: origen de replicación dependiente de la pro-teína pi (codificada por el gen pir+) Lac Z -galactosidasa sin su promotor MCS: sitio de clonado múltiple Luego de ligar, se transformaron E. coli competentes con el objetivo de transferir mediante conjugación el plásmido a las salmonelas dado que estas últimas no eran susceptibles de ser transformadas. El propósito de esta etapa del experimento es generar una genoteca de salmonelas donde el plásmido de la figura 1 se haya integrado al genoma bacteriano por recombina-ción homóloga (el segmento clonado presenta la se-cuencia homóloga en el genoma). a) ¿Cómo debe ser el genotipo de las E. coli en cuanto a los genes pir, tra, y recA (participa en la recombina-ción homóloga)? ¿Cómo se seleccionaron las E. coli transformadas? Justificar b) ¿Cómo debe ser el genotipo de las salmonelas en cuanto a los genes pir y recA? ¿Cómo se seleccionan a las salmonelas que integraron el plásmido? Justificar. c) Esquematice la región homóloga en el genoma de Salmonella luego de ocurrir la recombinación homó-loga donde se integra el plásmido. Una de las particularidades de esta construcción es que los genes CAT y LacZ están desprovistos de pro-motor por lo que solo se podrán expresar (como men-sajero policistrónico) si en el MCS se clonó un frag-mento de ADN que contiene un promotor en la orien-tación adecuada. d) Esquematice el plásmido recombinante incluyendo: el inserto, secuencias de Shine-Dalgarno, ATG inicia-dores, codones STOP y terminadores de la transcrip-ción. e) ¿Por qué se realizó una biblioteca genómica y no una de cDNA? Con estas salmonelas recombinantes (que eran sensi-bles a cloranfenicol y LacZ-) se infectaron ratones a los cuales se les suministró cloranfenicol. Luego de 3 días se sacrificaron los ratones y se recuperaron las bacterias que sobrevivieron las cuales fueron plaquea-das en LB + X-gal (da colonias azu -galactosidasa). f) ¿Qué característica tendrán las bacterias aisladas de los ratones (in vivo) en cuanto a la orientación y ex-

presión del inserto? ¿Por qué no fue necesario agre-gar IPTG? g) En dichas placas, ¿a qué tipo de insertos corres-ponden las colonias blancas y a cuales las azules? ¿Esperaría que haya más colonias azules o más blan-cas? (No pierda de vista el objetivo de esta estrategia generada). h) A partir de la obtención de colonias de interés, ¿cómo haría para identificar los genes de Salmonella que se expresan específicamente durante una infec-ción? Explique brevemente los pasos a seguir. i) ¿Cómo evaluaría funcionalmente los genes identifi-cados? Respuestas: a) Las E. coli deben ser : - pir+ : para que el plásmido pueda replicar y para po-der transferirlo completo a las salmonelas. - tra+ : para tener los factores necesarios para poder transferir el plásmido por conjugación a las salmone-las. - recA- : para evitar que el plásmido se integre al ge-noma en caso de existir alguna zona homóloga. Para seleccionar, luego de transformar, se crecen las bacterias en medio con ampicilina (no se puede usar cloranfenicol porque sino se estaría sesgando la selec-ción a aquellas construcciones que incorporaron un promotor que pueda expresarse en E. coli). b) Las salmonelas deben ser: - pir- : para que el plásmido no pueda replicar y cuan-do se realice la selección solo sobrevivan y repliquen las bacterias que integraron el plásmido al genoma. - recA+: para que puedan integrar el plásmido por re-combinación homóloga. - AmpR La selección de las bacterias debe realizarse creciendo las bacterias en medio con ampicilina (no puede ser cloranfenicol por motivos similares a los mencionados en la pregunta anterior). c)

X: inserto

X´: región homóloga en el cromosoma

d)

Cada gen tiene que tener su propia secuencia de Shi-ne-Dalgarno (río arriba del ATG) y su propio STOP. Ambos genes tienen que tener la misma orientación para que puedan ser traducidos a partir del mismo mensajero policistrónico. Por otra parte debe haber un solo terminador de la transcripción rio abajo del lacZ para que se genere el mensajero policistrónico. e) Se realizó una biblioteca genómica porque el obje-tivo es ver que promotores se encienden durante una infección in vivo utilizando los genes CAT y LacZ como reporteros. En una biblioteca de cDNA no se encuentran los promotores y sí en una genómica.

AmpR mob

OriR6K

MCS

CAT LacZ

AmpR mob

OriR6K

MCS

CAT LacZ

CAT LacZX´

S-D S-D

ATG ATGSTOP STOP

Terminador

CAT LacZX´

S-D S-D

ATG ATGSTOP STOP

Terminador

mob

OriR6K

CAT LacZ AmpRX´ Xmob

OriR6K

CAT LacZ AmpRX´ X

9

f) Porque la expresión de la -gal está regulada por el inserto (en caso de que contenga un promotor) y no por el promotor y operador del operón Lac. g) Las bacterias que sobrevivieron luego de la infec-ción en ratón y selección con cloranfenicol son aque-llas que expresaron el gen de resistencia a este antibi-ótico. Esto sólo sucede si el inserto contiene un pro-motor, en la orientación adecuada, que se expresa en las bacterias durante la infección y por ende permite la expresión del mensajero policistrónico que codifica para el gen CAT. Cuando se plaquea en medio LB + X-gal las colonias azules son las que expresan -gal. Dado que esto solo ocurre si el inserto tiene un promotor que es activo en el medio LB, las colonias azules corresponden a bac-terias que poseen un inserto que tiene un promotor que se expresa tanto in vivo como in vitro, lo cual in-cluye genes de expresión constitutivas. En cambio, las colonias blancas corresponden a bacte-rias con insertos donde el promotor que fue activo in vivo (y por ende sobrevivieron a la selección con clo-ranfenicol) fue inactivo in vitro. Es decir corresponde a genes que solo fueron activos durante la infección. Por lo tanto esperaría que haya más colonias azules. h) Partiendo de las colonias blancas se amplifica por PCR el inserto, utilizando primers complementarios a las regiones del plásmido flanquantes al MCS y luego se puede secuenciar dicho inserto. Utilizando dicha secuencia se puede realizar una búsqueda bioinformá-tica para ver a que gen corresponde, si el genoma está secuenciado. Si no está secuenciado se puede utilizar el inserto como sonda para buscar el gen completo en una biblioteca genómica. i) Por ejemplo se puede knockear el gen/genes en cuestión y evaluar el proceso de infección en ratones, comparando con la cepa salvaje. 11) El grupo de Ling y col. (2006) desarrolló una va-cuna recombinante para el virus Newcasttle y el virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), que son en-fermedades cuarentenarias de los pollos, utilizando para ello los genes de 2 antígenos de Newcasttle: el F y el HN y uno de ILTV: el gB. Para ello, subclonaron estos genes primero en un plásmido de E. coli con el objetivo de incorporarlos (en un segundo paso) en el genoma del virus Fowlpox (FPV, viruela de ave de corral, un pariente del virus vaccinia) bajo el control del promotor viral LP2EP2 (promotor temprano-tardío). Además, agregaron una construcción conte-niendo LacZ bajo el control de otro promotor viral tardío (el P11). Finalmente se colocaron secuencias homólogas (llamadas “brazos”) de FPV (Am1 y Am2 significando “arm” –brazo- 1 y 2). Todo esto, en un vector de E. coli como se muestra en la figura y que es un plásmido suicida (no tiene capaci-dad de replica-ción propia en células de aves):

Posteriormente, transfectan este plásmido en células de ave previamente infectadas con FPV. a)¿Para qué hacen esta transfección en células infecta-das y no en células sin virus? Como resultado de lo anterior obtienen, sobre medio sólido conteniendo X-gal, una monocapa de células con muchas placas transparentes y otras pocas azules. b)¿Con cuáles se quedaron y por qué? De las placas seleccionadas aislaron inóculo con el cual infectaron nuevas células que fueron analizadas por PCR, Western e inmunofluorescencia, como se muestra en la siguiente figura: Fig: Células aviares infectadas con FPV solamente (C) o se-leccionadas en el paso anterior (D) después de tratar con un anti-cuerpo marcado con fluoresceína.

c)¿Con qué anticuer-pos habrán hecho este estudio y el de wes-tern? Es decir, ¿Qué antígenos reconocen estos reactivos? d)¿Cuál sería el si-guiente paso para comprobar la efecti-vidad de esta poten-cial vacuna de nueva generación? e) Enumere 2 ventajas que tendría usar esta vacuna respecto a las vacunas convencionales que se usan hoy en día. 3) a) Para que se produzca el reemplazo alélico (re-combinación homóloga entre plásmido y genoma de FPV) y se construya así el virus recombinante b) Con las azules porque la expresión de beta gal es indicativa de la presencia de la inserción en los virus recombinantes c) Anticuerpos que reconocen F, HN, gB y ¿por qué no? beta galactosidasa. De todos modos, sólo son im-portantes lo 3 primeros porque el objetivo de todo esto es inmunizar contra estos antígenos y la expresión de beta galactosidasa ya se evaluó enzimáticamente. d) Ensayos de protección vacunando y desafiando posteriormente con los virus patogénicos. e) Se puede hacer una única vacuna para 2 enferme-dades distintas y no es necesario utilizar virus infec-ciosos para elaborar la vacuna.

Mendel y extensiones

1) En los cobayos, el color de pelo (negro vs blanco) es determinado por el gen B. Los símbolos negros re-presentan a los cobayos negros y los blancos a los co-bayos de fenotipo blanco. Se dispone del siguiente árbol genealógico, en el cual los individuos II1 y II4 pertenecen a líneas altamente endocriadas (asumir que pertenecen a líneas puras).

10

a) Represente el genotipo probable de cada individuo (en los casos de que pueda ser más de uno, represente con un guión bajo, i.e. B_) b) Calcule la probabilidad de que un descendiente del cruzamiento entre III1 y III2 sea blanco. Para contes-tar es suficiente que escriba los genotipos al lado de los símbolos en el esquema y las probabilidades (sólo de las que se usarán para hacer los cálculos) sobre el esquema (puede dibujarlo o escribir sobre este enun-ciado). De lo contrario, explique su razonamiento Respuestas esperadas:

En caso de respuesta con explicación: I1 y I2 tienen que ser heterocigotas (Bb) porque si no, no podrían tener un hijo blanco II1 y II4 son BB por definición de líneas puras, II2 bb porque su fenotipo refleja su genotipo II3 es B_ porque no podemos saber qué segundo alelo recibió. Tiene 1/3 de posibilidades de ser BB y 2/3 de ser Bb (son tercios y no cuartos porque se descarta que pueda ser bb dado que su pelaje es negro). III1 es Bb porque deriva de un BB y un bb III2 es B_ dado que, como se explica arriba, existe una probabilidad de 2/3 que su padre II3 sea Bb Si II3 era BB, III2 es BB. Si II3 era Bb, existe ½ de probabilidad de que III2 sea BB o Bb. Sólo si III2 resulta Bb, podrá tener ¼ de posibilidad de tener un hijo blanco con III1 Por lo tanto, la probabilidad de que se produzca un cobayo blanco es (2/3)(1/2)(1/4) = 2/24 = 1/12 2) La anemia de células falciformes (ACF) es un pro-ceso hereditario humano causado por un alelo au-tosómico recesivo de muy baja incidencia en las po-blaciones occidentales. Un matrimonio quiere conocer la probabilidad de tener un hijo afectado. Con sus co-nocimientos sobre herencia mendeliana ¿qué podría decirles si: a) ambos miembros de la pareja son normales, pero cada uno de ellos tiene un padre afectado y el otro progenitor no tiene historia familiar de ACF? b) el marido está afectado por la enfermedad pero la mujer no tiene antecedentes familiares de ACF? I) Para cada caso construya las genealogías posibles para esta familia indicando los genotipos y fenotipos de todos los individuos involucrados.

II) ¿Sobre qué fundamento(s) incluido(s) en la/s ley(es) de Mendel) se apoyan sus predicciones en los casos anteriores? Nomenclatura: S alelo determinante de hemoglobina falsiforme, N de Hb normal, _ puede ser cualquiera de los 2 alelos (N o S) Respuesta: a) ¼ b) 0 I) a) abuelos SS (enfermo) x NN (sano) padres SN (sanos en ambos casos) hijos posibles NN, SN o SS b) abuelos en un caso: S_ x S_ (ambos sanos o en-fermos) padre SS (enfermo), abuelos en otro caso NN x NN padre NN (sanos todos) II) En el concepto de segregación de los alelos al for-mar las gametas que darán origen a la progenie expli-citada en la primera ley de Mendel. 3) La corea de Huntington es una enfermedad rara, mortal, que aparece normalmente a mediana edad. Se debe a un alelo dominante. Un hombre fenotípicamen-te normal, de poco más de 20 años, advierte que su padre ha desarrollado la corea de Huntington. a) ¿Cuál es la probabilidad de que más tarde él mismo desarrolle la enfermedad? b) ¿Cuál es la probabilidad de que la desarrolle su hijo al cabo del tiempo? (Nota: Para sus cálculos asuma que la frecuencia del alelo que produce la enfermedad en la población humana es insignificante). Respuesta Suponiendo que el padre que desarrolla la enfermedad fuese heterozigota para el alelo mutante (dado que la probabilidad de que también lo tenga la madre es insignificante): a) ½ b) ¼. Si suponen que el padre también podía ser homocigota (además de heterocigota) y se hacen los cálculos co-rrectos [a) 1 b) ½ ] para esta segunda posibilidad el problema se considerará bien contestado. Si ponen homocigota como única posibilidad aún cuando se hagan los cálculos correctos, el problema está mal contestado. 4) Dos plantas enanas de maíz (E1 y E2) tenían origen distinto, pero eran fenotípicamente idénticas. Se cru-zaron cada una de estas plantas enanas con una línea altamente endocriada de plantas altas que, se sabía, son homozigóticas para todos los genes que determi-nan el tamaño. Ambos cruces dieron lugar a una F1 constituida únicamente por plantas altas. Al autofe-cundar cualquier planta de la F1, la proporción de la F2 fue de 3 altas: 1 enana. Los cruzamientos entre las dos líneas enanas paternas E1 x E2, solo dieron lugar a plantas altas en la F1. A pesar de este resultado, en la F2 reaparecieron las variantes enanas. La propor-ción de plantas enanas en la F2 fue de 7/16. a) Explicar los resultados obtenidos, indicando todos los genotipos implicados. b) ¿Qué proporciones genotípicas y fenotípicas espe-raría si se realizase el cruzamiento prueba de la F1 del cruzamiento E1 x E2 con el progenitor E1? Respuesta a) Dos genes afectan al tamaño A (normal)> a (enanismo 1) B (normal)> b (enanismo 2) [Es un caso de epístasis complementaria] P E1=AAbb x E2=aaBB F1 AaBb (altas) F2 9 A_B_ (altas) vs 7 aa__ o __bb (enanas)

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2 ?

Bb Bb

BB BB

bb

2/3

---Bb

1/3

BB Bb ½ b ½ BB

½ Bb

½ b

I

II

1 2

1 2 3 4

1 2 ? III

11

b) AaBb x AAbb AABb ¼, AaBb ¼, AAbb ¼, A-abb ¼. Proporciones fenotípicas: A- B- 1/2 altas; A- bb 1/2 enanas 5) Un criador de canarios desea en generar aves de color naranja. Con este objetivo cruza animales de una raza (es decir, altamente endocriada) amarilla con animales de una raza roja. A pesar de sus expectativas todos los animales de la descendencia resultaron de color rojo. Sin darse por vencido, decidió cruzar esta F1 con animales de la raza parental amarilla. Para su sorpresa no solo los animales no resultaron naranjas, sino que tuvieron variados colores: 25 rojos, 27 verdes y 48 amarillos. Completamente desconcertado decide llamarlo a usted como genetista para responder a los siguientes interrogantes: a) ¿Es posible que el color de estas aves esté determi-nado por un solo locus? b) ¿Y por dos loci? Justifique por que sí o por qué no, indicando los alelos probables de los parentales y de la descendencia, y alguna explicación bioquímica. c) ¿Cómo haría para validar estadísticamente su hipó-tesis? Explique brevemente sin realizar los cálculos. Respuesta: a) En primer lugar asumimos parentales homocigotas porque se trata de razas en las cuales hay mucha en-docría. Si fuera determinado por un solo locus tene-mos AA (rojo) x aa (amarillo) Aa (rojo) x aa ½ Aa (rojo); ½ aa (amarillo) Deberíamos tener sólo fenotipos rojos y amarillos y en igual cantidad b) Si son dos loci tenemos A1A1B1B1 (rojo) x A2A2B2B2 (amarillo) A1A2B1B2 (rojos) x A2A2B2B2 A1A2B1B2 (rojos); A1A2B2B2; A2A2B1B2; A2A2B2B2 (amarillos) De lo genotipos restantes uno debería dar fenotipo amarillo y el otro verde (no importa cual por simetría). Entonces supongamos que A1A2B2B2 es verde y A2A2B1B2 es amarillo. En este caso la relación rojo:verde:amarillo debería ser 1:1:2 que es lo que se observa. Una posible explicación sería la siguiente vía de pro-ducción de pigmentos: A1 B1 Amarillo verde rojo Nota: A y B no están ligados porque si lo estuvieran en la F1 habría una frecuencia de gametas A1B1 ma-yor a ¼ con lo cual más de ¼ de la descendencia de-bería ser roja. c) Prueba de bondad de ajuste (chi-cuadrado) a una relación 1:1:2

6) Se presentó ante los tribunales de justicia el si-guiente caso: la familia Pérez reclama que cierto bebé (Juan), que les dieron en la maternidad, no les perte-nece y que, en cambio, el bebé Felipe, que tiene la familia García, es el suyo y se lo cambiaron. La fami-lia García niega este hecho, y el tribunal ordena el examen de los grupos sanguíneos de los bebes y de los padres, con los siguientes resultados:

Ma-dre

Pa-dre

Bebé

Familia Pérez AB O A (Juan) Flia. García A O O (Felipe)

¿Qué familia tiene razón y por qué? Respuesta: la García. Si escribimos los genotipos completos de los padres resulta claro que el primer podría ser resultado de cualquiera de las 2 parejas, pero el segundo bebé sólo de la segunda

Ma-dre

Pa-dre

Bebé

Familia Pérez AB OO AO Flia García AO OO OO

Mapeo

1) En una determinada especie animal los loci A,a; B, b y C,c se localizan en el mismo autosoma. El locus B,b es el central. La distancia entre A,a y B,b es de 20 unidades de mapa, la distancia entre B, b y C, c es de 10 unidades de mapa y el coeficiente de coincidencia es 0,6. Indicar la proporción esperada de individuos obtenidos con el fenotipo Abc. Respuesta: Cc = Frecuencia de dobles observadas (FO) / Frecuencia de dobles esperados (FE) = 0.6 FO= 0.6 x FE= 0.6 x 0.2 x 0.1=0.012 Nº de dobles observados = 0.012 x 100 = 1,2% indi-viduos dobles recombinantes: AbC y aBc distancia. A-B = Nº de Individuos recombinantes en-tre estos marcadores + Nº de dobles recombinates x 100 / nº total de individuos = 20 nº ind. rec. entre estos marcadores + 1,2 = 18,8 Es decir, 18,8 % son recom. Abc y aBC por lo tanto aproximadamente tendremos la mitad de individuos de cada tipo: 9,4 % 2) Se está estudiando una nueva especie de plantas descubierta recientemente. Se sabe que el alelo Q co-difica para hojas verdes, y el q para hojas moteadas (Q domina sobre q); por su parte el alelo R codifica para hojas redondas, y el r para puntiagudas (R domina sobre r). Todavía no se sabe la función del gen E/e. A estos investigadores les resultó raro que, a pesar de haber muestreado una gran región en la que este tipo de planta habita, no se encontró ninguna planta con hojas verdes y puntiagudas simultáneamente. Para dilucidar esta cuestión, se realizó un cruzamiento prueba, y los resultados fueron los siguientes: a) ¿Qué genes están ligados? b) ¿Hay interferencia? Contestar si o no, no hace falta calcularla numéricamente (lo mismo en a) c) ¿Por qué piensa que no se observan individuos de uno de los genotipos posi-bles? d) Analizando los resultados, discuta qué

clases Nro

EqR 280

eqr 203

EQR 199

eqR 7

Eqr 67

eQr 279

eQR 73

12

supuestos de los que se utilizan para este tipo de dio para calcular las distancias génicas en base a las frecuencias observadas pueden no estar cumpliéndose. Rta: a) Q/q y E/e están ligados, E/e y R/r están liga-dos, q/Q y R/r no parecerían estar ligados porque el porcentaje de recombinación es del 50%. Sin embar-go, se encuentran en el mismo cromosoma (están “li-gados” a 50 um o más) Para hacer los cálculos (no pedidos para responder la pregunta), primero tienen que sacar el locus central que es el E/e. Después: dist Q/q – E/e = 36,9 um dist E/e – R/r = 13,27 um dist q/q – R/r = 50,07 um (“no” están ligados) Lo correcto para calcular la distancia entre los genes de los extremos es sumar las distancias internas (da 50,07 um), en vez de realizar una prueba de dos pun-tos (da 48,92 um), pues de lo contrario no se estarían considerando los dobles recombinantes. b) Si. Para hacer los cálculos (no pedidos para respon-der la pregunta) Cc = 7 / 54,25 = 0,12 Por lo tanto I = 1- 0,12 = 0,88 Siendo 7 el nro de dobles rec observados Siendo 54,25 el nro de dobles rec esperados (0,369 * 0,1327 * 1108) Siendo 1108 el total de individuos c) Una posibilidad es que, como sugería el enunciado, la combinación de alelos Q/q r/r sea letal, siempre y cuando a su vez el genotipo sea E/e. En el campo abierto podría presentarse el mismo fenotipo genera-do por el genotipo anterior por ejemplo por la combi-nación de QQ Ee rr, Qq EE rr ò Qq eE rr (pues se pueden dar todas las combinaciones posibles, al no tratarse de cruzamientos prueba). Dado que en el enunciado se menciona que a campo abierto no se ob-serva ese fenotipo (hojas verdes y puntiagudas) se puede pensar que tanto Q/Q r/r como Q/q r/r son com-binaciones letales en presencia de por lo menos un alelo E. (y no en presencia de ee, ya que se observan parentales del cruzamiento prueba que son Qq ee rr) d) Hay que recordar que para calcular distancias en base a frecuencias fenotípicas, se supone que todas las gametas son igualmente viables. En este caso vemos que no es así. 3) Los experimentos que realizó Mendel, con una se-rie de marcadores genéticos de arveja, le permitieron llegar a la conclusión de que los caracteres se transmit-ían independientemente unos de otros. Sin embargo, se sabe ahora que tres de ellos se encuentran en el cromo-soma 4, en las posiciones (en unidades Morgan respec-to del inicio del cromosoma), 78 (fa, vainas axia-les/terminales), 199 (te, altura de planta alta/enana) y 211 (v, vainas hinchadas/arrugadas), siendo dominan-tes los alelos que se mencionan primero. a) Dibuje un mapa genético de los marcadores indi-cando las distancias entre ellos. ¿Qué conclusiones puede deducir respecto a la utilidad que hubieran pre-sentado estos loci para los estudios de Mendel? b) Según los datos aportados, indique las frecuencias fenotípicas y genotípicas que esperaría en la F1 - y su correspondiente F2- proveniente de un cruzamiento

entre dos líneas puras: una de plantas altas y vainas hinchadas y otra de plantas enanas y vainas arrugadas. ¿Cuáles son las frecuencias que hubiera esperado Mendel? c) ¿Qué cantidad de individuos de cada fenotipo esperaría encontrar, si la F2 estuviera compuesta por 160 plantas? ¿Cuántos hubiera esperado Mendel (no es necesario realizar la verificación estadística)? Solución a) La distancia entre estos genes en unidades mapa es de 199 - 78 = 121 (fa-le) y de 211 - 199 = 12 (le-v). Debido a la enorme distancia que separa al gen fa de los otros dos, en un experimento de cruce se hubieran comportado como independientes. Sin em-bargo, el cruce le x v hubiera dado resultados muy alejados de la independencia. Por lo tanto, este par de caracteres no le hubiera permitido elaborar sus leyes. Aclaración: en el enunciado dice “te”. b) Resultados que hubiera obtenido Mendel de haber cruzado le y v: Le V/Le V x le v/le v

= Le V/ le v

De acuerdo con la distancia a la que se encuentran estos dos genes y suponiendo igual frecuencia de re-combinación en la formación de los gametos en los dos sexos, tendríamos: Acá deben saber en función de la distancia, las frecuencias de los que son recombi-nantes y de los que no lo son es un conepto teórico importante.

