Agrobiotecnología

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Agrobiotecnología Curso 2011

Cultivo de tejidos vegetales IMaría Mercedes Rivero

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Micropropagación vegetal

Consideraciones técnicas de la propagaciónclonal masiva de plantas

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

Sistemas de micropropagación vegetal. Proliferación de yemas axilares o apicales

Sistemas de micropropagación vegetal. Proliferación de yemas axilares o apicales

Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemas

Sistemas de micropropagación vegetalLiberación de patógenos

Sumario

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidosvegetales

Referencias

Conservación de germoplasma

Sumario

Semillas sintéticas

Cultivo in vitro de células haploides y de embriones-Cultivo de anteras-Cultivo de polen-Cultivo de óvulos-Cultivo de embriones

Cultivo de protoplastos

Variación somaclonal

Agrobiotecnología


Técnicas del cultivo de célulasy tejidos vegetales

Agrobiotecnología


• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de cé lulas y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

- Balance de reguladores del crecimientovegetal

Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro

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• La teoría de la totipotencialidad celular , enunciadapor Haberlandt a principios del siglo XX, postula qu e toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren co ndiciones específicas referidas al medio del cultivo, relacio nes hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.

• La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización d e un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemát ico. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células previamente desdiferenciadas.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento , fundamentalmente de auxinas y citocininas .

Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales

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• Micropropagación vegetal

• Regeneración de plantas(embriogénesis y organogénesis)

• Cultivo de meristemas

• Cultivo de suspensiones de células vegetales

• Cultivo de protoplastos

• Cultivo de anteras

• Cultivo de óvulos y embriones

Técnicasdel cultivode célulasy tejidosvegetales

Agrobiotecnología


Micropropagación vegetal

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• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala.

• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperat ura, luz y fotoperíodo.

La micro-propagaciónconstituyela principal aplicacióncomercialdel cultivode tejidosvegetales

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• Propagación vegetativa rápida y a gran escala

• Uniformidad seleccionada del material clonado

• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales

• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin

• Mayor control sobre la sanidad del material propagado

• Introducción rápida de nuevos cultivares

• Conservación de germoplasma

• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal

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Alcances de la micro-propagación vegetal

Consideraciones técnicas de la propagaciónclonal masiva de plantas

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• Laboratorio- Area de preparación de medios- Area de lavado y esterilización- Cuarto estéril- Cámara de cultivo- Area de rusticación

• Material vegetal

- Plantas madres seleccionadas(preacondicionamiento)

- Explantos (elección, disección,esterilización, etc.)

• Condiciones de cultivo

- Asepsia- Recipientes- Temperatura- Luz y fotoperíodo

La micro-propagaciónrequiere unainfraestructuramínimaespecializaday condicionescontroladasde cultivo

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Compuestos inorgánicosMacronutrientes: NO4

- , PO43- , K+, Ca2+,

Mg2+, SO42-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-

CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol

VitaminasTiamina (B1)PiridoxinaAcido nicotínico (C)Biotina

AminoácidosGlicina

Reguladores del crecimientoAuxinasCitocininasGiberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite®

pH5,6 – 5,8

Esterilización1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave

Medios de cultivo: composición general

• Soluciones concentradas de macroelementos (100x)

• Soluciones concentradas de microelementos (100x)

• Vitaminas grupo B (500 ó 1000x)

• Mio-inositol (100 mg/L)

• Azúcares: sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L

• Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L

Formulaciónbásica de un medio de cultivo para tejidos vegetales

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• El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).

• En el caso de un medio sólido, la concentracióny calidad del ágar pueden tener importantes efectosen el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindiblecuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:

- Inducción de embriogénesis- Cultivo de protoplastos- Cultivo de suspensiones celulares

Consistencia del medio

Semisólido

Líquido

Propiedades físicas de los medios de cultivo

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• Intercambio gaseoso:Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resinite ��) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.

