ANEXO 2. A

INFORME TÉCNICO DE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA

PROINNOVA: Programa de Estímulos a la Innovación

Clave del Proyecto: _222792________

Título del proyecto: Sistema integrado de inocuidad y trazabilidad para la reducción de

riesgos en Carica papaya

INSTITUCIÓN: Universidad de Colima

Responsable: Dr. Salvador Guzmán González

1. Avances del proyecto (resumen en una cuartilla)

Se realizó el desarrollo y estandarización de tres protocolos utilizando la

técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para la detección de

Salmonella, Escherichia coli y coliformes totales patógenos humanos importantes y

que deben ser monitoreados constantemente para la aprobación de los cultivos.

Por otro lado, se realizó un documento técnico que indica cómo se realizará la

trazabilidad de un cultivo, para llevar un registro que permita identificar toda la ruta

que atraviesa un fruto, es decir, considera desde el suelo donde se sembró la

planta, hasta su distribuidor final, para de esta manera poder tener un control

sobre los frutos.

Además, se realizó una documento con una propuesta técnica de cómo se

realizará la validación de los análisis que se realizarán en el laboratorio de la

empresa Red Starr.

Finalmente se capacitó al personal involucrado y que será el responsable de llevar

a cabo los análisis en la empresa, donde se le enseñó los siguientes puntos

principales: preparación de material, uso de equipos de laboratorio, preparación y

vaciado de medios, siembra en medio sólido y líquido, conservación de bacterias,

extracción de ADN, PCR en punto final y electroforesis.

2. Logro de objetivos y metas (enunciarlos de forma específica y su porcentaje de avance en media cuartilla)

Objetivo general: Diseñar un sistema integrado de detección y trazabilidad de

plagas para la reducción de riesgos de inocuidad mediante el

diseño de tecnologías de detección y estrategias de control

biológico sustentables en Carica papaya que generen seguridad

para el consumidor en los mercados nacional e internacional

No. Entregables Comprometidos % de

avance

1

Dos protocolos de detección molecular en fase de prueba de laboratorio, estos serán diseñados de tal forma que puedan ser implementados rápidamente en campo y analizados en laboratorio.

100 %

2

Un estudiante de maestría en proceso en un posgrado perteneciente al PNPC y que iniciará sus trabajos en el marco del proyecto planeando.

100 %

3

Un documento de planeación de trazabilidad y análisis de producto que incluya los protocolos de detección, el diseño de muestreos, la frecuencia de muestreos y los análisis estadísticos que deban ser aplicados.

100 %

4

Un plan de validación de pruebas de detección que serán realizadas por la Universidad como datos confirmatorios de las pruebas que realice la empresa en el campo.

100 %

5

Capacitación al personal en técnicas de diagnóstico molecular para el grupo que conforma el área de investigación y desarrollo, así como la asesoría en la consolidación del área de prueba y diagnóstico en la empresa.

100 %

3. Productos obtenidos en la etapa

a) Descripción y alcance de los productos generados

No. Productos obtenidos

Descripción Observaciones

1

Tres protocolos de detección molecular en fase de prueba de laboratorio

a) Se implementaron los protocolos siguientes:

1. Procedimiento para determinar

Salmonella spp. en frutos por PCR en punto final.

2. Procedimiento para determinar E. coli en frutos por PCR en punto final.

3. Procedimiento para determinar

- Sin observaciones

Coliformes totales en frutos por PCR en punto final.

(Apéndice A: Procedimientos técnicos).

2 Estudiante de maestría en proceso

C. Fernando Romero Parra, en cuarto semestre del Programa de Maestría en Ciencias en Agrobiotecnología, del Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jal., cuyo trabajo de investigación se titula “Análisis bioquímico de la interacción de frutos de papaya (Carica papaya L.) con el hongo Colletotrichum spp.”, causante de la enfermedad de antracnosis. Uno de sus asesores es el Dr. Gilberto Manzo Sánchez, participante del proyecto y profesor de la Universidad de Colima. (Apéndice B: Constancia de asesor de la Universidad de Colima, Calificaciones del tercer semestre y documento de Seminario III).

Se estima que para el mes de marzo del año 2016 presentará el examen de grado.

3 Documento de análisis de trazabilidad

- Se elaboró un documento de cuatro cuartillas, en el que se describe el procedimiento para realizar la trazabilidad de productos hortofrutícolas. (Apéndice C: Procedimiento técnico).

- Sin observaciones

4 Plan de validación

- Se elaboró un documento de 11 cuartillas, en el que se describe el procedimiento para la validación, confirmación y pruebas de desempeño técnico de métodos de ensayo normalizados, no normalizados y desarrollados, que son utilizados por un Laboratorio. (Apéndice D: Procedimiento técnico).