0,44 Le V 0,44 le v 0,06 Le v 0,06 le V

0,44 Le V 0,1936 0,1936 0,0264 0,0264

0,44 le v 0,1936 0,1936 0,0264 0,0264

0,06 Le v

0,0264 0,0264 0,0036 0,0036

0,06 le V 0,0264 0,0264 0,0036 0,0036

(En blanco, fenotipo LeV, en amarillo, lev. En rosa: Le v, en celeste, le V. es decir, (Aca deben saber en forma teórica cuales serían las frecuencias esperadas de recombinantes y no recombinantes)

Le V le v Le v le V

Observado 0,6936 0,1936 0, 0564 0,0564

Esperado 9/16= 0,5625

1/16 0,0625

3/16 0,1875

3/16 0,1875

c) Mendel, en su trabajo sobre hibridación en plantas, indica que se hicieron varios experimentos uniendo caracteres de dos en dos o de tres en tres. Si hubiera realizado el cruce anterior unas 160 plantas (número de plantas que contó en uno de sus experimentos de dihibridismo obtenido el siguiente resultado,

Lo que Mendel hubiera esperado

Lo que Mendel hubiera encontrado

Le V 90 111 (110,976)

Le v 30 9 (9,024)

le V 30 9 (9,024)

13

le v 10 31 (30,976)

(Por supuesto, las diferencias son enormes) Otra forma de resolver el problema

obs L l Total V 111 9 120 v 9 31 40

Total 120 40 160

Sin suponer ligamiento esperados L l Total

V 90 30 120 v 30 10 40

Total 120 40 160

Genética Bacteriana

1) ¿Cómo esperaría que fuera la transferencia hereda-ble del gen lac+ en cruzamientos entre cepas donoras de E. coli lac

+ a) Hfr, b) F+ y c) F'lac con cepas re-

ceptoras F- lac

- incapaces de recombinar (rec

-)? Justi-

fique su respuesta Respuesta: El único cruzamiento capaz de transferir el gen lac+ en forma heredable es aquel en el que in-terviene la donora c) F'lac debido a que el gen lac+ forma parte del plásmido transferido que no requiere de recombinación (entrecruzamiento) para mantenerse establemente en la célula receptora.. La cepa b) es capaz de transferir lac+ pero la cepa re-ceptora requiere de las funciones de recombinación homóloga para que se produzca el reemplazo alélico (entrecruzamiento) para integrar establemente el gen recibido. Como el segmento transferido es inestable (es lineal, no puede replicarse correctamente y es sus-ceptible a degradación por nucleasasas) termina per-diéndose. La cepa a) F+ sólo puede transferir lac+ con muy baja frecuencia si en alguna de sus células el factor F se integra previamente al cromosoma principal (esas po-cas células se convertirían en “Hfr”). Sin embargo, tendrá el mismo problema que la cepa b). 2) Se realizaron experimentos de conjugación inte-rrumpida entre cepas Hfr Amp

S leu

+mal

+trp

+ y F

-

AmpR leu

-mal

-trp

-. Los resultados se exponen en la

siguiente figura: (mal: capacidad de metabolizar la maltosa)

1) ¿Por qué los recombinantes para leu y mal aparecen

con mayor número de recombinantes? 2) Explique en qué medios se hicieron crecer las bacterias para analizar su genotipo, y qué tipo de bacterias (qué genotipo) crece en cada uno.

3) ¿A qué distancia del ori de transferencia mapea el gen que codifica para trp? Y los que codifican para leu y mal? 4) ¿Qué experimento haría para determinar el orden entre leu y mal? 5) Dibuje, indicando Origen de transferencia y termi-nación, el modo en que el plásmido F se integró al cromosoma bacteriano y dio origen a esta HFR. 6) ¿Qué tipo de recombinación ocurre para que las bacterias leu

- pasen a ser leu

+? ¿Qué tipo de recom-

binación ocurre cuando el plásmido F se integra en el cromosoma bacteriano? Rta: 1) Porque al estar más cerca del origen de trans-ferencia pasan antes y le dan menos tiempo a las bac-terias conjugantes a que se separen espontáneamente e interrumpan la transferencia. 2) MM + ampicilina + los 2 aac que no se analizan en cada caso F

- Amp

R aac

+ donde aac

+ es leu

+, mal

+ (que

en realidad no es un aminoácido) o trp+, respectiva-

mente. Para los otros 2 genes cuyos aa están presentes en el medio, los genotipos pueden ser + o -. Por ej, en el primer caso el genotipo es F

-Amp

Rleu

+mal

+/-trp

+/-

3) 10’, 5’ 4) una prueba de recombinación equivalente a una prueba de 3 puntos con los 3 marcadores de este expe-rimento. 5) Dibujito 3) Un tema de interés para la medicina humana y vete-rinaria es el desarrollo de vacunas más confiables. En el caso de la brucelosis (que es una zoonosis, es decir, enferma a animales y a humanos) se desarrollaron va-cunas para el ganado vacuno que consisten en bacte-rias vivas atenuadas por diferentes procedimientos de cultivo. En este contexto, en la Argentina se utiliza la cepa S19 que tiene algunos problemas porque no está suficientemente atenuada. Con el advenimiento de la ingeniería genética se pudieron caracterizar genes co-mo el bp26 y el bmp18 que, al ser mutados, práctica-mente eliminan la virulencia, tal como lo publican Campos y col (Veterinary Microbiology, 2002). En un trabajo previo, lo demostraron mediante el desarrollo de mutantes knock-out para ambos genes. a) Indique una estrategia de cómo hubiese obtenido Ud. esta mutante knock-out. Utilice exclusivamente esquemas para su respuesta Debido a que no resulta deseable la liberación de or-ganismos modificados genéticamente conteniendo genes de resistencia a antibióticos (y menos si éstos son patogénicos), para la construcción de la cepa mu-tante vacunal Δbp26::luc Δbmp18 (Δ simboliza dele-ción y :: simboliza inserción y que bautizaron IN-TA2) usaron una técnica de contraselección (ver Figu-ra).

Aclaraciones: El gen sacB (de Bacillus subtilis) codi-fica para una levansacarasa que metaboliza la sacarosa en un levano que es tóxico para Brucella. Es decir que las bacterias que contienen este gen se mueren cuando se agrega sacarosa al medio de cultivo. a y b señalan secuencias homólogas (probables sitios de entrecru-zamiento). El gen luc codifica para la luciferasa de luciérnaga, los genes Ap

R y Kn

R para resistencia a

ampicilina y kanamicina, respectivamente. En varios de los genes se especifican, con flechas, oligonucleó-

14

tidos diseñados para PCR y el tamaño del fragmento de amplificación esperado.

b) ¿Qué función específica cumplen los siguientes genes marcadores en el esquema de obtención de la cepa vacunal? i) Ap

R y Kn

R (2 ptos); ii) luc (2 ptos); iii) sacB

c) ¿Porqué se usaron plásmidos suicidas? d) Diseñe un sistema molecular de detección para dis-tinguir los 5 genotipos posibles entre sí. Explíquelo. e) Un punto importante en cualquier campaña de erra-dicación de enfermedades como la brucelosis es poder distinguir animales vacunados de infectados en forma sencilla, barata y masiva. Tradicionalmente, el dia-gnóstico se realiza mediante la detección de anticuer-pos anti-Brucella en sangre porque la bacteria es muy difícil de detectar y no resulta sencillo diferenciar en-tre los animales que tienen estos anticuerpos debido a que estuvieron infectados o porque fueron vacunados. ¿Qué solución le parece que proponen los diseñadores de esta vacuna? Respuestas: a) Se podría usar el mismo esquema del enunciado (parte izquierda) reemplazando el gen luc por un gen de resistencia a antibiótico (por ej. a Tetra-ciclina) y manteniendo el gen de resistencia a kanami-cina (o SacB) para seleccionar el doble recombinante. b) i) Suponiendo que se quiera ir paso a paso (como sugiere el flujo de esquemas) y seleccionar primero el cointegrado (construcción 2) y recién después el doble recombinante (construcción 3): Kn

R serviría para se-

leccionar en un medio conteniendo kanamicina (en

ausencia de sacarosa). En un segundo paso, se pa-sarían las bacterias a un medio conteniendo sacarosa,

en ausencia de kanamicina. [De hecho, esto fue lo que hicieron los autores del trabajo]. Lo mismo con Ap

R para el gen bmp18.

Otra respuesta correcta: Suponiendo que se qui-siera seleccionar directamente la construcción 3, sin pasar por la construcción 2 (doble recombinan-te directo), Kn

R no tiene función alguna en el ex-

perimento del problema. Al utilizarse el sistema de contraselección basado en SacB podría no estar presente, sin afectar con su ausencia el resultado. En este caso, su única función es ser un marcador selectivo en E. coli (otorga al plásmido una ventaja selectiva que ayuda a mantenerlo, evitando su pérdida, durante su multiplicación en E. coli). En el caso del segundo plásmido conteniendo Ap

R,

esta aproximación es mucho más difícil (aunque no imposible) porque no tengo un gen indicador y sólo puedo distinguir dobles recombinantes (cons-trucción 5) de salvajes (construcción 3) mediante PCR de las colonias, por ej. ii) Este gen sirve para distinguir las mutantes “knock out” para el gen bp2 que quiero seleccio-nar (construcción 3) de las revertantes salvajes (construcción 1), dado que ambas sobreviven en el medio conteniendo sacarosa. iii) Como dice el enunciado, este gen sirve para contraseleccionar (seleccionar en forma negativa) las construcciones 2 y 4 en presencia de sacarosa. c) Básicamente, el que el plásmido sea suicida me permite seleccionar más eficientemente al recom-binante. Suponiendo que la selección de las cons-trucciones se hizo paso a paso [como se explica en “b) i)”], si el plásmido replicara en Brucella, la

selección en presencia de kanamicina solo me daría muchísimas bacterias con el plásmido sin integrar y me sería extremadamente dificultoso aislar el recom-binante (construc. 2) por su baja probabilidad de ocu-rrencia. Ahora, suponiendo la alternativa de selección directa del doble recombinante [como se explica en “otra res-puesta correcta” en “b) i)”], el primer plásmido podría no ser suicida, porque sería seleccionado en forma negativa en presencia de sacarosa. d) Por PCR usando los primers flanqueantes de los genes. Las construcciones 1, 3 y 5 darían una sola banda por primer (total 2 bandas), a saber 696 + 990 en 1, 1837 + 990 en 3 y 1837 + 694 en 5. Los cointe-grados darían 2 bandas, para el par de primers p26 en 2 o para el par de primers p18 en 4. En total 3 bandas. También se considerarán correctas respuestas con otras variantes (detección de fluorescencia en lugar de la banda de 1837 combinada con PCR de los otros genes; RFLPs usando bp26 y bmp18 como sondas, detección de las proteínas codificadas mediante Wes-tern, etc.), siempre y cuando la respuesta permita dife-renciar claramente los 5 genotipos. e) La presencia de anticuerpos anti-luciferasa diferen-cian animales vacunados con esta cepa respecto de los que se infectaron con una cepa salvaje no recombinan-

S19

B B B1 N

INTA2

2

p26f p26r p18f p18r 990 bp 696 bp

KnR

B B

luc

a b

p26f p26r p18f p18r 990 bp 1837 bp

B

1

N

sacB

ApR

bmp18

a b

p26f p26r p18f p18r 694 bp 1837 bp

Integración del plásmido suicida

Selección con sacarosa

Integración del plásmido suicida

Selección con sacarosa

bmp18

bmp18 bp26

bmp18

bmp18

bmp18

bmp18

bp26

luc bp26

luc

luc

luc

sacB

sacB

sac

B

KnR

ApR

pKS26L

pSD18

+

+

/

/

/

/

/

/

/

/

/

/

Primer evento

de entrecruza-

miento

Primer evento

de entrecruza-

miento

Segundo evento

de entrecruza-

miento

Segundo evento

de entrecruza-

miento

1

3

4

5

15

F

his

te. La ausencia (versus presencia) de anticuerpos con-tra bp26 y bmp18, es otra variante de la respuesta. También se considerará correcta (con la mitad de la nota = 2,5 ptos) la respuesta que proponga el aisla-miento de bacterias del animal, las cuales deberían no ser fluorescentes en presencia de luciferina en el caso de la cepa de campo y ser fluorescentes en el caso de la cepa vacunal. Idem si la técnica seleccionada es una PCR. En la realidad, esta última variante no es practi-cable, porque la cepa vacunal sobrevive muy poco a las defensas del animal y resulta lento, peligroso y poco práctico el aislamiento de bacterias patogénicas. 4) Bacterias de una cepa de E. coli Hfr rec

+ bio

+ his+

StrS son mezcladas junto a bacterias de otra cepa de E.

coli F- rec

+ bio

- his

- Str

R. A diferentes tiempos, se

inter-rumpieron las conjugaciones, se plaqueó en los siguientes medios selectivos (todos conteniendo Str) y al día siguiente se contó el N° de colonias. (MM = medio mínimo)

a) El experimento anterior se aprovechó para mapear los genes involucrados en la síntesis de biotina. Ubique en el mapa genético el gen bio. Se aclara la posición donde está integrada la secuencia del plásmido F en esta cepa Hfr, y además la del gen his, previamente mapeado. b) Un amigo suyo, estudiante de Biología, le cuenta que hizo un experimento de conjugación -mientras miraba videoclips de Britney Spears- con una cepa Hfr diferente a la anterior, la cual, al conjugar con la misma F

- que en el

experimento anterior, le transfiere el gen his a los 20 min y el gen bio a los 40 min. ¿Le creería a su amigo o pensaría que se distrajo mientras hacía los experimentos? c) Un fago que hace transducción generalizada puede encapsidar fragmentos de DNA genómico de una cepa bacteriana infectada y lisada que tengan un tamaño de hasta 30.000 pb. Si ese fago es usado para infectar una cepa de E. coli salvaje, y el lisado resultante es usado, a baja multiplicidad de infección, para infectar a la F

- mencionada antes. ¿Esperaría

observar colonias en MM? Justifique (1 min equivale a 20 kpb aprox) e) ¿Usaría Ud. la cepa F

- en MM para testear la muta-

genicidad de una sustancia en un test de Ames? R a) El gen bio entra a los 10’ y el his a los 30’, por lo tanto el gen bio se encuentra a 1/3 de la distancia entre F e his. b) Le creo, seguramente tiene un Hfr distinto con el F integrado apuntando al revés y en otra posi-ción. Nótese que la distancia entre his y bio es de 20’

(igual que en este experimento). c) No, están dema-siado lejos para ser cotransducidos. d) No, porque es una doble auxótrofa y por lo tanto requiero de la mu-tación (reversión) simultánea de al menos 2 bases dis-tintas y cuya reversión no necesariamente requieren del mismo mecanismo de mutación Respuesta alter-nativa que, en caso de aparecer, debe ser considerada correcta: Sí, si utilizo MM+ bio (o MM+ arg). 4) Un investigador está interesado en mapear y estu-diar 3 genes a, b y c involucrados en la biosíntesis de aminoácidos. Se sabe que los productos de los genes a, b y c catalizan las siguientes reacciones: Leu Ile

A C

X

B

Val

donde X es un compuesto que puede ser sintetizado por ambas cepas de bacteria creciendo en un medio mínimo (MM). Para realizar el estudio dispone de 2 cepas de bacterias: Hfr a

+b

+c

+ Str

S y otra F

- a

- b

- c

- Str

R

con las cuales realizó un experimento de conjugación interrumpida obteniendo los siguientes resultados:

a) ¿En qué medios se seleccionaron cada uno de los genotipos de bacterias del gráfico anterior? b) ¿A qué distancia del origen de transferencia de la cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c? c) Grafique y explique los resultados que hubiera te-nido en el experimento de conjugación interrumpida si el genotipo de la cepa dadora hubiese sido: i) Hfr a

+b

+c

+ Str

R

ii) F+ a

+b

+c

+ Str

S

iii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr se encontrara entre el gen b y el c. El hecho de que a y b mapearan juntos y formaran parte de una misma vía metabólica le sugirieron al investigador que a y b pertenecen a un mismo operón. Con el objeto de estudiar esta posibilidad realizó el siguiente experimento: A) Se digirió ADN genómico de una cepa salvaje con

la ER Alu I (de corte frecuente) en cantidades limitan-

tes. Luego los fragmentos se ligaron en uno de los

vectores que se muestran. B) Luego se transformaron bacterias a

- b

- c

+ Amp

S con

uno de los vectores y se plaquearon las bacterias transformantes en ágar + MM + ampicilina + un ami-noácido. Cada una de las colonias que crecieron en estas placas fueron luego cultivadas en ágar + MM + ampicilina obteniéndose los siguientes resultados:

Tiempo Nº de colonias en (min) MM MM+bio MM+his MM+bio+his

5 0 0 0 503 10 0 0 34 487

15 0 0 44 499 20 0 0 50 503 25 0 0 59 498 30 20 30 80 501

4 8 12 16 20 24 t (min)

Nº

reco

mb

inan

tes

c+ StrR

a+ StrR

b+ StrR

4 8 12 16 20 24 t (min)

Nº

reco

mb

inan

tes

c+ StrR

a+ StrR

b+ StrR

16

Vector 1: Todas las bacterias que crecieron en MM+Amp+Leu crecieron también en MM+Amp. -De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val el 60% crecieron en MM+Amp. Vector 2: De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Leu+Lac, el 55% crecieron en MM+Amp +Lac.

