Ascidia

UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

CORDADOS

01. TITULO :

Efecto antimicrobiano de la túnica de Ciona instestinalis “Ascidia” en la bahía de Samanco-Chimbote, Perú.

02. INVESTIGADOR RESPONSABLE:

Nombre y Apellidos: PEDRO HUAMÁN MAITA

03. CO-INVESTIGADOR/ LABORADORES

• Nombre y Apellidos: CHUMACERO LIVIAS, MILAGROS

Teléfono celular: 969611132

Correo-e: [email protected]

• Nombre y Apellidos: POLANCO CALDERON, JOSE



• Nombre y Apellidos: YNILUPU MATTOS, LESLY



Nombre y apellidos: YSLA GARCIA, EDWARD



04. UNIDAD ACADÉMICA DONDE SE DESARROLLARA EL PROYECTO

Facultad de Ciencias Biológicas – Laboratorio de Microbiología

05. TIPO Y DISCIPLINAS DE BASE:

http://aulavirtual1.urp.edu.pe/scripts/moodle/user/view.php?id=66878&course=1

Marcar tipo Indicar Disciplina(s) de base

Básica ( )

Aplicada ( ) (Microbiología, Cordados)

06. DURACIÓN

Periodo 7 de Mayo del 2012 al 19 de Junio del 2012

07. MONTO DE GASTOS

Requerimientos de la URP S/.508.80

08. FUNDAMENTACIÓN

Todos los animales necesitan protegerse contra los debilitantes efectos microbianos si quieren sobrevivir y colonizar su habitad. Sabemos que los invertebrados carecen de anticuerpos específicos y respuesta inmunitaria, entonces estos animales usan una variedad de actividades como la producción de ciertos compuestos, fluidos corporales, entre otros. La eficiente protección antibacteriana es especialmente importante para aquellos animales que carecen de un exoesqueleto duro en donde se depende de un óptimo funcionamiento de circulación de los fluidos a través de los tejidos para su posterior alimentación. Muchos estudios de inmunidad antibacteriana se han realizado para los invertebrados pero estos tienden a centrarse solamente en grupos importantes tales como los insectos, moluscos y crustáceos.

Por lo que menos atención se le ha dado a otros grupos, como el Ascidaceae, los cuales son sésiles, cuerpo suave, filtradores de partículas y ampliamente distribuidos por todo el ambiente marino. Así, los urocordados son particularmente un grupo significativo de investigación ya que estos animales llevan una cercana relación filogenética con los vertebrados. La actividad antimicrobiana de las ascidias solitarias ha sido notado por pocos trabajos, en algunos casos, llegando a prestar potencial atención farmacológica, sin embargo, la precisa ubicación y la naturaleza de los factores responsables han sido pocos estudiados y mucho menos es conocido la relación de los agentes antimicrobianos a otros aspectos de defensa celular.

CARACTERISTICAS

La Ciona intestinalis es una especie de urocordado de la clase Ascidiacea, parientes lejanos de los vertebrados. Alcanza entre 2 a 10cm de longitud. Su cuerpo es alargado,

cilíndrico y retráctil, de textura gelatinosa, fijado al sustrato por la base o por el lado izquierdo. El sifón inhalante terminal, con 8 lóbulos, y el exhalante más corto, justo debajo del inhalante. Manto transparente, con tonos verdosos o amarillentos.

Desde la época de Darwin, las ascidias se han reconocido posiblemente como el más cercano de los invertebrados en relación con los seres humanos. Su genoma completo ha sido secuenciado, comparte el 80% de sus genes con los seres humanos. Durante el siglo 21 se ha convertido en un importante modelo experimental para los desarrollos biológicos.

El cuerpo de la Ciona es en forma de bolsa y está cubierto por una túnica, que es una secreción de las células epidérmicas. El cuerpo está unido a una base permanente situada en la parte posterior, y la parte anterior tiene dos aberturas, el sifón oral y el atrial. El agua se introduce en la ascidia a través del sifón oral y sale del sifón atrial.

