ANÁLISIS DE LIPIDOS POR HPLC

HPLC: análisis de TGs y fosfolípidos. Moléculas pequeñas como FA y esteroles: GC.Preparación muestra: líquida (inyección directa de aceites). Sólidos: extracción con solvente apolar (aislar TGs) y clean-up.Triglicéridos: interés para procesado y control alimentosGrasas: mezclas complejas de TGs, esteroles y vitaminasFormación hidroperóxidos enranciamiento

HPLC: - contenido en TGs, esteroles, vitaminas e hidroperóxidos (UV-DAD), para diferenciar entre TGs saturados e insaturados- perfil de TGs específico a cada tipo de aceite, permite detectar adulteraciones

Detección: índice refracción (isocrático). Gradiente con detectores UV y ELSD.

-Separación lípidos sencillos: determinar fracciones de ésteress de esteroles, ácidos grasos libres, TG, DG, esteroles libres, monoacilgliceroles, ceras. Tradicionalmente análisis cromatografía adsorción columnas sílice y ELSD.

-Cromatografía reparto: RP y NP. Separación TGs con RP y fase móvil no acuosa (acetonitrilo:acetona) permite separación en función número C.

Análisis de perfil de TGs en aceite de girasol envejecido.

Detección entre 200-215 nm: TGs

Detección a 240 nm: hidroperóxidos

Detección a 280 nm: TGs fragmentados

ANÁLISIS DE VITAMINAS POR HPLC

- Liposolubles: A, D, E- Hidrosolubles: C, B6, B12, B2, B1- Importancia: legislativa, etiquetado, asegurar calidad alimentos suplementados, estudiar cambios durante procesado, almacenamiento, etc.Dificultad análisis:

- bajas concentraciones- en presencia de otros compuestos en elevadas concentraciones y con propiedades químicas similares- se degradan con luz, O2, elevadas Tª

HPLC: - información cualitativa y cuantitativa (UV-DAD y electroquímica)

Vitaminas hidrosolubles: problemas análisis de estas vitaminas Vitaminas hidrosolubles: problemas análisis de estas vitaminas relacionados con preparación muestra antes del análisis por HPLC debido a que estas vitaminas se encuentran a menudo ligadas a otros constituyentes como carbohidratos y proteínas.

Vitamina C: 2 vitámeros, ac. Ascórbico y dehidroascórbico.Actúan en otras funciones, previniendo cancer, hipertensión, etc.Problema: baja estabilidad. Extracción utilizando ácidos (metafosfórico).Análisis HPLC fase inversa con agua a bajos pH. Detección: UV a 254 nm (AA) y 210-230 nm (DHAA)Detección fluorescencia después derivatización

Análisis vitaminas hidrosolubles en una bebida y espectros vitaminas. Fase inversa, DAD, Fase móvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.Preparación muestra (reales): extracción, hidrólisis, oxidación, clean-up, etc.

Vitamina B1 (tiamina): 4 vitámeros, la forma no fosforilada (tiamina) mayoritaria en plantas y formas fosforiladas mayoritarias en productos animales. Deficiencia tiamina asociada a beri-beri.

Extracción: hidrólisis ácida para liberar vitámeros de matrices alimentarias. A veces es necesaria hidrólisis enzimática para eliminar exceso de almidón y proteínas.

Clean-up con SPE C18 o columnas intercambio iónico

Análisis HPLC: par iónico

Detección: fluorescencia (excitación 365-375 nm y emisión 425-435 nm) después derivatización.

etc.

- Vitaminas liposolubles: se pueden dividir en 4 grupos dependiendo de su actividad biológica: vitamina A (retinol y carotenoides), vitamina D (colecalciferol y ergocalciferol), vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles) y vitamina K (filoquinona y menaquinona).

- Vitamina A: esencial visión, crecimiento, sistema inmune. Fuentes naturales vitamina A derivan de carotenoides (provitamina A) sintetizados por plantas superiores y organismos fotosintéticos- Vitamina A sintética se utiliza como suplemento.

