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ACLARACIONES DEL TEMA 5: RIA/IRMA

1. EN EL PUNTO :

Quiero que tachéis el párrafo siguiente tal y como os lo muestro, y que leáis las siguientes aclaraciones:

5.2 RIA No competitico o RIA de Sandwich.

Recientemente se ha introducido el análisis inmunorradiométrico no competitivo conocido como técnica

de “sándwich”.

2. ACLARACIONES DE LAS TÉCNICAS DE RIA /IRMA

Ambas son técnicas utilizadas para cuantificar sustancias utilizando radioisótopos y una reacción

tipo antígeno anticuerpo.

Inicialmente se desarrolló el RIA competitivo para la determinación de la concentración de una

sustancia (normalmente que se encuentra en concentraciones muy bajas, del orden de picomoles, en una

mezcla compleja de otras sustancias).

La condición precisa para poder cuantificar esta sustancia por RIA, es la posibilidad de que exista un

anticuerpo que se una específicamente con ella (ver los apuntes) y es el antígeno el que se marca

radiactivamente.

Posteriormente se desarrollaron técnicas no competitivas, tipo sándwich (ver apuntes).

Cuando en las técnicas no competitivas, en lugar de marcar el antígeno es el anticuerpo el que se

marca, la técnica se denomina IRMA.

La confusión viene debido al hecho de que hay autores que estas técnicas en dos grupos:

-Competitivas. RIA (Antígenos marcados) -No competitivas: IRMA (Anticuerpos marcados)

Esta clasificación es la más ampliamente utilizada, ya que son las que tienen mayor aplicación

clínica.

No obstante, tal y como aparece en los apuntes, existe RIA no competitivo, y IRMA

(competitivo).

La diferencia entre un RIA competitivo y un IRMA competitivo es que en el RIA, se marca el

antígeno y en el IRMA se marca el anticuerpo (no es tipo sándwich).

La diferencia entre RIA no competitivo y un IRMA no competitivo es que en el RIA, se marca un

anti-anticuerpo y en el IRMA se marca el anticuerpo.

Las técnicas tipo sándwich no puede emplearse en la determinación de moléculas pequeñas (ej.

esteroides) que poseen baja capacidad antigénica, ya que en general se requiere que posean varios

epitopes (para que puedan unirse al menos dos anticuerpos). Este tipo de ensayo requiere de dos

anticuerpos específicos (mono ó policlonales) dirigidos contra epitopes diferentes del antígeno.

Ambos anticuerpos deben encontrarse en altas concentraciones (en exceso).

Ventajas del IRMA no competitivo frente al RIA competitivo:

•Posee mayor sensibilidad que el RIA. Al utilizar anticuerpos en exceso, el IRMA es capaz de detectar

antígeno en muy bajas concentraciones.

•Es más fácil marcar radiactivamente anticuerpos (como utiliza el IRMA) que marcar radiactivamente

antígeno (como requiere el RIA). Los anticuerpos marcados tienen mayor estabilidad que los antígenos

marcados.

Desventajas del IRMA no competitivo frente al RIA competitivo:

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•Requiere de mayor número de pasos, por ejemplo necesita lavados adicionales.

• Utiliza generalmente anticuerpos monoclonales (Mab), que son más laboriosos de obtener que los

anticuerpos policlonales (Ac).

En el RIA se utilizan anticuerpos policlonales.

En el RIA basta con que tengan un determinante antigénico.

3. ACLARACIONES SOBRE EL RIA competitivo:

Ya hemos mencionado que en el RIA competitivo el Ag a cuantificar es añadido junto con el antígeno

marcado y ambos compiten con el anticuerpo.

Anticuerpo anti-Ag de interés se agrega en concentraciones limitantes con el fin de que se

establezca la competencia entre Ag y Ag*.

Podemos entonces hablar de una fracción unida (complejos Ag-Ac y Ag*-Ac) y de una fracción libre

(moléculas de Ag y Ag*).

Si con un método

adecuado separamos la fracción

libre de la unida, podremos medir

la radioactividad presente en cada

una de estas fracciones. Cuanto

mayor haya sido la cantidad de Ag

presente en la muestra original,

mayor será la cantidad de

complejos Ag-Ac y menor la de

complejos Ag*-Ac formados, y

mayor será la cantidad de Ag*

libre.

Preparando simultáneamente una curva patrón (o de desplazamiento) con cantidades conocidas y crecientes del Ag (patrón, es decir Ag de concentración conocida). Evidentemente, todos los tubos,

incluyendo los que contienen la

muestra, deberán llevar la misma

cantidad de Ac y de Ag* dado que

la única variable del ensayo debe

ser el Ag de la muestra, y deberán

ser sometidos a las mismas

condiciones de incubación y

separación. Entonces, a mayor

concentración de Ag más se

desplaza el Ag* y menos

complejos Ac-Ag*. Se construye

entonces la curva de

desplazamiento.