Ecología

Ciona intestinalis es considerado como una especie invasora y crece sobre cualquier sustrato flotante o sumergido, sobre todo en las estructuras artificiales como los pilotes, la acuicultura, boyas y cascos de barcos, en la parte intermareal inferior a las zonas sub-mareales.

Importancia como un organismo modelo

Estos tunicados tienen algunos de los genomas bilaterales más pequeños: el contenido haploide es sólo aproximadamente 0,196 pg de ADN.

Muchas características de la Ciona es un modelo muy manejable: La Ciona tiene sólo 2.500 células en el último estado larval; el destino celular se determina muy temprano en la embriogénesis en comparación con las de otros animales, y los genes de desarrollo han alterado las funciones de forma equivalente en la morfogénesis del embrión.

Existen sorprendentes paralelismos entre el tunicado, Ciona intestinalis y el nemátodo, Caenorhabditis elegans, en términos de reducción del genoma del núcleo, la rápida evolución del genoma mitocondrial, la adquisición de un desarrollo determinado y la simplificación de la estructura corporal.

Genética

C. intestinalis es uno de los animales cuya plena genoma ha sido secuenciado. Posee un genoma relativamente pequeño (unos 160 Mbp) que consta de 14 pares de cromosomas con unos 16000 genes. El análisis del proyecto genoma han identificado nueve genes Hox, que son Ci-Hox1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 12 y 13. La Ciona savignyi, el pariente más cercano de Ciona intestinalis, también tienen el mismo conjunto de

genes Hox. La organización de los genes Hox es conocida sólo por C. intestinalis . Los nueve genes Hox están ubicados en dos cromosomas; CI-Hox1 a 10 en un cromosoma y Ci-Hox12 y 13 en otro. Las distancias TBP dentro de los genes Hox de Ciona son extraordinariamente largas. Siete genes Hox Ci-Hox1 a 10, se distribuyen, que abarca aproximadamente la mitad de la longitud del cromosoma. De las comparaciones a las expresiones de genes Hox y ubicaciones en otras especies, es probable que los genomas de coloración sean bajo condiciones de dispersión.

Su clasificación taxonómica es de la siguiente manera:

CLASIFICACION TAXONOMICA

Reino Animalia

Filo Chordata

Subfilo Urochordata

Clase Ascidaceae

Orden Enterogona

Familia Cionidae

Genero Ciona

Especie C. intestinalis

En el presente estudio se investigará las propiedades de la actividad antimicrobiana en la túnica de la ascidia solitaria, Ciona intestinalis.

09. OBJETIVOS

General: Determinar propiedades antimicrobianas de la Túnica de Ciona intestinalis “Ascidia”.

Específicos: Establecer los efectos del Principio activo antibacterial sobre la proliferación bacteriana Gram Positivas y Negativas.

10. ANTECEDENTES

• The Draft Genome of Ciona intestinalis: Insights into Chordate and Vertebrate Origins en 1998, menciona que los primeros cordados aparecen en el registro fósil en el momento de la explosión del Cámbrico, cerca de 550 millones de años. El moderno renacuajo ascidia representa una aproximación plausible a estos cordados ancestrales.

Para iluminar los orígenes de los cordados y vertebrados, se ha empleado la porción de la proteína codificada del genoma de la ascidia más estudiado, Ciona intestinalis. El Genoma de C. intestinalis contiene ~ 16.000 genes que codifican proteínas, de forma similar al número de otros invertebrados, pero sólo la mitad de la que se encuentra en los vertebrados. Genes de familias de vertebrados se encuentran típicamente en forma simplificada en C. intestinalis, lo que sugiere que las ascidias contiene el complemento básico ancestral de genes implicados en la señalización celular y el desarrollo. El genoma de ascidia también ha adquirido una serie de linajes específicos de innovaciones, incluyendo un grupo de genes que participan en el metabolismo de celulosa que se relacionan con los de las bacterias y los hongos.