- La inducción de yemas a partir de callosde tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno

- La acumulación de etileno puede inhibirla regeneración de brotes

• pH:- Constituye un factor crítico- Se ajusta en el rango 5,5-5,8- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos

Propiedades físicas de los medios de cultivo

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Composición de medios de cultivo comúnmente usados

8,6121-ZnSO4.7H20

--0,0250,2-CuSO4

6,2135-H3BO3

--1010-MnSO4.H2O

-600---NaNO3

1.900-3002.50081KNO3

----142Ca(NO3)2

--134--(NH4)2SO4

---300-NH4H2PO4

1.650----NH4NO3

-750--65KCl

44075150200-CaCl2.2H2O

37025050040074MgSO4.7H2O

22,30,1---MnSO4.4H2O

-125150--NaH2PO4.H2O

170---12KH2PO4

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto

-

0,03

0,01

Heller

0,250,250,1-NaMoO4.2H2O

0,025---CuSO4.5H2O

0,830,751-KI

Murashige y Skoog

Gamborg(B5

Schenk y Hildebrandt

(SH)White

8,6121-ZnSO4.7H20

--0,0250,2-CuSO4

6,2135-H3BO3

--1010-MnSO4.H2O

-600---NaNO3

1.900-3002.50081KNO3

----142Ca(NO3)2

--134--(NH4)2SO4

---300-NH4H2PO4

1.650----NH4NO3

-750--65KCl

44075150200-CaCl2.2H2O

37025050040074MgSO4.7H2O

22,30,1---MnSO4.4H2O

-125150--NaH2PO4.H2O

170---12KH2PO4

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto

-

0,03

0,01

Heller

0,250,250,1-NaMoO4.2H2O

0,025---CuSO4.5H2O

0,830,751-KI

Murashige y Skoog

Gamborg(B5


(SH)White

Composición de medios de cultivo comúnmente usados

5,85,55,9pH

--10,5-Piridoxina-HCl

-0,03---NiCl 2.6H2O

-0,03---AlCl 3

0,025-0,0250,1-CoCl2.6H2O

----2,46Fe(SO4)3

27,86--15-FeSO4.7H2O

-1---FeCl3.6H2O

100-1001.000-Mio-inositol

37,26--20-Na2EDTA

--28--Sequestrene 330 Fe

----100Extracto de Levadura

--15-Acido nicotínico

0,4-105-Tiamina-HCl

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

-

Heller

30.00020.00030.00020.000Sacarosa

Murashige y Skoog (MS)

GamborgB5


(SH)White

5,85,55,9pH

--10,5-Piridoxina-HCl

-0,03---NiCl 2.6H2O

-0,03---AlCl 3

0,025-0,0250,1-CoCl2.6H2O

----2,46Fe(SO4)3

27,86--15-FeSO4.7H2O

-1---FeCl3.6H2O

100-1001.000-Mio-inositol

37,26--20-Na2EDTA

--28--Sequestrene 330 Fe

----100Extracto de Levadura

--15-Acido nicotínico

0,4-105-Tiamina-HCl

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

-

Heller

30.00020.00030.00020.000Sacarosa

Murashige y Skoog (MS)

GamborgB5


(SH)White

Reguladores del crecimiento comúnmente usadosen medios de cultivos vegetales

10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina

(kinetina)

10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábily no debería ser

autoclavada

Las citoquininasson normalmente

disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso

10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas

10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-acético

10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-diclorofenoxiacético El AIA puede ser

oxidado por células vegetales. Es

frecuentemente usadocomo única fuente de auxinas en el medio

de cultivo

Las auxinas son usualmentetituladas en solución con

NaOH

10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacéticoAuxina

10-7-10-5202,2NOAAcido β-naftoxiacético

10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoacético

10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutírico

10-7-5x10-6

10-7-10-5

Rango de concentración

(M)

Soluble en agua

Preparación de solución stock

Es termolábil, no debeser autoclavada. Es

comúnmente necesariopara la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en

suspensión. Algunasveces necesario para la

regeneración de plántulas.

364,4GA3Acido giberelicoGiberelina

219,2ZeaZeatina

ComentariosPeso

MolecularAbreviaturaNombreClase

10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina

(kinetina)

10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábily no debería ser

autoclavada

Las citoquininasson normalmente

disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso

10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas

10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-acético

10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-diclorofenoxiacético El AIA puede ser

oxidado por células vegetales. Es

frecuentemente usadocomo única fuente de auxinas en el medio

de cultivo

Las auxinas son usualmentetituladas en solución con

NaOH

10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacéticoAuxina

10-7-10-5202,2NOAAcido β-naftoxiacético

10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoacético

10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutírico

10-7-5x10-6

10-7-10-5

Rango de concentración

(M)

Soluble en agua

Preparación de solución stock

Es termolábil, no debeser autoclavada. Es

comúnmente necesariopara la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en

suspensión. Algunasveces necesario para la

regeneración de plántulas.