-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val+ Lac, el 50% crecieron en MM+Amp+Lac. d) ¿Cuáles son los genotipos de las bacterias que cre-cen en cada uno de los 3 medios? e) ¿Cómo interpreta los resultados de este experimen-to? Demuestre que estos resultados son compatibles con la hipótesis de que a y b están en el mismo operón. f) ¿Cuál de los genes está más cerca del promotor: a o b? Justifique. g) ¿Cómo haría, utilizando la técnica de PCR, para demostrar que a y b pertenecen al mismo operón? In-dique los resultados esperados tanto si a y b forman parte de un operón como si se transcriben indepen-dientemente. Respuesta a) a+ StrR = MM + Str + Val + Ile b+ StrR = MM + Str + Leu + Ile c+ StrR = MM + Str + Leu + Val b) a y b mapean a 12 min del OriT y C mapea a 6 min. c) i) Se hubieran seleccionado a las bacterias dadoras por lo que no hubiera habido diferencias entre los dis-tintos medios ni tampoco entre los distintos tiempos. ii) Se hubieran obtenido muy pocas recombinantes (aquellas en las que el plásmido F+ se hubiera incor-porado en la cepa dadora y luego los marcadores a, b o c se hubieran transferido a la cepa aceptora). iii) Dependiendo de la orientación del OriT hay dos posibilidades: -que a y b salgan primero y bastante tiempo después salga c -que c salga primero y bastan-te tiempo después salgan a y b. En el gráfico tienen que quedar claro esto, y además que la frecuencia de recombinantes para los genes que salen primero debe ser bastante mayor que la de los genes que salen al final. d) MM+Amp+Leu = a- b+ AmpR y a+ b+ AmpR. Es decir, b+ AmpR MM+Amp+Val = a+ b- AmpR y a+ b+ AmpR. Es decir, a+ AmpR MM+Amp = a+ b+ AmpR La lactosa no importa, sólo se usa para inducir la ex-presión mediada por el promotor lac.

e) De las bacterias transformadas con el vector 1 todas las bacterias b+ también eran a+, pero sólo el 60% de las a+ eran b+. En cuanto a las bacterias transformadas con el vector 2 el 55% de las bacterias b+ también eran a+, y el 50% de las a+ eran también b+. La diferencia en los resultados obtenidos con ambos vectores radica en que el vector 1 no contiene un pro-motor por lo que la expresión de los transgenes se dará solo si vienen acompañados de su promotor. El hecho de que todas las bacterias b+ sean también a+ nos indica que b se transcribe utilizando el promotor de a sugiriendo que a y b forman parte de un operón. En el caso del vector 2 dado que aporta un promotor (y éste está encendido debido a la lactosa) sí se obtie-nen bacterias a-b+. f) Dado que, cuando se transformó con el vector 1, no se obtienen bacterias a-b+ pero sí a+b- esto nos sugie-re que no se necesita que se transcriba b para que se transcriba a (pero sí al revés). Esto indicaría que a se encuentra más próximo al promotor que b. g) RT-PCR usando primers de la región 5´ del gen a y de la región 3´ del gen b. Si amplifico es porque hay transcriptos que contienen al gen a y al b. Hay otras posibilidades que se evaluarán caso por caso… 5) Se realiza un experimento de transformación con una cepa bacteriana donante re-sistente a cuatro antibióti-cos: A, B, C y D. La cepa receptora es sensible a las cuatro drogas. La población de células receptoras tratada se divide y se siembra en placas de medios suplemen-tados con varias combina-ciones de las drogas. Los resultados fueron: a) Uno de los genes está cla-ramente alejado de los otros tres, los cuales parecen estar estrechamente ligados. ¿Cuál es el gen distante? b) ¿Cuál es el orden de los tres marcadores que están ligados? Rta: a) B es el gen distante; b) A D C. 1) El Dr. Watson está estudiando un fago temperado descubierto en su laboratorio (P26) con el objeto de determinar si durante el ciclo lisogénico éste se inserta en el cromosoma bacteriano, y si lo hace en qué sitio. Para ello infecta una cepa Hfr salvaje Amp

S Str

S con

un fago deficiente en el cual se ha reemplazado al gen X (esencial para que el fago entre en ciclo lítico, pero no para que entre en ciclo lisogénico) por un gen de resistencia a ampicilina bajo el control del promotor Lac (con su región operadora). a) ¿En qué medio de cultivo selecciona a las bacte-

rias Hfr que presentan el fago? Luego de seleccionar en medio sólido 15 clones Hfr lisogénicos y con el objetivo de determinar si el fago defectivo está integrado en el cromosoma y en qué sito lo hace, conjuga, por separado, a cada Hfr lisogé-

Antibióticos Nº colonias

A 1.156

B 1.148

C 1.161

D 1.139

AB 46

AC 640

AD 942

BC 51

BD 40

CD 786

ABC 30

ABD 42

ACD 630

BCD 36

ABCD 30

Total 7.877

Alu I Alu IP

AmpR AmpR

Vector 1 Vector 2

Alu I Alu IP

AmpR AmpR

Vector 1 Vector 2

P = promotor del operón

lac

17

nica con una cepa F- gal- leu- arg- AmpS Str

R obte-

niendo, en todos los casos, el mismo resultado: b) ¿En qué medios seleccionó a cada uno de los ge-

notipos? c) En base a los resultados obtenidos, ¿cuál de las

siguientes opciones es la correcta? - el fago no se integra en el cromosoma bacte-

riano (queda como episoma) - el fago se integra al cromosoma en un único

sitio - el fago puede integrarse en varios sitios del

cromosoma bacteriano Justifique su elección y por qué descarta las de-más.

Otro investigador, intentó reproducir estos experimen-tos con una cepa Hfr de su laboratorio y el mismo fa-go defectivo que solicitó al Dr. Watson. Sin embargo, en este caso el marcador Amp

R mapeó a 10 min del

origen de transferencia. d) ¿Le parece que esto contradice necesariamente los resultados del Dr. Watson y su respuesta de la pregunta c?

Nota: Las bacterias gal- no pueden utilizar galactosa como fuente de carbono y energía, las bacterias leu- y las arg- no pueden sintetizar los aminoácidos leucina y arginina respectivamente. R: a) Debe seleccionarlas en medio mínimo, sin glu-cosa (para que no haya represión catabólica) y con IPTG o lactosa para inducir al operón lac y que se ex-prese el gen de resistencia a ampicilina. El medio debe tener además ampicilina para matar a todas las bacte-rias que no posean el fago. b) Gal +: MM + gal + arg + leu + Streptomicina Leu +: MM + glu + arg + Streptomicina Arg+: MM + glu + leu + Streptomicina AmpR: MM + lac + leu + arg + Ampicilina + Strep-tomicina (ojo que la fuente de carbono debe ser lacto-sa y no glucosa, por un lado para inducir al operón y por el otro para que no haya represión catabólica) c) Si el fago P26 no se integrara al cromosoma de la Hfr y quedara como episoma no sería transferido a la cepa F- en el experimento de conjugación interrupida y por ende no se detectaría bacterias AmpR (recordar que el gen de resistencia a ampicilina está dentro del genoma del fago). Además podemos decir que el fago se integra en un único lugar del genoma porque en los 15 clones de Hfr lisogénicas generadas el marcador AmpR entró en el mismo tiempo. d) No contradice los resultados del Dr. Watson ni las conclusiones sacadas ya que, al ser una cepa Hfr dis-tinta el origen de transferencia puede estar ubicado

más cerca (o más lejos) del sitio de integración del fago. Lo que sí debería ocurrir, es que en todos los clones el gen de resistencia a ampicilina mapee cerca del gen leu.

Mutagénesis y Transposición

1) En levaduras, el tratamiento con mutágenos permi-tió seleccionar, en forma independiente, varios tipos de mutantes auxótrofas incapaces de utilizar galactosa como nutriente. El mapeo de las mutaciones respon-sables de esta característica permitió clasificarlas en 2 grupos de ligamiento distintos (mendelianamente in-dependientes). a) ¿Significa este resultado que los genes involucrados se encuentran en 2 cromosomas distintos? ¿Por qué? b) ¿Cuál será el fenotipo resultante del diploide resul-tado del cruzamiento entre mutantes (haploides) per-tenecientes a distintos grupos de ligamiento? ¿Por qué? c) ¿Cómo serán las proporciones fenotípicas de las levaduras (haploides) derivadas de las ascosporas una vez producida la meiosis? d) ¿Qué clase de mutagénesis es la más apropiada pa-ra este tipo de experimentos? ¿la producida por radia-ción (gamma) o por algún compuesto químico como el EMS o la nitrosoguanidina? Justifique muy breve-mente. Respuesta: a) En principio sí, los grupos de ligamien-to pueden comprender y extenderse más allá de 50 u de recombinación y pertenecer al mismo cromosoma [es decir, si bien 2 genes o marcadores pueden com-portarse mendelianamente como independientes por estar a más de 50 unidades de mapa, a través de otros marcadores o genes intermedios puedo incluirlos a ambos en el mismo grupo de ligamiento = cromoso-ma. Sin embargo pueden existir 2 grupos de ligamien-to pertenecientes al mismo cromosoma si no tengo la suerte de encontrar marcadores o genes intermedios]. b) Protótrofa. Por complementación. [Si a es el alelo mutante de A y b de B: Ab x aB AaBb fenotipo salvaje] c) 3 a 1, auxótrofas a protótrofas [¼ ab, ¼ Ab, ¼ aB vs ¼ AB] d) Usualmente se utiliza algún mutágeno químico (como EMS o nitrosoguanidina) que producen muta-ciones puntuales y se pueden dosificar más fácilmen-te. La radiación produce rupturas, deleciones y re-arreglos cromosómicos groseros, por lo que sería me-nos conveniente. 2) Se estudia el efecto de 2 conocidos mutágenos en levaduras: el etil metanosulfonato (EMS) y el bromu-ro de etidio (EtBr) observando la frecuencia de apari-ción de petites (levaduras que forman colonias de cre-cimiento mucho más lento que las normales o gran-des, debido a un malfuncionamiento del sistema de fosforilación oxidativa). A primera vista, los resulta-dos parecen similares ya que ambos mutágenos indu-cen una abundante aparición de mutantes. Sin embar-go, más del 99% de las mutantes obtenidas con EMS, segregaban en una proporción mendeliana de 50% grandes a 50% petites, al ser cruzadas con levaduras salvajes (grandes). Nota: recordar que las levaduras

Nº

de

re

com

b

t(min)10 20 30 40 50 60

Gal+

AmpR

Leu+

arg+

Nº

de

re

com

b

t(min)10 20 30 40 50 60

Gal+

AmpR

Leu+

arg+

18

son usualmente haploides y que los fenotipos descrip-tos se refieren a lo observado con ese nivel de ploidía. En cambio, más del 90% de las mutantes obtenidas con EtBr “segregaban” 100% de petites o 100% de grandes. Es decir, a pesar de tener un parental petite y un parental grande, la progenie era toda petite o toda grande. ¿Cómo se explican estos resultados? Solución: el EMS afecta, fundamentalmente a genes nucleares (que pueden afectar a las funciones mito-condriales para resultar en un fenotipo petite -no reali-zan fosforilación oxidativa- porque éstas importan ciertas proteínas codificadas en el núcleo) y el EtBr tiene mayor especificidad por los genes mitocondria-les que se heredan uniparentalmente. 3) En un estudio sobre mutaciones inestables de maíz, un investigador propuso los siguientes genotipos para dos plantas distintas de esta especie: I) C/cd

; Ac

+/Ac

-

II) C/ca ; Ac- /Ac

-

C: alelo silvestre que permite la expresión del color del grano; cd: es un alelo inestable producto de la in-serción de un elemento móvil no autónomo Ds que inactiva la expresión del gen. ca: es un alelo inestable producto de la inserción de un elemento móvil Ac autónomo que inactiva la expresión del gen. Ac

+ pre-

sencia/ Ac-

ausencia del elemento móvil (atención que esta nomenclatura es distinta a la empleada en algunos libros de texto). Se realizaron los siguientes cruzamientos: a) plantas con genotipos I y II se cruzaron con plantas c/c; Ac

- /Ac

-, en donde el alelo

c representa una forma

mutante incolora, producto de una sustitución de ba-ses. b) planta con genotipo I) se cruzó con planta con ge-notipo II). ¿Qué fenotipos y en qué proporciones aparecerán en la descendencia de los cruzamientos a) y b)? NOTA: Asumir que Ac y C no están ligados, y que la frecuen-cia de rupturas cromosómicas es despreciable. Respuesta: a) I) ½ púrpuras, ¼ blancas, ¼ mosaico II) ½ púrpuras, ½ mosaico; b) ¾ púrpuras, ¼ mosai-cos [Todos los genotipos C_, homo- o heterocigotas, son púrpuras; la probabilidad de que un transposón (por ej. del locus Ac) justo vaya a insertarse en un lo-cus específico del genoma es extremadamente baja. Todos los genotipos “dobles” recesivos (conteniendo c, cd o ca) son mosaicos si está ca_ o cd_, Ac+_] 4) Se confeccionaron varios mutantes del Tn5 me-

diante ingeniería genética. El mapa y el fenotipo se

muestra más abajo: grafica una deleción del

DNA entre los extremos de la llave. grafica

un fragmento de 800 pb de DNA foráneo que se in-

sertó en la posición O. Las capacidades del mutante de

transponerse y de resistir a neomicina (NeoR) se indi-

can a la derecha de cada mutante. WT significa wild

type (normal o salvaje). y indican

las regiones repetidas invertidas (IR) del Tn5. NOTA:

Para su respuesta suponga que entre los valores de la

tabla 90 y 100 o entre 0 y 0,5 no existen diferencias

estadísticamente significativas.

¿Qué conclusiones puede sacar acerca de:

a) la(s) region(es) requerida(s) para la transposición y

region(es) no requeridas?

b) ¿Por qué estos resultados son inesperados y se con-

tradicen con lo que Ud. aprendió en la materia?

c) la(s) regio(es) requeridas para NeoR?

Solución: a) Para la transposición: completo,

sólo el extremo izquierdo (aquella parte

afectada en la mutante 135). b) Porque hubiera espe-

rado que TODO el hubiera sido imprescindi-

ble para la transposición. c) El gen NeoR (completo o

su extremo 5’) está ubicado en algún lugar entre el

extremo derecho de y su región derecha ad-

yacente (es decir, parte o todo el fragmento afectado

por la deleción en la mutante 138). [Con los datos su-

ministrados no puedo afirmar que TODO el gen NeoR

esté en ese segmento. Tampoco puede concluirse, con

estos datos, que haya una superposición entre parte

del gen y el IR izquierdo, pero resulta altamente sos-

pechoso. Para confirmarlo, deberían hacerse mutacio-

nes dirigidas usando deleciones más pequeñas o susti-

tuciones nucleotídicas puntuales].

5) En un trabajo reciente (Mol Gen Genomics, 2006,

275: 231-241) un grupo japonés estudia la coloración

de las flores en Gentiana scabra, una planta ornamen-

tal muy difundida en Japón. Para ello analizan tres

cultivares de G. scabra: cv. Momokorin (flores rosa-

das), la línea mejorada 13-98 (flores rosadas) y el cv.

Alta (flores azules); y G. triflora cv. Macyri (flores

azules). Primero, miden la acumulación de antociani-

nas mediante HPLC de extractos obtenidos de los

pétalos de las flores. Los perfiles de HPLC obtenidos

fueron los siguientes:

a y d) cv. Alta: dos picos, uno mayor correspondiente

a delfinidina y otro menor a cianidina.

b,c y e,f) Línea 13-98 y cv. Momokorin: un único pico

correspondiente a cianidina

cepa

19

i) ¿Qué le indican estos resultados en cuanto a la de-

terminación bioquímica del color de las flores?

La enzima clave en la biosíntesis de delfinidina es la flavonoidil 3’5’-hidroxilasa (F3’5’H) que cataliza la hidroxilación en 5’ del anillo B del esqueleto de la antocianina. La expresión génica de esta enzima se mues-tra en la siguien-te figura: a) Análisis de Northern blot usando RNA total de pétalos de los tres culti-vares de G. sca-bra. La mem-brana fue hibri-dada con cada una de las son-das correspon-dientes a los genes F3’5’H y F3’H (codifica para una enzima que cataliza la hidroxilación en 3’ del anillo B de flavonoides). rRNA: control de cantidad de RNA ribosomal teñido con bromuro de etidio. b) Análisis de RT-PCR para amplificar el ORF de F3’5’H usando RNA total extraído de pétalos. Los números a la derecha indican los tamaños de los fragmentos amplificados. Nota: por 3’RACE amplifican transcriptos menores a 1,4 kb en la línea 13-98 c) Análisis de PCR para amplificar la secuencia genómica de F3’5’H con los iniciadores empleados para la RT-PCR. Los números a la derecha indican lo mismo que en b.

ii) ¿Cuál fue el objetivo de los experimentos mos-trados en a y b? iii) ¿Para qué se realizó la hibridación con F3’H? iv) ¿Qué explicación molecular podría dar a los cam-bios en el perfil de los transcriptos? A continuación, a partir de ADN genómico de las plantas amplifican fragmentos conteniendo el ORF F3’5’H (ver parte c de la figura anterior): v) ¿Cuál fue el objetivo de este experimento? vi) ¿Qué evidencian estos resultados? Los fragmentos de 4 kb y 3,3 kb fueron clonados y secuenciados. El fragmento de 4 kb de la línea 13-98 presentaba en el exón 1 una inserción (a la que llamaron dTgs1) cu-ya secuencia contenía un sitio blanco de duplicación (TSD) de 8 pb y repeticiones terminales invertidas (TIR) de 14 pb. La secuencia TIR presentaba una re-gión palíndromica imperfecta y exhibía similitud par-cial con un elemento dTph de petunia (el cual se sabe que es reconocido por la transposasa Ac). El fragmento de 3,3 kb del cv. Momokorin contenía una inserción en el exón 1, a la que denominaron GsTRIM. Esta secuencia presentaba repeticiones di-rectas terminales (TDR). Esta inserción no contenía secuencias que codificaran para alguna proteína. Asi-mismo, presentaba similitud con secuencias de Lotus japonicus, designadas LjTRIM. vii) ¿Qué le permiten confirmar estos datos de se-cuencia? ¿Cuál es entonces la explicación para los diferentes fenotipos observados? Como los elementos TRIM fueron identificados a par-tir de análisis de bases de datos de secuencias nucle-otídicas y mostraron la peculiaridad de estar conser-vados en distintas especies de plantas, realizaron un análisis filogenético empleando las secuencias TDR y usando los programas CLUSTAL W y TREEVIEW. El árbol obtenido se muestra a continuación:

vii) ¿Qué puede concluir del agrupamiento mostrado en el árbol? viii) Sugiera un experimento simple para analizar la existencia de los elementos dTgs1 y GsTRIM en el genoma de otras especies de Gentiana. Rta: Aclaración: Las gentianas rosadas vienen siendo obtenidas por mejoramiento a partir de mutaciones espontáneas a partir de gentianas azules, pero el/los mecanismo/s involucrado/s eran desconocido/s hasta el momento. i) Estos resultados indican que hay diferencias en la acumulación de las distintas antocianinas en ambas

20

A MA M

plantas (azules y rosadas), en particular, las plantas rosadas carecen de delfinidinas. Pero la acumulación de cianidinas es similar para ambas. ii) Como los autores saben que la F3’5’H es la enzima clave en la síntesis de delfinidina y viendo los resulta-dos anteriores, analizan si hay diferencias en cuanto a la expresión del gen para esta enzima entre los dos tipos de plantas y analizan si esto podría explicar los fenotipos observados. iii) La hibridación con F3’H es usada como control. Tanto en plantas azules como rosas se obtiene el mis-mo patrón de expresión. Es otra enzima involucrada en la síntesis de pigmentos pero que produce otro compuesto (que no tiene nada que ver con las delfini-dinas, si bien pertenece a la misma ruta biosintética). También prueban con otros genes relacionados con la síntesis de flavonoides y ven que exhiben los mismos patrones que la F3’H pero esto tampoco lo muestran en el trabajo original. iv) Los resultados evidencian que: No se observa transcripto de F3’5´H para la planta rosada, línea 13-98 tanto por Northern blot como por RT-PCR (Aclaración: los primers para esta RT levan-tan el ORF por completo, full length). Además se aclara que por 3´RACE obtienen fragmentos menores a 1,4 kb. Para la planta rosada cv. Momokorin, el transcripto de F3’5´H es de tamaño mayor que el observado para la planta azul cv. Alta (Northern). Por RT-PCR este cul-tivar muestra dos fragmentos de 1,3 y 2,1kb que difie-ren del de 1,6kb observado para la planta azul. En conclusión: ninguna de las plantas rosadas acumu-lan el transcripto de tamaño normal esperado (1,6kb) v) El objetivo de este experimento fue examinar la estructura del gen para F3’5´H en estas plantas a partir de amplificación sobre el ADN genómico de las mis-mas, para ver si existen diferencias que puedan expli-car los resultados a nivel de transcriptos. vi) Se obtienen fragmentos de amplificación de distin-to tamaño para las distintas plantas. Estos resultados muestran que el cv. Alta (azul) muestra un fragmento de 2,8kb mientras que para la línea 13-98 y el cv. Momokorin (rosadas) las bandas son 1,2 y 0,5kb mas grandes, respectivamente (sus tamaños eran 4 y 3,3 kb, respectivamente). Es probable que en el gen de las plantas rosadas haya alguna inserción. vii) Estos resultados, dadas las similitudes de las se-cuencias con elementos transponibles, evidencian que las inserciones observadas corresponderían a transpo-sones (dTgs1 y GsTRIM1). La explicación para los diferentes fenotipos observados es que estos transpo-sones interrumpen la secuencia del gen, resultando en transcriptos anormales (o ausencia de transcripto) que no permiten la síntesis de la enzima F3’5´H y por lo tanto no se sintetizan el pigmento que produce la colo-ración azul (delfinidina). vii) Los resultados claramente muestran que GsTRIM1

y LjTRIM se agrupan juntos y apartados del resto de

los TRIMs reportados previamente, indicando que

estos dos transposones son evolutivamente diferentes

de los otros elementos TRIM de plantas.

vii) Al inicio del problema, en el enunciado, se in-dica que también disponen de G. triflora cv. Macyri. Por lo tanto, el experimento sería hacer Southern blot de ésta conjuntamente con las 3 plantas analizadas de G. scabra e hibridar con dTgs1 y GsTRIM1 (Sout-herns separados, obviamente) y observar la aparición de muchas bandas (esto mostraría que, como la ma-yoría de este tipo de transposones, son miembros de una familia de alto número de copias, y que están dis-tribuidos por todo el genoma de Gentiana). 6) Un investigador está estudiando el mecanismo de transposición del transposón X de ratón. Para ello, partiendo de la secuencia salvaje del transposón, in-serta una construcción entre el gen pol y el LTR de la derecha, que contiene:

- al gen C, cuya expresión le confiere color marrón a los ratones. - el promotor del gen C interrumpido por un intrón haciéndolo no funcional Partiendo de ratones albinos, genera ratones trans-génicos heterocigotas para dicha construcción (es de-cir, los ratones tienen una sola copia del transposón recombinante). a) Detalle el fenotipo de dichos ratones en cuanto al color de piel y presencia o ausencia de manchas: i) si se trata de un retrotransposón, ii) si se trata de un transposón Justifique su respuesta. Los ratones resultaron albinos con algu-nas manchas marrones. A partir de biop-sias de piel, se extrajo ADN, se digirió con EcoRI y se realizó un Southern blot utilizando como sonda el cDNA de “pol”. b) Esquematice los resultados esperados del Southern si las biopsias se tomaron a partir de porciones albinas de la piel, y si se tomaron a partir de zonas marrones. Justifique. c) ¿Cómo explica el hecho de que algunas manchas marrones resultaron grandes y otras pequeñas? R) a) i) En aquellas células donde no ocurra transpo-sición el color de la piel será albino ya que al estar interrumpido el promotor de C y no ser funcional el gen C no se expresará. En caso de que se trate de un retrotransposón, este transposón pasará por un intermediario de RNA. En dicho intermediario podrá ocurrir el splicing del intrón de la construcción y al retrotranscribirse a DNA e in-tegrarse en algún lugar del genoma del ratón se rege-nerará el promotor de C. En aquellas células de la piel, derivadas de aquellas donde ocurrió la retrotransposi-ción, se expresará el gen C dado parches de color marrón. ii) En este caso el intrón no se eliminará nunca (ya que la maquinaria que elimina intrones los elimina del

pol LTR LTR C Intron

Promotor

EcoRI EcoRI

LTR LTR C Intron

Promotor

gag LTR LTR C Intron

Promotor

EcoRI EcoRI

21

RNA y no del DNA) por lo que el promotor nunca será funcional, aún cuando haya transposición. Por lo tanto los ratones deberían ser íntegramente albinos. b) En las zonas blancas de la piel no ocurrió transpo-sición por lo que debería ver una sóla banda corres-pondiente al tamaño del fragmento incluyendo el intrón. En las zonas marrones de la piel si ocurrió retrotrans-posición y se eliminó el intrón. Por este motivo deber-ía ver dos bandas una incluyendo el intrón (el retro-transposón original no se elimina) y otra sin el intrón. c) Las manchas grandes se deben a eventos de trans-posición que ocurrieron temprano en el desarrollo (y por ende dieron lugar a una porción grande de la piel) mientras que las manchas pequeñas se deben a even-tos de transposición que ocurrieron de forma más tard-ía. 7) NNK y NNN son nitrosaminas presentes en el ta-baco y en el humo de cigarrillo, conjuntamente con otros potentes carcinógenos y se sospecha que tienen un rol primario en el cáncer de pulmón, boca y otros sitios. Por otro lado, se cree que el té verde podría funcionar como quimioprotector, debido a la presen-cia de antioxidantes fenólicos que actuarían en los pasos dependientes de replicación que ayudan a fijar las mutaciones como parte del desarrollo oncogénico. Pressentin y col (2001) estudiaron genotoxicidad de NNK y NNN utilizando ratones transgénicos para lacZ (sistema Mutamouse) a los cuales suministraron NNN, NNK y/o té verde en el agua de bebida durante tiempos y condiciones controladas. Después de los tratamientos, extrajeron DNA de los órganos de in-terés, se lo empaquetó con un extracto con cápsides de fago λ y se infectaron bacterias, las cuales se plaquea-ron. Se investigaron, además de los órganos que des-arrollan cáncer con mayor frecuencia en fumadores, al hígado y al riñón porque se reportó que estos com-puestos son metabolizados y excretados por vía urina-ria en los fumadores (se sabe hace mucho que la orina de fumadores es mutagénica). En la figura 1 se cuanti-fican la cantidad de placas (playas de lisis) transparen-tes sobre el total (azules + transparentes).