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4. TRANSFORMACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO A UNA RECTA

En estos ensayos se obtiene una curva decreciente si es competitivo y creciente si es no competitivo.

Dado que las interpolaciones sobre curvas no son precisas se recurre a un tratamiento matemático

de los datos que transforma la curva en recta para trabajar con menor error.

Este procedimiento se conoce como método

LOGIT LOG. En lugar de representar las cpm o PB

(porcentaje de ligamiento) (ver apuntes). Se calcula el Logit T, para ello se calcula el logaritmo neperiano de

(T/1-T) como aparece en la figura y se representa frente

al logaritmo decimal de la concentración de Ag, de esta

forma al representar los valores en lugar de una curva se

obtiene una recta.

Por otro lado, cada vez que se realice un ensayo

deben considerarse las uniones inespecíficas.

Las uniones inespecíficas son las uniones del Ag* a otras sustancias que no sean el Ac. Para ello

utilizamos tubos procesados de la

misma manera que

los restantes pero que carecen del

Ac (tubos blanco, ver apuntes). Toda

unión que se observe en estos tubos

se deberá a la fijación del Ag y Ag* a

moléculas distintas al Ac. El valor de

esta unión inespecífica se sustrae a

los tubos restantes, ya que se asume

que en todos los tubos ocurre en la

misma proporción.

EJEMPLO UN ENSAYO RIA Se realiza un RIA para determinar la

concentración de LH en 2 muestras

de suero (A y B). Los datos obtenidos

se muestran en la siguiente tabla:

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Todos los tubos deben tener igual volumen final, lo que se consigue completando con solución buffer.

Calcule las concentraciones de LH en A y B (en mUI/ml) utilizando una representación gráfica.

Resolución: Primero hay que promediar los valores de radioactividad (cpm) para cada par de duplicados. La unión

específica de cada tubo se obtiene restando el promedio de la unión inespecífica [(396+418)/2=407]. Se

hacen los cocientes entre el promedio de cada punto y el de la unión máxima, tanto para la curva como

para las muestras a determinar. A este cociente se lo denomina T = cpm unido / cpm unión máxima.

Se calcula el valor de Logit T:

Logit T = ln (T/1-T)

Se hace la representación gráfica de Logit T en función de los logaritmos de la concentración de LH

(eje x: log [LH]; eje y: Logit T).

Entrando a la recta con el valor de Logit de las muestras a determinar, se obtiene el valor del

logaritmo de la concentración de LH, a partir del que se calcula la concentración de LH (antilogaritmo).

5. AMPLIACIÓN SOBRE EL DETECTOR DE CENTELLEO SÓLIDO/ LÍQUIDO

En el RIA, los elementos radioactivos frecuentemente utilizados para marcar los Ag son: 125

I y 3H

(tritio).

El 125

I posee un exceso de energía y para ganar estabilidad desintegra emitiendo fotones γ. Como

los fotones no poseen masa, su interacción con la materia es pobre, por lo que pueden recorrer grandes

distancias antes de colisionar con moléculas del medio circundante (tienen alta penetrancia). El número de

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desintegraciones que el 125I emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador de centelleo

sólido.

Este instrumento de medición lo que determina es el número de coaliciones que se producen entre

los fotones γ emitidos y un cristal de NaI, en otras palabras determina cómo interacciona con la materia.

El 125I se utiliza para marcar moléculas proteicas. La mayoría de las proteínas posee en su

estructura residuos de tirosina, y son precisamente los anillos aromáticos los que se iodinan (así como

ocurre con la tiroglobulina en la glándula tiroidea).

Las hormonas esteroideas no pueden ser marcadas con 125I, por lo que se debe recurrir a otro

elemento radioactivo mucho más pequeño, el tritio: 3H.

El 3H posee un exceso de neutrones en su núcleo y para ganar estabilidad emite una partícula

cargada llamada β-.

Esta partícula posee cierta masa y rápidamente interacciona con la materia, por lo que su

penetrancia es baja. El número de desintegraciones que el 3H emite en la unidad de tiempo no podría

jamás medirse en un contador de centelleo sólido debido a su baja penetrancia. La partícula β-

coalicionaría primero con el tubo o con el aire antes de interaccionar con el cristal.

Para ello, la materia que va a interaccionar con el 3H debe mezclarse con la muestra que posee 3H.

Dicha materia se denomina líquido centellante. El número de coaliciones entre la partícula β- y las

moléculas del líquido centellante se miden en el contador de centelleo líquido. Tanto para el contador de centelleo sólido como líquido, la eficiencia de medición no es del 100%, siempre pierde alguna que otra coalición, por lo que la medida arrojada la da en cuentas por minuto (cpm) y no en desintegraciones por minuto (dpm).

Para marcar las hormonas esteroideas lo que se hace es recurrir a una marcación isotópica,

reemplazando algunos de los átomos de H de la molécula por 3H.

En la figura se observa como ejemplo la marcación de la testosterona con 8 átomos