-Análisis: - saponificación (liberar retinol esterificado)- extracción- o extracción directa (hexano) p.ej. vitamina A total leches- análisis HPLC: fase normal o inversa- inversa mejor cuando muestra contiene bajas concentraciones de triglicéridostriglicéridos- detección: UV (328 nm) (fluorescencia nativa baja)

- Vitamina D: prevención raquitismo y osteomalacia (reblandecimiento óseo). Imprescindible organismos no expuestos a luz solar (dietary intake). Vitamina D esta presente en alimentos solo a niveles traza. - Estructura parecida a otros lípidos que se encuentran en concentraciones muy elevadas: exhaustivo tratamiento muestra previo análisis. -Etapas: saponificación, extracción con disolventes y purificación para eliminar esteroles, carotenoides, etc. - Vitaminas D2 y D3 sólo se pueden separar en fase inversa utilizando como f. Móvil metanol:agua o acetonitrilo:agua- Detección: 264 nm

-Vitamina E: se encuentra en aceites vegetales y otros alimentos como frutos secos, semillas y frutas. 8 formas (tocoferoles y tocotrienoles) con diferente actividad. Vitamina E: antioxidante lipídico.

- Extracción directa o saponificación previa (dependiendo matriz).

- Aceites y grasas: disolución en hexano y análisis directo por HPLC fase normal con sílice o fases polares. Es posible separar las 8 formas de vitamina E en isocrático.

- Detección fluorescencia: nativa muy fuerte (elevada sensibilidad y selectividad)

- Otros sistemas detección: UV (280 nm) y electroquímica (mayor sensibilidad (ha permitido la detección de pmoles de vit E en plasma humano)

Figure 2. HPLC of Vitamin E. (A) Standards of vitamin E vitamers. Column, 5-µm Supelcosil LC-Si (250 x 4.6 mm ID); mobile phase, isooctane/ethyl acetate(97.5:2.5), 1.6 ml/min; fluorescence detection, excitation 290 nm, emission 330nm. Peaks: (1) α-tocopherol; (2) α-tocotrienol; (3) β-tocopherol; (4) γ-tocopherol; (5) β-tocotrienol; (6) γ-tocotrienol; (7) δ-tocopherol; (8) δ-tocotrienol. (B) Saponified rice bran sample. Chromatographic conditions as in(A) except for mobile phase: isooctane/ethyl acetate/2,2-dimethoxypropane(98.15:0.90:0.85:0.1). Reproduced with permission of AOCS Press.

Análisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Separación en fase normal. Fase móvil: hexano/isopropanol. Isocrático. Concentración de tocoferoles en extracto de margarina, detección fluorescencia: long. exc. 295 nm, long. em: 330 nm.

Análisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Fase inversa, detección electroquímica.

-Vitamina K: actividad antihemorrágica.

- Preparación muestra: hidrólisis enzimática y clean up. Análisis HPLC en fase normal o inversa.

- Deteccción UV a 270 nm.

-Múltiples vitaminas liposolubles: A, E, D2 y D3

- Fase inversa con metanol:agua y detección UV a 263 nm después saponificación.

- Fase normal también se ha utilizado (aceites semillas).

- A veces es necesario utilizar varios detectores (UV y fluorescencia)

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS POR HPLC

- Análisis importante desde punto vista nutricional, control de calidad y control en el desarrollo de nuevos productos (fracción proteica). Importante para asegurar autenticidad de alimentos (separación e identificación enantiómeros).Aminoácidos

-La composición en aminoácidos de proteínas puede usarse para determinar el origen de carnes: detectar adulteraciones.-Preparación muestra distinta si AA libres o totales: AA ligados a proteínas, es necesaria hidrólisis ácida o digestión ácida previa HPLC. Posterior etapa clean-up para eliminar interferencias/concentrar muestra (SPE con cartuchos C18 capaces de retener lípidos y proteinas grandes).-Análisis HPLC (intercambio iónico) o fase inversa previa derivatización con OPA (aumentar hidrofobicidad).-Habitualmente la detección se lleva a cabo después de la formación de -Habitualmente la detección se lleva a cabo después de la formación de derivados (UV y fluorescencia)-Derivatización on-line (OPA) puede ser: precolumna o postcolumna-Análisis aminoácidos en cerveza después derivatización on-line con OPA.