Fig 1: Promedio de unidades formadoras de placa (pfu) para NNK, NNN y un control no tratado. Se gra-fican los desvíos estándar. Un asterisco simple impli-ca P < 0.05 usando el Mann–Whitney U-test versus el control correspondiente. El doble asterisco (**) de-nota P < 0.01. liver, hígado; lung, pulmón; O.T., te-jido oral; esoph., esófago; tongue, lengua; kidney, riñón; cont., control . a) ¿Qué ventajas (en términos temporales) tiene este método comparado, por ejemplo, con cuantificar el desarrollo de tumores en los ratones, si es esto último es lo que interesa en última instancia? b) En base a los resultados ¿diría que las nitrosaminas de tabaco son mutagénicas? ¿Por qué? c) Dado que la ingestión de agua sin nitrosaminas (control) resulta en valores significativamente distin-tos de cero ¿sospecharía que en el experimento hay algún otro mutágeno que no se está controlando o que es mutagénica el agua y que pueda afectar la validez del experimento? d) A partir de los resultados ¿Considera que existe especificidad de tejido o no? ¿Se condicen estos resul-tados con las evidencias epidemiológicas previas que indican que pulmón, esófago y boca son los que mues-tran mayor incidencia de carcinogénesis por efecto del cigarrillo? e) Una de las ventajas de este sistema de detección es que se puede aislar fácilmente DNA de las placas transparentes y secuenciarlo. ¿Qué información apor-taría esto último? Posteriormente, se realizaron experimentos suminis-trando una infusión de té verde, con los resultados que se muestran en la Fig 2:

Fig. 2. Igual que en la Fig. 1. Las diferencias denota-das por asteriscos son entre NNK y NNK+T. NNK+T: NNK + té verde. f) Indique y justifique si le recomendaría tomar té verde a un fumador (aunque no le guste) en vez de aconsejarle que deje de fumar. Respuestas: a) Porque esperar a que desarrollen tumores lleva, por lo menos, varias semanas. Este método es más rápido.

22

b) Sí, en todos los casos, salvo la NNK en lengua, porque los valores de PFU son significativamente di-ferentes a los controles. c) No necesariamente, porque estos valores pueden estar reflejando las frecuencias de mutación espontá-nea o basal. Aún en el caso de que hubiera otro mutá-geno adventicio, las diferencias son estadísticamente significativas, validando así el experimento. d) Sí, porque el órgano más afectado fue el hígado y los demás lo hicieron en menor grado. No, por lo an-tedicho. Podría especularse que existe un efecto dife-rencial por la vía de entrada. La vía de ingreso de las nitrosaminas (oral en vez de pulmonar) podría ser un causal de esta diferencia. Para demostrarlo, habría que suministrar las nitrosaminas por aspiración en una atmósfera de humo y comparar los resultados. e) Aportaría información sobre el mecanismo mole-cular de mutación (transiciones, transversiones, indels, etc) f) Las diferencias significativas indican que el té ver-de sería un quimioprotector en todos los tejidos eva-luados salvo en esófago y lengua. Sin embargo, no evita por completo la genotoxicidad en las condicio-nes ensayadas. Por lo tanto, no reemplaza el efecto benéfico de dejar de fumar. 8) Recientemente, un grupo de investigadores estudiaron los mecanismos de regulación del elemento transponible mariner, que está presente en genomas de invertebrados, hongos y humanos. Ellos obtuvieron un macho transgénico que tenía reemplazado un fragmento del gen white, localizado en el cromosoma X, por otro homólogo, pero interrumpido por un mariner cuya transposasa no era funcional. Esta variante de transposón con transposasa no funcional se denominó peach. El gen white codifica para un pigmento rojo del ojo y cuando está mutado por inserción, no se expresa y los ojos resultan blancos. Por sucesivas cruzas, se obtuvo una población de machos y hembras con todos sus cromosomas X conteniendo el gen white interrumpido por peach. Por otro lado, se logró una construcción denominada hsp, en la que el elemento mariner salvaje se puso bajo la regulación del promotor del gen de la proteína hsp70 (heat shock protein), que es inducible por calor. Esta segunda construcción se introdujo en uno de los cromosomas del par 2 de moscas transgénicas que ya eran peach, obteniéndose moscas hsp/+. Se realizaron cruzas entre moscas transgénicas peach, en las que uno de los parentales tenía 1 dosis de hsp (hsp/+) y el otro parental, ninguna (+/+) . Se contó el porcentaje de la progenie, criada a 25ºC (actividad basal de hsp) o a 37ºC (actividad inducida de hsp), que exhibía ojos rojos.

Genotipo del cromosoma 2 de los padres

Temp. % de progenie con ojos rojos

hsp/+ ; +/+ 25 8 37 17

hsp/+ ; hsp/+ 25 18 37 48

+/+ ; +/+ 25 1 37 2

Preguntas : a) Interprete los resultados numéricos b) ¿En qué etapa del desarrollo ocurren los eventos que dan a origen a la progenie con ojos rojos ? c) En este tipo de cruza también aparecen individuos con ojos blancos con manchas rojas (fenotipo mosaico). ¿Cómo justifica estos resultados? ¿En qué etapa del desarrollo ocurrieron los procesos que originaron los ojos mosaico? d)Las hembras mosaico presentan un mayor número de manchas rojas que los machos mosaico. ¿Cual es la causa ? Solución: Super familia mariner Tc1 IR IR

50-28 pb 1000 50-28 pb

trasposasa D. mauritiana: especie endémica hospedador de mari-ner: IR tr + IR mariner (wt) IR tr - IR peach

IR tr + IR hsp a) hsp/+ ; +/+ 25 ºC, 8%: actividad basal que induce la síntesis de tr, que actúa en trans sobre white interrumpido por pe-ach 37 ºC, 17%: idem, pero con promotor inducido 25 ºC: hsp/+; hsp/+ 37 ºC: 18% y 48%: análogo a la progenie de los otros parentales pero con doble dosis de tr y trasposasa. +/+ ; +/+ : valores basales en ausencia de tr. 1% puede ser casual, retromutación debería ser 0%. b) Durante el desarrollo del embrión, etapas tempra-nas c) Desarrollo embrionario, estado multicelular del de-sarrollo del ojo. La transposición que elimina a peach de white ocurrió varias veces. a) La doble dosis del X en las hembras duplica la probabilidad de la transposición respecto a los ma-chos, que tienen una sola dosis del X.

Alteraciones cromosómicas y cromosomas

1) El caballo (Equus caballus) tiene un complemento diploide de 64 cromosomas, de los cuales 36 que son acrocéntricos. El burro o asno (Equus asinus) tiene 62, de los cuales 22 son acrocéntricos. a) Indique el número (diploide) de cromosomas que tendrá el híbrido interespecífico (la mula) b) ¿A qué atribuye la usual esterilidad (incapacidad de producir gametas viables) de la mula? R: a) Las gametas de los caballos tendrán 32 cromo-somas (la mitad de 64) y las de los burros 31 32 +31 = 63 (¡el “2n” de la mula es impar!). b) A los problemas de apareamiento y segregación meiótica derivados de cromosomas tan disímiles y de número impar

23

2) Describa un ejemplo de alteración cromosómica estructural que afecte la fertilidad en individuos hete-rocigotas para la alteración. Justifique brevemente su respuesta. Respuesta: Cualquiera de los ejemplos de alteracio-nes estructurales que dio Liliana o figuran en los li-bros (translocaciones recíprocas, por ejemplo) que impliquen la formación de configuraciones meióticas como trivalentes, tetravalentes, etc. y que afecten la correcta migración de los cromosomas en la anafase meiótica. La inclusión de algún esquema reemplaza buena parte de la explicación. 3) Se desea localizar en qué cromosoma se localiza el locus para un marcador molecular de tipo codominan-te (microsatélite) ligado a un carácter de interés agronómico (QTL). La especie vegetal tiene un núme-ro diploide de 2n=10 cromosomas y se dispone de la serie monosómica completa. Se cruza una planta disómica homocigótica (muestra una banda de 200 pb) por cada uno de los diferentes monosómicos todos los cuales muestran una banda de 180 pb. Algunos de los descendientes muestran ambas bandas (200/180 pb) y otros sólo una (la de 200 pb). Las descendencias obtenidas se desglosan en la tabla clasificadas de acuerdo a su constitución cromosómica, es decir si poseen 9 cromosomas (es decir, monosómicas) o 10 cromosomas (disómicas, ver columna 1) y a su patrón de bandas (columnas 2 a 5):

Cromosoma en condición mo-

nosómica

Descendencia de los 5 cru-zamientos analizados

Disómicos Monosómicos

200/180 200 200/180 200

1 140 0 139 0

2 97 0 93 0

3 193 0 0 196

4 58 0 57 0

5 158 0 145 0

Explique los resultados obtenidos e indique en qué cromosoma se localiza el marcador molecular. Solución: Si el locus no está en un cromosoma cual-quiera de los que se encuentran en 2 copias (es decir no está en el monosómico) tendrá una segregación 1:1 mendeliana normal y todos sus descendientes serán heterocigotas 200/180. Si el locus está en el cromo-soma crítico lo que realmente estamos cruzando es 200/200 x 180, y de esta descendencia, los individuos con 9 cromosomas serán 200 y los de 10 cromosomas serán 200/180. Si observamos la tabla vemos que este razonamiento se compatibiliza con los resultados del cromosoma 3. Por ej. para el cromosoma 1: 200/200 x 180/180 todos 200/180 (sean mono- o disómicos) Para el cromosoma 3: 200/200 x ---/180 50% 200/180 (disómicos) y 50% ---/200 (monosómicos) 4) En una enferme-dad genética huma-na se observa la si-guiente conforma-ción cariotípica de los pares de cromo-somas 7 y 21 (notar las similitudes de

bandeo mostradas por las llaves). a) ¿Cual fue el origen de esta anomalía y qué nombre recibe? b) En caso de examinar la gametogénesis de este indi-viduo ¿esperaría observar alguna peculiaridad durante la meiosis? ¿Cuál? c) ¿Podría implicar una reducción en la fertilidad de las gametas? ¿Por qué? Respuesta: a) Translocación no recíproca) 7:21 b) Sí. Polivalentes formados entre el 7, el 21 y el 21 translocado c) Sí, como consecuencia de lo descripto en b) se afectaría la migración a los polos provocando aneu-ploidías capaces de inviabilizar las gametas 5) Un investigador trató con colchicina las famosas arvejas de Mendel y obtuvo los tetraploides corres-pondientes. Por otro lado, también introdujo un transgén proveniente del trigo que estabiliza una for-ma de herencia diploide evitando la formación de po-livalentes (por ej. tetravalentes) que puedan distorsio-nar la meiosis. Luego repitió los cruzamientos arvejas de flores blancas por arvejas de flores rojas. ¿Qué proporciones de plantas con flores blancas y rojas ob-tuvo en la F2? Describa los genotipos simplificados de dicha F2, de la F1 que le dio origen y de los parentales poliploides (usar guiones bajos para ejemplificar casos en que ambas variantes genotípicas resultan en fenoti-pos equivalentes) Respuesta más correcta: a) 15 a 1; P: AAAA x aaaa F1: AaAa F2. 15 A___ 1 aaaa o Respuesta menos correcta: b) si se interpreta que todos los bivalentes posibles se pueden formar (al azar) la frecuencia de individuos aaaa en la F2 es 1/ 36 (1:35) 6) En un reciente trabajo de Learmonth y colaborado-res se estudiaron los efectos a largo plazo de las artro-plastías (injerto o reemplazo de partes óseas por próte-sis metálicas) que generan debris (restos) en linfocitos de sangre periférica. Estos restos metálicos se suelen alojar en las adyacencias de la prótesis, ganglios linfá-ticos, hígado y páncreas. Para ello realizaron hibrida-ción in situ (FISH: preparados cromosómicos a los cuales hibridaron) con sondas específicas del cromo-soma 1 marcadas con un fluoróforo (rodamina) que lo tiñe específicamente de rojo, contrastando con el color azul del resto de los cromosomas (teñidos con DAPI). Observaron que cuando se utilizan prótesis con cro-mo-cobalto se observa un aumento de 3,5 veces de conformaciones cromosómicas del tipo de la figura 1 y 2,5 veces de las de la fig. 2 respecto a la utilización de prótesis de acero inoxidable. a) Defina el tipo de mutaciones cromosómicas estruc-turales y numéricas detectadas en las figs. 1 y 2. b) En el trabajo se hizo un especial esfuerzo para que el muestreo realizado se independizara de factores como el hábito de fumar, el número de radiografías, etc. ¿Por qué?

24

c) De acuerdo a lo que muestra este trabajo. En prin-cipio, las prótesis de cromo-cobalto inducen mutacio-nes ¿somáticas o germinales? Es decir, ¿podrían au-mentar la probabilidad de que se produzcan malfor-maciones genéticas en la descendencia de estos pa-cientes? d) En este trabajo solo se examinaron mutaciones de tipo estructural y no aquellas de tipo puntual? ¿Se le ocurre algún modelo experimental (no humano) para estudiar este aspecto. ¿Le serviría este modelo para contestar con más certeza la pregunta c)? Rta a) traslocación y aneuploidía (triploidía) del cro-mosoma 1 b) Porque son otros factores mutagénicos comproba-dos que también aumentan la tasa de mutaciones y podrían interactuar sinérgicamente (o no) con el factor que estoy estudiando. c) Somáticas. En principio, no. (los debris no se acu-mulan en tejidos reproductivos) d) Los sistemas basados en ratones transgénicos vistos en clase de problemas injertados con prótesis o inyec-tados con debris metálicos en sangre, analizando dis-tintos tejidos incluyendo el reproductivo. Pueden con-testar otros sistemas como pueden ser los de inter-cambio de cromátides hermanas (por ej) pero este sis-tema no detecta tan bien mutaciones puntuales sino las cromosómicas o el test de Ames pero no podrían examinar tejido reproductivo. 7) Un investigador está estudiando la genética de una especie de helecho denominado “Verdecitus bonitus, cultivada hace siglos por los indígenas del Amazonas. Le llama la atención que en una tribu (que llamaremos 1) todos los helechos son de hoja verde brillante (v1), de borde liso (b1) y textura aterciopelada (t1), mien-tras que en dos tribus del otro lado del río (que lla-maremos 2 y 3) los helechos son opacos (v2), de bor-de festoneado (b2) y textura ríspida (t2). Decide estu-diar si los helechos de las distintas tribus pertenecen realmente a la misma especie y cuál es la dominancia entre los rasgos. Al cruzar los helechos de la tribu 1 con los de las 2 obtiene una F1 integrada por helechos v1, b1 y t1 y sin problemas de fertilidad. Decide en-tonces que es válido considerarlas de la misma especie y decide mapear los loci estudiados. Analiza para ello 400 gametas producidas por la F1 y encuentra los si-guientes resultados:

v1b1t1 87 v2b2t2 79 v1b2t1 19

v2b1t2 21 v1b1t2 77 v2b2t1 80

v1b2t2 15 v2b1t1 22

a) Indique a qué conclusiones llegó el investigador. Detalle los genotipos en los cruzamientos realizados, la dominancia de los alelos y los resultados del ma-peo. Por otro lado, al cruzar los helechos de la tribu 1 con los de la tribu 3, suponiendo que iba a lograr los mis-mos resultados, se sorprendió al obtener otro resulta-do. La F1, fenotípicamente igual al parental de la tribu 1, presentó 300 gametas de los siguientes tipos: v1b1t1 141 v3b3t3

134 v1b3t3 14

v3b1t1 11

Al estudiar más detalladamente encontró que la F1 era menos fértil que sus padres (los helechos nativos de cada tribu presentaban una fertilidad similar) b) Explique todos los resultados obtenidos, realizando un esquema que muestre claramente qué se observaría en paquitene de la F1 y la ubicación relativa de los loci, con sus distancias. RESPUESTA a) Los helechos cultivados en tribus distintas son

homocigotas. Por lo tanto el cruzamiento es V1b1t1/v1b1t1 (tribu1) X v2b2t2/v2b2t2 (tribu 2). La F1 es heterocigota y vemos que los rasgos de la tribu 1 son todos dominantes. Al analizar las distan-cias llegamos a

VBT V-B V-T B-T CANTIDAD

111 P P P 87

222 P P P 79

121 R P R 19

212 R P R 21

112 P R R 77

221 P R R 80

122 R R P 15

211 R R P 22

VB: P= 323, R= 77 =>19,25 cM (20 es aceptable) VT: P=206, R= 194=> 48,5 No ligado BT: P=203, R= 197 =>49,25 No ligado VB están a 20 u.m., T está en otro cromosoma o en el mismo, pero muy alejado. b) Acá desaparecen fenotipos. Hay transtornos de fer-tilidad. Al analizar los resultados tenemos:

VBT V-B V-T B-T CANTIDAD

111 P P P 141

333 P P P 134

133 R R P 14

311 R R P 11

VB= P= 275 R=25 => 25/300 0,0833 (aprox 8,3 cM) VT todos parentales. BT mismo resultado Lo más probable es que haya ocurrido una transloca-ción. Entonces, lo que estamos midiendo (8,33cM) es la distancia entre V y el punto de la translocación. (F1 es heterocigota estructural) Es importante que expliquen que los trastornos de fer-tilidad se deben a que las gametas cuya segregación no es alterna no prosperan. Tienen que realizar el siguiente esquema y marcar que probablemente la distancia entre V y B siga siendo 20,

Fig. 1

Fig. 2

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pero la distancia entre V y el punto de translocación es 8,33 (V y B pueden ser intercambiables.) Si la translocación no ocurre “cortando” el espacio entre V y B no cambian las distancias entre ellos, que es lo que pasa en el problema. Por lo tanto, esas op-ciones se descaetan- Igualmente, las gametas resul-tantes de quiasmas entre B y la translocación o entre t y la translocación son desbalanceadas. Sólo las re-combinantes entre V y la translocación son completas.