364,4GA3Acido giberelicoGiberelina

219,2ZeaZeatina

ComentariosPeso

MolecularAbreviaturaNombreClase

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas- Citoquininas- Giberelinas- Acido abscísico- Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultadosestán determinados por las concentracionesrelativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todosu ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en funcióndel estado fisiológico de la planta y en cadauno de los órganos de ésta.

- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Reguladoresdel crecimiento

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• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensa jero responsable de la elongación y de la respuesta foto trópica del coleoptile de gramíneas.

- Alargamiento y división celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias- Dominancia apical- Acción herbicida- Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta var ía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

• Su transporte es polar

• Auxinas sintéticas:

- Acido indol butírico (IBA)- Acido naftalen acético (ANA)- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

NOH

O

Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)

Las auxinas se emplean como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis

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• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.

• Están involucradas en variadas respuestas fisiológi cas:

- Promoción de la división celular- Promoción de la organogénesis (relación

auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

• Citoquininas endógenas:

- Zeatina (Zea)- Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:

- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuen tran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 ��g/Kg.

• Su transporte es no polar.

Las citoquininasdeterminan diferentes respuestas morfogenéticasen combinación con las auxinas

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• Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presenta ban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del ho ngo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina i dentificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberel inasdiferentes.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanoso plantas bianuales

- Crecimiento de yemas latentes- Germinación de semillas en dormición- Floración- Movilización de reservas en la semilla

• Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el em brión.

• Su transporte no es polar.

Las giberelinasfavorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes

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O

HCH3 H COOH

H

HO OH

CH3

C O

Acido giberélico (GA3)

Etapas del cultivo in vitrode plantas superiores

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Elección de una plantamadre selecta

Explantos

Desinfección superficial

Establecimiento en mediode cultivo apropiado

Transferencia a un medio de multiplicación

Formación de brotes o embrioides

Transferencia a un mediopara el enraizamiento de

los brotes

Pasaje a maceta en un invernáculo

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

ETAPA 4

El procesode micro-propagaciónde especiesvegetalesconsta de varias etapas

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Elección del explanto inicial

Escarificación

Esterilización

Semillas estériles

Germinación

% de germinación?

Disección bajo lupa

Esterilidad Medio de Hoagland

Tritón X-100 3%, 10 minHipoclorito de Na 15%, 20 min

M. apicalHojaM. axilarTalloRaízM. radicular

MS + 2,4-D

• Protocolo tipo de esterilizació n superficial de material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.

- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO)de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).

- En el caso del HgCl2, el material se debeenjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

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Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Explanto(asepsia)

Ambiente

Cultivo

• Sin respuesta

• Cultivo infectado

• Regeneración indirecta

• Regeneración directa

Respuesta

Explanto(asepsia)

Ambiente

Cultivo

• Sin respuesta

• Cultivo infectado

• Regeneración indirecta

• Regeneración directa

Respuesta

Vías morfogenéticas:organogénesis y embriogénesis

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• Posibles vías morfogenéticas:

- Organogénesis

- Embriogénesis

• Diferencias entre las dos posibles vías:

- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferenciainicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas.

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

Existen dos posibles vías morfogenéticaspara la diferenciación de novo de brotes o plantas completas

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EmbriogénesisOrganogénesis

Fotomicrografías de las dos vías morfogenéticas

d

pfpf

av

arcv

Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Explanto (disco de hoja)

Explanto (células

vegetales)

REGENERACIÓN

Suspensión celular

Embriones somáticos

ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN

GERMINACIÓN Semillaartificial

Callo

Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de yemas axilares o apicales

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• Proliferación de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicación de plantas a partirde las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas.

- La tasa de multiplicación (tm) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año a partir de una única yema inicial.

- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.

Propagaciónvegetativa a partir de yemaspreexistentes

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Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de tejidos desdiferenciados

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• Consideraciones generales:

- Callo: masa de células desdiferenciadasobtenidas a partir de un explanto cultivadoin vitro (disco de hoja, meristema,células en suspensión, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vástagos a partirde estos callos.