• Fine Structure of the Tunic of Ciona intestinalis L. II. Tunic morphology, cell distribution and their functional importance en el 2003 menciona acerca de la arquitectura de la túnica de C. intestinalis y la distribución de células fueron investigados en microscopio electrónico. Las observaciones mostraron que la cubierta de ascidia está formada por una cutícula delgada exterior, una subcuticular de ancho variable y una gran capa única de sustancia fundamental. Gránulo grande, mórula, los fagocitos y granulocitos son los tipos celulares encontrados, que aparecen principalmente en los estados altamente vacuolados y se distribuyen a lo largo de toda la túnica. Las Células Granulosas grande, sin embargo, se presentan principalmente en la capa de la cutícula y las células mórula aparecen principalmente en la zona exterior de la sustancia fundamental. El papel de estas células en la construcción túnica, la reparación y regeneración, así como su función de barrido se discuten.

• An exceptional salt-tolerant antimicrobial peptide derived from a novel gene family of haemocytes of the marine invertebrate Ciona intestinalis en 2007 menciona una nueva familia de genes que codifica péptidos antimicrobianos fue identificado en EST (etiquetas de secuencias expresadas) de base de datos de C. intestinalis, y uno de estos genes de sus sub especies se clonó molecularmente en el norte de Europa. La hibridación in situ y el análisis inmunocitoquímicos reveló que el péptido natural se sintetiza y se almacena en un tipo distinto de hemocitos, el granulocito univacuolar no refráctil. Por RT-PCR semicuantitativa (transcripción reversa -PCR), se demostró que la expresión del gen es marcadamente regulada en hemocitos. Para evaluar la potencia antimicrobiana de la supuesta proteína defensa, se sintetizó un péptido correspondiente a su región de núcleo catiónico. El péptido fue altamente eficaz contra las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, incluyendo varias patógenos humanos y marinos, así como la levadura Candida albicans. En particular, la actividad antibacteriana del péptido fue retenida en concentraciones de sal de hasta 450 mM de NaCl. Usando dos métodos diferentes se ha demostrado que el péptido mata Las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas permeabilizando sus membranas citoplasmática. CD espectroscopia reveló que, en presencia de liposomas fosfolípidos compuestos de carga negativa, el péptido se somete a un cambio conformacional y

adopta una estructura α-helicoidal. Además, el péptido era prácticamente no citolítico de los eritrocitos de mamíferos. Por lo tanto, el diseño péptido antimicrobiano tolerante a la sal puede representar un modelo valiosa para el desarrollo de nuevos antibióticos.

• HENNING FEDDERS, A reverse search for antimicrobial peptides in Ciona intestinalis: Identification of a gene family expressed in hemocytes and evaluation of activity. En la búsqueda de pépticos antimicrobianos en la túnica de Ciona intestinalis, se uso el recientemente proyecto genoma y el numero se secuencias expresadas (EST), por este medio, se logro identificar a un gen putativo que muestra varios rasgos estructurales típicos de pépticos antimicrobianos. El péptido sintetizado posee una potente actividad antimicrobiana contra una variedad de bacterias y también contra el hongo Candida albicans. Además se pudo concluir que usando una célula fluorescente permeable se evidencio que los péptidos mata directamente las bacterias permeabilizando sus membranas citoplasmáticas. Ciona intestinalis, posee entonces un péptido que representa un potencial arsenal para combatir infecciones microbianas.

• CAMERON FINDLAY, Antimicrobial factors in solitary ascidians. Las ascidias solitarias poseen un amplio rango de agente antimicrobianos en su sangre y otros tejidos, un numero de ellos han sido purificados y caracterizados con una vista de desarrollar potentes productos farmacológicos, sin embargo, para todas las especies de tunicados se sabe muy poco a cerca de la actividad, localización del tejido o modo de acción de estos componentes y no existen detalles de sus biosíntesis o regulación interna. Los últimos trabajos relacionados a la actividad microbiana de Ciona intestinalis revelan una amplia variedad de actividad ante bacterias Gram positiva y Gram negativa dentro de las células sanguíneas principalmente en las células de la mórula. Las células de la mórula son conocidas por participar en una variedad de respuestas en defensa del hospedero, puede existir una pequeña duda de que estas proteínas ayudan en la neutralización de bacterias y posiblemente de otros microorganismos. Además, en algunas especies, los péptidos con propiedades antibióticas han demostrado tener efectos biológicos in Vitro como por ejemplo protección ante predacion, digestión o prevención de epibiosis.