Esas corresponden al 8,33- Este esquema es uno de los posibles, ya que no hace falta que los marcadores v y t estén en el mismo cro-mosoma, sólo es necesario que la translocación se dé entre esos dos cromosomas. Esta es otra opción:

Si plantearon que T está en un cromosoma distinto, la única opción es la translocación. La inversión entre V y B no modificaría a T, por lo tanto VT y BT seguir-ían dando no ligados. La fusión (los 3 cromosomas en el mismo cromoso-ma) no es una opción porque, si bien podría modificar

la distancia de T a los emás no modificaría la dis-tancia entre V y B. Por otro lado, tampoco es válida una deleción. Prime-ro, porque si no es muy grande no debería ocasionar transtornos en la fertilidad. Segundo porque aún si cambia la frec de recombinantes ebtre V y B no cam-biaría T, que seguiría estando no ligado. En el caso en que los tres loci estén en el mismo cro-mosoma (T bien lejano) sí es válido considerar que una de las tribus tiene invertido V-B respecto a la otra. En ese caso las gametas parentales y las recombinan-tes entre V y el punto de inversión son las únicas via-bles. 8) Usted trabaja en un hospital, en la división de Cito-genética. Dos familias con padres de fenotipos com-pletamente normales recurren a usted pues entre sus descendientes tienen una hija que presenta Síndrome de Down. Este síndrome se produce por tener 3 copias del cromosoma 21. Flia Madre Padre Hija enferma

1 46, XX 46, XY Down 2 45, XX, +T (14q. 21q) 46, XY Down a) ¿Cuál es el cariotipo de las hijas de cada familia? b) ¿Cómo es posible que la madre de la familia 2 ten-ga fenotipo normal? En la meiosis de la madre de la familia 2 se producen trivalentes y en la posterior segregación dos cromo-somas del trivalente, al azar, migran a un polo y el restante al otro. c) Para cada uno de los 3 casos descriptos indique en la meiosis de qué parental se produjo la falla y en qué fase de la misma. Mencione todas las posibilidades. d) Para cada familia indique si la probabilidad de te-ner otro hijo con Down es alta o baja. Justifique. Respuesta: a) Hija 1: 47, XX, +21 Hija 2: 46, XX, -14, +T (14q . 21q) b) El cromosoma 14 y el 21 son acrocéntricos por lo que en la fusión, con pérdida de los brazos cortos, po-siblemente se perdieron pocos genes. La madre de la familia 2 tiene 45 cromosomas: dos de cada par, un cromosoma 14, un cromosoma 21 y uno translocado. Salvo para los genes de los brazos cortos del 14 y el 21 hay 2 copias de cada gen. Los genes de los brazos cortos del 14 y 21 quedan en hemicigosis (están en las copias normales) pero si son pocos puede que el feno-tipo de la madre sea normal. c) Familia 1: Los padres tienen genotipo normal por lo que lo más probable es que no haya ocurrido disyun-ción para el cromosoma 21 en la anafase I o la anafase II durante la formación de gametas en el padre o en la madre. Familia 2: La madre presenta una fusión entre el cro-mosoma 14 y el 21. Como resultado de esto en meta-fase I se forma un trivalente por lo que en anafase I puede haber una segregación desbalanceada de cro-mosomas. d) Familia 1: La no disyunción es una falla que ocurre al azar por lo que, teniendo en cuenta factores de ries-go como edad de los padres, etc., la probabilidad de que tengan más hijos con el Síndrome de Down son

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bajas, o por lo menos similares a las de cualquier otra pareja. Flia 2: 1/6 de las gametas darán lugar a descendientes con Sín-drome de Down. Es decir tiene una alta pro-babilidad de tener otro descendiente Down (que en realidad dentro de los hijos nacidos vivos es más de 1/6 ya que los casos resaltados en rojo no son viables, y el último caso generalmente tampoco). 10) Cuando se cruzaron dos plantas pertenecientes al mismo género, pero de diferentes especies, los híbri-dos F1 presentaron mayor viabilidad y tuvieron más flores. Desgraciadamente, estos híbridos fueron estéri-les y sólo se pudieron propagar mediante injertos ve-getativos. Explique la esterilidad de los híbridos. Cómo podría el horticultor intentar anular la esterili-dad. Explique los resultados que obtendría. Rta. La esterilidad se debe a que, como son especies dife-rentes, los cromosomas no son homólogos, sino homeólogos. Por lo tanto no se forman bivalentes, o sólo se forman pocos bivalentes y muchos univalen-tes, la meiosis es irregular, y no se producen gametas viables (balanceadas). Para anular la esterilidad se puede tratar con colchici-na, lo que produce una duplicación del número de cromosomas. Esto da por resultado un alotetraploide (o anfidiploide), en el cual se forman todos bivalentes, la meiosis es regular y las gametas son balanceadas. 9) Se realiza el siguiente cruzamiento entre moscas (Drosophila melanogaster). Una hembra heterocigota para los siguientes caracteres: vestigial (vg) mutación recesiva ubicada en el cromosoma II, white (w) muta-ción recesiva ubicada en el cromosoma I (que es el X) y ebony (e) mutación recesiva ubicada en el cromo-soma III es cruzada con un macho recesivo para los tres caracteres. Se obtuvieron los siguientes resulta-dos, siendo que toda la descendencia (sean machos o hembras) presentaron los siguientes fenotipos: vg+ e+ w+ : vg e+ w : vg e w : vg+ e w+ JUSTIFIQUE si las siguientes afirmaciones son co-rrectas (o no): a) No se observan recombinantes entre vg y w, lo que puede deberse a la existencia de una inversión que involucre a ambos genes. b) No se observan recombinantes entre vg y w lo que puede deberse a la existencia de una o más transloca-ciones recíprocas. c) Entre los machos de la descendencia, la propor-ción de machos con ojos blancos (white) es de 1/4 dado que este carácter está ligado al sexo. d) Si hubiese habido una translocación recíproca entre e+ y w+, la proporción de machos descendientes w+ hubiese sido distinta a la proporción esperada (pro-porción esperada es la que se obtendría si no hubiese una alteración cromosómica). R) a) Incorrecta. Sólo puede considerarse la transloca-ción recíproca ya que los genes están en cromosomas independientes. Esta alteración permite explicar que los genes segreguen como si estuviesen ligados. b) Correcta. Podría ser que vg+ haya translocado al cromosoma donde está w+ o que vg haya translocado al cromosoma donde está w. Sería menos probable

que se produzcan dos eventos de translocación recí-proca. c) Incorrecta. White sí está ligado al sexo pero la pro-porción es de ½. d) Incorrecta. La proporción esperada de machos con ojos wild type entre los machos de la descendencia es de ½. Ejemplifico el caso en que hubiese habido una translocación recíproca entre w+ y e+. Gametas que produce la hembra translocada:

Gametas que produ-

ce el macho:

Genética cuantitativa

1) La longitud media internodal en espigas de cebada de la variedad gran cervecera es de 4,24 mm (con baja variancia). En la variedad imperial la media in-ternodal es de 6,34 mm (con baja variancia). La media de la F1 de un cruce entre las dos variedades tiene, aproximadamente, 5,4 mm (con baja variancia). La F2 da también 5,4 mm pero con un rango de variación continuo desde un extremo parental al otro (alta va-riancia). El análisis de la progenie de la autofecunda-ción de cada uno de los individuos de la F2 mostró 3 distribuciones entre sus descendientes: i) tipo gran cervecera con media de 4,24 mm y baja variancia, ii) tipo imperial de 6,34 mm y baja variancia y iii) igual a la F2. La longitud internodal en espigas de cebada, ¿es un carácter discontinuo o cuantitativo?¿Cuántos loci están involucrados en la segregación del carácter?¿Por qué? Respuesta: La respuesta puede ser de distintas mane-ras (ver más abajo) pero se debe concluir que la herencia involucra un único locus y es típicamente mendeliana (en este caso semidominante ) y no de tipo “cuantitativa”. Si gran cervecera es AA e impe-rial aa, la F1 es Aa (semidominante) y los individuos de la F2 son AA, aa o Aa, como lo demuestra el com-portamiento de las respectivas pruebas de progenie. Se puede contestar que es un carácter discontinuo (medi-

Gametas

½ Machos

w+ y hete-

rocigota

para e

½ Machos w

y homocigo-

ta para e

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do cuantitativamente) o que es cuantitativo (por su forma de medición) pero formado por un único locus (QTL). 2) Una población vegetal silvestre es sometida durante muchas generaciones sucesivas a un proceso de selec-ción artificial basado en sembrar cada año únicamente las semillas procedentes de plantas incluidas en el 20% de mayor producción. Como consecuencia de la selección practicada, la producción media aumenta gradualmente. Los valores de heredabilidad del carác-ter producción en dicha población a lo largo del pro-ceso selectivo serán a) creciente, b) decreciente, c) primero creciente y luego decreciente d) constante. Justifique su respuesta. Respuesta: Decreciente. La heredabilidad está en función directa con la variabilidad genética (varianza genotípica), la cual disminuye con el proceso de se-lección.[Respuesta alternativa: debería ser decreciente y después constante, una vez agotada la variabilidad genotípica]. 3) Dados los excepcionales conocimientos de Genéti-ca que adquirió en tiempo récord en este curso de ve-rano y gracias a la devaluación y sus bajas pretensio-nes salariales, una exitosa empresa textil exportadora de productos regionales decide contratarlo para mejo-rar la productividad y la calidad de la lana de sus re-baños de llamas. El establecimiento del NOA dispone de una población de animales cuya producción de lana y calidad de la fibra siguen una distribución de tipo normal y que se muestran en A y B, respectivamente. Tal como aprendió en Genética I, lo primero que hace es estudiar la heredabilidad del carácter y para ello dividió la población en 3 subgrupos cada una (deno-minados 1, 2 y 3 en la figura) de acuerdo a los valores promedio de producción o calidad X1, X2 y X3, res-pectivamente). Seguidamente dejó que los individuos de cada una de las subpoblaciones creadas se aparea-ran entre sí y analizó la distribución de valores de la siguiente generación. Como se ve en la figura, los va-lores promedio de la nueva generación coincidieron con los valores promedio de cada una de las subpo-blaciones paternas en A (productividad). En cambio en B (calidad) coincidieron con el promedio de la po-blación original sin seleccionar.

a) ¿Cómo fue la heredabilidad de los 2 caracteres? Debido a que es un profesional muy serio, antes de hacer un diagnóstico prefirió esperar un par de años más y ver que ocurre en una segunda generación antes de emitir un diagnóstico y una estrategia de mejora-miento. Para ello, sin aplicar nueva selección, dejó cruzar entre sí a los nuevos individuos pertenecientes a las subpoblaciones.

b) ¿Cómo serían las distribuciones en esta segunda generación? c) ¿Cuál fue su diagnóstico y qué plan de mejoramien-to presentó a la empresa? Aprovechando su estancia en el NOA decidió hacerse un viajecito a Bolivia y, en el lago Titicaca observó unas llamas con una fibra de excepcional calidad (muy superior a cualquiera de las del establecimiento argentino) aunque de productividad de lana muy infe-rior. Indeciso, compra esas llamas y vuelve al estable-cimiento a realizar nuevos cruzamientos entre ellas y las argentinas. Para su sorpresa, entre los descendien-tes no sólo obtiene individuos con un aumento de la calidad de la fibra, sino que algunos (muy pocos) animales tienen una productividad superior a la obser-vada en la subpoblación seleccionada de “A”. Descon-fiado, supone que los valores de estos pocos indivi-duos podrían estar influidos por el ambiente, por lo que los pone aparte, deja que se crucen entre sí y ana-liza sus hijos. Resultado: la alta productividad se man-tiene y obtuvo las mejores llamas de la historia. d) ¿Cómo explica su buena suerte? Es decir, ¿a qué fenómeno genético atribuye este resultado? A todo esto, ya pasaron varios años y decide ir con sus resultados a pedir un considerable aumento de sueldo. Sin embargo, a esta altura del partido, vuelve Cavallo al ministerio de Economía, reimplanta la convertibili-dad y la empresa entra en crisis, entre otras cosas por-que, durante los años en Ud. hacía estudios genéticos, la productividad no aumentó y decidieron prescindir de sus servicios por “ineficiente” (no vale la pena hacer investigación y desarrollo en la Argentina, le argumentaron) y le vendieron las llamas a Telecom para su famosa propaganda (porque observaron que llamaban por teléfono muy seguido a sus familiares bolivianos). Mientras tanto, su hermanito más chico decide seguir sus pasos y en la facultad aprende que un grupo en Australia, publicó un trabajo en el que encuentra una asociación entre un RFLP correspondiente a un gen que interviene en la síntesis de la queratina en la lana en ovejas y que explica el 90% de la variabilidad (va-rianza genética) del carácter calidad de la fibra. e) En base a toda esta experiencia y en no más de 10 renglones ¿qué hubiera hecho distinto (además de vo-tar con conciencia) para evitar este final? Nota: se cas-tigará con -1 punto si la respuesta excede los 10 ren-glones. Respuesta: a) 1 (100%) y 0, respectivamente, b) igual, c) Que, dada la alta heredabilidad de A, puedo tratar de seguir seleccionando individuos en base a producción y que, dada la nula heredabilidad de B, no hay variabilidad genética y no tiene sentido seleccio-nar para este carácter. Deberían buscarse otras fuentes de variabilidad. d) Segregación transgresiva. e) Hubie-ra tratado de hacer mis primeras evaluaciones utili-zando la mayor diversidad genética disponible (y no limitarme a los animales del establecimiento) y, en paralelo, hubiera buscado la literatura científica rela-cionada para evaluar la factibilidad de encontrar mar-cadores moleculares para el carácter estudiado que me sirvan para seleccionar con más eficiencia. Por ejem-

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plo, intentaría usar el gen de oveja como sonda que, si hibrida con el gen homólogo de la llama, podría servir para observar si encuentro un polimorfismo útil en llama para RFLP (u otra técnica como STS, SSCP, etc.), es decir, ver si hay cosegregación de un marca-dor con mi característica de interés para así usarla en selección asistida por marcadores. Respuesta alterna-tiva: llamas transgénicas con el gen de la oveja. 4) En el mejoramiento bovino se busca un aumento más rápido del peso de los animales en determinados ecosistemas de pasturas semitropicales. Se trata de un carácter cuantitativo y aditivo. Para ello se cruzaron vacas con cebúes (de aumento más rápido, pero cuya calidad de carne es menor) obteniéndose una F1 con valores intermedios (la media se ubicó equidistante entre la media de las vacas y la media de los cebúes). La varianza fue muy similar tanto a la de vacas como de cebúes (que a su vez se parecían entre sí). Los inte-grantes de la F1 se cruzaron entre sí para obtener una población segregante. a) ¿Cómo supone que fue la media de esta población segregante? ¿mayor, menor o similar a la de la F1? b) La varianza fue ¿mayor, menor o igual a la de la F1? Entre los individuos de esta población se encontraron algunos que superaron en aumento de peso a los mejo-res cebúes. c) ¿Conoce alguna explicación genética a este fenó-meno? Respuestas esperadas: a) Similar, b) mayor, c) se-gregación transgresiva 5) Un conocido protagonista de Los Simpsons que habitualmente se disfraza de Vaquita de San Antonio se dedicó a la lucrativa venta de dichos coleópteros pero, para hacerlos más atractivos, necesitaba aumen-tar su tamaño dado que naturalmente tienen una media de tan solo 5 mm. Seleccionó los machos y hembras más grandes que encontró (promedio de 8 mm) pero como eran muy pocos decidió reproducirlos para así disponer de volumen para la venta. Para su sorpresa, la descendencia no mantuvo la esperada longitud me-dia de 8 mm sino que bajó a 6,5 mm. Muy enojado por la baja performance de los bichos, los tiró y se fue a recoger coleópteros nuevos y repitió el procedimien-to de selección (con idénticos resultados). a) ¿Por qué bajó la longitud promedio de la descen-dencia? b) ¿Puede calcular la heredabilidad de este carácter? Después de admirar el tamaño de las cucarachas del bar de Moe, abandonó la idea de seleccionar y se le ocurrió criarlas con una dieta que le recomendó Homero. De esta manera logró aumentar el promedio de longitud de 5 a 6,5 mm (¡lo mismo que arriba!) c) ¿Es casualidad que ambas medias hayan coincidi-do? Finalmente decidió contratarlo como consultor d) ¿Qué hubiera hecho Ud en caso de querer conver-tirse en vendedor de vaquitas de San Antonio super size, disponiendo únicamente de una regla milimetra-da y sabiendo que en Springfield NO existen laborato-rios de marcadores moleculares o ingeniería genética? Respuestas esperadas

1) a) Porque el tamaño observado es la combina-ción de una estructura genética poblacional particular (variancia genética) que puede segregar y de la in-fluencia ambiental (no heredable) o variancia ambien-tal. b) La selección diferencial fue de 8 – 5 = 3 mm y la respuesta selectiva 6,5 – 5 = 1,5 mm. Por lo tanto, la heredabilidad fue de h

2 = 1,5/3 = 0,5 (50%)

c) Sí (o no, en el sentido de que se reduce a un míni-mo la variancia ambiental permitiendo expresar el máximo potencial genético; de todos modos sigue siendo casualidad que coincida una media general únicamente debida a factores genéticos de una pobla-ción sin seleccionar con los de una población selec-cionada en la que no se afectó la influencia ambiental) d) Volver a seleccionar en la descendencia y en las siguientes generaciones hasta que la heredabilidad se acerque a 0 (además de darles la dieta de Homero). 6) La resistencia al patógeno Sclerotinia sclerotiorum en girasol es un carácter complejo que involucra dis-tintos loci y se evalúa cuantativamente mediante un índice de daño en el capítulo floral. Para evaluar la heredabilidad del carácter se sembraron 100 plantas de una línea moderadamente resistente (no existen variedades totalmente resistentes al patógeno) en Bal-carce, obteniéndose una media de índice de daño de 0,20. De esta población, se seleccionó un grupo de individuos de mayor resistencia, con una media para el índice de daño de 0,10, como padres para la si-guiente generación, siendo la media de esta última generación de 0,13 para la variable evaluada a) ¿Cuál es la heredabilidad del carácter resistencia? Cuando el mismo experimento, utilizando el mismo material y presión de selección se realiza en otra loca-lidad, la heredabilidad obtenida fue de 0,50 b) ¿A qué se debe la diferencia en la heredabilidad obtenida en ambos casos? Sobre una población segregante F2 proveniente del cruzamiento de la línea resistente estudiada arriba y una línea susceptible al patógeno, se realizó un es-tudio con marcadores moleculares codominantes, de-tectándose 2 marcadores estrechamente ligados a 2 QTLs, uno en el grupo de ligamiento 8 (GL8) y el segundo en el grupo de ligamiento 6, que explican el 50 y 35 % de la varianza genética del carácter resis-tencia respectivamente. En base a estas conclusiones, c) ¿Descartaría la presencia de otros QTLs para este carácter en la población en estudio? El siguiente esquema representa el patrón para el mar-cador asociado al QTL del GL8 en el padre modera-damente resistente (MR), en el sensible (S) y en 10 individuos F2, evaluados como moderadamente resis-tentes o sensibles (ver fila superior)

Padres Resistentes Susceptibles

MR S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ----

---- ---- ----

---- ----

----

----

----

----

----

----

¿Cómo explica el patrón encontrado para el marcador en estudio en los individuos 3 y 5 cuya evaluación fenotípica es moderadamente resistente? Rta: a) h

2 = Xf –Xo = 0,7

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Xs - Xo b) a la varianza ambiental e interacción genotipo-ambiente (carácter cuantitativo, con alta componente ambiental). c) Dado que entre los dos QTLs explican el 85 % de la varianza genética, es muy probable que haya otro/s QTLs de efecto menor en otros grupos de ligamento no detectados d) Se esta evaluando con un marcador ligado a un solo QTL y la resistencia moderada observada puede deberse a la presencia de otro/s QTL/s en esos indivi-duos. También pueden decir que hubo recombinación entre el marcador y el QTL, pero dado que se dijo que estaban estrechamente ligado se espera que deduzcan la primera respuesta 7) En Drosophila melanogaster se obtuvieron dos líneas homocigotas que difieren ampliamente en la longevidad media a 25ºC. La línea L tiene una longe-vidad media de 120 días mientras que la línea C tiene una longevidad media de solo 40 días (ver figura). A partir de una retro-cruza entre las líneas C y L se construyeron líneas RIL. A cada RIL se le midió la longevidad. El siguiente esquema muestra el cromo-soma 3 de las líneas C y L, y más abajo resume las RIL más informativas para localizar QTL de la longe-vidad sobre este cromosoma, considerando que no existe epistasis. a) ¿Indique dónde están el o los QTL a lo largo del cromosoma 3 (en cM) y justifique en menos de 5 ren-glones si es de esperar que existan más QTL en otros cromosomas? b) ¿Por qué las distancias genéticas no son proporcio-nales a lo largo del mapa físico? (por ejemplo, la dis-

tancia entre 0 y 20 cM es menor que la distancia entre 40 y 60 cM en el mapa físico, ver figura)

c) Esquematice una posible curva de LOD en función de cM que esperaría obtener, de acuerdo a su respues-

ta en “a” en el siguiente gráfico, si aplicara un método bioinformático tal como hicimos en el trabajo práctico sobre QTL. Considere que la línea horizontal es el umbral de significación (LOD = 3). d) Se analizaron micromatrices mediante “chips” de genes que abarcan todo el cromosoma 3. Se identifica-ron 10 genes que aumentan significativamente sus niveles de expresión en las moscas viejas (en edades avanzadas se expresan al menos 4 veces más que en la edad de control). Estos genes y su posición en el ma-pa (cM) fueron:

Gen A B C D E F G H I J K Posición 4 5 9 10 22 25 30 42 60 90 93

Sobre la base de su respuesta en “a”, ¿cuáles de estos genes NO estarían incluidos entre los responsables de las diferencias en la longevidad entre las líneas C y L? Respuesta: a) el QTL esta entre aproximadamente 80 y 100 cM – Es de esperar que existan mas QTL en otros cromosomas porque el identificado en el cromo-soma 3 explica menos (40 – 90 = 50 dias) que la dife-rencia entre ambas lineas parentales (120 – 40 = 80 dias) b) las distancias genéticas no son proporcionales a las físicas porque dependen de las frecuencias de recom-binación y las frecuencias de recombinación no son ctes a los largo del cromosoma (son mayores en las regiones telomèricas y menores en las regiones cen-tromericas) c) hacen una curva que supere el LOD de 3 solo entre 80 y 100 cM d) los genes que seguro NO serian responsables de ninguna diferencia de longevidad entre las lineas pa-rentales L y C son A, B, C, D, E, F, G, H e I, porque si bien cambian de niveles de expresión durante el enve-jecimiento NO están incluidos en el QTL (a diferencia de los genes J y K). 8) Un marcador molecular RFLP está ligado en Dro-sophila a un locus QTL está involucrado en la deter-minación del número de setas abdominales. Una son-da que cubre toda la región del polimorfismo, se hibrida con un fragmento de restricción de 6,5 kpb, con un fragmento de 4,0 kpb o con los dos (en los in-dividuos heterocigotos). Los genotipos para el QTL son QQ, Qq y qq y los números de setas abdominales medias que corresponde a cada genotipo son respecti-vamente 20, 18 y 16. Se efectúa el siguiente cruza-miento:

Hembras q

Q

q

Q

0,4

5,6

0,4

5,6 machos

Se determinan, después, los fenotipos de cada descen-diente y se les extrae el ADN que se somete a una co-rrida electroforética e hibridación con la sonda de ma-nera de determinar su perfil de RFLP. En los casille-ros ubicados en las calles del gel dibujado más abajo, escriba el número medio de las setas abdominales para cada uno de los tres fenotipos RFLP, suponiendo que la frecuencia de recombinación entre el QTL y el marcador es del 10%. Recordar que no existe recom-binación en los machos de Drosophila. Detalle el cru-zamiento y todos los cálculos que realizó para obtener sus respuestas.