-Fase inversa, fluorescencia, Fase móvil: A: acetato sódico, B: ACN. Gradiente.

Péptidos

-Preparación muestra 2 etapas: extracción y eliminación proteínas (UF) que permite fraccionamiento de péptidos. Clean-up SPE C18.-Análisis columnas RP con cromatografía de par iónico (ácido trifluoroacético), intercambio iónico, exclusión molecular.-Detección: UV (AA aromáticos como tirosina y triptófano) y despueés derivatización con cloruro de dansilo.-Avances detección y análisis de péptidos: LC-ESI-MS, permite identificación de biopolímeros de elevado PM generando iones de múltiple carga.-También MALDI-TOF-MS: permite medida precisa masa de péptidos y proteínas con una gran sensibilidad (subpicomol).-Bases de datos que permiten caracterización péptidos y secuenciación.

Proteínas

-Habitualmente después de aislamiento utilizando diálisis, UF, precipitación con disolventes orgánicos o sales.-Análisis RP-LC, IEC, SEC.-Separación proteínas utilizando rellenos peliculares, rellenos perfusión y columnas monolíticas.-Diferentes aproximaciones al problema de baja difusividad proteínas en poros de rellenos convencionales: ensanchamiento y pérdida de eficacia.-Rellenos peliculares, de perfusión y columnas monolíticas.-Polymeric monolithic stationary phases offer an alternative to theclassical microparticulate sorbents, bringing important advantages tosample analysis. In contrast to the traditional stationary phases, whichconsist of packed particles, the monolithic separation medium is made ofa continuous, rigid polymeric rod with a porous structure. The lack ofintraparticular void volume improves mass transfer and separationefficiency, which allows for very fast separations of biopolymers.

Capillary LC/MS separation of 13 digested proteins. Up to 150 peptides separated in less

than 15 min.

ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS POR HPLC

Interés análisis carbohidratos:

- relación carbohidratos-salud- control productos bajo contenido calorías/dietéticos/diabéticos- industria-control calidad y de adulteraciones, ej: contenido lactosa en alimentos sin lactosa, contenido fructosa siropes, etc.Análisis carbohidratos:- métodos químicos- métodos enzimáticos- GC (baja volatilidad, derivados cuantitativos)- HPLC (mínima preparación muestra, desarrollo nuevos detectores: amperométricos, MS, etc.)- HPLC, detectores más utilizados: índice refracción

short wavelength UV fluorescencia después defluorescencia después deformación derivadosamperométrico

Extracción con agua previa análisis HPLC, clean-up SPE.HPLC con fase ligada a sílice amino, diol, ciano, C18, etc.ó intercambio iónico con resinas aniónicas y catiónicas, SEC Análisis de carbohidratos en limonada. Detector índice refracción, Intercambio iónico

CONSERVANTES

Autorizados por la CEE 64/54/CEE de 5/11/63 y post.:ac. sórbico, cítrico, acético, propiónico, succínico, fosfórico, láctico,málico, tartárico, fumárico, etc.ACIDULANTES: - agentes saborizantes para intensificar ciertos

sabores y enmascarar algunos otros- control pH (tampón) durante el procesado y conservación- prevenir crecimiento µorg- sinergia con antioxidantes para prevenir enranciamiento y oscurecimiento- modifican viscosidad- modifican punto fusión

PREPARACIÓN MUESTRA: f(matriz)destilación, SPE

Intercambio iónicoFase móvil: 0.003 M H2SO4Longitud onda: 192 nm

Intercambio iónicoFase móvil: 0.007 M H2SO4DAD

ANTIOXIDANTES

Retardan enranciamiento oxidativo (adición grasas y aceites en 200 ppm)ac. ascórbico, tocoferoles, galato propilo (PG), galato octilo (OG), butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), etc.