•CAMERON FINDLAY AND VALERIE J. SMITH mencionan acerca de que trabajos recientes sobre Ciona intestinalis han demostrado que la actividad antibacteriana es potente contra una amplia gama de bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas, las cuales residen dentro de las células sanguíneas circulantes, principalmente las células de mórula. La actividad es constitutiva, y no se encuentra relacionada a la lisozima y esto hace que no implique aglutinación o lisis directa de la pared celular bacteriana. Debido a que las células mórula participan en una variedad de receptores celulares en respuesta de defensa, no puede haber duda de que estas

proteínas ayudan en la neutralización de las bacterias, y posiblemente en la neutralización otros microorganismos, que pueden tener acceso a los tejidos.

11. METODOLOGÍA

• Recolección de la muestra

Ubicación del lugar de recolección: La bahía de Samanco se ubica entre las coordenadas geográficas de 78o 28' a 78º 34 LW y 09º 10' a 09º 16' LS, comprende un área de aproximadamente 6000 has. Políticamente esta bahía, incluye los distritos de Nuevo Chimbote y de Samanco, Provincia de Santa, Región Ancash, Perú.

Especímenes de C. intestinalis fueron colectadas en el “Concesionario Barrera”- Bahía de Samanco, a condiciones:

Transparencia (del mar) 3,5 m

Oxigeno (mg/l) 4,08

Temperatura 19,4º

Salinidad (ppm) 34,8

PH 8,19

Color del mar: verde oscuro

Viento: moderado

Mar: calmo (moderado)

El tamaño de la muestra obtenida fue de 100 individuos, todos sacados de una misma linterna, los individuos se colectaron indistintamente de su madurez, peso y ubicación.

Se colocaron en bolsas ziplok y éstas a su vez en un cooler para su preservación.

• Preparación del Extracto

Con el uso de las manos se procedió a aplastar y vaciar todo el contenido de las acidias quedándonos sólo con el órgano de interés, la Túnica. Luego de eliminar todo residuo, las muestras se sometieron a un licuado simple. Obtenido el extracto se almacenaron en frascos de dilución autoclavados.

Éstos a su vez se prepararon a dos diluciones diferentes:

Dilución A: al 50% (1:2)

Dilución B: al 30% (3:10)

• Preparación del cepario

Se preparó el medio TSA, para poder mantener las cepas de las bacterias que utilizaríamos para el trabajo. Posteriormente inclinaron los tubos tipo “pico de flauta” hasta que solidifique, luego se llevó a la estufa para realizar la prueba de esterilidad y posteriormente, al día siguiente se hizo el sembrado en el cepario, para esto usamos 3 bacterias previamente aisladas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae, luego del sembrado se procedió a dejarlas en la estufa a 37º C por 24 horas y consecuentemente se las refrigeró para su conservación y posterior uso.

• Preparación de medio de cultivo y Sembrado

Se prepararán 200mL el medio Agar TSA (agar Caso), según el protocolo y se servirán en 6 placas autoclavadas. Listas las placas, se procederá al sembrado de las sepas aisladas e inmediatamente después separar el área en 4 cuadrantes para, en cada una de ellas aplicar perforaciones de papel filtro embebidos en el extracto problema, según el protocolo del Antibiograma.

12. RESULTADOS

Evaluación de la acción bactericida*Efecto Bactericida son los sistemas que sí “matan” a los microorganismos que causan enfermedades. Por ejemplo los purificadores UV son los bactericidas más eficientes.

Para establecer el efecto de la acción bactericida se registró el diámetro (en milímetros) del halo de inhibición bacteriana formado 24 horas después de haber sembrado las muestras aisladas.En el cuadro presentado se observan los promedios de los diámetros obtenidos de los cuatro cuadrantes de cada placa, utilizando el extracto de la túnica.

Tabla 1: Diámetro promedio del halo inhibitorio en relación con la especie de bacteria usada y el extracto de túnica de Ciona intestinalis.