Línea C

Línea L

Líneas RIL

Cromosoma 3 Longevidad (días)

120

40

90

40

40

40

RIL1

RIL2

RIL3

RIL70

0 20 40 60 80 100

Posición en cM

Posición en cM

LOD

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

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9) El Dr. Kormy Yot (un importante nutricionista) se embarcó en un proyecto nutrigenómico (“una dieta para cada individuo, según su genotipo”) utilizando una población de ratones de laboratorio para determi-nar con precisión la influencia relativa de los compo-nentes genéticos versus los componentes ambientales (particularmente la dieta) en el peso corporal. Utilizó una población genéticamente uniforme para la longi-tud del cuerpo (desde la cola a la nariz) cuyo peso promedio es de 30 g. Para ver si la variación en el pe-so es heredable seleccionó a los ratones que pesaban 33 g o más (35 g en promedio) como progenitores de la siguiente generación. En la siguiente generación el peso promedio aumentó significativamente 2 g (el peso medio fue de 32 g). a) ¿Cuál es la heredabilidad (h

2) del carácter en la po-

blación inicial de 30 g?

b) Mediante selección y posterior endocría logró obtener dos líneas homocigotas para todo el genoma, una de bajo peso (25 g) y la otra de alto peso corporal (39 g). Si la varianza ambiental es de 3, ¿cuál es la heredabilidad (h

2) y la varianza fenotípica en cada una

de estas dos líneas homocigotas?

c) A partir de las dos líneas mencionadas en “b” se construyeron 40 líneas RILs para el cromosoma 7, pues era el único autosoma del que se disponía de marcadores moleculares informativos. Teniendo en cuenta el siguiente esquema que resume las líneas RIL que resultaron informativas: - indique si existe uno o más QTL sobre el cromoso-ma 7, y la respectiva localización (segmento cro-mosómico). - ¿Cree Ud que pueden existir más QTLs para el mis-mo carácter (peso) en el resto del genoma? Justifique brevemente. R) a) R = h

2 S => h

2 = R / S => h

2 = (X1 – X0) / (Xs –

X0) = (32 – 30) / (35 – 30) = 0,4. b) h

2 = 0 en cada una de las líneas porque las líneas

son homocigotas para todo el genoma (incluyendo los posibles genes que afectan al peso), es decir que la varianza genética es nula. La VP será igual a VE por-que toda la variación observada es ambiental, VP = 3. c) El primer segmento negro del cromosoma 7 de la RIL2 (contando de izq a derecha) es el único QTL observado en este autosoma porque es el único que diferencia a las RIL con respecto al peso corporal. Seguramente existirán más QTLs en otros cromoso-mas porque este cromosoma 7 no explica toda la dife-rencia entre las líneas de alto y bajo peso. La máxima diferencia entre las líneas “parentales” usadas para construir las RILs es de 39 gr – 25 gr = 14 g mientras que la máxima diferencia entre las RILs explicada por el cromosoma 7 es de 34 – 25 = 9 g. 10) Mediante un estudio de la capacidad musical en humanos se concluyó que ésta representa una función compleja integrada por la apreciación del tono, memo-ria tonal, sentido del ritmo, gusto melódico y conjunto armónico. En un estudio llevado cabo por Musi-Quita se colectaron muestras de DNA humano de una po-blación altamente endogámica (es decir, con carac-terísticas similares a las de un alto grado de endocría o autofecundación) con pedigrí cerrado (y conocido) en Islandia, muy analizada por los laboratorios medi-cinales para realizar estudios de enfermedades heredi-tarias porque es lo más parecido (en humanos) a estu-diar los recombinantes descendientes de un cruza-

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miento controlado y se trató de mapear algún QTL asociado a la capacidad musical. Para la realización de este estudio se muestrearon personas con buena afina-ción (incluyendo a la famosa cantante Bjork) y perso-nas que han demostrado ser “molestamente” desafina-das seleccionadas en “cantando por un sueño” en ver-sión vikinga. De esta manera, se establecieron 2 gru-pos, de acuerdo a un índice de afinación (Ia) que pue-de cuantificarse (variando de 0 a 1): Afinados (A) cu-yo Ia es mayor a 0.75 y Desafinados (D) cuyo Ia es menor a 0.25. a) ¿Cuál es la ventaja, para el análisis genético, de utilizar grandes poblaciones descendientes de muy pocos individuos parentales? b) ¿Qué piensa sobre cómo debió ser el muestreo de la población de individuos estudiada en cuanto a: su es-tatus social, país de origen, formación musical obteni-da, etc.? ¿lo más homogéneo posible, tal como se buscó en el caso de su origen genético o todo lo con-trario?¿Por qué? Se estudió la distribución de los patrones de marcado-res moleculares (microsatélites). En la tabla sólo se muestran algunos de los loci analizados y el resultado de sólo 10 individuos de cada grupo (considere que la muestra evaluada resulta representativa).

TABLA: En cada caso se muestran los homocigotas para 1

ó 2 de cada locus y el heterocigota expresado como H.

c) ¿Cuáles de estos loci podrían servir para mapear algún QTL asociado a la capacidad de afinación? Jus-tifique su respuesta. d) ¿Qué podría decir acerca del número de QTLs aso-ciados al carácter? Para responder básese en los datos de la tabla, en sus respuestas de los puntos anteriores y demás características sobre el carácter que se men-cionan en el enunciado. En el norte de nuestro país, se identificó una pobla-ción de origen indígena con características similares a las de Islandia, lo mismo ocurrió con una tribu de bosquimanos en África y con la población del pro-blema 1. e) Discuta la probabilidad de encontrar los mismos QTLs en estas otras poblaciones. Respuestas: a) Como se dice en el enunciado, al tratarse de un carácter complejo, es probable que haya muchos ge-nes involucrados. Utilizar poblaciones endogámicas de pedigrí cerrado permite reducir esta complejidad (el número de genes con variación, así como de sus variantes alélicas), porque muchos de ellos deberían estar en homocigosis y permanecer constantes. b) Asumiendo que la varianza ambiental influye en el fenotipo del carácter estudiado, se sugiere que debe

ser una muestra que reúna en cada grupo diversidad en cuanto a esos y otros factores para que la varianza ambiental no sea la mayor contribuyente a la variación fenotípica observada. c) Para los loci A y C ya que existe una correlación entre la expresión del carácter cuantitativo Ia y la condición 1, 2 o H de estos carácteres cualitativos. d) Según los datos de la tabla al menos existe 1 QTL. Si se observan los datos se ve que, con alta frecuencia, A1 se hereda junto con C2, por lo tanto estos marca-dores podrían estar ligados y mapear junto al mismo QTL. Sin embargo, dada la introducción del enuncia-do y teniendo en cuenta la complejidad del acto resul-ta intuitivo adjudicar el fenotipo a más de 1 QTL. In-cluso el hecho de obtener heterocigotas para A o C con valores tan altos y tan bajos de Ia hace pensar que hay otros genes que colaboran en la expresión de este carácter y también que el ambiente sería de gran in-fluencia. No necesariamente. Lo más probable es que NO, de-bido a que hay varios genes distintos involucrados (incluso distintos alelos de un mismo gen) que se fija-ron en forma diferencial en las distintas poblaciones. 11) En una población experimental de Drosophila melanogaster, el peso medio seco de las moscas es de

2000 ug. La varianza fenotípica es 40000 ug2 y

la varianza genética aditiva es de 10000 ug2. Si

como progenitores de la siguiente generación se seleccionan individuos grandes, que en promedio pesan 2400 ug, a) ¿cuál es el peso corporal promedio espera-do en la progenie? b) ¿cuáles son la varianza ambiental y la here-dabilidad en sentido amplio (H

2) de este carác-

ter suponiendo que el único componente gené-tico de la varianza fenotípica del carácter es el

aditivo? Suponga ahora que para un estudio de QTL sobre el peso seco de las moscas se ha seleccionado la pobla-ción indicada arriba durante muchas generaciones ob-teniéndose dos líneas muy diferenciadas para este carácter: la línea de alto peso (W) y la línea de bajo peso corporal (L). A partir de la F3 recombinante en-tre las dos líneas W y L se construyeron líneas RIL para localizar los QTL.

Grupo: Afinados

Ia 0.9 1 0.75 0.84 0.86 0.88 0.85 0.95 0.77 0.82

Locus A (A1A2) A1 A1 A2 H H H A1 A1 H H

Locus B (B1B2) H H B1 B2 B2 H B1 B1 H B2

Locus C (C1C2) C2 C2 H H H H C2 C2 H H

Desafinados

Ia 0.02 0.23 0.05 0.2 0.15 0.04 0.07 0.08 0.1 0.25

Locus A (A1A2) A2 H A2 H H A2 A2 A2 A2 A1

Locus B (B1B2) B2 B2 B1 H B1 H H B1 B2 B2

Locus C (C1C2) C1 C2 C1 H H C1 C1 C1 H C2

Línea de alto peso

Línea de bajo peso-

Cromosoma 3

RIL 1

RIL 2

RIL 3

RIL 40

1000

4000

1010

1005

1020

X

40 RIL

0 20 40 60 80 100

Posición genética en cM

2900

32

c) A cada RIL se les midió el peso corporal, El si-guiente esquema muestra el cromosoma 3 de las líneas W y L) y más abajo resume las RIL más informativas para localizar QTL. ¿Dónde están los QTL a lo largo del cromosoma (en cM) y cuál es el número mínimo de genes del cromosoma 3 que afectan al peso corpo-ral? Pueden haber más QTLs en otros cromosomas – Justifique brevemente.

d) Dibuje una posible curva LOD en función de cM que esperaría obtener, de acuerdo a su respuesta en “c”, en el siguiente gráfico si aplicara un método bio-informático tal como hicimos en el trabajo práctico sobre QTL. Considere que la línea horizontal es el umbral de significación (LOD = 3). R) a) S = 2400 ug – 2000 ug = 400 ug h

2 = 10000 / 40000 = 25%

R = h2 * S = 0.25 * 400 = 100 ug

media esperada X1 = 2000 ug + 100 ug = 2100 ug b) VA = VP – VA = 40000 – 10000 = 30000 ug

Como VG = VA, entonces H2 = h

2 = 0.25

c) Hay un solo QTL aproximadamente a 40 cM. Por

lo tanto el número mínimo de genes que afectan al

carácter es 1. Deben haber más QTLs e otros cromo-

somas ya que este QTL no explica toda la diferencia

entre las líneas parentales W y L (4000 – 1000 ug).

d) Una posible curva esperada seria la siguiente. Lo

unico importante es que el LOD seria significativo

solo en el “intervalo” aproximado que consideraron

que era un QTL en la respuesta“c”.

Genética de poblaciones

1) La apolipoproteína E (apoE) fue implicada como

un factor de riesgo en las enfermedades cardiovascu-

lares y en el Alzheimer. Se describieron 3 alelos co-

munes: apoE2, apoE3 y apoE4. La tabla muestra la

distribución poblacional de los distintos genotipos:

¿Cuál es la frecuencia del alelo apoE2?

Genotipo E2E2 E2E3 E2E4 E3E3 E3E4 E4E4 Total

N° indiv 2 64 7 684 169 11 937

a) 0,002 b) 0,040 c) 0,076 d) 0,175

Respuesta:b) [f(E2)= (2x2)+(64)+(7)/(937x2)=0,040]

2) Hagamos un poco de ciencia-ficción. Supongamos

que la ciencia médica avanzase hasta el punto de que,

con un tratamiento aplicado a lo largo de toda la vida,

la especie humana dejase de sufrir nuevas mutaciones.

Admitamos también que tal tratamiento se aplica a

toda la humanidad en el intervalo de una sola genera-

ción, y se mantiene así en lo sucesivo. ¿Qué ocurriría

con la variabilidad genética en las sucesivas genera-

ciones? ¿Aumentaría? ¿Desaparecería? ¿Se mantendr-

ía? Explíquese tanto como pueda.

Respuesta: Suponiendo panmixia, ausencia de selec-

ción y el alto número poblacional de la especie, la va-

riabilidad debería mantenerse constante (en equilibrio

de HW). Por lo tanto, se mantendría. Lo que se impe-

diría es el surgimiento de potenciales nuevos alelos

inexistentes en la población actual.

4) Según algunos las rubias (no teñidas) están conde-

nadas a la extinción cuando la población humana

mundial llegue a total panmixis. El alelo determinante

del color rubio del principal gen involucrado en el

color del cabello es de expresión recesiva.

Si mediante un cálculo arbitrario estimamos que la

cantidad de rubias/os es de 22 millones sobre una po-

blación mundial de 6.600 millones y hay 50 millones

de heterocigotas.

a) ¿Cuál será la proporción de rubios cuando la pobla-

ción llegue a equilibrio de Hardy-Weimberg?

b) ¿Qué proporción de rubios de la población tendrán

los dos padres no rubios?

Rta: p=R+1/2H= 22/6600 +50/6600*1/2= 0,0071

q=1-p=0,9929

En equilibrio H-W la población de rubios será

p2=5*10

-5

b) NO era necesario contestar. La respuesta era q2

2pq=0,014. La proporción de matrimonios (0,014)2=

2*10-4

Hijos ¼ * 2*10-4

= 5.10-5

1) Un investigador está estudiando una población de

peces que habita en una laguna ubicada en un oasis en

el desierto del Sahara. Se propone estudiar dos loci

correspondientes a dos enzimas en 1000 individuos:

Locus 1: A1A1: 640, A1A2: 320, A2A2: 40

Locus 2: B1B1: 400, B1B2: 580, B2B2: 20

a) Determine si los loci antes mencionados se encuen-

tran en equilibrio de Hardy-Weinberg. Evalúe estadís-

ticamente su hipótesis.

b) En caso de que alguno/algunos de los loci no se

encuentre en equilibrio, ¿cuál/cuáles pueden ser las

causas: falta de panmixia, selección o mutación? Justi-

fique tanto su elección como aquellas causas que des-

carta.

Respuesta:

a) Locus 1:

Posición en cM

LOD

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Posición en cM

LOD

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

33

Frecuencias alélicas: A1=0,8, A2=0,2

Frecuencias genotípicas esperadas:

A1A1 = (0,8)2 x1000 = 640

A1A2 = 2x0,8x0,2 x 1000 = 320

A2A2 = (0,2)2 x 1000 = 40

X2 = 640

2 / 640 + 320

2 / 320 + 40

2 / 40 = 0 No re-

chazo Ho, por lo que este locus está en equilibrio de

H-W

Locus 2:

Frecuencias alélicas: B1=0,69 y B2=0,31

Frecuencias genotípicas esperadas:

Frecuencias genotípicas esperadas:

B1B1 = (0,69)2 x1000 = 476

B1B2 = 2x0,69x0,31 x 1000 = 428

B2B2 = (0,31)2 x 1000 = 96

X2 = (476 - 400)

2 / 476 + (428 – 580)

2 / 428 + (96 –

20)2 / 96 = 126,3

Como este valor es mayor al valor crítico rechazo Ho

este locus no se encuentra en equilibrio de H-W.

b) Falta de panmixia: es poco probable que esta sea la

causa ya que el locus 1 está en equilibrio y si no

hubiera panmixia también afectaría las frecuencias

genotípicas de este locus.

Selección: Es posible. Por ejemplo, el genotipo B2B2

podría estar desfavorecido frente a los otros dos geno-

tipos ya que su frecuencia es mucho menor de la espe-

rada.

Migración: no puede ser ya que se trata de un oasis

aislado en el desierto.

Mutación: Poco probable ya que para que las frecuen-

cias genotípicas observadas se deban a mutación

aproximadamente 80 de los 620 alelos B2 estudiados

deberían haber mutado a B1, es decir que se requerir-

ían tasas de mutación muy altas (más del 10%). Sin

embargo, no podemos descartar una mínima contribu-

ción de las mutaciones a las frecuencias observadas.

5) Un estudioso de las plantas Florecitus lindus, des-

cubre una población silvestre en una apartada región y

decide investigar sus características.

Primero decide realizar un muestreo al azar de la po-

blación, para lo que extrae ADN de 300 plantas. En-

tonces, entre otros estudios, analiza un carácter de im-

portancia ornamental, la presencia de un patrón de-

terminado de coloración en la flor. Por estudios pre-

vios en el género, sabe que ese carácter está determi-

nado por un único gen autosómico y bialélico (siendo

la presencia del patrón de coloración dominante sobre

su ausencia). Como la planta florece cada tres años, y

aún no está en floración, decide utilizar un marcador

molecular RFLP localizado en el gen. Obtiene tres

tipos de patrón de bandas. El primero, que por sus es-

tudios está asociado con el patrón de color, aparece en

100 individuos. El segundo patrón lo tienen 120 indi-

viduos y el tercero, sólo 80.

a) ¿Esta población se encuentra en equilibrio de Har-

dy-Weinberg para este carácter? Si la respuesta es

afirmativa, explique por qué cree usted que se mantie-

ne en ese equilibrio. Si no lo es, dé una explicación

razonable de por qué no existe el equilibrio en esta

población.

VC (valor crítico)=3,84 para 1 GL; VC=5,99 para 2

GL; VC=7,82 para 3 GL.

b)¿Qué supuestos me permitirían a mí calcular, a par-

tir de esta población, cuáles serían las frecuencias

génicas dos generaciones después? ¿Y las genotípi-

cas? Explique su razonamiento. Aclaración: No se

pretende que esas sean realmente las frecuencias que

va a tener la población en esa generación, sólo que

indique qué necesitaría un investigador para poder

afirmar cuáles serían.

1) a) observado

a1a1 a1a2 a2a2

100 120 80

p= 0,53333333

q= 0,46666667

Esperado bajo H-W

a1a1 a1a2 a2a2

85,33 149,33 65,33

X2= 11,5752551

No está en equilibrio (VC=3,84)

Posible explicación: lo más probable es que no exista

panmixia y que haya algo de endogamia (por ejemplo,

porque las plantas poseen algún grado de autofecun-

dación facultativa, o porque sus semillas no se disper-

san tanto). Esto se justifica porque hay exceso de

homocigotas. Otras explicaciones menos probables:

diferencia entre sexos. (en este caso, si hubiera pan-

mixia, sólo se tardaría dos generaciones en alcanzar el

equilibrio, sería raro que el investigador justo hubiera

encontrado la población en ese punto)

b) En ausencia de mutación, migración, selección y

deriva, las frecuencias génicas serían las mismas que

ahora. Si además, hubiera panmixia, las frecuencias

genotípicas serían las del equilibrio. 6) En 1960 el cacique de una tribu localizada en una lejana isla del pacífico, preocupado por la gran canti-dad de enfermedades de origen genético presentes en la población de la isla recurrió al Dr. Boyd. Éste estu-dió la distribución de alelos de grupos sanguíneos MN (los individuos son MM, MN o NN), obteniendo los siguientes resultados: MM: 520, MN: 160, NN: 320 a) ¿Se encuentra la población en equilibrio de Hardy-Weinberg con respecto a los grupos sanguíneos MN? Verifique estadísticamente. b) ¿Hay mayor, menor o igual homocigosis que la es-perada por Hardy-Weinberg? Sorprendido por estos resultados el Dr. Boyd decidió averiguar un poco más sobre esta tribu, y encontró que la misma está dividida en 5 castas. Los matrimonios entre personas de distinta casta estaban terminante-mente prohibidos. Reanalizando sus datos, ahora te-

34

niendo en cuenta las castas a las que pertenecían las personas, notó que dentro de cada casta se cumplían las frecuencias de H-W. c) ¿Cómo explica este último resultado en relación a su respuesta de la pregunta “a”? ¿Qué supuestos no se cumplen en la población total? d) ¿Por qué le parece que hay tantas enfermedades genéticas en la población? Debido a estos hallazgos el Dr. Boyd recomendó al cacique que quitara toda restricción en cuanto a los matrimonios, lo cual el cacique acató inmediatamente. En 1980 el Dr. Boyd regresó a la tribu y notó que a pesar de que la población general no se encontraba en equilibrio de Hardy-Weinberg, si sólo analizaba las muestras de sangre de los menores de 20 años ajusta-ban perfectamente a dicho equilibrio. e) ¿Cómo puede explicar este último resultado? R) a) M = (520 + 160 /2) / 1000 = 0,6 N = (320 + 160/2) / 1000 = 0,4 Si la población se encontrara en equilibrio de H-W las frecuencias genotípicas deberían ser: MM = 0,6

2 * 1000 = 360

MN = 2 * 0,6 * 0,4 * 1000 = 480 NN = 0,4

2 * 1000 = 160

X2 = (520-360)

2 /360 + (160-480)

2 / 480 + (320-160)

2

/ 160 = 444,4 Como es mayor que X

21,0,05 entonces rechazamos la

hipótesis. Es decir la población no se encuentra en equilibrio de H-W. b) Dado que los homocigotas esperados son 520 mien-tras que los observados son 840 podemos decir que hay mayor homocigosis que la esperada por H-W. c) Dado que están prohibidos los matrimonios entre castas no hay panmixia. Por lo tanto aunque cada cas-ta se encuentre en equilibrio de H-W la población to-tal no lo está. Esto también explica la mayor homoci-gosidad respecto de lo esperado por H-W ya que están favorecidos los matrimonios co-sanguíneos. d) La alta homocigosidad debida a la endogamia hace que sea más probable que una persona sea homocigota para alelos recesivos responsables de una enfermedad hereditaria. e) Al quitar la restricción en la elección de pareja, y suponiendo que a partir de dicho momento hubo pan-mixia, las frecuencias genotipicas de aquellos que na-cieron bajo el nuevo régimen (los menores de 20 años) se ajustarán a H-W. Sin embargo, en la pobla-ción general no sucede los mismo debido a que el grupo de personas que nacieron antes (y que todavía están vivos al realizar el análisis poblacional) presenta las proporciones genotípicas que no ajustaban a H-W.