En los paises donde está permitido su uso debe determinarse el máximo nivel de estos compuestos en el alimento.

HPLC: técnica más idonea para determinación antioxidantes de naturaleza fenólica

PREPARACIÓN MUESTRA: f(matriz)bajas grasa: L/Lcomplejas: SPE, L/L,detilación

Fase inversa. Fase móvil: A: agua, B: ACN gradienteDAD

COLORANTES

Color: característica influye directamente rechazo o aceptación productoAntigüedad: colorantes naturales (clorofilas, carotenoides, flavonoides, antocianos plantas, minerales como óxidos de hierro, etc.)

Actualidad: colores sintéticos. Clasificación según estructura química:- azo (mono, di, tris)- indol- trifenilmetano

Métodos HPLC: par iónico e intercambio iónico

Absorción UV: longitud onda característica

EDULCORANTES

Edulcorantes no nutritivos: - sustitutivos sacarosa- más utilizados: sacarina

aspartamociclamatosacesulfamo potásico

Investigación para detectar la toxicidad de estos compuestos (seguridad para consumo). Regulación de su concentración en alimentos y bebidas para evitar un consumo excesivo

Aspartamo: derivatización en columna (OPA) + análisis HPLC fase inversa. Fase móvil: A: acetato sódico, B: metanol. Gradiente. Detección UV 338 nm

ANÁLISIS DE RESIDUOS Y CONTAMINANTES POR HPLC

Elección método análítico:- especificidad- sensibilidad- precisión- reproducibilidad- rapidez

Residuos productos zoosanitarios: substancias destinadas aldiagnóstico, prevención o tratamiento de las enfermedades de losanimales que pueden dar lugar, por su mal uso o abuso, a repercusionesdesfavorables para aquellos o para la salud pública

Clasificación según finalidad uso:- promotores crecimiento- productos para tratamiento terapéutico o - productos para tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades

Tipos de residuos: - anabolizantes (estrógenos, andrógenos, etc.)- tireostáticos- antibióticos (cloranfenicol, tetraciclinas)- sulfamidas (bacteriostáticos)- beta-agonistas (clembuterol)- plaguicidas (carbamatos, piretrinas, herbicidas)

Necesidad análisis residuos:- existencia riesgo potencial salud (hormonas producen alteraciones)- efecto sobre procesos industriales (antibióticos: bacterias resistentes. Problemas en la elaboración yogur/queso)- ventajas comerciales no legales (tireostáticos: fraude)- aspectos toxicológicos

Características residuos:

- presencia muestra prohibida: el residuo o sus metabolitos deben buscarse en el tejido donde se acumula (ej: tireostáticos en tiroides)- concentración por debajo niveles autorizados: tomar muestra representativa de la totalidad

Análisis residuos

bajas concentraciones (ppm, ppb, ppt) en muestras complejas

Esquema operativo:

1) extracción

2) purificación y concentración

3) detección e identificación

4) cuantificación

Análisis residuos de fármacos en huevos. Fase inversa, DAD. Fase Análisis residuos de fármacos en huevos. Fase inversa, DAD. Fase móvil: A: acetato sódico, B: ACN/agua. Gradiente.

Análisis de micotoxinas: compuestos tóxicos producidos por hongos. Análisis esencial para garantizar seguridad de cereales, aceites semillas, especias, etc.Detección ppb: concentración muestra y detección con suficiente sensibilidad. Fase inversa, DAD y detector fluorescencia. Fase móvil: metanol:agua.

Análisis de plaguicidas en muestras de ensalada. Fase inversa, UV, Fase móvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.