ESPECIE SEMBRADA Nº PLACAEXTRACTO DE

TUNICA DE Ciona intestinalis DILUCION A

Escherichia coli 1 23mmKlebsiella pneumoniae 5 25mm

ESPECIE SEMBRADA Nº PLACAEXTRACTO DE

TUNICA DE Ciona intestinalis DILUCION B

Escherichia coli 2 21mmKlebsiella pneumoniae 6 23mm

Siendo: 1 Dilución B y 2 Dilución A

Finalmente para comprobar el efecto Bactericida, se procedió a preparar un cepario en el que sembraron las colonias circundantes al halo resultantes de la exposición al extracto. Al cabo de 24 horas no hubo crecimiento en los tubos de verificación.

Evaluación de la acción bacteriostática* Efecto Bacteriostático se refiere a filtros que no permiten la reproducción de microorganismos. Esto no quiere decir que los destruya, solo que no permite su reproducción, es decir, si al filtro entran 50 bacterias, no se podrán desarrollar más, pero en ningún caso las elimina.

Para establecer la acción bacteriostática se evaluó longitudinalmente el crecimiento in vitro de cepas de Staphylococcus aureus expuesta a dos situaciones experimentales, durante cuatro tiempos de exposición.En el extracto de túnica de la ascidia el promedio de las colonias en el minuto uno fue de 98, en el minuto tres fue de 82, en el minuto 5 de 72 y en el minuto quince fue de 70. Luego de ello el número de colonias se mantuvo constante.

Gráfico 1: Promedio de crecimiento bacteriano por tiempo de exposición según el agente evaluado.

Finalmente para comprobar el efecto Bacteriostático, se procedió a preparar un cepario en el que se sembraron las colonias circundantes al halo resultantes de la exposición al extracto. Al cabo de 24 horas hubo sí crecimiento en los tubos de verificación.

13. CONCLUSIONES

Su efectividad antibacteriana es relativamente eficiente debido a que los halos de inhibición producidos en los cuadrantes de las placas petri fueron entre 21 y 25 mm de diámetro.

El efecto bacteriostático de Staphylococcus aureus frente al extracto problema fue comprobado debido al crecimiento de las colonias circundantes al halo en el cepario de verificación. Esto indica que el crecimiento de las colonias fue suprimido, mas éstas no fueron eliminadas.

La acción bacteriostática frente a Staphylococcus aureus es eficiente ya que el nivel poblacional de bacterias disminuye paulatinamente conforme va pasando el tiempo, y llega mantenerse constante en un determinado momento.

El efecto bactericida de E. coli y Klebsiella frente al extracto problema fue comprobado debido a la ausencia de crecimiento de las colonias circundantes al halo en el cepario de verificación. Esto indica que el crecimiento de las colonias fue suprimido debido a que éstas fueron eliminadas.

La acción bactericida de E. coli y Klebsiella es eficiente ya que el halo de inhibición formado fueron de diámetros relativamente favorables.

14. DISCUSIONES

Como se sabe en la túnica de Ciona intestinalis poseen un poder antibacteriano posiblemente debido a las células mórula ya que estos participan en una variedad de receptores celulares en respuesta de defensa, por eso, no puede haber duda de que estas proteínas ayudan en la neutralización de las bacterias, y posiblemente en la neutralización otros microorganismos, que pueden tener acceso a los tejidos.

Para comprobar el efecto bactericida y Bacteriostático se tuvo que corroborar los resultados en un sembrado de las colonias en un cepario de verificación.

15. AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a todas las personas que nos brindaron su apoyo para poder realizar este proyecto, nuestras familias; en especial al profesor Pedro Huaman Maita y al Blgo. Guillermo Alvarez Bejar quienes nos dieron muchas facilidades para poder movilizarnos hasta el concesionario Barrera, ya que sin ellos no hubiésemos logrado movilizarnos y poder colectar las ascidias.

16. ANEXOS

FIG 1.

Bahía de Samanco, Chimbote, se observa a los trabajadores alistando la lancha para el traslado hacia el concesionario Barrera. .