Genéticas no Mendelianas

1) La neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL)

es una enfermedad rara en la especie humana que pro-

duce una rápida atrofia del nervio óptico y que genera

ceguera en adultos jóvenes. Esta enfermedad está ca-

racterizada por una pérdida bilateral de la visión cen-

tral mientras que se mantiene la visión periférica. La

1° genealogía muestra la herencia de esta enfermedad

en una familia bastante amplia:

¿Cuál es el tipo de herencia más probable para la

NOHL en la especie humana? Explique su razona-

miento.

Según su hipótesis complete la 2° genealogía indican-

do los individuos afectados.

Respuesta: Observamos que todos los descendientes

independientemente de su sexo, muestran el fenotipo

de la madre. [Esto no podemos explicarlo si el carác-

ter estuviera en los cromosomas sexuales, ya que el

fenotipo de la descendencia no depende de si el carác-

ter es dominante o recesivo, o de la dirección del cru-

zamiento, sino sólo del fenotipo de la madre]. Por lo

tanto podríamos asegurar que este carácter es un caso

de herencia materna.

En B se sombrean: II 2, 3, 5; III 1, 3, 4, 8,10,11; IV

todos

2) El siguiente árbol muestra una familia que hereda

una forma severa de hidrocefalia causada por una mu-

tación en el gen L1CAM (localizado en el cromosoma

X) y que presenta una herencia recesiva. Utilizando

un marcador intragénico que tiene tres alelos (12, 8 y

7) se hace el diagnóstico del propósito (nombre que

reciben los “pacientes” por parte de los genetistas

médicos y que se indica con una flecha).

¿Cuál fue el resultado del diagnóstico?

a) La propósito es portadora del alelo mutante

b) La propósito es heterocigota no portadora

35

c) La propósito es homocigota para el alelo normal

d) El resultado no permite dar un diagnóstico preciso

sobre el genotipo.

Respuesta: b)

3) En el antiguo testamento, Dios dispuso que los

hijos de Isaac y su mujer constituirían la nación judía.

Sin embargo, la esposa de Isaac era bastante mayor y

supuestamente infecunda. Según las costumbres loca-

les de la época, ella eligió una mujer alternativa con la

que Isaac tuvo un hijo: Esaú. Un día, la anciana mujer

le comentó a Isaac que estaba encinta y tuvo un hijo:

Jacobo. Posteriormente, Jacobo se casó con 5 herma-

nas (de otra familia) y tuvo 13 hijos y varias hijas.

Suponiendo que pudiera acceder a muestras de tejido

de Isaac, Esaú, Jacobo y de los hijos de Jacobo y,

además, pudiese extraer DNA y analizarlo:

a) ¿Cuántos haplotipos o secuencias nucleotídicas di-

ferentes en la región del cromosoma Y en la región

del gen Sry obtendría? Justifique.

b) ¿Cuántos tipos de secuencias nucleotídicas diferen-

tes del D-loop de DNA mitocondrial obtendría? Justi-

fique.

Solución: a) Uno sólo: el que proviene de Isaac

(herencia ligada al sexo, etc….)

b) 4: el de Isaac (donado por su madre), el que provie-

ne de la madre de Esaú, el que proviene de la madre

de Jacobo y el que proviene de la madre de las 5 her-

manas (herencia materna...)

4) Aproximadamente el 0,3% de la humanidad tiene

una enfermedad genética leve llamada LHON produ-

cida por una mutación que substituye una Asn por una

Asp en el complejo NADH mitocondrial.

a) ¿Cuáles son las frecuencias genotípicas para este

carácter? ¿Serían distintas a las frecuencias alélicas?

¿por qué?

b) Si apareciese una corriente eugenésica que preconi-

ce “mejorar” la raza humana que proponga eliminar

las enfermedades genéticas por métodos drásticos

¿deberían prohibir tener hijos a todos los individuos

con síntomas de LHON?¿por qué? Atención: ignore

los datos que se enumeran a continuación para contes-

tar esta pregunta.

Gracias a los conocimientos adquiridos en genética I y

para buscar argumentos científicos para enfrentar al

movimiento eugenésico a Ud se le ocurre hacer 2

estudios: i) diagnóstico molecular confirmatorio y ii)

cuantificación de la frecuencia de aparición espontá-

nea de esta mutación. En el primer caso encontró que,

además de los enfermos, existen individuos con la

mutación pero asintomáticos (debidos a heteroplas-

mia: presencia de mitocondrias con genotipo normal y

mutante en una única célula) y en el segundo que la

misma es significativa.

c) Argumente por qué estos estudios demostrarían la

inutilidad práctica de encarar la selección negativa

propuesta por los eugenésicos.

Respuestas: a) Este es un carácter mitocondrial por lo

que, salvo algún caso raro de heteroplasmia, el alelo

está presente o ausente (como si fuera una especie

monoploide)]. Por lo tanto, las frecuencias alélicas

son iguales a las genotípicas f(LHON) = 0,3%

F(normal) = 0,97%

b) A las mujeres (y no a los varones) porque se trata

de una herencia materna, no hay necesidad de evitar la

reproducción de los varones dado que no transmiten la

enfermedad

c) Después de la selección negativa la segregación

somática de los heteroplásticos y la aparición constan-

te de nuevas mutaciones similares llevarían la enfer-

medad genética a las mismas cifras actuales (después

de algunas pocas generaciones)

5) El señor señalado con un círculo rojo tiene una rara

enfermedad genética y le pregunta: -Vos que hiciste

un curso rápido de genética ¿me podrás averiguar qué

probabilidad tengo de transmitirle esta enfermedad a

mis futuros hijos?

Mi señora no posee esta enfermedad pero ¡con la

genética nunca se sabe!. ¿Me tendré que hacer un aná-

lisis yo o mi señora?

¿Le podrá contestar sin necesidad de pedirle un análi-

sis genético detallado (pedigrí) a la señora? Justifique

brevemente.

Rta: La probabilidad es nula porque se trata de un

claro ejemplo de herencia materna. No requiere de

más análisis.

Respuestas alternativas válidas a esta pregunta (no

pedidas):

a) Imprinting materno

b) podría ser un gen autonómico recesivo

En el caso b), SÍ debería hacer análisis genéticos.

6) En la siguiente genealogía los símbolos en negro

denotan la condición patológica de una enfermedad

con baja incidencia en la población, que afecta ma-

yormente a hombres. Justifique todas sus respuestas.

a) ¿Cuáles de los siguientes tipos de herencia puede

descartar: herencia mendeliana, ligada al sexo, li-

gada al cromosoma Y, limitada por el sexo, in-

fluenciada por el sexo, herencia materna, influen-

cia materna?

b) De las posibilidades que no descartó, ¿cuál le pare-

ce más probable?

c) asumiendo como cierta la hipótesis que esco-

gió en el punto b), ¿cuál sería el genotipo de los

distintos individuos de la genealogía? Tenga en

36

cuenta que en algunos casos puede haber más de

una opción posible.

d) Si los individuos que poseen el asterisco se

casan, cuál es la probabilidad que tengan un

hijo que porte el alelo enfermo?

Respuesta:

a) Herencia mendeliana: no la puedo descartar, podría

tratarse de una enfermedad recesiva.

Ligada al sexo: puede ser

Ligada al Y: No puede ser porque sino el hijo varon II

debería ser enfermo y el V no debería serlo.

Limitada por el sexo: no puede ser porque según el

enunciado en la población también hay mujeres en-

fermas.

Influenciado por el sexo: puede ser

Herencia e influencia materna: no porque las madres

de los enfermos no están enfermas y el que introdujo

el alelo que da la enfermedad fue el padre de las gene-

ración I

b) Es un gen ligado al cromosoma X. Podría ser un

gen autonómico recesivo, pero eso sería posible si

todos los matrimonios se dieron con personas hetero-

cigotos para la enfermedad y si ésta es rara como dice

el enunciado esta alternativa es muy poco probable.

También podría ser influenciado por el sexo.

c)

d)La probabilidad de que la mujer sea heterocigota es

½ (dado que recibió XA del padre y existe ½ de proba-

bilidad que haya recibido Xª de la madre) y la proba-

bilidad de que siendo heterocigota transmita el alelo

enfermo es ½. Por lo tanto la probabilidad de que un

hijo varón porte un alelo enfermo es ¼.

9) El Dr. Visen publicó hace años los resultados de la

herencia del color del pelaje de los gatos. Su primera

observación fue que el pelaje puede ser de color negro

o naranja, entre otros. Posteriormente al cruzar gatos

con estos colores los cruces recíprocos dieron resulta-

dos diferentes, apareciendo animales con un fenoti-

po en mosaico llamado “carey”, formado por pelos

negros y naranjas distribuidos en forma aleatoria en

todo el cuerpo

Hembras F1 Machos F1

Cruza-

miento

Hem-

bras

Ma-

chos

negro naranja carey negro naranja

1 negro negro 48 46

2 naranja negro 16 20

3 carey naranja 47 43 38 54

4 carey negro 12 21 29 35

a) ¿De qué tipo de herencia se trata?

b) ¿Por qué sólo aparecen hembras carey y no así ma-

chos?

c) ¿Cuál es la relación de dominancia entre los genes

que condicionan estos colores?

2) a) Que los dos cruces recíprocos den resultados

diferentes indica, en principio, herencia en relación

con el sexo. Fijándonos en los machos de la F1; su

fenotipo es igual al de su madre, típico deherencia

cruzada. Los hijos reciben el cromosoma X de la

madre con el alelo para negro o para

naranja, sin embargo, las hijas presentan el mismo

fenotipo «carey» en ambos cruces. De acuerdo con la

hipótesis de herencia ligada al sexo, las hijas del pri-

mer cruce tienen que ser heterozigotas, con un cro-

mosoma X materno portador del alelo para negro y

un cromosoma X paterno con un

alelo para naranja. En las hembras heterozigotas se

expresarían los dos alelos, produciendo dicho fenoti-

po en mosaico. Esto se debe al fenómeno de inactiva-

ción aleatoria de uno de los dos cromosomas X de la

hembra, que se produce en fases tempranas del desa-

rrollo (Lionización).

b) El resultado de los cruces 3 y 4 nos ayudará a con-

firmar la hipótesis. Una hembra «carey», será hetero-

zigota para negro y naranja (Xne

Xna

), y tendrá hijos

tanto negros (Xne

Y) como naranjas (Xna

Y), que es lo

que ocurre en los dos cruces. Una hembra «carey» cru-

zada con un macho naranja tendrá hijas tanto «carey»

como naranja:

Xne

Xna

x Xna

Y = Xne

Xna

+ Xna

Xna

+ Xna

Y + Xne

Y

carey naranja = carey + naranja+ naranja

+negro

En el cruce hembra «carey» con macho negro la dife-

rencia es que en lugar de hijas naranjas aparecen, lógi-

camente, hijas negras, siendo todo lo demás igual.

Los machos, al ser hemizigotos, serán siempre Xna

Y

(naranjas) o Xne

Y (negros), pero nunca podrán ser

«carey».

c) Aunque negro y naranja son alelos del mismo gen,

no se puede hablar estrictamente o deducir relaciones

de dominancia/recesividad, de herencia intermedia o

de codominancia, ya que en cada célula que produce

pelo se manifiesta uno u otro alelo, en los machos de-

bido a la hemizigosis y en las hembras heterozigotas

debido a la inactivación de uno de ellos. 10) En plantas de maíz con citoplasma de tipo T se ha identificado un gen (urf13) cuya expresión induce la

*?

I

II

V

III

IV *?

XAXa XAXa

XAXa XaY

XAY XAY XAXa

XaY XaY XaY XAY

XAY

XaY

XaY XaY XaY

XAY

XAY

XAY XAXa XAXa

XAXa XAY XAX-- XAXa

XAX--

XAX--

XAXa

XAX--

XAX--

XAY

*

I

II

V

III

IV *

37

androesterilidad. Asímismo para este tipo de plantas se han identificado dos genes restauradores nucleares dominantes (Rf1 y Rf2) cuya expresión concertada restaura la fertilidad, no habiendo restauración si sólo se expresa uno de estos genes. El gen Rf1 fue el pri-mer gen restaurador aislado y caracterizado molecu-larmente. Si se dispone de una planta con citoplasma T, homocigota para el gen Rf1 dominante, descono-ciéndose su constitución genética para el locus Rf2, a) Indique cual/es de las siguientes líneas de maíz utilizaría en sus experimentos para determinar la composición alélica del locus Rf2 en la planta incóg-nita. Justifique su respuesta, indicando qué planta usaría como padre y como madre en sus experimentos de cruzamiento, cómo espera que sea la descendencia en caso de que la planta a la que se le quiere determi-nar el genotipo sea rf2rf2, Rf2rf2 o Rf2Rf2 y por qué descarta las plantasno elegidas. i. T rf1 rf1 Rf2 Rf2 iv. N Rf1 Rf1 rf2 rf2 ii. N rf1 rf1 Rf2 Rf2 v. T Rf1 Rf1 Rf2Rf2 iii. T Rf1 Rf1 rf2 rf2 vi. N Rf1 Rf1 Rf2 Rf2 Nota: N corresponde a citoplasma normal, T corres-ponde a citoplasma androestéril. b) Un mejorador recibe una planta con una nueva fuente de androesterilidad citoplasmática y al cruzarla con una línea restauradora para los genes Rf1 Rf2 ob-tiene toda la descendencia estéril ¿Cómo explica este resultado? R) a) Utilizaría la planta iv como padre que es fértil (citoplasma normal) y aparte es homocigota dominan-te para RF1 (este locus no está en estudio pero es ne-cesario para restaurar fertilidad) y rf2 doble recesivo para evaluar la composición de la descendencia al cruzarlo por la planta incógnita (T Rf1Rf1 -- --) Si la descendencia es 100% estéril, la planta era T Rf1 Rf1 rf2 rf2 (Rf1 solo no restaura la fertilidad) Si la descendencia es 100% fértil la planta era T Rf1Rf1 Rf2Rf2 Si la descendencia es 50% esteril, 50% fértil, la planta era T Rf1Rf1 Rf2rf2 Las otras líneas no darían resultados conclusivos i), iii): no dan polen viable ii) , v), vi): toda la descendencia es fértil pero no se puede establecer que alelos Rf2/rf2 componen el lo-cus incógnita b) Es portadora de un gen de androesterilidad distinto al urf13 para el cual la línea retauradora no posee el gen restaurador necesario

Genómica

1) Mediante el uso de marcadores moleculares se

construyó un mapa de ligamiento del ratón, usando

como genotipos parentales de la población de mapeo a

dos líneas endocriadas que presentan una marcada

diferencia respecto a su predisposición a contraer

Alzheimer experimental (enfermedad caracterizada

por una acelerada desmielinización a nivel cerebral).

Se localizó en dicho mapa de ligamiento, además, un

locus (gen de expresión recesiva) involucrado en di-

cha predisposición. El mencionado gen (al que se de-

nominó alz) mapea en el cromosoma 3, flanqueado

a 10 cM y 13 cM por dos marcadores RFLP humanos

denominados hs3 y hs1, respectivamente (Fig. 1) (No-

ta: fue posible usar sondas humanas ya que muchas

sondas de esta especie hibridan con DNA de ratón

debido a su alto grado de parentesco). Recientemente,

un grupo de investigación, clonó molecularmente en

humanos, un gen (gdm) involucrado en la regulación

de la producción de mielina a nivel cerebral y lo ma-

peó en el cromosoma 8, flanqueado a 12cM y 15cM,

por los mismos marcadores hs3 y hs1. En la publica-

ción de dicho trabajo, los autores reportaron la locali-

zación cromosómica del gen y su secuencia completa.

Al leer este trabajo, se sospechó (y con fundamento)

que el gen de ratón podría ser un homólogo del gen

humano. Lamentablemente ambos grupos nunca cola-

boraron para que esto se pudiera demostrar.

a) ¿Cuáles fueron los fundamentos de la sospecha?

b) ¿Qué estrategia utilizaría usted para clonar, al me-

nos parcialmente, al gen supuestamente homólogo de

ratón (recuerde que el gen de ratón está mapeado pero

no está secuenciado y no se sabe si la similitud de se-

cuencia es alta, ni tampoco si hibridan entre sí)?

c) ¿Cómo verificaría, funcionalmente, si el gen de

humanos cumple la misma función que su homólogo

en ratones? Diseñe un experimento recordando que

los genes y las proteínas humanas son funcionales en

ratones y viceversa.

Respuesta: a) La sintenia evolutiva (conservación

filogenética de mapas genéticos entre especies empa-

rentadas) y, tal vez, las características de los genes en

cuanto a su rol fisiológico.

b) Clonado posicional (cualquiera de sus variantes es

correcta). Otras alternativas de clonado ingeniosas

pueden llegar a aceptarse.

c) Hacer estudios de complementación en ratones

transgénicos (alz/alz, es decir homocigotas recesivos)

usando el gen humano como transgén. Espero que a

ninguno se le ocurra hacer humanos transgénicos para

Alzheimer…..

2) El clonado molecular de genes de resistencia (R) a

enfermedades en plantas es un viejo objetivo de los

fitopatólogos que trabajan en interacción huésped-

Humano

hs3

hs1

gdm

Fig. 1

15

12

cM

hs3

alz

hs1

13

10

cM

Ratón

38

patógeno. A fines de los ’90 se clonaron los primeros

genes R por estrategias de clonado posicional (ver

figura) y en la actualidad ya hay decenas de estos ge-

nes en el GeneBank y otras bases de datos. Ud se in-

volucra en un proyecto de este tipo para su tesis y tie-

ne que resolver un número de cuestiones:

En el paso se identificaron marcadores moleculares

ligados al locus a distancias genéticas del orden de los

10 cM. En el paso se obtuvieron marcadores más

cercanos de forma tal de disminuir las distancias físi-

cas para que en el paso poder trabajar con un

número no muy grande de clones.

a) ¿Con qué tipo de colecciones (libraries) de clones

se trabaja para hacer esto?

i) genómicos

ii) o de cDNA

y ¿por qué?

b) ¿Qué tipo de vectores se utilizan (plásmidos, fagos,

cósmidos, BAC o YAC) y porqué?

c) Suponiendo que los marcadores moleculares em-

pleados (M1, M2, M3 y M4) son RFLPs ¿Cómo se

hace (metodológicamente) para identificar los clones

1, 2, 3 y 4 de la figura y su ordenamiento posicional

(mapa fisico)?

d) ¿Cuál es el tamaño físico aproximado (en kilo-

pares de bases) de 1 unidad de mapa genético (1 cM)

en el ejemplo de la figura?

¿Por qué esta diferencia de unidades? ¿Cómo se mide

cada una de ellas?

Una vez identificados los clones correspondientes a

esta región cromosómica, sus insertos se subdividen

en tamaños más chicos (paso ) para su subclonado y

transferencia a plantas (paso ) para evaluar a estas

últimas fenotípicamente como R (resistentes) o S

(sensibles) a la enfermedad.

e) Para introducir los segmentos de ADN en plantas

¿se requiere de algún paso de subclonado en vectores

especiales? ¿Se requiere, dentro de lo anterior, mo-

dificar el promotor y el terminador? ¿Por qué? ¿Se

debe tener alguna consideración acerca del genotipo

que se va a transformar? Es decir ¿se puede usar un

clon de la misma planta que se usó para clonar el gen

de resistencia?

En el último paso (el ) se secuencian los insertos, se

identifican las ORF (secuencias abiertas de lectura)

presentes, las que se constituyen en candidatos a ge-

nes R.

f) ¿Cómo se identifica una secuencia ORF en un in-

serto?

g) ¿y si hay más de una, cómo me doy cuenta de la

correcta?

h) Bioinformáticamente ¿de qué manera puedo asig-

narle una posible función al gen?