- Las plantas diferenciadas puedenno ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.

Resulta posibleregenerar broteso yemas a partirde tejidosvegetalesdesdiferenciadosin vitro

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Sistemas de propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta

Explanto(disco de tejido)

Explanto(suspensión de células)

Regeneracióndirecta

Regeneraciónindirecta

CalloFormación

directade brotes

Formaciónindirectade brotes

Planta regenerada

Sistemas de propagaciónvegetativain vitro

Propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta

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Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemas

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Cultivo de meristemasEl empleo de meristemascomo explantos es una posibleherramienta parael saneamientode plantasinfectadas

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Meristema apical

Meristema axilar

Domo meristemático

• Posibilitan la micropropagación de diferentes espec ies vegetales.

• Constituyen el explanto ideal para liberar de patóg enos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma.

Los meristemasson grupos de células indiferenciadas que retienenla capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos

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Aplicaciones del cultivo de tejidos: Liberación de patógenos

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- El domo meristemático no está vascularizado(muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).

- El número de partículas virales es menoren los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivode meristemas fueron obtenidas por Morel y Martinentre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

El cultivo de meristemasfacilita la eliminación de patógenos

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Mediante esta técnica es posible sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos como bacterias, hongos, virus y viroides.

El cultivo de tejidos posibilita el saneamientode las plantas multiplicadas vegetativamente Síntomas producidos

por el Tomato mosaic virus.

Partículas de Potato virus Y

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El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:

• Termoterapia

• Quimioterapia

• Cultivo de meristemas

Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro.

El tratamiento de plantas madres puede efectuarse por distintas técnicas

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• Termoterapia

El tratamiento por calor es un método eficaz para inactivar algunos virus y viroides. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivación del virus.

Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanumtuberosum a 8ºC durante 4 meses permiten obtener un 30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid (PSTV).

Consideraciones prácticas para el saneamiento de plantas madres por termoterapia

Sintomasinducidospor PSTV en tubérculosde papa

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• Quimioterapia

Esta técnica implica el tratamiento de las plantas madres o explantos (in vivo o in vitro) con las siguientes sustancias:

- Fungicidas en el caso de hongos

- Insecticidas frente al ataque de insectos

- Antibióticos en el caso de bacterias

- Inhibidores metabólicos (actinomicina D)

- Análogos de aminoácidos (fluorofeniladenina)

Aspectos prácticos del saneamiento de material vegetal por quimioterapia

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• Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patógeno considerado.

• Estas pruebas se denominan ensayos de indización (indexing) y difieren según el sistemahuesped-patógeno de que se trate.

• Se incluyen entre estas pruebas:

- Selección visual u observación de síntomas

- Empleo de hospedantes indicadores

- Métodos serológicos

- Microscopía electrónica

La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada

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• Consiste en la observación de síntomas.

• Se trata de un método impreciso.

• Resulta confiable en el caso de enfermedadesque inducen síntomas muy característicoso conspícuos.

PotatoVirus X

ColiflowerBlack Rot

Observaciónvisual

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Mosaico clorótico producido por Tomato mosaic virus en tomate

Síntomas de pie negro y podredumbre blanda causados porErwinia carotovora en papa.

Enfermedades bacterianasy/o viralescon síntomas distintivos

Tubérculo inoculadocon E. carotovora

Tuberculo no inoculadoPie negro

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Antracnosis en Fragaria spp. causada por Colletotrichum

Powdery Mildew en Solanum tuberosumcausado por Erysiphespp.

Síntomas de enfermedadescausadas porhongos

Síntomas en estolones Síntomas en frutos

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Disminución de tamaño causada por nematodes en maíz

Micrografías de un nematode del género Trichodorus(tamaño aproximado: 0,5 µM de diámetro, 1 mm de largo).

Síntomas de enfermedades causados por nematodes

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• Es una técnica frecuentemente utilizadapara detectar virus que pueden transmitirsemediante el jugo infeccioso extraído de plantas enfermas.

• Se usan como indicadoras variedadesmuy susceptibles de la especie estudiadau otras especies que desarrollan síntomascaracterísticos en un corto tiempo.