FIG 2: Lancha lista para el abordo para ir hasta el concesionario Barrera.

FIG 3: Concesionario Barrera. Se observan a los trabajadores colectando conchas de abanico.

FIG 4: Coordinando con el responsable del concesionario para poder colectar las ascidias de las linternas de conchas de abanico.

FIG 5: Linternas con numerosas ascidias impregnadas, se procedió a la colección de éstas para su posterior estudio.

FIG 6: En esta foto nos encontramos tres de los cuatro integrantes del proyecto junto con el Sr. Guillermo quien nos dio las facilidades en Chimbote para ir hasta el Concesionario Barrera.

15. REFERENCIAS

- Cameron F. and Valeries, J. 1995. Antibacterial activity in the blood cells of the Ciona intestinalis “Solitary ascidian” in vitro. The Journal of experimental zoology. Vol 273- 434-444p.

- Cameron F. and Valeries, J. 1995. Antimicrobial factors in solitary ascidians. School of Biological and Medical Sciences, Gatty Marine Laboratory,University of St Andrews, Fife, KY16 8LB, Scotland, U.K. 645-658p.

- Fedders, H. and Leippe, M. 2006. A reverse search for antimicrobial peptides in Ciona intestinalis. Department of Zoophysiology, Zoological Institute, University of Kiel, Olshausenstr.

- Fedders,H.; Matthias, M.; Joachim,P.; Leippe, M. 2008. An exceptional salt-tolerant antimicrobial peptide derived from a novel gene family of haemocytes of the marine invertebrate Ciona intestinalis. Department of Zoophysiology, Institute of Zoology, University of Kiel, Olshausenstr.

- Paramvir D.; et al. 2002. The Draft Genome of Ciona intestinalis: Insights into Chordate and Vertebrate Origins

- Giacomo L.; Eleonora P.; Giovanni F.; 2010. Structure of the Tunic of Ciona intestinalis L. II. Tunic morphology, cell distribution and their functional importance.

16. PRESUPUESTO (En nuevos soles enteros)

Gastos URP TOTAL

BIENES

Medios de cultivo:TSAAgar nutritivo

Material de laboratorio:Tubos tapa rosca pyrex de 13 x 100Placas PetriAsa de siembraPipetasBalanza

Material biológico:Túnica de Ciona intestinalis

Otros materiales:CoolerHielo secoGel refrigeranteImpresiones

Proporcionado por el laboratorio de Microbiología de la facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma.

Proporcionado por el laboratorio de Microbiología de la facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma.

Se colecto en la Bahia de Samanco, en la Ciudad de Nuevo Chimbote.

S./ 40.00S./ 15.00S./ 6.00S./ 28.00

MEDIOS DE TRANSPORTE

Costo del viaje de Lima a Chimbote para tres personas.Ida:Vuelta:

Costo de la gasolina para la lancha de la Universidad Ricardo Palma

Costo del transporte en la ciudad de Nuevo Chimbote(taxis)

S./150.00S./120.00

S./ 64.80

S./ 20.00

Estadía en la ciudad Chimbote

DesayunoAlmuerzoCena

S./15.00S./35.00S. /15.00

TOTAL S./ 508.80

17. CRONOGRAMA APROXIMADO DE GASTO (En nuevos soles enteros)

Actividad/tiempo Marzo Abril Mayo JunioRecolección de datos (papers, libros)

S./8.00

Compra de materiales que se necesitaran para el proyecto

S./ 61.00

Viaje al centro de recolección de la muestra

S./419.80

Impresión del proyecto

S./20.00

18. CRONOGRAMA APROXIMADO DE ACTIVIDADActividad/Tiempo Marzo Abril Mayo JunioPresentación del proyecto

xxxxxxx

Elaboración y búsqueda de antecedentes y bibliografía

Xxxxxxxxx x xxxxxxxxxx

Viaje a Chimbote para la obtención de la muestra

x

Preparación del material de laboratorio para las pruebas respectivas

xxxxxxxx

Culminación del proyecto

Xx xxx xx x

Entrega del proyecto

xxxx

Ascidia

Documents

Transcript of Ascidia