Rta: a) Genómicos porque tengo representada una

copia exacta del segmento cromosómico que estoy

identificando, incluyendo regiones no codificantes

que me van a servir para empalmar (identificar sola-

pamientos entre clones) las secuencias con las que se

arma el mapa físico de la región. Si usara clones de

cDNA, no podría empalmar un clon con otro porque

no habría secuencias comunes entre ellos.

b) BACs o YACs porque son los que me permiten

contener insertos más grandes y así poder tener re-

prensada la región cromosómica en el menor número

de clones posible.

c) Las sondas utilizadas para RFLP pueden utilizarse

como sondas para inspeccionar (“screenear”) la geno-

teca y así identificar los clones que se corresponden al

segmento cromosómico en estudio. El ordenamiento

de los insertos lo puedo deducir de estas hibridacio-

nes. Sé que el orden deducido del mapa genético es

M1-M3-M4-M2. El mapa físico, en cambio, sólo me

permite ubicar M3 y M4 porque no tengo clones que

abarquen a M1 y M2 (+ el gen que quiero clonar) y

sean contiguos a M3 y M4. Por lo tanto, el inserto del

clon 1 (que sólo hibrida con M3) tiene que estar ubi-

cado en un extremo y así sucesivamente. La ocurren-

cia de insertos que hibridan un marcador y al gen

(clones 3 y 4) facilitan este ordenamiento.

d) 600-700 kpb / 0,2 cM = 2000 – 3500 kpb

Porque uma proviene del mapeo genético que se reali-

za mediante cruzamiento y recuento de recombinantes

(unidades de recombinación o cM) y la otra por ma-

peo de restricción donde se comparan los tamaños de

los insertos com estándares de tamaño molecular en

kilo pare de bases.

e) Si se decide utilizar transformación mediada por

Agrobacterium tumefaciens, se requiere subclonarlo

en un vector Ti. En el caso de usar biolística (cañón

génico), no haría falta subclonar en ningún vector es-

pecial. No se requiere cambiar secuencias regulatorias

porque estamos trabajando con genes y secuencias

nativas y el experimento no requiere cambiar la regu-

lación de su expresión. No se puede elegir un clon de

la planta de la cual se clonó el gen porque sería resis-

tente independientemente del inserto que se le intro-

39

duzca. Debería elegirse un genotipo susceptible a la

enfermedad.

f, g y h) Identificando codones de iniciación (ATG) y

terminación (alguno de los 3 codones STOP) con pro-

gramas informáticos. Esto se podría complementar

mediante la identificación de secuencias consenso de

promotores, terminadores, splicing, etc.Mediante el

uso de BLAST y comparación con otras secuencias ya

publicadas. 3) Dos variedades puras de maíz (A y B) pueden ser distinguidas por una serie de RFLPs, los cuales dan los siguientes patrones:

Un consorcio internacional de secuenciación del ge-

noma del maíz de otra variedad, le pide que usted le

envíe sondas para poder “anclar” una colección de

BACs al mapa genético. Usted conoce la localización

en el mapa genético de los 7 RFLPs de la figura y sa-

be, además, que las enzimas utilizadas no cortan de-

ntro de los fragmentos utilizados como sonda. ¿Cuáles

sondas enviaría y por qué? Rta: Enviaría las sondas correspondientes a los RFLPs 213, 48 y la 1112 dado que parecen ser de co-pia única. Evitaría las demás porque parecen hibridi-zar con más de una región del genoma y por lo tanto podrían inducir al error al hibridizar con BACs que no son contiguos. 4) El Dr. Lirón estudió la duración de la fase alfa en el sueño de ratones y encontró un mutante, al que llamó sleepy, cuya fase alfa duraba 2 horas, mientras que en los ratones salvajes la misma es de 4 horas. Al cruzar un sleepy con otro ratón salvaje, la mitad de los des-cendientes resultó mutante y la mitad salvaje. a) El ratón analizado ¿era homocigota o heterocigota para el gen sleepy? ¿Se trata de un alelo dominante, recesivo, codominante o semidominante? Justifique su respuesta. Al concurrir a un congreso internacional de sonambu-lismo, Lirón se encuentra con un colega que encontró otro mutante similar. El investigador decide verificar si el gen involucrado es el mismo que él encontró. Para ello, utiliza una línea homocigota para el gen sleepy y la cruza con los ratones, también homocigota para el gen en cuestión, del colega. Todos los ratones de la F1 tuvieron sueño alfa reducido. Luego cruzó la F1 con ratones salvajes. De los 200 descendientes que obtuvo, 180 presentaron sueño alfa reducido mientras que 20 presentaban sueño normal. b) Los alelos mutantes encontrados ¿pertenecían am-bos al mismo gen? Justifique su respuesta. En caso que los genes fueran distintos ¿estarían ligados? ¿a qué distancia? El siguiente objetivo del Dr. Lirón decidió mapear el gen mutado. Para ello, utilizando 200 marcadores mo-leculares, logró ubicarla entre dos marcadores M1 y

M2 separados entre sí por 0,3 cM (aproximada-mente 600.000 pb). Después, el Dr. Lirón construyó una genoteca de BAC y encontró 4 BACs solapantes (A-D) que abarcaban toda la región entre los marcado-res M1 y M2:

Con estos BACs (que habían sido obtenidos utilizando DNA genómico de un ratón sleepy homocigota) el Dr. Lirón generó 4 líneas transgénicas (una para cada BAC: LA, LB, LC y LD respectivamente) transfec-tando células de un ratón salvaje. Los ratones de las líneas LB y LC tuvieron un sueño reducido de 2 horas, igual a la de sleepy mientras que los ratones de las líneas LA y LD presentaban duraciones de sueño similares a los normales. c) ¿Qué características deberían tener los marcadores moleculares utilizados por el Dr Lirón para realizar este mapeo? ¿De qué tipo de marcadores se trataría, probablemente? ¿Cómo explica los resultados obteni-dos? ¿En qué región del mapa que se presenta se en-cuentra el gen mutado? d) ¿Hubiera obtenido los mismos resultados transfec-tando ratones sleepy con BACs procedentes de ratones salvajes? ¿Por qué? Durante el tiempo que le tomó realizar todos estos experimentos, salió publicado el borrador del genoma de ratón (salvaje) por lo que, basado en la secuencia de la región en la que determinó que estaba su gen mutante, encontró 3 posibles genes. MM_213: secuencia homóloga a un gen de Danio re-rio (pez cebra) pero careciendo promotor. MM_437: gen constitutivo involucrado en la glucóli-sis. MM_854: gen de función desconocida que presenta enhancers propios de genes que se expresan en el sis-tema nervioso central. e) ¿Cómo se hizo, bioinformáticamente hablando, pa-ra adjudicar estas funciones hipotéticas a estos 3 ge-nes? Explique, si resulta pertinente, si debe emplear técnicas moleculares adicionales y programas in-formáticos. f) ¿Cuál o cuáles elegiría como genes candidatos a estar relacionados con el sueño? Respuestas esperadas: a) Heterocigota. Si estas mutaciones se pueden detec-tar fenotípicamente es porque son dominantes. b) Si se tratara del mismo gen la F1 tendría ambos alelos del mismo gen mutantes (homocigota). Al rea-lizar la cruza de la F1 con una cepa salvaje, todos los ratones (salvo que haya recombinación intragénica que es muy poco probable) resultarán heterocigotos: -la mitad para la mutación de la línea sleepy

M1 M2

A

BC

D

100 kpb

M1 M2

A

BC

D

M1 M2

A

BC

D

100 kpb

40

-la otra mitad para la mutación de la línea del colega Dado que ambas mutaciones son dominantes, todos los ratones de la descendencia deberían tener sueño reducido. Dado que éste no es el caso (hay un 10% de ratones salvajes) podemos descartar que se trate del mismo gen. Si el gen mutado es el C/c y el mutado en la otra línea es el R/r entonces la F1 de la cruza será CcRr. Al cru-zar con ratones salvajes (ccrr), si los genes no están ligados tendremos ¼ CcRr, ¼ Ccrr, ¼ ccRr y ¼ ccrr donde todos los genotipos salvo el ccrr (que tiene memoria normal) tienen memoria reducida (algunos genotipos más que otros). Es decir que si los genes no están ligados esperaríamos tener ¼ de ratones con memoria normal, lo cual no es el caso. Por lo tanto, los genes están ligados. CCrr x ccRR

C r x c r c R c r Las gametas parentales del cruzamiento prueba son Cr y cR mientras que las recombinantes son CR y cr. Da-do que en la descendencia del cruzamiento prueba 20 individuos son ccrr, entonces un 10% de las gametas producidas por la F1 son cr. Un porcentaje equivalen-te debe ser CR que es el producto complementario de recombinación. Es decir que el 20% de las gametas son recombinantes con lo que la distancia entre los genes es de 20 u.m. c) Debió utilizar marcadores STS, es decir marcadores de localización única. Si un BAC porta el alelo mutante al generar la línea transgénica, ésta tendrá insertado en algún lugar del genoma. Como el alelo mutante es dominante se va a poder expresar aún en presencia de uno (suponiendo reemplazo alélico) o dos (suponiendo integración ectópica) copias del alelo salvaje. Dado que los BACs B y C presentan el fenotipo mu-tante ambos BACs contienen al gen completo. Por este motivo podemos localizar al gen en la zona de solapamiento de los BACs B y C (de aproximadamen-te 100 kpb). d) No, si hubiese usado BACs procedentes de ratones salvajes para transfectar ratones sleepy, los ratones transfectados hubiesen sido todos con fenotipo sleepy ya que este alelo es dominante sobre el alelo normal. e) Se secuenció la región de solapamiento de los clo-nes BAC B y C, subclonados en vectores plasmídico, se realizó un ensamblado de los mismos y los contigs obtenidos fueron analizados para la detección de mar-cos de lectura abiertos y se compararon los mismos con secuencias en bases de datos, utilizando progra-mas de comparación local como BLASTX y BLASTN pudiendo predecir en base a la similitud de las secuencias contenidas en esa región con secuen-cias de función conocida disponibles en bases de datos f) El MM_213 no es un buen candidato porque como le faltan secuencias presentes en los promotores, posi-blemente no se transcriba (y sea un pseudogen). El MM_437 tampoco es un buen candidato porque es un gen constitutivo y fundamental para la glucólisis. Su mutación debería afectar más cosas que el sueño y

de hecho posiblemente dicha mutación sea letal en homocigosis. El MM_854 es un buen candidato porque es un gen que posiblemente se exprese diferencialmente en sis-tema nervioso central. 5) Carol Martinson recibió unas muestras de aránda-nos de un productor que aducía que las plantas que había comprado en la empresa Truchex (SRL, Socie-dad de responsabilidad MUY limitada) no rendían ni tenían la calidad prometida. Para genotipificar, Carol comparó los patrones de marcadores moleculares con la muestra problema (número 2, supuestamente perte-neciente a la variedad O’Neil) con muestras de mate-rial de multiplicación del INTA Concordia de O´Neal y de otra variedad muy usada (Misty), tanto de mate-rial in vitro como de las plantas derivadas de micro-propagación puestas a campo, obteniendo el siguiente electroforetograma:

Fig Patrones de amplificación de RAPDs. Las diferen-tes calles representan los productos de amplificación obtenidos para las distintas muestras: 1 (O’Neal, certi-ficado, in vitro), 2 (supuesto O’Neal), 3 (O’Neal de campo), 4 (Misty de campo) y 5 (Misty, certificado, in vitro). a) ¿Qué significan las bandas marcadas con flechas negras que Carol dibujó sobre la foto? ¿En qué se di-ferencian de las bandas marcadas con flechas blancas? ¿Cuáles de los 2 tipos de bandas fueron útiles para este análisis? b) ¿Pertenecía la muestra 2 a la variedad O´Neal o no? Computando las bandas y armando una base de datos, Carol calculó la similitud entre las muestras y obtuvo el siguiente dendrograma: c) Ubique las muestras 2, 3 y 4 en los casilleros en blanco del dendrograma. d) En las comparaciones, Carol incluyó material mi-cropropagado in vitro y de campo ¿Existe alguna razón por la cual podrían ser diferentes y explicar lo que pasó?

41

Rta: a) Las flechas negras indican las bandas polimór-ficas (variables) y las blancas indican bandas mono-mórficas. Las negras fueron las útiles porque permiten establecer DIFERENCIAS además de similitudes. b) No c) 3, 4 y 2 d) Para los brillantes: podría haber variación somaclo-nal (mutación causada por el hecho de cultivar in vi-tro)

Desarrollo, epigenética, etc.

1) Las etapas más tempranas del desarrollo en moscas se explican, en parte, por la distribución subcelular de los transcriptos de genes maternos como el bicoid (bcd) y el nanos (nos), dado que los mismos están ad-heridos al citoesqueleto. Con el objeto de estudiar por donde se une un ARN mensajero al citoesqueleto, se realizaron una serie de construcciones quiméricas:

1 Promotor nos

5’UTR nos Codif. nos

3’UTR bcd

2 Promotor nos

5’UTR nos Codif. bcd

3’UTR nos

3 Promotor nos

5’UTR bcd Codif. nos

3’UTR nos

UTR (untranslated región) simboliza el DNA que es-pecifica los extremos 5’ y 3’ no codificantes del mRNA. Como puede observarse, se reemplazaron 3 segmentos de nos (de a uno por vez) por los respectivos segmen-tos de bcd. Con los mismos, se transformaron genéticamente moscas silvestres y se analizaron los embriones tem-pranos por hibridación in situ de mRNAs en el em-brión utilizando como sonda un cDNA de nos (segun-da fila) o bcd (tercera fila). En la primera fila, se ob-serva el aspecto del embrión en una etapa más avan-zada. La figura siguiente muestra el resultado que se obtuvo con la construcción 1 en moscas silvestres (primera columna) y moscas transgénicas (segunda columna).

a) Describa brevemente las diferencias observadas entre transgénicas y normales. b) ¿Cómo interpreta que, en la transgénica, la sonda detecta mRNA de nos en la parte anterior (izquierda) del embrión (además de en la parte posterior)? c)¿Por qué el transgénico con la construcción 1 pre-senta el fenotipo mutante bicoid? d) Brevemente ¿qué resultados esperaría con la cons-trucción 3? e) ¿Eesperaría resultados diferentes si, en la construc-ción 1, se reemplaza el promotor nos por el promotor bcd? ¿Por qué? 3) a) fenotipos: normal y bicoid. Hibridación in situ con sonda nos: hibrida en la parte posterior en el nor-mal, anterior y posterior en el transgénico. Con la sonda bcd, no se detectan diferencias. b) Porque la secuencia 3’UTR es la responsable de la unión a proteínas del citoesqueleto. La secuencia 3’UTR bcd es diferente a la nos y “pega” el mRNA del transgén nos a la parte anterior. Debe recordarse que el transgén se adiciona y no reemplaza a los genes normales presentes en la mosca. Por eso se detecta, como era de esperar, mRNA de nos en la parte poste-rior igual que en el normal. c) Es consecuencia de la expresión, en la parte ante-rior, del relocalizado producto del transgén nos, que interfiere con la del bcd y el resultado es un embrión con 2 colas (bicoid) d) Todo daría igual que en el normal porque la región 5´ no codificante, no tiene función en la localización subcelular. e) No, porque ambos genes son del mismo tipo (ma-terno) y se expresan en forma relativamente sincroni-zada y similar. 2) Muchos tipos de cáncer humano tienen su causa en la hipometilación del ADN. Para estudiar este fenó-meno se generaron ratones transgénicos conteniendo alguna de estas construcciones: i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitu-tivo, proveniente de un adenovirus) controlando la expresión de la secuencia estructural de la metiltrans-ferasa

1 (Dnmt1) en orientación antisentido

ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (consti-tutivo, proveniente e un adenovirus) controlando la expresión de la secuencia de la metiltransferasa

1

(Dnmt1) en orientación sentido iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo pro-veniente del fago controlando la expresión de la se-cuencia estructural de la metiltransferasa

1 (Dnmt1) en

orientación sentido. iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo pro-veniente del fago controlando la expresión de la se-cuencia estructural de la metiltransferasa

1 (Dnmt1) en

orientación antisentido Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilación del ADN en ratones y que su sobre-expresión permite metilar exhaustivamente todo potencial ADN metila-ble y que su disminución causa una sustancial hipo-metilación del ADN en todos los tejidos. a) ¿Cuál de los 4 vectores usaría? ¿Por qué?

42

b) En base al vector elegido, ¿cómo espera que sea el grado de metilación general del ratón transgénico? Explique el mecanismo c) ¿Con cuál de las siguientes técnicas corroboraría que el ADN está hipometilado? Justifique: i) digestión con sendas ER que reconocen sitios meti-lados y no metilados, respectivamente, seguido de Southern Blot con la sonda Dnmt1 ii) ensayo de protección a la digestión por ADNasaI iii) preparación de ARN de ratón salvaje y ratón transgénico, seguida de Northern Blot con la sonda Dnmt1 iv) digestión con ER que reconocen sitios metilados, seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insu-lin-like growth factor-2, conocido gen que sufre im-pronta génica) v) secuenciación bisulfítica genómica directa de Dnmt1y/o igf2 vi) secuenciación bisulfítica del cDNA de Dnmt1y/o igf2 Para la/s técnica/s elegida/s indique los controles que haría. El ratón transgénico desarrolló tumores en varios teji-dos. Se determinó que el gen Tm, candidato a causar tumores en hígado, se encontraba hipometilado en estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos, Tm1: sin sitio para EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI. d) ¿Cómo haría para probar que Tm sufre impronta (imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con ratones homocigotas como con heterocigotas. e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm en el macho ¿cómo sería la proporción de Tm1 y Tm2 metilados y no metilados en la F2, es decir los nietos de un cruzamiento entre ratones ♂ homocigotas para Tm1 y ♀ Tm2? Respuesta a) El i) porque es el único que tiene un promotor que se expresa en células eucarióticas y tie-ne potencialidad de reducir la actividad de mutilación bloqueando la traducción del gen que codifica la en-zima Dmnt 1. Contestación no necesaria: Podría venir bien usar al vector ii) pero sólo como CONTROL contrastante del experimento. Las construcciones de los vectores iii) y iv) no se expresarían en células eu-carióticas porque sólo funciona en bacterias. b) Altamente reducida. El RNA antisentido (comple-mentario) de Dmnt 1 formará una doble cadena de RNA con el mensajero nativo dificultando su traduci-bilidad. Al reducirse la cantidad de enzima, se reduce también el efecto de la misma. c) La v) dado que este tipo de secuenciación permite detectar nucleótidos metilados. Se debe secuenciar un gen ya caracterizado como metilado. No sabemos si éste es el caso del gen Dmnt1 y lo más probable es que no lo sea. En todo caso, Dmnt1 puede servir como control (no metilado). En realidad, el control más im-portante es comparar con la secuenciación común (que es insensible a la metilación) y (como se indica después) ratones transgénicos vs no transgénicos. La iv) sirve si se compara el patrón de restricción de ratón transgénico vs no transgénico. También podría ser aceptada como válida si se explica que se usa ER que NO reconocen sitios metilados, además de los

metilados para así comparar ambos patrones, dado que usar sólo una enzima que sí reconoce sitios meti-lados, no es capaz de diferenciarlos de los no metila-dos. Una complicación (que no es necesario explicitar en la respuesta correcta) es que los genes metilados por imprinting tienen una copia (epialelo) metilado y otro no metilado. d) Cruzaría 2 homocigotas: por ej. ♂ homocigotas para Tm1 y ♀ Tm2. Después, analizaría en la F1 la correspondencia entre metilación (por ej. por secuen-ciación bisulfítica que, además, me revelará la presen-cia/ausencia del sitio EcoRI en el epialelo metilado). (La otra alternativa es una doble digestión con ER sensible/insensibles a metilación + EcoRI seguido de Southern). En base a cual alelo aparezca metilado de-terminaré si el imprinting es paterno o materno. La confirmación del imprinting se puede hacer realizando un cruzamiento “prueba” con el parental que no metila sus gametas. Debería ver un 50% de la progenie con metilación para cada alelo. e) 25% de individuos Tm1 homocigotas con una copia de las 2 metiladas (Tm1

m/Tm1), 25% Tm2 homocigo-

tas ídem (Tm2m/Tm2), 25% de heterocigotas con meti-

lación en Tm1 (Tm1m/Tm2) y 25% de heterocigotas

con metilación en Tm2 (Tm2m/Tm1).

3) Los genes fushi-tarazu (ftz) y engrailed (en) codifi-can factores de transcripción con homeodominio y pueden producir la expresión de otros genes. Ambos genes actúan aproximadamente en el mismo momento durante el desarrollo y en la misma región para espe-cificar destinos celulares en los segmentos corporales. Estudios experimentales de mutantes evidenciaron que en embriones ftz (-), no hay proteína engrailed mientras que en embriones en (-) la expresión de ftz es normal. i) ¿Regula engrailed la expresión de fushi-tarazu o sucede lo contrario? ii) Indique cuando se expresan estos genes y cual es la función principal de cada uno de ellos. iii) ¿Se expresan estos genes durante toda la vida del organismo? En caso afirmativo justifique. Rta: 4) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila me-lanogaster participan varias moléculas conocidas co-mo morfógenos, siendo en las primeras etapas, de origen materno (los mRNAs que codifican para dichos morfógenos se traducen en el huevo, pero provienen de las células nutricias maternas). Ejemplo de esto y responsables del establecimiento del eje antero-posterior son: -en la parte anterior del embrión, BICOID (bcd) y más tardíamente HUNCHBACK (hb), productos de los respectivos mRNA maternos. -en la parte posterior del embrión, NANOS (nos) y más tardíamente CAUDAL (cd), productos de los res-pectivosmRNA maternos. Se demostró también que: -la proteína bcd reconoce el 3’UTR del mRNA de cd y enla región promotora del gen hb -la proteína nos reconoce el 3’UTR del mRNA de hb. I) ¿Qué tipo de acción presentan bcd y nos según lo comentado anteriormente? Para contestar complete el siguiente esquema con flechas de unión: (conven-

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ciones: activación, ---| inhibición).

II) Con toda la información que tiene acerca de bcd, complete los fenotipos que espera observar en los ex-

perimentos de la Fig asignando en cada caso, alguna de las 4 opciones que se muestran debajo de la figura, en donde se ha ensayado el agregado de mRNA bcd en embriones con diferentes fondos genéticos En la Figura siguiente, complete (con flechas) el esquema de los resultados de inyección de mRNA de bcd.

Rta I)

Explicación: bcd y nos son los morfógenos de la parte anterior y posterior: bcd actua como factor de trans-cripción para hb regulando positivamente su transcripción, pero también es un inhibidor de la traducción del morfógeno cd, que es más tardío. Análogamente, nos es un inhibidor del morfógeno más tardio de la parte ante-rior, hb. II) Explicación: bcd es el morfógeno principal anterior, ya que donde se coloca, se generan zonas que darán lugar a estructuras anteriores (cabeza y torax). El esquema del primer experimento sería análogo a una comple-mentación (mutante bcd-, con fenotipo WT por el agregado del morfógeno anterior en la zona correspondien-te).

Desarrollo normal Desarrollo en mutante bcd- inyectado adelante inyectado al medio iny. atrás en salvaje

Las 4 opciones para los 3

casos incógnita

? ? ?

bcd nos

hb cd mRNA hb

mRNA cd gen

HB