- Sin observaciones

5

Capacitación de tres empleados de la empresa

- Se llevó la capacitación de Remedios García Franco, Víctor Alejandro Cruz Salcedo y de Ana Gabriel Robles Vázquez, en las técnicas de detección molecular de Salmonella spp., E. coli y coliformes totales, en las instalaciones del laboratorio de Agrobiotecnología, durante los días 12, 13, 24 y 25 de noviembre del presente. (Apéndices E: Fotografías de la capacitación y

- Sin observaciones

F: Constancias de capacitación).

4. Desviaciones y/o modificaciones en la etapa

a) Descripción de las desviaciones y/o modificaciones

No hubo desviaciones

b) Acciones para corregir las desviaciones y/o modificaciones

5. Compromisos para la etapa siguiente

No hay etapa siguiente.

__Dr. Salvador Guzmán González ______ 27 de noviembre de 2015 ________

Firma del Responsable Técnico Fecha

APÉNDICE A

APÉNDICE B

ANÁLISIS BIOQUÍMICO DE LA INTERACCIÓN DE FRUTOS DE PAPAYA (Carica papaya L.) CON EL HONGO Colletotrichum spp.

1Romero-Parra, F., 1Mancilla-Margalli, N.A., 1Ávila-Miranda, M.E. 2Manzo-Sánchez, G. 1Intituto Tecnológico de Tlajomulco, 2Universidad de Colima, FCBA.

Palabras clave: Colletotrichum. spp., Especies reactivas de oxígeno, C. papaya.

INTRODUCCIÓN Las plantas responden al estrés abiótico o biótico a través de una rápida producción localizada de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivadas del O2 como el radical superóxido (O2-), hidroxilo (OH-) y peróxido de hidrógeno (H2O2)(1). La tolerancia o susceptibilidad en las plantas ante la presencia de patógenos depende de su respuesta bioquímica. Los ROS tiene el potencial de ser directamente tóxicos, como el H2O2 que provoca respuestas en el sitio de interacción como lignificación, producción de fenoles y muerte celular (respuesta hipersensible, RH); además es señal para la expresión sistémica de mecanismos de defensa (proteínas relacionadas con patogénesis, PRs)(2), enzimas generadoras de fitoalexinas y, posteriormente, sistemas antioxidantes para el control de los ROS(3). El objetivo de este trabajo es identificar las principales respuestas bioquímicas asociadas a la interacción compatible (o incompatible) de frutos de papaya tolerantes (y susceptibles) a cepas de Colletotrichum spp. MATERIALES Y MÉTODOS -Caracterización de la respuesta bioquímica de la interacción fruto-patógeno. La cepa no patogénica o patogénica (MLNI y WSFT, respectivamente) se inoculó (2.5x107 con/mL) en frutos de papaya var. Maradol en estado verde-maduro. Durante los 5 días posteriores a la inoculación (DPI), se extrajeron las proteínas del fruto del sitio de interacción. Se analizaron las actividades enzimáticas de proteínas PRs como guaiacol peroxidasa (POX), β-1,3-glucanasa (GLC), quitinasa (CHI), enzimas rédox como catalasa (CAT), ascorbato peroxidasa (APX) y polifenol oxidasa (PPO) así como la fenilalanina aminoliasa (PAL), enzima clave en la ruta de fitoalexinas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la interacción incompatible (II, la POX tiene un incremento bifásico al 1 y 4 DPI; mientras que la interacción compatible (IC), la enzima es inhibida en el 1 DPI. Una diferencia en actividades de PPO de 20 unidades de actividad enzimática (UAE) también es observada en el primer día de contacto, siendo mayor en la II. POX y PPO están involucradas en la formación de barreras físicas a partir de reacciones de oxidación que involucran el H2O2. En la interacción II, la actividad GLC se mantiene constante durante el período evaluado, a diferencia de la IC, donde se inhibe en los primeros tiempos; La actividad CHI, por su parte empieza a incrementar desde el 3 DPI en la II. Esta inducción tardía en GLC y CHI es debido a la conformación de la pared celular del hongo donde primero hidrolizan los β-glucanos y después la quitina. En el sistema antioxidativo, mediado por APX y PPO, se encuentran menos activas en la II durante los primeros 2 DPI, incrementando a niveles superiores a partir del 3DPI, mientras que CAT es más activa en IC a los 2 DPI e incrementando en el 3 DPI. En cambio, la PAL es inhibida por la II desde el primer momento, mientras que la IC es aumentada hasta 225 UAE al 1 DPI. CONCLUSIONES La pronta actividad de POX y PPO y subsecuentes actividades de GLC y CHI parecen ser claves en la tolerancia del fruto, adicional a una inhibición inicial del sistema antioxidativo. REFERENCIAS. 1. Benezer-Benezer, M. et al. 2008. Rev. Mex. de Fito. 26:56. 2. Mellersh, D.G. et al. 2002. Plant J. 29:257-268. 3. Hung, S. et al., 2005. Bot Bull. Acad. Sin. 46:1

“2015, Año del Generalísimo José María Morelos y Pavón”

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TLAJOMULCO

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APÉNDICE C

APÉNDICE D

APÉNDICE E

APÉNDICE F