• Los síntomas inducidos en la plantaindicadora revelan la presenciadel patógeno y permiten identificarlo.

Empleo de hospedantes indicadores

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• Se basan en la alta especificidad de la reacciónantígeno-anticuerpo, por la cual un anticuerporeconoce y se combina sólo con la porción de antígeno que le dio origen.

- Pruebas inmunoenzimáticas(DAS-ELISA)

- Floculación de látex sensibilizado(partículas de látex recubiertas poranticuerpos específicos, se observaagregación de partículas con formaciónde precipitado)

- Microprecipitación (gotas de antisueroy antígeno, se observa formación de precipitado)

Métodosserológicos

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• Observación de partículas virales en extractosvegetales (dip method)

• Inmunoelectromicroscopía

• Cortes ultrafinos de tejidos vegetales (observación directa del patógeno o de anomalías citológicaso efectos histopatológicos como secuelade la presencia del patógeno)

Inclusiones virales detectadas con el microscopio óptico

Microscopíaelectrónica

Inclusión cristalina del virus delmosaico de tabaco (I) en células

epidérmicas de Nicotiana tabacum

Célula de tricoma de Vicia fabacon inclusión amorfa (I)

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• Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patógeno considerado.

• Estas pruebas se denominan ensayos de indización (indexing) y difieren según el sistemahuesped-patógeno de que se trate.

• Se incluyen entre estas pruebas:

- Selección visual u observación de síntomas

- Empleo de hospedantes indicadores

- Métodos serológicos

- Microscopía electrónica

La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada

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Conservación de germoplasma

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Las técnicas de cultivo in vitro de tejidosvegetales costituyen parte esencial de unaestrategia general para la conservacióne intercambio de recursos fitogenéticos.

Conservaciónde germoplasma

Gentillieza W. Roca

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• Colecciones in vitro

• Bancos de semillas

• Crioconservación

Existen diferentesmétodos parala conservaciónde germoplasma

www.cgiar.org

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• La conservación de germoplasma medianteel cultivo de tejidos se basa en la limitacióndel crecimiento del material vegetal.

• Implementación:

- Medios de cultivo de composición subóptima

- Baja intensidad lumínica (<500 lux)

- Temperaturas inferiores a las adecuadaspara el activo metabolismo de las células y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC)

- Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol)

Bancos de germoplasma in vitro

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• Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento.

• El material debe mantenerse bajo condicionescontroladas en una cámara de mantenimiento:

- Bajas temperaturas

- Bajo contenido de humedad

• Este método no puede aplicarse a la conservaciónde plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especiesde propagación vegetativa obligada

Los bancos de semilla permiten la conservación de especies vegetales que se propagan sexualmente

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• Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 ºC),por inmersión en nitrógeno líquido

• Diferentes explantos (ápices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) así como callos y suspensiones celularespueden ser crioconservados a -196 ºC.

Crioconservaciónde germoplasma

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• Crioprotección

• Congelamiento

• Almacenamiento

• Descongelamiento

• Pruebas de viabilidad

• Recultivo

Etapas del proceso de crioconservaciónde material vegetal

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Crioconservación y cultivo de meristemas de soja

Cultivo in vitro de células haploidesy embriones

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• Mejoramiento vegetal.

• Estudios de genética cuantitativa.

• Estudios de diferenciación celular y alternancia de generaciones.

Aplicacionesdel cultivoin vitrode célulashaploides

Tétradas demicrosporas

Sacos polínicos(con granos de polen)

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Consiste en el cultivo de anteras inmadurasen medios sintéticos que promueven la divisióncelular y la formación de embriones o callos.Los embriones, transferidos a un mediode regeneración, darán lugar a plantas haploides.

Cultivo in vitrode anteras

anteras

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- Genotipo de las plantas donantes

- Fisiología de las plantas donantes

- Caracterización citológica y bioquímicade etapas muy tempranas del desarrollode los granos de polen

- Pretratamiento de las anteras con altaso bajas temperaturas o con choqueosmótico

- Medios de cultivo con alto contenido en osmóticos para la inducción de callos y menores concentraciones de sacarosapara la regeneración de plantas

Condicionesque afectanel cultivode anteras

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- Permite la expresión e identificaciónde alelos recesivos

- Constituye una fuente útil para el mejoramientointravarietal

- Permite la rápida introducción de caracterescitoplasmáticos en un fondo genéticohomocigótico

- Crea y acrecienta las reservas citogenéticasy citoplasmáticas de los cultivos

- La obtención de haploides duplicados resultaútil para el desarrollo de nuevas variedadescon el fin de distribuirlas en ambientes ecológicosmuy diversos y para ensayarlas en ellos.

- Las microsporas o células haploides puedenusarse para la inducción de mutantes y parala selección de caracteres esporofíticos.

El cultivo de anteras ofrecenumerosasventajas para el mejoramientode plantas de interés comercial

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• Estudio de requerimientos nutricionalesde embriones en desarrollo.

• Rescate de embriones híbridos derivadosde cruzamientos interespecíficos e intergenéricos.

• Produción de monoploides.

• Superación de la latencia de las semillas.

El cultivode embrionesinmadurospermiterealizardiferentesaplicaciones

Embrión cigótico

Corte longitudinal de una semilla de Brassica

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Embriones somáticos (es) obtenidos a partir del cultivo de óvulos de Arabidopsis.

• Rescate de embriones (mediante polinizacióny fertilización in vitro)

• Inducción de la embriogénesis somáticaa partir de nucelos de diferentes especiesvegetales.

Aplicaciones del cultivode óvulos

es

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Semillas sintéticas

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Semillassintéticas

Embriones somáticos de Pinus sp

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Las semillas artificiales reproducen la estructura de una semilla de origen sexual

Las semillas artificiales poseen una cubierta de protección, contienen sustancias de reserva y portan un embrión en su interior.

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Procedimiento para encapsularembrionessomáticos

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Cultivo de protoplastos

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Los protoplastos son célulasvegetalesdesprovistasde pared celular

Suspensión de protoplastosde mesófilo de tabaco

Protoplasto de mesófilo de tabacoProtoplastos de la línea celular By2

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Esquema general de la manipulación genética de protoplastos in vitro para la realización de técnicas de mutagénesis, fusión o transformación.

Los protoplastosconstituyen un explanto ideal para diferentes fines biotecnológicos

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• Método mecánico

- Bajo rendimiento- Procedimiento tedioso- Aplicabilidad limitada

Choque osmótico para producir plasmólisis celulary ruptura de la pared. Los protoplastos se liberande las células rotas mediante el restablecimientode su nivel osmótico.

• Método enzimático

Consiste en la incubación de las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen además proteasas, nucleasas y lipasas.

Métodos parael aislamientode protoplastos

• Protocolo para la obtención de protoplastos . de mesófilo de hoja de tabaco:

- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jóvenes de tabaco).

- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de hoja. Disponer los explantos en un regulador osmótico.

- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri conteniendo la solución mezcla de enzimas y medio nutritivo para el cultivo de protoplastos en una proporción 1:1.

- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 hen oscuridad, a 22-25ºC, a 50 rpm.Observar la liberación de los protoplastos en un microscopio invertido.

- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizándolos y centrifugándolos a 100 g. Usar las soluciones formuladas para tal fin.

- Remover el sobrenadante y resuspenderlos protoplastos en medio de cultivo.

Pasosimplicados en el aislamientode protoplastos de mesófilode tabaco

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Variación somaclonal

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Entre otras causas:

• Modificaciones genéticas heredables porlas progenies de las plantas obtenidasmediante cultivo in vitro

• Prevalencia del cariotipo específico de plantas y tejidos quiméricos y de mosaicos

• Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientosde cultivo (composición del medio, etc.)

• Aneuploides no separables en el cultivo

La variaciónsomaclonalpuede explicar la variación fenotípicade las plantas regeneradas in vitro

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• Cese mitótico que lleva a líneas poliploides

• Mutaciones del cariotipo

• Amplificación o disminución de genes

• Reordenamiento de mutaciones en genomasde organelas

• Transposones

• Inversiones, traslocaciones y otros accidentes cromosómicos

Otra posibles causas de la variabilidad de las plántulas regeneradas

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• Indeseable en la micropropagación de plantas de interés comercial (diversidad genotípica)

• Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material genético (variabilidad)

Características de la variación somaclonal

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